Evaluación de la actividad antimicrobiana del extracto Pinus Radiate ante cepas de Cándida Albicans in vitro

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UNIVERSIDAD REGIONAL AUTÓNOMA DE LOS ANDES “UNIANDES”

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

PROGRAMA DE MAESTRÍA EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO DE MAGÍSTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA

TEMA:

EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO Pinus radiate ANTE CEPAS DE Cándida albicans IN VITRO

AUTORA: BQF. SANTAMARÍA BEDÓN ELIANA JACQUELINE TUTOR: DR. WONG VAZQUEZ LESTER

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APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN

CERTIFICACIÓN

Quienes suscriben, legalmente CERTIFICA QUE: el presente Trabajo de Titulación realizado por la BQF. Santamaría Bedón Eliana Jacqueline, Maestrante del Programa de Maestría en Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, con el tema: “EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO Pinus radiate ANTE CEPAS DE Cándida albicans IN VITRO”, ha sido prolijamente revisado, y cumple con todos los requisitos establecidos en la normativa pertinente a la Universidad Regional Autónoma de los Andes –UNIANDES-, por lo que aprueban su presentación.

Ambato, mayo del 2019

__________________________ DR. WONG VAZQUEZ LESTER

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DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD

Yo, Eliana Jacqueline Santamaría Bedón, maestrante del Programa de Maestría de Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, declaro que todos los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación, previo a la obtención del Grado Académico de MAGÍSTER en FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA, son absolutamente originales, auténticos y personales; a excepción de las citas, por lo que son de exclusiva responsabilidad.

Ambato, mayo del 2019

_____________________________ Eliana Jacqueline Santamaría Bedón C. I. 1804151981

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DERECHOS DE AUTORA

Yo, Eliana Jacqueline Santamaría Bedón, declaro que conozco y acepto la disposición constante en el literal d) del Art. 85 del Estatuto de la Universidad Regional Autónoma de los Andes, que en su parte pertinente textualmente dice: El Patrimonio de la UNIANDES está constituido por… “La propiedad intelectual sobre las investigaciones, trabajos científicos o técnicos, proyectos profesionales y consultoría que se realicen en la Universidad o por cuenta de ella…”

Ambato, mayo del 2019

__________________________________ Eliana Jacqueline Santamaría Bedón C. I. 1804151981

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DEDICATORIA

A Dios, por ser el inspirador y darme fuerza para

continuar en este proceso de obtener uno de los

anhelos más deseados, a él que con su infinito

amor me ha dado la sabiduría suficiente para

culminar mi postgrado.

A mis padres por ser el pilar fundamental con su

apoyo incondicional en los momentos más

difíciles.

A mi esposo e hija por ser las personas que me

inspiran a seguir adelante que siempre ha estado

(6)

AGRADECIMIENTOS

En primera instancia agradezco a mis

formadores, personas profesionales de gran

sabiduría quienes se han esforzado por

ayudarme a llegar al punto en el que me

encuentro.

Gracias por sus conocimientos y dedicación que

me han brindado durante todo este tiempo, he

logrado importantes objetivos como culminar el

desarrollo de mi tesis con éxito y poder obtener

(7)

ÍNDICE GENERAL

APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD

DERECHOS DE AUTORA DEDICATORIA

AGRADECIMIENTOS

ÍNDICES ... 7

RESUMEN ... 13

ABSTRACT ... 14

Introducción ...1

Planteamiento del problema ...2

Formulación del problema ...3

Delimitación del problema ...3

Objeto de investigación ...3

Campo de Acción ...3

Identificación de la línea de investigación ...3

Objetivo general ...3

Objetivos específicos ...3

Hipótesis ...4

Justificación del tema ...4

Metodología ...5

Resumen de la estructura de la tesis ...5

Aporte teórico ...5

Significación práctica ...5

Novedad científica ...6

CAPITULO I...7

1. Marco teórico ...7

(8)

1.2 Análisis de las distintas posiciones teóricas sobre el objeto de

investigación. ...7

1.2.1 Descripción de la planta. ...8

1.3 Metabolitos secundarios. ...11

1.3.1 Definición de metabolitos secundarios ...11

1.3.2 Importancia de los metabolitos secundarios de origen vegetal. ...12

1.3.3 Tipos de metabolitos secundarios ...12

1.4 Extractos...13

1.4.1 Definiciones de extractos...13

1.4.2 Métodos de extracción...13

1.5 Tamizaje fitoquímico del extracto de la planta. ...14

1.6 Cándida Spp ...15

1.6.1 Concepto de Cándida albicans ...15

1.6.2 Factores predisponentes de infección ...15

1.6.3 Factores de patogenicidad ...16

1.6.4 Formas clínicas de infección ...16

1.7 Conclusiones parciales del capítulo I. ...16

CAPITULO II...18

2. Marco metodológico y planteamiento de la propuesta ...18

2.1 Caracterización del sector ...18

2.1.2 Área de estudio ...18

2.2 Descripción de la metodología de la investigación ...18

2.2.1 Tipo de estudio ...18

2.3 Tipo de investigación ...19

2.3.1 Investigación bibliográfica...19

2.3.2 Investigación de campo ...19

(9)

2.4 Metodología, técnicas e instrumentos ...19

2.4.1 Técnicas ...20

2.4.2 Instrumentos y reactivos ...20

2.4.2.1 Materiales de laboratorio ...20

2.4.2.2. Equipos ...20

2.4.2.3. Reactivos ...21

2.5. Elaboración de los Instrumentos de evaluación ...21

2.5.1. Selección de Material Vegetal ...21

2.5.1.1. Recolección de la muestra de hoja de pino ...22

2.6. Obtención de los extractos ...23

2.6.1. Preparación del extracto ...23

CAPITULO III...41

3. Análisis e interpretación de los resultados de investigación ...41

3.1 Resultados de encuestas realizadas, estudio etnofarmacológico. ...41

3.1.1 Porcentajes y edades de las personas encuestadas ...41

3.1.2 Distribución porcentual del sexo de los encuestados ...42

3.2 Preguntas y resultados de las respuestas obtenidas en las encuestas ...43

3.3 Resultados generales ...51

3.3.1 Resultados del estudio in vitro para evaluar la actividad antimicrobiana del extracto de Pinus radiate ante cepas de Cándida albicans. ...53

3.3.2 Resultados del Tamizaje Fitoquímico del Pinus radiate. ...55

3.4 Conclusiones del Capítulo II ...57

4. MARCO PROPOSITIVO...59

4.1 TEMA...59

4.2 INTRODUCCIÓN ...59

4.2.1 OBJETIVOS ...59

(10)

4.2.1.2 Objetivos específicos ...60

4.2.2 Justificación ...60

4.3 Desarrollo de la propuesta...61

4.3.1 Problema a resolver...61

4.3.2 Tipo de paciente ...61

4.3.3 Lugar de desarrollo de la propuesta ...61

4.3.4 Metodología empleada para el desarrollo de la propuesta ...61

4.3 5 Diseño de un protocolo para la utilización del extracto acuoso y aceite esencial de Pinus radiate (Pino) como medicamento alternativo en estudiantes con infecciones micóticas por Cándida albicans de la Universidad Regional Autónoma de los Andes “UNIANDES”...61

4.3.6 Beneficios de la propuesta ...63

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...64

5.1 Conclusiones ...64

5.2 Recomendaciones ...64 BIBLIOGRAFÍA

(11)

ÍNDICE DE TABLAS

(12)

ÍNDICE DE ILUSTRACIONES

Ilustración 1. Pino (Pinus radiata D. Don) ... 7

Ilustración 2. Ubicación de la Parroquia San Juan, cantón Riobamba ... 22

Ilustración 3. Extracción sucesiva del material vegetal para la aplicación de técnicas de Tamizaje Fitoquímico. ... 25

Ilustración 4. Reacciones a realizar en el extracto de éter etílico ... 26

Ilustración 5. Reacciones a realizar en el extracto alcohólico. ... 27

Ilustración 6. Reacciones a realizar en el extracto acuoso. ... 28

Ilustración 7. Obtención de los extractos vegetales ... 33

Ilustración 8. Colocación de los discos de antimicrobiano ... 35

Ilustración 9. Colocación del extracto y aceite esencial ... 36

Ilustración 10. Porcentajes y edades de las personas encuestadas ... 42

Ilustración 11. Distribución porcentual del sexo de los encuestados ... 42

Ilustración 12. Resultado de la pregunta 2 ... 43

Ilustración 13. Resultado de la pregunta 2 ... 43

Ilustración 14. Resultado de la pregunta 3 ... 44

Ilustración 15. Resultado de la pregunta 4 ... 45

Ilustración 16. Resultado de la pregunta 5 ... 46

Ilustración 17. Resultado de la pregunta 6 ... 47

Ilustración 18. Resultado de la pregunta 7 ... 48

Ilustración 19. Resultado de la pregunta 8 ... 49

Ilustración 20. Resultado de la pregunta 9 ... 50

Ilustración 21. Resultado de la pregunta 10 ... 51

Ilustración 22. Resultados generales de encuesta realizada ... 52

Ilustración 23. Promedio de halos de inhibición de extracto etanólico ... 53

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RESUMEN

Se trata de una investigación cuanticualitativa experimental de campo realizada en los laboratorios de la Escuela Superior Politécnica de Chimborazo, perteneciente a la Facultad de Ciencias de la ciudad de Riobamba basada en tres fases; el estudio etnofarmacológico, la obtención de extracto etanólico y del aceite esencial, y el análisis microbiológico de Pinus radiata ante cepas de Cándida albicans.

Se realizó una encuesta donde se evaluó el uso del pino en la provincia de Chimborazo, cantón Riobamba, parroquia San Juan obteniéndose un índice de valor de uso igual a 0,05; lo cual cumple con la aceptación cultural para ser tomada en cuenta en tratamientos de problemas en la salud de una población. Se realizó la marcha fitoquímica para la obtención de los metabolitos secundarios, obteniendo como resultado el extracto etanólico y aceite esencial en una intensidad moderada de reacción. El análisis in vitro mostró contenido de alcaloides, terpenoides, compuestos grasos, cumarinas, taninos, azúcares reductores, flavonoides y mucílagos lo que hace que tenga propiedades anestésicas, antisépticas y antibacterianas.

El análisis in vitro del efecto antibacteriano del extracto y aceite esencial de Pinus radiata ante cepas de Cándida albicans fue similar al uso de Ketoconazol en concentraciones entre 75% y 100% de extracto etanólico y por encima de 25% del aceite esencial.

Mediante un protocolo se destaca el uso del Pinus radiata como una alternativa de la medicina natural para eliminar las infecciones por Cándida albicans en estudiantes de la “UNIANDES”

(14)

ABSTRACT

It is an experimental field quantitative research carried out in the laboratories of the Polytechnic Superior School of Chimborazo, belonging to the Faculty of Sciences of the city of Riobamba based on three phases; the ethnopharmacological study, the obtaining of ethanolic extract and of the essential oil, and the microbiological analysis of Pinus radiata before strains of Candida albicans.

A survey was carried out where the use of pine was evaluated in the province of Chimborazo, Riobamba canton, San Juan parish, obtaining an index of use value equal to 0.05; which complies with the cultural acceptance to be taken into account in the treatment of problems in the health of a population.

The phytochemical march was carried out to obtain the secondary metabolites, obtaining as a result the ethanolic extract and essential oil in a moderate intensity of reaction. The in vitro analysis showed content of alkaloids, terpenoids, fatty compounds, coumarins, tannins, reducing sugars, flavonoids and mucilages which makes it have anesthetic, antiseptic and antibacterial properties.

The in vitro analysis of the antibacterial effect of the extract and essential oil of Pinus radiata before strains of Candida albicans was similar to the use of Ketoconazole in concentrations between 75% and 100% of ethanolic extract and above 25% of the essential oil.

Through a protocol, the use of Pinus radiata as an alternative to natural medicine to eliminate infections by Candida albicans in students of the "UNIANDES" is highlighted.

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1 Introducción

La Medicina Tradicional (MNT) es muy utilizada en diferentes partes del mundo, especialmente en países en vías de desarrollo. Estudios realizados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) plantea que el 80% de la población mundial ha recurrido alguna vez a diferentes formas de la medicina alternativa o complementaria.(1)

Aproximadamente una cuarta parte de los medicamentos modernos se derivan de productos naturales, en tal sentido la Conferencia Internacional sobre Medicina Tradicional para los Países de Asia Sudoriental, celebrada en febrero de 2013, planteó:

“las medicinas tradicionales de calidad, seguridad y eficacia comprobada contribuyen a asegurar el acceso de todas las personas a la atención de salud". (2)

La medicina ancestral, no convencional o tradicional es practicada alrededor del mundo, por tanto, representa una opción significativa ante las necesidades de atención a la salud en diferentes países de América Latina y el Caribe a pesar de su presencia subordinada en los sistemas oficiales de salud (3).

Las organizaciones internacionales de salud como la OMS y la OPS (Organización Panamericana de la Salud) reconocen las tentativas de apoyo y promoción de políticas dirigidas a ensayar distintas maneras de articulación de esta medicina con los sistemas nacionales de salud, aunado a esto, la atención primaria a la salud (4).

Cerca de 500 especies de plantas medicinales son utilizadas por el 80% de la población del Ecuador en la atención primaria de salud (5). Aproximadamente 228 especies son las más empleadas y 125 especies son ampliamente comercializadas para tratar varias enfermedades. Estas prácticas basadas en el conocimiento empírico según la experiencia de los pueblos no han sido validadas científicamente, por lo que existe escasa información al respecto (6).

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2

acción antioxidante; mantiene suave los tejidos conjuntivos y se le atribuyen propiedades antiinflamatorias y anticancerígenos (9).

En el norte de Europa es utilizado como alimento, a partir de la corteza interna se elabora pan, conocido como pan finlandés o “pettu”. Los metabolitos secundarios como son los aceites naturales cineol, borneol y el ácido protocatecuico le proporcionan propiedades antitusivas, expectorantes y sedantes por lo que es muy utilizada en la bronquitis, la tos, el resfriado, la faringitis o la sinusitis (10).

Los metabolitos secundarios del aceite y extracto de las hojas de pino (11) le confiere actividad antibacteriana debido a la presencia de: triterpenoides, flavonoides, fenoles, alcaloides, cumarinas, taninos y esteroides cuyo efecto antimicrobiano sobre cepas patógenas es imputable (12).

Planteamiento del problema

Actualmente el uso indiscriminado de antibióticos ha generado una resistencia antimicrobiana por parte de diferentes microorganismos patógenos poniendo en peligro la prevención y tratamiento de infecciones por virus, bacterias, hongos y parásitos (13) , en tal sentido se mantiene el descontrol, la perpetuidad y la transmisibilidad de las enfermedades (8).

Esta situación ha despertado el interés y la necesidad de buscar nuevas alternativas de tratamientos en la medicina natural que sean más eficaces contra bacterias y hongos causales de patologías en humanos.

A pesar de que el uso de plantas con efectos medicinales está comprobado desde hace millones de años, aún no existe un fitofármaco con posología conocida que impida la proliferación de Cándida albicans causante de infecciones superficiales o sistémicas sobre todo del área mucocutánea, gastrointestinal y genitourinaria en el ser humano sano, siendo capaz de colonizar las membranas mucosas en el 30 a 60 % de las personas. (14)

(17)

3 Formulación del problema

La existencia de metabolitos secundarios del aceite esencial y extractos de Pinus radiata con efecto antibacteriano frente a la Cándida albicans.

Delimitación del problema

 El presente trabajo de investigación se realizó el sector San Juan, provincia Chimborazo, lugar escogido para la recolección de las hojas de Pinus radiata y la aplicación de la encuesta etnofarmacológica.

 En uno de los laboratorios de Escuela Superior Politécnica de Chimborazo, perteneciente a la Facultad de Ciencias de la ciudad de Riobamba se realizó la extracción de los extractos alcohólicos y etéreo y el análisis microbiológico.

Objeto de investigación

Evaluación del efecto antibacteriano del extracto acuoso y aceite esencial del Pinus radiate frente a cepas de Cándida albicans.

Campo de Acción

Actividad antimicrobiana del extracto acuoso y aceite esencial del Pinus radiate frente cepas de Cándida albicans.

Identificación de la línea de investigación Estudios microbiológicos

Objetivo general

Evaluar el efecto antimicrobiano del extracto acuoso y aceite esencial de Pinus radiata ante cepas de Cándida albicans.

Objetivos específicos

(18)

4

 Identificar metabolitos secundarios en extracto de Pinus radiata mediante tamizaje fitoquímico.

 Realizar el análisis in vitro del efecto antibacteriano del extracto y aceite esencial de Pinus radiata frente a cepas de Cándida albicans.

 Determinar el efecto antimicrobiano según concentración de extracto y aceite esencial de Pinus radiata frente a cepas de Cándida albicans.

Hipótesis

Hipótesis nula (Ho): El extracto acuoso y aceite esencial de Pinus radiata no presentan efecto antimicrobiano frente a cepas de Cándida albicans.

Ho: μ = O

Hipótesis alterna (Hi): El extracto acuoso y aceite esencial de Pinus radiata presenta efecto antimicrobiano frente a cepas de Cándida albicans.

Hi: μ ≠ O

Justificación del tema

La propia historia de la humanidad recoge el uso de las plantas medicinales en el tratamiento y cura de disímiles enfermedades, consideradas por muchos de plantas prodigiosas. Debido a ello su uso se ha extendido, desde tiempos ancestrales hasta nuestros días, y su uso se ha extendido hasta países considerados desarrollados donde ven en ella una manera sana de tratar enfermedades rutinarias.

En nuestro país es considerada una de las alternativas para la cura de determinadas enfermedades, además, de ser parte de nuestra cultura e idiosincrasia, actualmente respaldad por diversos estudios que han redescubierto sus propiedades medicinales en el alivio y cura de enfermedades sustituyendo, no pocas veces, a la medicina convencional por su costo beneficio y acciones terapéutica favorables.

(19)

5 Metodología

La investigación tiene un enfoque cualitativo y cuantitativo, tiene una modalidad de campo, documental, bibliográfica, será de tipo experimental, observacional y descriptivo. Para su realización se emplearon tres fases: el estudio etnofarmacológico mediante la aplicación de una encuesta como instrumento; una segunda fase consistente en la obtención de los extractos mediante maceración, y una tercera fase consistente en el análisis microbiológico mediante la técnica de difusión en discos con concentraciones de 100%, 75%, 50% y 25% con un control positivo de Ketoconazol y con el negativo alcohol absoluto al 86%. Estos resultados serán analizados con métodos estadísticos que permitieron establecer conclusiones finales.

Resumen de la estructura de la tesis

Este trabajo de investigación constó de tres capítulos que dieron cumplimiento al objetivo general y responden la pregunta científica: el marco teórico permitió mediante la información obtenida de fuentes bibliográficas la sustentación científica que sustentó la discusión; el marco metodológico, enfocado en el planteamiento y desarrollo de la propuesta de investigación, y el análisis de los resultados, mismo que contiene el estudio etnofarmacológico, e análisis fitoquímico y el análisis microbiológico.

Aporte teórico

El presente trabajo de investigación tiene gran impacto al permitir aumentar los conocimientos ancestrales relativos a las propiedades antimicrobianas del pino; se aportarán elementos pocos conocidos a partir nuevas investigaciones actualizadas acerca de las propiedades in vitro del extracto y aceite esencial de Pinus de Pinus radiata ante cepas de Cándida albicans.

Significación práctica

(20)

6

La investigación tendrá un impacto en la comunidad y en los profesionales de la salud, porque se llegará a conocer los beneficios de la acción antimicrobiana del extracto de Pinus radiata ante cepas de Cándida albicans, para en un futuro tener a disposición un fitofármaco accesible en el control y/o eliminación de este microrganismo con afectación humana.

Finalmente es factible esta investigación científica, por cuanto se cuenta con los conocimientos y herramientas básicas requeridas. Y el acceso a la bibliografía especializada, además se cuenta con los recursos humanos, materiales y financieros necesarios para la realización de este proyecto.

Novedad científica

(21)

7 CAPITULO I

1. Marco teórico

1.1 Origen y evolución del objeto de investigación.

Los pinos son un grupo de plantas vasculares con semilla de origen muy diverso. Estas plantas leñosas aparecieron sobre la tierra hace unos 300 millones de años, en el periodo Carbonífero y se fueron formando a lo largo del Mesozoico (250 a 65 millones de años). Al respecto se considera que en la era Terciaria (hace 65 millones de años) ya existían las 575 especies actuales. (15)

Debido a esto ha sido utilizado desde tiempos remotos debido a sus propiedades medicinales. Las afirmaciones anteriores sugieren que su corteza (contiene taninos y flavonoides) es un excelente antioxidante, mientras que en sus hojas y su aceite esencial se hallan beneficios efectivos utilizados en enfermedades del aparato respiratorio. (8)

El pino es utilizado por la población como un remedio natural para tratar los resfriados, la tos, la gripe, las infecciones respiratorias y pulmonares, además para combatir los refriados, la fiebre, las inflamaciones del tracto urinario o eliminar cálculos renales, biliares o hepáticos.

1.2 Análisis de las distintas posiciones teóricas sobre el objeto de investigación.

Ilustración 1. Pino (Pinus radiata D. Don)

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8 1.2.1 Descripción de la planta.

Árbol perteneciente a la familia Abietáceas, subfamilia Pinaceae, respondiendo al nombre científico de Pinus radiata D; Don de tronco cónico y recto; alcanza una altura de 60 metros y un grosor de un metro, su corteza externa es de color café, agrietada y su corteza interna de color crema- rosáceo, segrega una reina transparente. Su copa es alargada y cónica, monopódica con hojas aciculares en fascículos de tres.

Otros nombres: Pino, pino silvestre, pino candelabro, pino enebral o pino nebral, pino rojal, pino rojo, pino albar, pino blanquillo, pino serrano, pino bermejo (7), pino doméstico, pino piñonero, pino mediterráneo, pino parasol, pí rojal, pí pinyoner, pí melis, leherr, ligu, leu, pinheiro bravo, piñeiro de piñón. (16)

a) Origen y distribución

Es originario de Monterrey, México, donde existen 91 especies de las 575 actuales (8), en Ecuador se encuentra difundido en la Sierra. (7)

b) Requerimientos climáticos

 Altitud: 1800-3500 msnm

 Precipitación: 800-1300 mm

 Temperatura: 11-170C

 Suelo: franco-arenoso, bien drenado, pH neutro a ligeramente ácido, rico en fósforo, boro y zinc.

 Riesgos o peligros: alta humedad atmosférica y suelos anegados; insectos defoliadores (lepidópteros: gusanos medidores, orugas, gusanos enrolladores de hojas, gusanos formadores de bolsas o canastos; ortópteros; langostas) y barrenadores (Coleópteros: escarabajos descortezadores; escarabajos barrenadores; Hymenopteros: avispas de la madera), además existe enfermedades como el damping – off (pudrición basal), quemadura de acículas, manchas de acículas, marchites descendente, muerte descendente, marchites y chancro además, enfermedades micóticas importantes, causadas por Cronartium cerebrum, Fommesannosus, y Armillaria mellea.

 Sobrevida: 22 años.

(23)

9 c) Características botánicas

Es un árbol de tronco erecto con pocas ramificaciones excepto en su la parte superior, donde presenta una copa abierta formada por ramas extendidas de tallos rojos oscuro. Las hojas son aciculares de color verde azulado brillante o verde amarillenta alargadas, gruesas, punzantes y agrupadas en pareja. Sus flores masculinas con estambres peltados, las femeninas se encuentran en conos o estróbilos y su fruto tiene el aspecto de un cono o estróbilo leñoso, grande parecido a una piña, contiene semillas aladas de color negro grisáceo. (7)

d) Características organolépticas

Su madera es de un color blanco claro, con transición gradual hacia el amarillo pálido hacia su centro, aumentando su intensidad a marrón muy pálido; veteado suave con líneas longitudinales oscuras. Textura fina con olor característico a madera resinosa, fragante cuando está fresca. Sabor ausente o no distintivo y brillo medio.

e) Composición química

En las hojas y yemas se encuentra el aceite esencial que cumple una triple función en las plantas: protegerse de las enfermedades (propiedades bactericidas, fungicidas y acaricidas); tóxicos y desagradables para la mayoría de los rumiantes e insectos y para la polinización. Algunos de ellos son: 1.5-5% de bornil acetato, pinenos, borneol, limoneno, terpineno, ocimeno, terpenoides como el alcanfor (aceite esencial de las hojas); trementina (químicamente son hidrocarburos monoterpénicos) de la cual se extrae el aguarrás. Taninos como el ácido ascórbico, butírico, cafeico, caproico, clorogénico y felúrico. Carotenos, hidratos de carbono y flavonoides f) Usos del pino:

Desde la antigüedad el hombre ha utilizado la corteza y raíces del pino para diferentes actividades. Aun es utilizado como alimento, como medicamento, en la ebanistería, como materia prima en la elaboración de cosméticos, textil y artículos de limpieza (7) (11).

(24)

10

circuitos eléctricos, crema para cuerdas de violín incluso como excipiente de espadatrapos (8).

Medicinales: antiinfeccioso, astringente, antipirético, antitusivo, diurético, uricosúrico, expectorante, antinflamatorio, analgésico, antiséptico, mucolítico, , sedante (8).

g) Componentes medicinales

 Aceite esencial: sus hojas y yemas contienen 1.5-5% de bornil acetato, pinenos (α -pineno, β -pineno), borneol, limoneno, terpineno, ocimeno, mirceno, sabineno, terpinoleno, canfeno; Terpenoides como el alcanfor.

 Trementina: de sus hojas y yemas se extrae su aceite esencial llamado aguarrás quienes químicamente corresponde a pinenos o hidrocarburos monoterpénicos (α y β-pineno, canfeno, β-felandreno).

 Colofonia o resina compuesta por ácidos diterpénicos.

 En su corteza se encuentran oligómeros proantocianidícos, 5%; trementina (15-30% de aceite esencial y 70-85% de resina), taninos.

 Ácidos: ascórbico, butírico, cafeico, cáprico, caproico, clorogénico, férulico, protocatecuico, pimárico.

 Compuestos aromáticos: estragol, anetol.

 Carotenos.

 Hidratos de carbono: pinitol, fructuosa, glucosa, sacarosa, maltosa.

 Flavonoides: luteína y quercetina (17). h) Propiedades terapéuticas

 Enfermedades respiratorias: Los aceites esenciales borneol y cineol presentan capacidades antiinflamatorias, antibacterianas, antitusivas y sedantes; por su parte el ácido ascórbico con sus propiedades mucolíticas disuelve la flema por lo que es utilizada en forma de infusión y en inhalaciones.

 Enfermedades renales con oliguria, cistitis, pielitis: debido a su capacidad diurética y desinflamatoria.

 Gota y cálculos biliares por su capacidad diurética y antiinflamatoria.

 Enfermedades osteomioarticulares (reumatismo, golpes). Por las propiedades de sus aceites esenciales como balsámico y antiinflamatorio.

(25)

11

 Trastornos gastrointestinales: Sus flores en forma de infusión es utilizada para el control de las diarreas, los vómitos, dolor abdominal, gastritis, parasitismo intestinal, estreñimiento y trastornos biliares (18).

 Antiinflamatorias y contra el cáncer: debido a su poderosa acción antioxidante de la proantocianidina oligoméricas (flavonoide); mantiene suave los tejidos conjuntivos (19).

 Nutracéutico: el aceite extraído de sus semillas “no es un fármaco, sino un alimento con propiedades farmacológicas”; sus propiedades radican en la presencia de ácido pinolénico y otros compuestos, extraídos desde las semillas del cono del árbol que al ser consumido incrementa el contenido de las hormonas CCK y GLP en la sangre , los cuales son inhibidores naturales del apetito (con un efecto de saciedad, no de rechazo) además, bajo ciertas composiciones disminuye la resistencia a la insulina (efecto sensibilizador) permitiendo retrasar o prevenir la diabetes tipo 2, por tanto este producto en una alternativa eficaz contra el síndrome metabólico (20).

 Antifúngico: extractos fluidos alcohólicos de hojas al 100 y 75 % presentaron actividad antifúngica similar a la nistatina frente al Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis y Trichophyton rubrum (21).

1.3 Metabolitos secundarios.

1.3.1 Definición de metabolitos secundarios

(26)

12

1.3.2 Importancia de los metabolitos secundarios de origen vegetal.

Aunque los metabolitos secundarios no responden a una determinada función son sintetizados en pequeñas cantidades presentando funciones ecológicas específicas como atrayentes o repelentes de animales. Una parte considerable de ellos son pigmentos que proporcionan color a flores y frutos, jugando un papel esencial en la reproducción atrayendo a insectos polinizadores, o atrayendo a animales que van a utilizar los frutos como fuente de alimento, de esta forma, dispersan sus semillas. Otros funcionan como protector frente a predadores, actuando como repelentes, proporcionando a la planta sabores amargos, haciéndolas indigestas o venenosas o como pesticidas naturales.

Además, estos metabolitos presentan un significativo valor medicinal y económico al ser usado en la industria cosmética, alimentaria y farmacéutica como medicamentos, resinas, gomas, potenciadores de sabor, aromas, colorantes

1.3.3 Tipos de metabolitos secundarios

Los terpenos, o terpenoides, constituyen el grupo más numeroso entre los que se encuentran hormonas (giberelinas y ácido abscísico), pigmentos carotenoides (carotenos y xantofilas), esteroles (ergosterol, sitosterol, colesterol), derivados de los esteroles (glicósidos cardiacos), látex y aceites esenciales (proporcionan el olor y el sabor característico de las plantas) de gran importancia para el crecimiento y supervivencia de las plantas

Compuestos fenólicos, también conocido como polifenoles o fenilpropanoides deriva del fenol, un anillo aromático con un grupo hidroxilo, otros como las cumarinas, flavonoides, lignina y taninos le brindan dureza y protección a la planta, aunque pueden ser carcinogénicos potentes para el ser humano por infestación de alimentos o animales de consumo como es el caso de las aflatoxinas.

Los Glicósidos son metabolitos de gran importancia, destacándose las saponinas, los glicósidos cardiacos, los glicósidos cianogénicos y los glucosinolatos muy utilizados en cosmetología y en medicina

(27)

13

utilizados en dosis bajas como relajantes musculares, tranquilizantes, antitusivos o analgésicos. (22)

1.4 Extractos

1.4.1 Definiciones de extractos

Extractos: son preparaciones de consistencia líquida (extractos fluidos y tinturas) o semisólida (extractos blandos o densos), o sólida (extractos secos), obtenidos a partir de drogas vegetales o tejidos animales en estado generalmente seco.

Extractos blandos: son preparaciones semi sólidas obtenidas por evaporación total o parcial de los solventes usados para la extracción.

Extractos secos: es una preparación sólida obtenida por evaporación del solvente usado en su producción; generalmente tiene una pérdida por secado o un contenido de agua no mayor del 5 % m/m.

Extractos fluidos: son preparaciones líquidas tal que una parte por masa o volumen es equivalente a una parte por masa o droga vegetal o tejido animal seco.

1.4.2 Métodos de extracción.

(28)

14

Digestión: es otra forma de maceración con ligero calentamiento (35-40oC) durante el proceso de extracción, sobre todo de partes más dura del vegetal, lográndose una mayor eficiencia en la utilización del menstruo.

Infusión: evita que los aceites volátiles se evaporen a otras temperaturas, para ello se coloca la planta en una cantidad de agua hirviendo por espacio de 15 minutos para luego ser filtrada.

Decocción: es utilizada con el fin de evitar alteraciones de los principios activos de la planta con la temperatura: Consiste en hervir la droga en agua durante de 15 a 60 minutos (según sea la planta o el principio activo a extraer), se enfría, se cuela y se añade suficiente agua fría a través de la droga hasta obtener el volumen deseado.

1.5 Tamizaje fitoquímico del extracto de la planta.

También conocido como screening fitoquímico, es capaz de determinar cualitativamente los principales grupos químicos presentes en una determinada planta, lo que permite, orientar la extracción y/o fraccionamiento de sus extractos para aislarlos de los grupos de mayor interés: reacciones de color y precipitación. a) Ensayo de Dragendorff, Mayer o Wagner (alcaloides): Permite reconocer en un extracto la presencia de alcaloides,

b)Ensayo de Shinoda. (Flavonoides): Permite reconocer la presencia de flavonoides en un extracto de un vegetal.

c) Ensayo de Liebermann-Burchard (triterpenos y/o esteroides): Permite reconocer la presencia de triterpenos y/o esteroides.

d) Ensayo de Borntrager (quinonas): Es útil para detectar la presencia de quinonas

e) Ensayo de Baljet (cumarinas): Es útil para reconocer la presencia de compuestos con agrupamiento lactónico, en cumarinas, aunque otros compuestos lacónicos pueden dar resultado positivo.

f) Ensayo de espuma (saponinas): Permite reconocer en un extracto la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como triterpénica.

(29)

15

h) Ensayo de Fehling (azúcares reductores): Consiente reconocer en un extracto la presencia de azúcares reductores.

i) Ensayo de mucilagos: Permite reconocer en los extractos de vegetales la presencia de esta estructura tipo polisacárido, que forma un coloide hidrófilo de alto índice de masa que aumenta la densidad del agua donde se extrae. (23)

1.6 Cándida Spp

Las especies del género Cándida pueden causar una gran diversidad de formas clínicas incluyendo alrededor de aproximadamente 150 especies, aunque no todas son patógenas para el ser humano las más frecuente son: Cándida albicans, Cándida tropicalis, Cándida glabatra, Cándida parapsilosis, Cándida krusei y Cándida lusitaniae. (24)

1.6.1 Concepto de Cándida albicans

Es un hongo del tipo polimórfico debido a que presentar morfología levaduriforme o porque crece como hongo filamentoso formando hifas verdaderas. Este tipo de hongo es considerado un huésped oportunista que existe como parte de los microorganismos del área mucocutánea, gastrointestinal y genitourinaria en el ser humano sano llegando a colonizar sus membranas mucosas si existen condiciones causando infecciones superficiales y sistémicas, por lo que es considerado el hongo patógeno principal del ser humano. (25)

1.6.2 Factores predisponentes de infección

 Locales: maceración, contacto con agua, mala higiene.

 Fisiológicas: recién nacidos, vejez (edades extremas), embarazo.

 Endocrinas: diabetes, hipotiroidismo.

 Alteración de la flora normal: por uso de antibióticos (ATB).

 Enfermedades hematológicas: linfomas, leucemias, anemia aplásica, agranulocitosis, neutropenia, hipo y agamaglobulinemia.

(30)

16

 Iatrogénicas: uso prolongado de corticoides, quimioterápicos, inmunosupresores, agentes citotóxicos, alimentación parenteral, transplantes, cirugía abdominal, utilización de sondas y catéteres, radioterapia, prótesis, hemodiálisis, cateterismo. (26)

1.6.3 Factores de patogenicidad

a. Capacidad de adherencia a diferentes superficies. b. Producción de enzimas extracelulares.

c. Producción de hifas y pseudohifas. d. Variabilidad fenotípica y antigénica. (26)

1.6.4 Formas clínicas de infección 1. Cutánea

2. Mucocutánea

3. Candidiasis invasiva 4. Alérgica (26)

1.7 Conclusiones parciales del capítulo I.

 Los extractos son preparaciones de consistencia líquida o semisólida o sólida obtenidos a partir de drogas vegetales en estado generalmente seco.

 Los pinos son un grupo de plantas vasculares con más de 300 años de antigüedad con una amplia utilización en diversas patologías; es antinflamatorio, analgésica, astringente, antipirética y uricosurico entre otros. Pertenece a la familia Abietáceas, subfamilia Pinaceae, respondiendo al nombre científico de Pinus radiata D; alcanza una altura de 60 metros y un grosor de un metro, su corteza externa es de color café, agrietada y su corteza interna de color crema- rosáceo, segrega una reina transparente. Su copa es alargada y cónica, monopódica con hojas aciculares en fascículos de tres.

(31)

17

en el ser humano sano llegando a causar infecciones superficiales y sistémicas.

 El índice de valor de uso muestra la cantidad promedio de usos que se otorga a una determinada planta mediante entrevistas a las personas que las usan.

 El nivel de uso significativo es la evaluación cuantitativa de la diversidad de especies importante porque define cual especie debe ser investigada.

 Para realizar el análisis etnobotánico es necesario el empleo de 3 índices: índice de valor de uso de especies (IVU); conocimiento relativo de la especie por varios informantes (RVU); nivel de uso significativo.

(32)

18 CAPITULO II

2. Marco metodológico y planteamiento de la propuesta

2.1 Caracterización del sector

2.1.2 Área de estudio

La presente investigación se realizó en la provincia de Chimborazo, específicamente en:

Provincia de Chimborazo, cantón Riobamba, parroquia San Juan. Lugar de recolección de las hojas de Pinus radiata y el cuestionario

etnofarmacológico.

Provincia de Chimborazo, cantón Riobamba.

Laboratorio de Escuela Superior Politécnica de Chimborazo, perteneciente a la Facultad de Ciencias de la ciudad de Riobamba, localizada en Panamericana Sur Km 1 ½. Extracción de los extractos alcohólico, etéreo y realización del tamizaje fitoquímico.

2.2 Descripción de la metodología de la investigación

La actividad antimicrobiana frente a cepas de Cándida albicans fue evaluada en tres fases: el estudio etnofarmacológico, la obtención de los extractos y el análisis microbiológico que permitió mediante la determinación de la concentración mínima inhibitoria, consistente en establecer la menor concentración de un antibiótico capaz de inhibir el crecimiento de un microorganismo,

2.2.1 Tipo de estudio

Según su metodología es una investigación “Cualicuantitativa” modalidades que se detallan a continuación.

(33)

19

Cuantitativa. - porque se realiza un análisis causal físico, químico y microbiológico de las hojas del Pinus radiata a través de la recogida y recopilación de datos que permita su cuantificación estadística.

Experimental. - porquedetermina la relación entre las variables y los resultados obtenidos a través de los procedimientos realizados.

Prospectivo: - porque se registraron los resultados obtenidos a partir de la fecha de análisis.

Exploratoria. - debido a que tiene por objeto esencial la familiarización con un fenómeno desconocido o poco estudiado, en este caso con los principios activos que contiene la planta, análisis físico- químico y microbiológico.

2.3 Tipo de investigación

2.3.1 Investigación bibliográfica

En esta investigación trabajo se utilizó la investigación bibliográfica. Este tipo de investigación nos permitió el análisis de los contextos obtenidos de libros, tesis, artículos científicos, revistas, folletos y otras fuentes, así se obtuvieron ideas claras de lo que se está investigando.

2.3.2 Investigación de campo

Mediante la investigación de campo se realizó una encuesta acerca del tema investigativo donde se pudo determinar el nivel de conocimiento, formas de preparación y usos de las diferentes partes del pino.

2.3.3 Investigación experimental

Mediante diferentes técnicas realizadas en el laboratorio de la Escuela Superior Politécnica de Chimborazo, Facultad de Ciencias de la ciudad de Riobamba, se pudieron extraer los extractos necesarios que fueron utilizados para valorar el crecimiento de la Cándida albicans.

2.4 Metodología, técnicas e instrumentos

(34)

20

de la muestra de las hojas de Pinus radiata, para ello se aplicaron criterios de inclusión y de exclusión para la obtención de los extractos, luego las muestras seleccionadas fueron llevadas al Laboratorio de Ciencias Naturales de la Escuela Superior Politécnica de Chimborazo (EPOCH), donde se realizaron los estudios fitoquímicos.

2.4.1 Técnicas

Se realizó una observación de campo mediante la aplicación de una encuesta a la población acerca del uso del Pinus radiate como planta medicinal. La encuesta estuvo conformada por dos partes, la primera parte es la del consentimiento informado (Anexo 1), la segunda parte es la evaluación de conocimiento mediante la aplicación de una encuesta (Anexo 2)

2.4.2 Instrumentos y reactivos

2.4.2.1 Materiales de laboratorio

 Mechero

 Matraz aforado

 Tubos de ensayos

 Mortero + pistilo

 Probeta de 100 ml

 Crisol

 Gradillas

 Balones aforados 10, 25,100 ml

 Vasos de precipitación 50, 100, 250 ml

 Cápsula de porcelana

 Embudos

2.4.2.2. Equipos

 Estufa

 Rotavapor

 Balanza analítica

(35)

21

 Computadora

 Impresora

2.4.2.3. Reactivos

 Ácido clorhídrico

 Cloruro de sodio (0,9%)

 Reactivo de Mayer

 Reactivo de Wagner

 Hidróxido de sodio

 Hidróxido de potasio

 Ácido sulfúrico concentrado

 Anhidro acético

 Carbonato de Sodio

 Reactivo de Fehling

 Tricloruro Férrico al 5%

 Acetato de Sodio

 Ácido clorhídrico concentrado

 Magnesio Metálico

 Reactivo de Dragendorff

 Colorante de Sudan.

2.5. Elaboración de los Instrumentos de evaluación

2.5.1. Selección de Material Vegetal

Los estudios de tipo etnobotánicos y etnofarmacológico de las especies vegetales que son utilizados como fitoterapia, requiere de un considerado protocolo de trabajo que se encuentra ajustado a pruebas y ensayos, mismo que comienza desde el momento que se selecciona la planta, parte escogida, así como los diferentes tipos de ensayos farmacológicos, químicos, fotoquímicos, toxicológicos y clínicos que permitan su utilización como

(36)

22

2.5.1.1. Recolección de la muestra de hoja de pino

Para la recolección de la muestra vegetal:Hojas verdes de Pino (Pinus radiate), se tuvo en cuenta que estuviera libres de placas, pesticidas y putrefacción. Las hojas fueron recolectadas en la Parroquia San Juan, localizada en las faldas del Nevado Chimborazo, ubicada en el cantón Riobamba, provincia Chimborazo. Para la recolección, se identificó a la especie vegetal, de acuerdo a las características botánicas, descritas en la bibliografía, la misma se realizó de forma manual, obteniendo una muestra representativa en fresco (horas de la mañana, sin rocío, usando tijeras y cortes sesgos), durante el mes de noviembre de 2017 (final de la primavera; momento óptimo para la recolección). Se recolectaron aproximadamente 500 gramos que se colocaron en bolsas de papel, con su respectiva identificación (nombre común, científico, fecha, lugar).

Ilustración 2. Ubicación de la Parroquia San Juan, cantón Riobamba Fuente: Wikipedia (27)

Criterios de inclusión

Selección de las hojas verdes de Pinus radiate sanas.

Criterios de exclusión

(37)

23

Posterior a la recolección de la muestra vegetal de Pinus radiate se tendrá en cuenta a toda la población de parroquia de San Juan a la cual se les aplicará la encuesta etnofarmacológica.

Para la encuesta se escogieron como muestra a 150 personas comprendidas en el grupo etario 30 a 65 años.

La fórmula utilizada para determinar la cantidad de personas participantes se realizó a través de la siguiente fórmula:

n= K2NPQ / e2 (n-1) + K2PQ Dónde:

N = Población

P = Probabilidad de éxito (0.5) Q = Probabilidad de fracaso (0.5)

K = Coeficiente de Nivel de Confianza del 95% (2) E = 10% (0.1)

Realizando la operación matemática obtendremos el siguiente resultado:

n= (2)2150(0,5) (0,5) / (0,1)2 (100-1) +(2)2(0,5) (0,5) n= 150/2.49

n= 60.24 = 60

La cantidad a evaluar fue de 60 hombres y mujeres, a las cuales se les aplicó la encuesta consistente en diez preguntas referentes al uso y conocimiento del Pinus radiate como planta de uso medicinal.

2.6. Obtención de los extractos

2.6.1. Preparación del extracto a) Estabilización de la muestra

(38)

24 b) Lavado

Luego de seleccionar la droga vegetal en buen estado. Se procedió a su limpieza con agua común, para la eliminación de residuos de tierra, polvo u otro material, se sumergió a la droga en agua común por 10 minutos repitiéndose el proceso en tres ocasiones y utilizándose agua destilada para la tercera lavada, posteriormente se colocó la droga limpia sin exceso de agua en un lugar fresco y seco, espaciándola adecuadamente sobre un periódico colocando los tallos separados unos de otros para evitar la formación de mohos durante un período de 24 horas (28).

c) Secado

De las plantas recolectadas se escogen las más propicias para el secado del exceso de agua, para ello se utilizan toallas absorbentes.

Secado a la sombra:

El secado es más lento, pero es recomendado para plantas medicinales y que contienen gran cantidad de aceites esenciales como es el caso del Pino

 Amarrar varios tallos en manojo usando una liga con cuidado que las hojas queden mirando hacia abajo.

 Se colgaron en un lugar con ventilación libre de humedad.

 Evitar la luz del sol (29). d) Molienda

 Tomar 100 a 150 gr de planta seca.

 Colocar en el molino a razón de 30 gramos por molienda.

 Recolectar en papel aluminio o fundas herméticas.

 Guardar en lugar fresco seco y libre de humedad (28). e) Procedimiento para el tamizaje

(39)

25

Ilustración 3. Extracción sucesiva del material vegetal para la aplicación de técnicas de Tamizaje Fitoquímico.

Posteriormente, en cada extracto por separado, se procedió de acuerdo a los esquemas representados en las ilustraciones 4, 5 y 6.

(40)

26 PROCESOS DE MACERACIÓN

EXTRACTO ETÉREO

 Se colocaron de 50 a 60 gramos de la planta previamente seca y molida con suficiente éter en un frasco hermético.

 Se dejó reposar por 48 horas.

 Filtrar y guardar el extracto.

 Medir el volumen y calcular la concentración.

 El residuo sólido se secó y pesó. EXTRACTO ALCOHOLICO

 Colocar el residuo sólido seco de la parte etérea, con tres veces el peso del residuo en volumen con etanol.

 Dejar reposar por 48 horas.

 Filtrar y guardar el extracto alcohólico obtenido.

 Medir el volumen y calcular la concentración.

 El residuo sólido secar pesar. EXTRACTO ACUOSO

 Colocar el residuo sólido seco de la parte alcohólica, con tres veces el peso del residuo en volumen con agua destilada.

 Dejar reposar por 48 horas.

 Filtrar y guardar el extracto acuoso obtenido.

 Medir el volumen y calcular la concentración del extracto.

 El residuo sólido secar, pesar y desechar (31).

PROCESO ANÁLISIS FITOQUIMICO PRELIMINAR (EXTRACTO ETÉREO) Ilustración 4. Reacciones a realizar en el extracto de éter etílico

(TRITERPENOS-ESTEROIDES) ENSAYO DE LIEBERMANN-BUCHARD

5 mL (LACTONAS Y COUMARINAS)ENSAYO DE BALJET

5 mL

(ALCALOIDES) MAYER Y WAGNER

ENSAYOS DE DRAGENDORFF15 mL (dividir en 3 porciones) (ACEITES Y GRASAS)

ENSAYO DE SUDAN5 mL

(41)

27

Ensayo de Sudan: Permitió reconocer en el extracto la presencia de compuestos grasos, para ello, a la alícuota de la fracción en el solvente de extracción, se le añadió 1 mL de una solución diluida en agua del colorante Sudán III o Sudán IV. Se calentó en baño de agua hasta evaporación del solvente.

La presencia de compuestos grasos se consideró positiva al aparecen gotas o una película coloreada de rojo en el seno del líquido o en las paredes del tubo de ensayos respectivamente (32).

EXTRACTO ALCOHÓLICO

Ilustración 5. Reacciones a realizar en el extracto alcohólico.

Ensayo de Dragendorff: Permitió reconocer en el extracto la presencia de alcaloides, para ello, si la alícuota del extracto estaba disuelta en un solvente orgánico se procedió a su evaporación en baño de agua y el residuo se redisolvió en 1 mL de ácido clorhídrico al 1% en agua. Si el extracto fue acuoso, a la alícuota se le añadió 1 gota de ácido clorhídrico concentrado, (calentado suavemente y dejado enfriar hasta acidez). Con la solución acuosa ácida se realizó el ensayo, añadiendo 3 gotas del reactivo de Dragendorff, si apareció opalescencia se consideró: (+), turbidez definida (++), precipitado (+++) (33). Ensayo de Mayer: Procediendo de la forma descrita anteriormente, hasta obtener la solución ácida. Se añadió una pizca de cloruro de sodio en polvo, se agitó y se filtró. Luego se añadieron 2 ó 3 gotas de la solución reactiva de Mayer,

EXTRACTO ALCOHÓLICO

DIVIDIR EN FRACCIONES

1mL ENSAYO DE CATEQUINAS 2 mL ENSAYO DE RESINAS 2 mL ENSAYO DE FEHLING (AZ. REDUCTORES) 2 mL ENSAYO DE BALJET

(LACTONAS) 2 mL ENSAYO DE LIEBERMAN-BUCHARD (TRITERPENOS-ESTEROIDES) 2 mL ENSAYO ESPUMA (SAPONINAS) 2 mL ENSAYO DE Cl 3Fe (FENOLES Y TANINOS)

2 mL ENSAYO DE NINHIDRINA (AMINOÁCIDOS) 2 mL ENSAYO DE BORNTRAGER (QUINONAS) 2 mL ENSAYO DE SHINODA (FLAVONOIDES) 2 mL ENSAYO DE KEDDE (CARDENÓLIDOS) 2 mL ENSAYO DE ANTOCIANIDINA (ALCALOIDES) MAYER Y WAGNER ENSAYOS DE DRAGENDORFF

(42)

28

si se observó opalescencia (+); Turbidez definida (++); precipitado coposo (+++) (34).

Observación: En el caso de alcaloides cuaternarios y/o amino-óxidos libres, éstos solo se encontrarán en el extracto acuoso y para considerar su presencia la reacción debe ser (++) ó (+++), en todos los casos, ya que un resultado (+), puede provenir de una extracción incompleta de bases primarias, secundarias o terciarias.

EXTRACTO ACUOSO

Ilustración 6. Reacciones a realizar en el extracto acuoso.

Ensayo de Wagner: Similar a los casos anteriores de la solución ácida, se añadieron 2 ó 3 gotas del reactivo, si se observó opalescencia (+); turbidez definida (++); precipitado coposo (+++).

Ensayo de Baljet: Permitió reconocer en un extracto la presencia de compuestos con agrupamiento lactónico, en particular Coumarinas, aunque otros compuestos lactónico pueden dar positivo al ensayo.

Para ello, si la alícuota del extracto no se encuentra en alcohol, debe evaporarse el solvente en baño de agua y redisolverse en la menor cantidad de alcohol (1 mL). En estas condiciones se adiciona 1mL del reactivo, considerándose un ensayo positivo la aparición de coloración o precipitado rojo (++ y +++) respectivamente.

El reactivo de Baljet se preparó de la siguiente forma:

EXTRACTO ACUOSO

6 ML en 3 porciones

ENSAYOS DE DRAGENDORFF MAYER Y WAGNER

(ALCALOIDES)

2 mL

ENSAYO DE CLORURO FÉRRICO

(TANINOS)

2 mL

ENSAYO DE SHINODA (FLAVONOIDES)

2 mL ENSAYO DE FEHLING

(AZ. REDUCTORES)

2 mL ENSAYO DE ESPUMA

(SAPONINAS) 10 mL ENSAYO DE

MUCÍLAGOS

(43)

29

Solución 1: Hidróxido de sodio al 10% en agua. Solución 2: Ácido pícrico al 1% en etanol.

Las soluciones se tuvieron preparadas de forma independiente y se mezclaron con igual cantidad en volumen de cada una de ellas justo en el momento de realizar el ensayo. Dicha mezcla es la que se adicionó a la alícuota a evaluar (35).

Ensayo de Hidroxamato férrico para Coumarinas: Una gota del extracto se colocó en una placa de porcelana y se añadió una gota de clorhidrato de hidroxilamina disuelto en etanol al 10%. Se añadieron unas gotas de hidróxido de potasio al 10% en etanol y se calentó a la llama hasta burbujeo, se añadieron unas gotas de ácido clorhídrico 0.5 mol/L y una gota de cloruro férrico al 1% en agua. El desarrollo de una coloración violeta (+), claro (++), intenso (+++) fue tomado como reacción positiva (36).

Ensayo de Borntrager: Permitió reconocer en un extracto la presencia de quinonas. Para ello si la alícuota del extracto no se encuentra en cloroformo, debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de cloroformo. Se adicionó 1 mL de hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amonio al 5 % en agua. Se agita mezclando las fases y se dejó en reposo hasta su ulterior separación. Si la fase acuosa alcalina (superior) se coloreo de rosado o rojo, el ensayo se consideró positivo. Coloración rosada (++); coloración roja (+++) (37).

Ensayo de Liebermann-Burchard: Permitió reconocer en un extracto la presencia de triterpenos y/o esteroides, por ambos tipos de productos poseer un núcleo del androstano, generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6. Para ello, si la alícuota del extracto no se encuentra en cloroformo, debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de cloroformo. Se adicionó 1 mL de anhídrido acético y se mezcló bien. Por la pared del tubo de ensayos se dejaron resbalar 2-3 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar. Un ensayo positivo se tiene por un cambio rápido de coloración: 1- Rosado-azul muy rápido.

(44)

30

A veces el ensayo quedó en dos fases o desarrollo de color. Muy pocas veces pudo observarse el primer cambio. El tercer cambio generalmente ocurrió cuando el material evaluado tiene cantidades importantes de estos compuestos. Es necesario tener en cuenta que para la realización de este ensayo no puede haber agua en el medio de reacción pues ésta con el ácido sulfúrico reacciona de forma violenta y puede ocurrir un accidente.

La reacción de Liebermann-Burchard se emplea también para diferenciar las estructuras esteroidales de los triterpenoides, las primeras producen coloraciones azules o azul verdoso, mientras que para las segundas se observa rojo, rosado o púrpura. Estas coloraciones pueden variar por interferencias producidas por carotenos, xantofilas y esteroides saturados que puedan estar presentes (38).

Ensayo de catequinas: Para ello, tome de la solución alcohólica obtenida una gota, con la ayuda de un capilar y aplique la solución sobre papel de filtro. Sobre la mancha aplique solución de carbonato de sodio. La aparición de una mancha verde carmelita a la luz UV, indicó un ensayo positivo (39).

Ensayo de resinas: Para detectar este tipo de compuesto, adicione a 2 mL de la solución alcohólica, 10 mL de agua destilada. La aparición de un precipitado, indica un ensayo positivo.

Ensayo de Fehling: Permitió reconocer en un extracto la presencia de azúcares reductores. Para ello, si la alícuota del extracto no se encuentra en agua, debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1-2 mL de agua. Se adicionaron 2 mL del reactivo y se calentó la mezcla en baño de agua 5-10 minutos. El ensayo se consideró positivo si la solución se coloreo o apareció precipitado rojo (40).

Ensayo de la espuma: Permitió reconocer en un extracto la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como triterpénica. De modo que, si la alícuota se encuentra en alcohol, se diluye con 5 veces su volumen en agua y se agita la mezcla fuertemente durante 5-10 minutos.

El ensayo se consideró positivo si apareció espuma en la superficie del líquido de más de 2 mm de altura y persistente por más de 2 minutos (34).

(45)

31

extracto alcohólico se le adicionaron 3 gotas de una solución de tricloruro férrico al 5 % en solución salina fisiológica (cloruro de sodio al 0.9 % en agua). Si el extracto es acuoso, el ensayo determina fundamentalmente taninos. A una alícuota del extracto se añadió acetato de sodio para neutralizar y tres gotas de una solución de tricloruro férrico al 5 % en solución salina fisiológica, un ensayo positivo puede dar la siguiente información general:

 Desarrollo de una coloración rojo-vino, compuestos fenólicos en general.

 Desarrollo de una coloración verde intensa, taninos del tipo pirocatecólicos.

 Desarrollo de una coloración azul, taninos del tipo piro galotánicos (41). Ensayo de Shinoda: Permitió reconocer la presencia de flavonoides en un extracto de un vegetal. Si la alícuota del extracto se encuentra en alcohol, se diluye con 1 mL de ácido clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico. Después de la reacción se espera 5 minutos, se añade 1 mL de alcohol amílico, se mezclan las fases y se deja reposar hasta que se separen. Si la alícuota del extracto se encuentra en agua, se procede de igual forma, a partir de la adición del ácido clorhídrico concentrado. Se considera positivo, cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo; intensos en todos los casos (33).

Ensayo de Quede: Permitió reconocer en un extracto la presencia de glicósidos cardiotónicos. Una alícuota del extracto en etanol se mezcló con 1 mL del reactivo y se dejó reposar durante 5-10 minutos. Un ensayo positivo es en el que desarrolla una coloración violáceo persistente durante 1-2 horas.

El reactivo de Quede se preparó de la siguiente forma:

 Solución 1: Ácido 3.5 dinitrobenzóico al 2 % en metanol.

 Solución 2: Hidróxido de potasio al 5.7 % en agua.

Las soluciones se tienen preparadas de forma independiente y se mezclan igual cantidad en volumen de cada una de ellas justo en el momento de realizar el ensayo. Dicha mezcla es la que se adiciona a la alícuota a evaluar (42).

(46)

32

Se agitó y se dejó separar las dos fases. La aparición de color rojo a marrón en la fase amílica fue indicativa de un ensayo positivo (43).

Ensayo de mucílagos: Permitió reconocer en los extractos de vegetales la presencia de esta estructura tipo polisacárido, que forma un coloide hidrófilo de alto índice de masa que aumenta la densidad del agua donde se extrae. Para ello una alícuota del extracto en agua se enfrío a 0-5 pc y si la solución tomo una consistencia gelatinosa el ensayo fue considerado positivo (44).

Ensayo de principios amargos y astringentes: El ensayo se realiza saboreando 1 gota del extracto acuoso o del vegetal y reconociendo el sabor de cada uno de estos principios, bien diferenciados al paladar (45).

f) Obtención de extractos vegetales Materiales

 Soporte universal

 Pinzas Fisher

 Reverbero

 Mangueras de Hule

 Balón de fondo plano de 500ml

 Dean Stark

 Balanza

Se colecta el follaje en los sitios determinados y se traslada al laboratorio para la obtención del extracto.

1. Se arma el sistema (figura 5).

2. Se agrega 300 ml. de agua en el matraz de 500 ml con 200g de muestra vegetal fresca.

3. Se coloca los núcleos de ebullición dentro del matraz generador de vapor. 4. Se colocan las mangueras para el paso del agua.

5. Se calienta el matraz y el material recolectado en el Dean stark se separa por división en fases.

6. Se realiza el cálculo del porciento de rendimiento según la siguiente fórmula:

(47)

33

% 𝐝𝐞 𝐫𝐞𝐧𝐝𝐢𝐦𝐢𝐞𝐧𝐭𝐨 = 𝟎. 𝟕

𝟐𝟎𝟎 ∗ 𝟏𝟎𝟎

Ilustración 7. Obtención de los extractos vegetales

g) Determinación de la actividad antimicrobiana por el método Agar dextrosa Sabouraud

Preparación Agar Dextrosa Sabouraud

 Disolver 65,5 g de medio en 1 litro de agua destilada.

 Calentar hasta ebullición, agitando para su completa disolución

 Tapar el Erlenmeyer y llevar a auto clavar a 121ºC por 15 minutos o 116ºC por 10 minutos.

 Dejar enfriar las placas.

Siembra de Agar Dextrosa Sabouraud

 Método de difusión en agar

CANTIDAD DE

MUESTRA(g) ml

% de

rendimiento

(48)

34

Esta prueba se basó en la inhibición del crecimiento fúngico, mediante la difusión de las sustancias activas en un medio sólido y se evidencia por la formación de halos claros alrededor de las colonias.

a) Hongos

Cándida albicans (ATTCC 10231), cepa proveniente del laboratorio “BIOLAB” en la ciudad de Riobamba, sector la Dolorosa.

b) Preparación del inoculo

Para la preparación de la suspensión del inoculo, se usaron microorganismos crecidos en Agar Dextrosa Sabouraud de 48 horas para Cándida albicans. Se suspendieron los microorganismos en solución salina 0,85% estéril, hasta lograr un inoculo de 1 x 106 ufc/mL, acorde a la turbidez.

Preparación e inoculación de las placas

 En medio agar dextrosa Sabouraud previamente reconstituido, esterilizado y mantenido a 45 ºC.

 Inocular con 1 ml de suspensión de inoculo (1 x 106 ufc/mL.) por cada 100mL de medio, homogenizado.

 Distribuir en Placas Petri de 90 mm de diámetro a razón de 20mL por placa.

 Dejar solidificar y se rotuló con el nombre del microorganismo. Preparación de los discos de papel filtro (extractos alcohólicos)

Se utilizaron discos de papel filtro con peso de 30 ± 4 mg/cm2 con un diámetro de 6.35 mm con la ayuda de una perforadora de papel.

Se separaron los discos en cuatro grupos y se cargaron los extractos alcohólicos de pino en las siguientes concentraciones.

 25%

 50%

 75%

 100%

Preparación de las concentraciones.

El presente cálculo inicia desde el volumen obtenido de solución de extracto de Pinus radiata (100 ml). Para esto se aplicó la siguiente fórmula:

(49)

35 Despejando V1 se obtuvo:

V1= C2*V2/ C1 Donde:

C1 = equivale al 100% de la concentración inicial

C2 = concentración a la que queremos llegar, 25%, 50%, 75% y 100%

V1 = cantidad de ml de alcohol que debemos añadir para las concentraciones V2 = Cantidad inicial en ml (100 ml)

Esta ecuación fue aplicada para el cálculo de los volúmenes de alcohol según las concentraciones requeridas.

Con el uso de una micropipeta se procedió a colocar en cada papel filtro la disolución respectiva del extracto y aceite esencial.

a) Colocación de los discos de antimicrobiano

 Colocar los discos máximo 15 minutos tras la inoculación en las placas.

 Aplicarlos con la ayuda de una pinza como se muestra en la ilustración 8.

 Realizar el procedimiento por triplicado

 Observar los halos de inhibición formados tras la incubación de 24 horas a 37ºC.

Ilustración 8. Colocación de los discos de antimicrobiano

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Ilustración 9. Colocación del extracto y aceite esencial

Fuente: Autora b) Controles

Para el ensayo se usaron como controles positivos ketoconazol y alcohol absoluto.

Las pruebas se realizaron por cuadruplicado. c) Lecturas e interpretación de resultados

Se observaron las zonas claras de inhibición de crecimiento (halos). Los diámetros se midieron en milímetros.

Se consideró actividad antifúngica significativa a un halo de inhibición mayor al de control (ketoconazol.

Pruebas de sensibilidad a antifúngicos con ketoconazol y alcohol absoluto Las pruebas de sensibilidad tienen como objetivo conocer si los microorganismos ensayados son sensibles o resistentes a los antimicrobianos, y sirven para elegir de forma óptima el tratamiento anti fúngico.

PROCEDIMIENTO DE DIFUSIÓN EN AGAR CON DISCO

 Se inoculó el microorganismo en la superficie del agar.

 Se depositó un disco con una concentración conocida al antimicrobiano.

 Disco de ketoconazol en la parte superior y de alcohol absoluto en la parte inferior

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 Observar el aparecimiento de la zona de inhibición de crecimiento alrededor del disco.

 Dependiendo del tamaño de la zona se puede determinar si el microorganismo es sensible, intermedio, indeterminado o resistente al antimicrobiano.

Se utilizó el ketoconazol como prueba positiva y etanol al 86 % para descartar la interferencia del solvente.

Evaluación cuantitativa de la diversidad de especies.

 Valor de Uso de las Plantas

Según Martín (46) y Phillips y Gentry (47), trabajando en la amazonia peruana propusieron un nuevo enfoque al valor de uso. Estos autores basaron sus evaluaciones de la importancia cultural en una técnica del índice de informante, relacionado con las coincidencias entre la gente local acerca de la utilidad de las distintas especies.

Martín sugiere que no todos los usos tienen igual importancia debido al significado cultural que tienen muchas plantas, sin embargo, pueden mostrar un valor de uso bajo en relación a otras, debido al poco conocimiento de sus otros usos.

Debido a estos enunciados muchas plantas del trópico, cuyo uso está restringido a la alimentación humana o animal, presentan gran diversidad de usos: medicinal, control biológico y colorantes entre otros.

 Índice de valor de uso (IVU)

Para evaluar las preferencias del pueblo hacia las plantas utilizadas Philips y Gentry empleó el concepto de “Valor de Uso”. Esta valoración muestra la cantidad de usos que se otorga a una determinada planta. Para su determinación se realizaron entrevistas a tres informantes acerca de los nombres y usos locales de las plantas, cada vez que un informante indicaba un uso se catalogaba como evento.

La fórmula es la siguiente:

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