Producción de bioetanol combustible a partir de boniato por sacarificación y fermentación simultáneas de mostos altamente concentrados (VHG)
Valeria Larnaudie, Mairan Guigou, Lucía Fajardo, María Belén Ramírez, Claudia Lareo y Mario Daniel Ferrari
Departamento de Bioingeniería, Facultad de Ingeniería, UdelaR J. Herrera y Reissig 565
Montevideo
El uso de mostos altamente concentrados (en inglés Very High Gravity, VHG) en el proceso de fermentación permite producir altas concentraciones finales de etanol y reducir en forma significativa el consumo de energía. Sin embargo, esta tecnología no ha sido muy utilizada con materiales como tubérculos, debido a la alta viscosidad de las suspensiones agua/materia prima y mostos obtenidos, que dificulta el manejo durante el proceso y a fenómenos de inhibición que provocan procesos lentos y conversiones incompletas. El boniato es una materia prima atractiva para la producción de bioetanol combustible debido a su alto contenido de azúcares, bajos requerimientos de cultivo y alto rendimiento agrícola. En este trabajo se evaluó la producción de bioetanol combustible a partir de una variedad de boniato (Ipomea batatas) K 9807.1 seleccionada para la producción de bioenergía, en forma fresca y seca (harina). Se realizaron ensayos de hidrólisis con α-amilasa y glucoamilasa y fermentación con Saccharomyces cerevisiae, usando suspensiones con una relación de materia seca de boniato a agua en el rango 1:8 a 1:2 (p/v). A relaciones materia seca a agua bajas (1:8) se encontraron resultados similares para boniato fresco y harina en términos de concentración final de etanol (38 – 45 g/L), tiempo de fermentación (16 h) y conversión (~ 100%). A mayores relaciones materia seca a agua, se observaron conversiones completas y más rápidas usando la harina, en comparación con el desempeño mostrado en los ensayos con boniato fresco. Para una relación de 1:3 usando harina, se obtuvo una concentración de etanol de 97 g/L luego de 36 h y conversión 100%. El uso de nuevas levaduras u otras estrategias de fermentación podrían mejorar el desempeño observado usando mostos con alta concentración.
Palabras clave: bioetanol, boniato, fermentación alcohólica
1. Introducción
El cultivo de boniato tiene varias características que determinan su adaptación local y elección por productores de tipo familiar. Tiene bajo requerimientos de calidad de suelo, de agua y fertilización, resistente a plagas y bajos efectos erosivos. Se cuenta además con un programa de mejoramiento genético nacional desde hace dos décadas. La producción local cubre el consumo nacional. El tamaño de este mercado limita el aumento del área y el desarrollo del cultivo (Vilaró et al., disponible
online).
El almidón es un polímero de glucosa. El proceso convencional de producción de bioetanol a partir de materiales amiláceos incluye la conversión del almidón en azúcares fermentables la cual generalmente se realiza en dos etapas: licuefacción usando α-amilasas y sacarificación por la adición de amiloglucosidasas (AMG). En el caso del boniato, la fermentación de la glucosa derivada del almidón se realiza junto con los azúcares solubles presentes.
Un aspecto importante del proceso es el balance hídrico. Exceso de agua agregada al proceso implica mayor consumo de energía para separar el bioetanol formado. La destilación es una de las etapas de mayor consumo de energía y el mismo aumenta cuando mayor es la cantidad de agua a eliminar, esto es cuando menor es la concentración final de etanol alcanzada en la fermentación. Se pueden obtener altas concentraciones de etanol si el caldo de fermentación tiene un alto contenido de azúcares fermentables. Para lograr altas concentraciones de azúcares, se debe agregar una mínima cantidad de agua a la materia prima. El medio así preparado usando raíces o tubérculos como materia prima, contiene alto contenido en sólidos y generalmente elevada viscosidad (en inglés Very High Gravity, VHG). Estas propiedades producen grandes dificultades en el manejo durante el proceso, y puede llevar a una hidrólisis incompleta del almidón a azúcares fermentables (Zhang et al., 2010; Watanabe et al., 2010) e incluso una fermentación incompleta ya que las levaduras serán expuestas a condiciones de estrés debida a la alta presión osmótica producida por la elevada concentración de sólidos disueltos y las elevadas concentraciones de etanol alcanzadas pueden llegar a ser tóxicas para las células (Breisha, 2010).
Para reducir la gran presión osmótica producida por la alta concentración de azúcares bajo condiciones VHG, una práctica utilizada es la realización de la etapa de sacarificación en forma simultánea a la fermentación (SSF) (Srichuwong et al., 2009; Cao et al., 2011; Shen et al., 2011; Zhang et al., 2011). Además, una SSF contribuye a reducir los efectos de inhibición por producto que puede presentar la AMG por altas concentraciones de glucosa (Cao et al., 2011; Mojović et al., 2006). En una SSF, la temperatura (~ 30°C) y el pH (~ 4.5) son más favorables para el crecimiento de la levadura que para la actividad de la AMG (generalmente 60°C y pH 4). Usando esta tecnología, el tiempo y la energía del proceso completo puede ser reducida ya que la etapa de sacarificación separada de la fermentación a temperaturas por encima de los 50°C es eliminada (Zhang et al., 2010).
del secado y el efecto del secado sobre el desempeño del proceso (conversión de almidón a glucosa).
En este trabajo se evaluó la producción de bioetanol combustible a partir de una variedad de boniato (Ipomea batatas) K 9807.1 seleccionada para la producción de bioenergía, en forma fresca y seca (harina), para suspensiones con distintas relaciones de materia seca de boniato a agua.
2. Materiales y Métodos
2.1 Materia prima, enzimas y microorganismo
Se utilizó una variedad de boniato (Ipomea batatas) K 9807.1 seleccionada para la producción de bioenergía proporcionada por INIA, Las Brujas, Canelones, Uruguay. Para preparar el medio con el material fresco, éste se trituró usando un blender. La harina de boniato se preparó por secado del boniato cortado en trozos a 55°C hasta una humedad 7.7%, y posteriormente se realizó la molienda, alcanzando un tamaño de partícula promedio de 0.4 mm. El boniato fresco y la harina tenían un contenido de almidón de 56.3% y 51.1% (p/p) materia seca respectivamente. Sin embargo, el contenido de azúcares libres fue menor en el material fresco. Las diferencias en el contenido de almidón y azúcares libres entre el material fresco y la harina se debieron a la alta variabilidad en la composición del propio material. Considerando los azúcares libres y el almidón, el total de azúcares fermentables expresados como equivalentes de glucosa fue 75.3% y 76.9% (p/p) materia seca, para boniato fresco y harina respectivamente. Cao et al. (2011), y Srichuwong et al. (2012), realizaron fermentaciones con boniatos con composiciones similares.
Se usaron enzimas comerciales, α-amilasa (Liquozyme® SC) y amiloglucosidasa (AMG, Spirizyme® Fuel), gentilmente donadas por Novozymes, Brasil.
Para las fermentaciones se usó levadura seca de panadería comercial, Saccharomyces cerevisiae (Fleischmann). Para la preparación del inóculo la levadura se cultivó en matraces Erlenmeyer de 500 mL conteniendo 300 mL de medio preparado con boniato fresco o harina, con una relación materia seca a agua equivalente a la mitad de la relación correspondiente a la del medio de fermentación a utilizar. Éste se suplementó con (NH4)2SO4 0.24 g/L y MgSO4.7H2O 0.12 g/L. El pH fue ajustado a 5.8-6.0, se agregó α-amilasa (5.4 µL por gramo de materia prima en base seca) y se mantuvo a 86ºC por 90 minutos. Luego la suspensión se enfrió a 60ºC, el pH fue ajustado a 4.0, se agregó AMG (5.4 µL por gramo de materia prima en base seca), y se mantuvo a 60ºC durante 30 minutos. El pH del medio se ajustó a 4.5, se pasteurizó a 100ºC por 30 minutos. Se inoculó con 5 gramos de levadura seca a temperatura ambiente y se incubó en un agitador orbital a 30ºC y 150 rpm por 12 horas.
2.2 Ensayos de fermentación
boniato. Los ensayos con relaciones 1:5 y 1:8 se realizaron en matraces Erlenmeyer de 500 mL conteniendo 300 mL de medio. Debido a las altas viscosidades y concentración de sólidos en el medio, para las relaciones 1:2, 1:2.2 y 1:3, se utilizó la metodología de matraces de “sacrificio” con matraces Erlenmeyer de 250 mL conteniendo 150 mL de medio. En este caso se analizó todo el contenido del matraz.
El medio se preparó agregando la materia prima al matraz, el cual contenía la cantidad de agua destilada necesaria para preparar una relación materia seca a agua dada. Se ajustó el pH a 5.8-6.0 y se agregaron 5.4 µL por gramo de materia prima en base seca de α-amilasa. La suspensión se mantuvo a 86ºC durante 90 min bajo agitación. El pH se ajustó a 4.5 y se pasteurizó a 100°C durante 30 min. Se inoculó con la levadura de forma de alcanzar una concentración inicial de 1x108 células/mL y se agregaron 5.4 µL de AMG por gramo de materia prima en base seca. Se incubó en un agitador orbital a 100 rpm y 30°C. A distintos tiempos se monitoreó el contenido de azúcares, etanol, glicerol y concentración celular.
2.3 Métodos analíticos
Las concentraciones de glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, etanol y glicerol se determinaron por HPLC usando un equipo Shimadzu con columnas Shodex SUGAR KS-801 o Phenomenex Rezex RPM-Monosaccharide y detector de índice de refracción (RID-10A). El contenido total de azúcares se expresó en equivalentes de glucosa (glucosa + fructosa + 1.05 x sacarosa + 1.05 x maltosa).
La determinación de azúcares libres (glucosa, fructosa y sacarosa) en el boniato se realizó suspendiendo el material en etanol al 80%; la solución resultante se analizó por HPLC.
El contenido de almidón se determinó por el método de α-amilasa/glucoamilasa seguido de HPLC según NREL (Sluiter y Sluiter, 2005), proteínas por Kjeldahl, y cenizas, fibra y lípidos según métodos AOAC. La humedad se determinó por secado a 60˚C hasta peso constante. La concentración celular se determinó por recuento directo al microscopio en cámara de Neubauer.
3. Resultados y discusión
Resultados encontrados en nuestros laboratorios mostraron el mismo comportamiento para ensayos donde la sacarificación y fermentación se realizaron en forma separada (SHF) y ensayos donde la sacarificación se realizó en forma simultánea a la fermentación (SSF), utilizando boniato fresco y una relación de materia seca a agua (p/v) de 1:5, en términos de consumo de azúcares, concentración y rendimiento de etanol alcanzados (datos no mostrados). Por otro lado, varios investigadores han reportado que ensayos SSF son mejores desde el punto de vista económico comparados con la SHF en términos de mayor rendimiento de etanol y menor consumo de energía (Zhang et al., 2010).
La Figura 1 muestra perfiles típicos de fermentación para harina de boniato y una relación materia seca a agua (p/v) de 1:3. A pesar de que en una SSF la temperatura es menor que la óptima recomendada para la AMG, la velocidad de hidrólisis del almidón fue mayor que la velocidad de consumo de glucosa por la levadura. A las 36 h de fermentación, la conversión de los azúcares fue completa. La Figura 2a y 2b muestran los perfiles de etanol obtenidos para boniato fresco y harina respectivamente.
La concentración de etanol y el tiempo de fermentación fueron mayores para relaciones de materia seca a agua altas, las cuales corresponden a medios con alto contenido de sólidos (Tabla 1). Para boniato fresco, el consumo de azúcares fue completo solo para la relación 1:8. Para relaciones 1:5 y 1:2.2, la concentración de azúcares se mantuvo constante en un valor de 34 g/L y 107 g/L después de 24 h y 48 h respectivamente. La máxima concentración de etanol alcanzada fue similar a la encontrada para harina (cercana a 100 g/L).
Para harina de boniato, las relaciones 1:8, 1:5 and 1:3 mostraron conversión total de azúcares; sin embargo, para la relación 1:2, la fermentación no fue completa ya que luego de 48 h los azúcares residuales permanecieron en un valor constante (72 g/L). La concentración de etanol máxima alcanzada usando levadura de panificación Saccharomyces cerevisiae fue cercana a 100 g/L (98 y 97 g/L para relaciones de materia seca a agua (p/v) de 1:2 y 1:3 respectivamente). Esto podría indicar que concentraciones de etanol superiores a 100 g/L son tóxicas para este microorganismo. Uno de los estreses más severos que las levaduras experimentan durante la fermentación es su exposición a niveles tóxicos de etanol, condiciones que se pueden dar a altas relaciones materia seca a agua (Zhao y Bai, 2009). Por otro lado, se ha encontrado que la tolerancia al etanol puede ser mejorada con una apropiada suplementación de nutrientes al medio, tales como diferentes fuentes de nitrógeno, vitaminas y metales (Zhao y Bai, 2009; Breisha, 2010; Shen et al., 2012). Sin embargo, muchos de los suplementos utilizados a escala de laboratorio, tales como amino ácidos, vitaminas, esteroles y ácidos grados insaturados, son muy caros para ser usados a nivel industrial. Una posible solución sería encontrar cepas de levaduras tolerantes a elevadas concentraciones de etanol (Watanabe et al., 2010; Pereira et al., 2011).
Tabla 1 – Resultados de fermentación para boniato fresco y harina de boniato para diferentes relaciones materia seca a agua.
Boniato
Relación materia seca a
agua (p/v)
Tiempo de fermentación
(h) (*)
Etanol (g/L)
Glicerol (g/L)
Conversión de azúcares (%)
(§)
Eficiencia (%) (¶)
Rendimiento industrial (L etanol/t boniato en base
seca)( †)
Rendimiento agroindustrial (L etanol/ha) (#,†)
1:2.2 (‡) 48 100 9 66 92 320 3170
1:5 24 52 7 76 93 370 3670
Fresco
1:8 16 45 8 100 85 490 4790
1:2 48 98 9 77 78 300 2980
1:3 36 97 9 100 93 460 4490
1:5 16 58 7 99 89 420 4170
Harina
1:8 16 38 4 99 84 410 4020
(*) El tiempo de fermentación fue estimado de los perfiles de azúcares y etanol.
(§) Conversión de azúcares calculada en base a los azúcares totales presentes en la materia prima (fresca o harina). (¶) Eficiencia en base a 0.511 g etanol/g azúcares como glucosa.
(†) Calculada usando la densidad del etanol a 20°C (0.7894 g/L).
Figura 1. Perfiles de fermentación (SSF) usando harina de boniato con una relación materia seca a agua (p/v) 1:3. Los azúcares totales se expresan como equivalentes de glucosa.
4. Conclusiones
A pesar del uso de altas concentraciones de azúcares y sólidos durante la fermentación de boniato (fresco y en forma de harina), se alcanzaron elevadas concentraciones de etanol, buenos rendimientos de etanol y conversiones de azúcares casi completas, las cuales contribuyen a reducir el consumo de energía del proceso.
Para una relación de materia seca a agua de 1:8, se encontraron resultados similares para boniato fresco y harina en términos de concentración final de etanol (38 - 45 g/L), tiempo de fermentación (16 h) y conversión de azúcares (~ 100% ). A mayores relaciones materia seca a agua, se encontraron conversiones completas y más rápidas usando harina de boniato. Para una relación 1:3, la concentración de etanol fue 97 g/L luego de 36 h y la conversión de azúcares 100%. Una relación mayor que la correspondiente a boniato fresco sin agregado de agua no mejoró la concentración final de etanol (100 g/L) y los rendimientos. El uso de otras levaduras tolerantes a elevadas concentraciones etanol o la adición de algún nutriente podría mejorar estos parámetros.
De los resultados encontrados en este trabajo, el boniato K 9807.1 genéticamente desarrollado para la producción de bioenergía es una materia prima atractiva para la producción de etanol combustible, ya que se pueden obtener entre 4500 y 4800 L de etanol por hectárea (Tabla 1).
Agradecimientos
Para la realización de este trabajo se recibió apoyo económico del INIA-FPTA-Uruguay (Proyecto 266). Los autores agradecen a Novozymes (Brasil) por la donación de enzimas, y al Dr. Francisco Vilaró por el suministro de boniato y su apoyo durante todo el proyecto.
Referencias
Breisha GZ. Production of 16% ethanol from 35% sucrose. Biomass Bioenerg 2010;34,1243-1249.
Cao Y, Tian H, Yao K, Yuan Y. Simultaneous saccharification and fermentation of sweet potato powder for the production of ethanol under conditions of very high gravity. Front Chem Sci Eng 2011;5(3):318 –324.
Kim K, Hamdy MK. Acid hydrolysis of sweet potato for ethanol production. Biotechnol Bioeng 1985;27:316-320.
Mojović L, Nikolić S, Rakin M, Vukasinović M. Production of bioethanol from corn meal hydrolyzates. Fuel 2006;85:1750–1755.
Shen Y, Guo JS, Chen YP, Zhang HD, Zheng XX, Zhang XM, Bai FW. Application of low-cost algal nitrogen source feeding in fuel ethanol production using high gravity sweet potato medium. J Biotechnol 2012; in press.
Shen Y, Zhang H, Zheng X, Zhang X, Guo J, Chen Y. Very high gravity fermentation using sweet potato for fuel ethanol production. Adv Mat Res 2011;236-238:59-62. Sluiter A, Sluiter J. NREL Biomass Program: Determination of starch in solid biomass
samples by HPLC. Biomass Analysis Technology Team, Laboratory Analytical. 2005; Procedure LAP-016. Department of Energy, United States of America. Srichuwong S, Fujiwara M, Wang X, Seyama T, Shiroma R, Arakane M, Mukojima N,
Tokuyasu K. Simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of very high gravity (VHG) potato mash for the production of ethanol. Biomass Bioenerg 2009;33:890-898.
Srichuwong S, Orikasa T, Matsuki J, Shiina T, Kobayashi T, Tokuyasu K. Sweet potato having a low temperature-gelatinizing as a promising feedstock for bioethanol production. Biomass Bioenerg 2012;39:120-127.
Vilaró F, Vicente E, Pereira G, Rodríguez G. Investigación para producción de etanol
a base de boniato. Available from: http://www.iica.org.uy/index.php?option=com_docman&task=cat_view&gid=88&li
mitstart=5 [accessed 04.17.12].
Watanabe T, Srichuwong S, Arakane M, Tamiya S, Yoshinaga M, Watanabe I, Yamamoto M, Ando A, Tokuyasu K, Nakamura T. Selection of stress-tolerant yeasts for simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of very high gravity (VHG) potato mash to ethanol. Biores Technol 2010;101:9710–9714. Zhang L, Chen Q, Jin Y, Xue H, Guan J, Wang Z, Zhao H. Energy-saving direct
ethanol production from viscosity reduction mash of sweet potato at very high gravity (VHG). Fuel Processing Technol 2010;91:1845-1850.
Zhang L, Zhao H, Gan M, Jin Y, Gao X, Chen Q, Guan J, Wang Z. Application of simultaneous saccharification and fermentation (SSF) from viscosity educing of raw sweet potato for bioethanol production at laboratory, pilot and industrial scales. Biores Technol 2011;102:4573-4579.
Zhao XQ, Bai FW. Yeast flocculation: New story in fuel ethanol production. Biotechnol Adv 2009;27:849–856
