Correlación de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico de hongos filamentosos aislados de la planta Espeletia
barclayana
ZULMA ASTRID MORENO
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para obtener el título de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
Bogotá, D.C. 2000
Correlación de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico de hongos filamentosos aislados de la planta Espeletia
barclayana
ZULMA ASTRID MORENO
______________________________
RUBEN DARIO TORRENEGRA Director.
Docente Pontificia Universidad Javeriana
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
Bogotá, D.C. 2000
Correlación de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico de hongos filamentosos aislados de la planta Espeletia
barclayana
________________________
Dr. Carlos Corredor Ph.D Decano Académico Facultad de Ciencias
_____________________________
Dra. Aura Rosa Manascero Gómez M.Sc.
Directora Carrera de Microbiología Industrial
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
Bogotá, D.C. 2000
NOTA DE ACEPTACION
___________________________
Presidente del jurado
___________________________
Dra. Mary Santaella de Martinez.
Jurado 1.
___________________________
Dr. Martín Bayona.
Jurado 2.
Bogotá, D.C. Noviembre 2000
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la resolución número 13 de Julio de 1964; “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus tesis de Grado”.
AGRADECIMIENTOS
Dedico éste triunfo a mi madre Mery Muñoz de Moreno, a mi hermano Zahir Moreno Muñoz, a mi tía Flordelina Muñoz Pulido, a mis demás familiares y amigos que de una u otra manera me apoyaron incondicionalmente en los momentos difíciles.
A Nelly Diaz Puentes y Ruben Darío Torrenegra quienes estuvieron con su apoyo y amistad, en cada uno de los momentos de este trabajo.
Agradezco a todas las personas que me colaboraron en el presente trabajo de grado, Dra. Beatriz Galvis de Colmenares, Bacterióloga del Laboratorio de Salud Pública de Cundinamarca por su colaboración en el préstamo de material de vidrio y a los demás integrantes del Grupo de Biotransformación del Departamento de Química de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana, (GIBUJ).
En general a todas las personas que permitieron la realización de éste trabajo.
A todos mi más sincero agradecimientos.
DEDICATORIA
Las circunstancias son buenas o malas según la fortaleza y la voluntad del corazón, por eso doy gracias al Todo Poderoso por haberme brindado la paciencia y la fortaleza, en la búsqueda de esta verdad.
ZULMA ASTRID MORENO MUÑOZ
TABLA DE CONTENIDO
Pág
1. INTRODUCCION. 21
2. MARCO TEORICO 24
2.1. Generalidades 24
2.2. Algunos Hongos filamentosos 35
2.2.1. Mucor sp. 35
2.2.1.1. Morfología Macroscópica 35
2.2.1.2. Morfología Microscópica 35
2.2.1.3. Aplicación Industrial 36
2.2.2. Curvularia sp. 38
2.2.2.1 Morfología Macroscópica 38
2.2.2.2. Morfología Microscópica 38
2.2.2.3. Hábitat 39
2.2.2.4. Aplicación Industrial 39
2.2.3. Alternaria sp. 39
2.2.3.1. Morfología Macroscópica 40
2.2.3.2. Morfología Microscópica 40
2.2.3.3. Hábitat 40
2.2.3.4 Aplicación Industrial 41
2.2.4 Cladosporium sp. 41
2.2.4.1 Morfología Macroscópica 41
2.2.4.2. Morfología Microscópica 42
2.2.4.3. Hábitat 42
2.2.4.4. Aplicación Industrial 42
2.2.5. Nigrospora sp. 44
2.2.5.1. Morfología Macroscópica 44
2.2.5.2. Morfología Microscópica 44
2.2.5.3. Hábitat 45
2.2.5.4. Aplicación Industrial 45
2.2.6. Acremonium sp. 45
2.2.6.1. Morfología Macroscópica 45
2.2.6.2. Morfología Microscópica 46
2.2.6.3. Hábitat 46
2.2.6.4 Aplicación Industrial 46
2.2.7. Trichoderma sp. 47
2.2.7.1. Morfología Macroscópica 47
2.2.7.2. Morfología Microscópica 47
2.2.7.3. Hábitat 48
2.2.7.4. Aplicación Industrial 48
2.2.8. Fusarium sp. 50
2.2.8.1 Morfología Macroscópica 50
2.2.8.2. Morfología Microscópica 50
2.2.8.3. Hábitat 51
2.2.8.4. Aplicación Industrial 51
2.3. La Planta Espeletia barclayana 52 2.3.1. Descripción Botánica del género 52 2.3.2.
Descripció n de la especie
53
2.3.3. Clasificación taxonómica 54
2.4. Método de conservación 55
2.4.1. Conservación en suelo 55
3. JUSTIFICACION 57
4. OBJETIVOS 58
4.1. Objetivo General 58
4.2. Objetivo Específico 58
5. HIPOTESIS 59
6. MATERIALES Y METODOS 60
6.1. Activación 60
6.2. Identificación Macroscópica y Microscópica 61
6.2.1 Observación Macroscópica 61
6.2.2. Observación Microscópica 61
6.3 Determinación del crecimiento radial 62 6.4. Determinación del crecimiento específico 62 6.5. Método de conservación en suelo 63
6.6. Diseño estadístico 63
7. RESULTADOS Y DISCUSION 64
7.1. Crecimiento radial 65
7.2. Crecimiento específico 69
7.3. Observaciones realizadas a las 22 cepas analizadas. 73
8. CONCLUSIONES 79
9. RECOMENDACIONES 80
Bibliografía 81
Anexos 86
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Taxonomía de la Espeletia barclayana. 53 Tabla 2. Observaciones macroscópicas y microscópicas, realizadas a Curvularia sp, Mucor sp, Alternaria sp y Nigrospora sp.
73
Tabla 3. Observaciones macroscópicas y microscópicas, realizadas a 2 cepas de Trichoderma sp, 2 cepas de Acremonium sp y 2 cepas de Cladosporium sp.
74
Tabla 4. Observaciones macroscópicas y microscópicas, realizadas a 5 CEPAS DE Fusarium sp.
75
Tabla 5. Observaciones macroscópicas y microscópicas, realizadas a 6 cepas de Fusarium sp.
76
Tabla 6. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Curvularia sp. 9 B.
87
Tabla 7. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Mucor sp. 321 g.
85
Tabla 8. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Trichoderma sp. Cepa 1. 203.3.c.
89
Tabla 9. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Fusarium sp. Cepa 2. 21.1.**
90
Tabla 10. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Fusarium sp. Cepa 1. F.2.1.
91
Tabla 11. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Fusarium sp. Cepa 3. 210 3 F.
92
Tabla 12. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Alternaria sp. 19.1.B.
93
Tabla 13. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de 94
crecimiento específico realizado a Acremonium sp. 29.3.
Tabla 14. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Fusarium sp. Cepa 4.F.2.2.
95
Tabla 15. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Nigrospora sp. 7 B.
96
Tabla 16. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Fusarium sp. Cepa 5. 502.
97
Tabla 17. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Fusarium sp. Cepa 6. 11.2.1.
98
Tabla 18. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Cladospoium sp. Cepa 1. 11.2.2.
99
Tabla 19. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Cladosporium sp. Cepa 2. 11.2.3.
100
Tabla 20. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Fusarium sp. Cepa 7. 502**.
101
Tabla 21. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Acremonium sp. Cepa 2. 21.1.3.
102
Tabla 22. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Fusarium sp. Cepa 8. F.2.3.
103
Tabla 23. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Fusarium sp. Cepa 9. 21.2.
104
Tabla 24. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Fusarium sp. Cepa 12. 17. F.
105
Tabla 25. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Fusarium sp. Cepa 11. 212.3.a.
106
Tabla 26. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Trichoderma sp. Cepa 2. 212.3.E.
107
Tabla 27. Formato de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizado a Fusarium sp. Cepa 10. 314.B.
108
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Línea de Investigación seguida por el grupo de Biotranformación (GIBUJ), del Departamento de Química de la Pontific ia Universidad Javeriana.
23
Figura 2. Mucor sp. 86
Figura 3. Curvularia sp. 86
Figura 4. Alternaria sp. 86
Figura 5. Cladosporium sp. 86
Figura 6. Nigrospora sp. 86
Figura 7. Acremonium sp. 86
Figura 8. Trichoderma sp. 86
Figura 9. Fusarium sp. 86
Figura 10. Espeletia barclayana. 86
Figura 11. Diámetros del crecimiento de las 22 cepas evaluadas. 68 Figura 12. Resultados de los dos medios evaluados, en el crecimiento radial.
68
Figura 13. Resultados de las 22 cepas evaluadas, comparando el crecimiento radial en los dos medios.
69
Figura 14. Resultados del crecimiento específico, en las 22 cepas evaluadas.
71
Figura 15. Resultados en los dos medios del crecimiento específico. 72 Figura 16. Fotografía de Curvularia sp. Crecimiento en medio Papa
Dextrosa Carrageenan (PDC).
77
Figura 17. Fotografía al microscopio de Curvularia sp. 77 Figura 18. Fotografía de Mucor sp. A la derecha crecimiento en medio
PDC a la izquierda crecimiento en medio PDA.
77
Figura 19. Fotografía al microscopio de Mucor sp. 77 Figura 20. Fotografía de Alternaria sp. A la derecha crecimiento en
medio PDC y a la izquierda en medio PDA
77
Figura 21. Dibujo de Alternaria sp. 77
Figura 22. Fotografía de Nigrospora sp. A la derecha crecimiento en medio PDC y a la izquierda en medio PDA
77
Figura 23. Fotografía al microscopio de Nigrospora sp. 77 Figura 24. Fotografía de Trichoderma sp. Cepa uno. A la derecha
crecimiento en medio PDA y a la izquierda en medio PDC.
77
Figura 25. Fotografía al microscopio de Trichoderma sp. Cepa uno. 77 Figura 26. Fotografía de Trichoderma sp. Cepa 2. A la derecha
crecimiento en medio PDA y a la izquierda en medio PDC.
77
Figura 27. Fotografía al microscopio de Trichoderma sp. Cepa 2. 77 Figura 28. Fotografía de Acremonium sp. Cepa uno. A la derecha
crecimiento en medio PDA y a la izquierda en medio PDC.
77
Figura 29. Fotografía al microscopio de Acremonium sp. Cepa uno. 77 Figura 30. Fotografía de Acremoni um sp. Cepa dos. A la derecha
crecimiento en medio PDA y a la izquierda en medio PDC.
77
Figura 31. Fotografía al microscopio de Acremonium sp. Cepa dos. 77 Figura 32. Fotografía de Cladosporium sp. Cepa uno. A la derecha
crecimiento en medio PDC y a la izquierda en medio PDA
77
Figura 33. Fotografía al microscopio de Cladosporium sp. Cepa uno. 77 Figura 34. Fotografía de Cladosporium sp. Cepa dos. A la derecha
crecimiento en medio PDC y a la izquierda en medio PDA
77
Figura 35. Dibujo de Cladosporium sp. Cepa dos. 77 Figura 36. Fotografía de Fusarium sp. Cepa uno. A la derecha
crecimiento en medio PDC y a la izquierda en medio PDA.
78
Figura 37. Fotografía de Fusarium sp. Cepa dos. A la derecha crecimiento en medio PDC y a la izquierda en medio PDA.
78
Figura 38. Fotografía de Fusarium sp. Cepa tres. A la derecha crecimiento en medio PDC y a la izquierda en medio PDA.
78
Figura 39. Fotografía de Fusarium sp. Cepa cuatro. A la derecha crecimiento en medio PDA y a la izquierda en medio PDC.
78
Figura 40. Fotografía de Fusarium sp. Cepa cinco. A la derecha crecimiento en medio PDA y a la izquierda en medio PDC.
78
Figura 41. Fotografía de Fusarium sp. Cepa seis. A la derecha crecimiento en medio PDC y a la izquierda en medio PDA.
78
Figura 42. Fotografía de Fusarium sp. Cepa siete. A la derecha crecimiento en medio PDC y a la izquierda en medio PDA.
78
Figura 43. Fotografía de Fusarium sp. Cepa ocho. A la derecha crecimiento en medio PDC y a la izquierda en medio PDA.
78
Figura 44. Fotografía de Fusarium sp. Cepa nueve. A la derecha crecimiento en medio PDC y a la izquierda en medio PDA.
78
Figura 45. Fotografía de Fusarium sp. Cepa diez. A la derecha crecimiento en medio PDA y a la izquierda en medio PDC.
78
Figura 46. Fotog rafía de Fusarium sp. Cepa once. A la derecha crecimiento en medio PDC y a la izquierda en medio PDA.
78
Figura 47. Fotografía de Fusarium sp. Cepa doce. A la derecha crecimiento en medio PDC y a la izquierda en medio PDA.
78
Figura 48. Fotografías de distintas muestras de Fusarium sp. 78 Figura 49. Seguimiento durante algunos días de la cepa siete de
Fusarium sp.
78
LISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo 1. Fotografías de distintos géneros de Hongos filamentosos. 86
Anexo 2. Formatos de la tasa de crecimiento radial y la tasa de crecimiento específico realizados a las 22 cepas analizadas obtenidas de la planta Espeletia barclayana.
87
Anexo 3. Análisis estadísticos, ANOVA y de Scheffe, de las muestras de 22 de Hongos filamentosos evaluadas.
109
Anexo 4. Medios de Cultivo 120
RESUMEN
En este trabajo se caracterizó y correlacionó la tasa de crecimiento radial con respecto a la tasa de crecimiento específico de hongos filamentosos aislados de la planta Espeletia barclayana, habitante del páramo el tablazo en Subachoque Cundinamarca. Para caracterizar el crecimiento específico se empleó un solidificante diferente al agar-agar, como fue el Carrageenan X 4910, compuesto que gracias a su composición física permitió mantener, y separar la biomasa del gel haciendo la tarea más fácil, ya que su punto de fusión está a 60ºC, temperatura no destructiva para el hongo, y además que evitó la presencia de residuos adicionales que pudieran alterar el verdadero peso de dicho microorganismo. Para establecer la tasa de crecimiento radial, se realizó un paralelo entre dos medios sólidos el ya mencionado Papa Dextrosa Carrageenan (PDC) y el habitual Agar Papa Dextrosa (PDA), siendo el primero el que arrojó resultados mejorados para la mayoría de los hongos, que estaban sometidos a las mismas condiciones extrínsecas, (Temperatura y humedad) e intrínsecas (pH) y con una concentración de 7.5 ml de medio ya que en él se notó un aumento más elevado con respecto al tiempo de crecimiento. Con respecto a la evaluación de la tasa de crecimiento específico, el peso fue relativamente similar para la mayoría de las especies. Se realizó un estudio estadístico empleando la técnica de Anova y la de Scheffe, para establecer diferencias entre el crecimiento de
los hongos según la técnica empleada, dejando como resultado definitivo que cualquiera de los dos métodos es igual para determinar cinética de crecimiento, aunque se estableció que se puede seguir con la tradicional evaluación de la tasa de crecimiento por medio de mediciones radiales, por costos y tiempo.
Lo anterior debido que al estudiar el crecimiento de hongos filamentosos resulta importante determinar su tipo de desarrollo, dado que actualmente estos parámetros son empleados como factor de aporte al estudio de su crecimiento, en cultivos de laboratorio para designar el grado de producción a nivel industrial, como en este caso, el grado de Biotransformación de Terpenoides, flavonoides, alcaloides y ácidos grasos de hongos filamentosos obtenidos de plantas promisorias Colombianas, siguiendo con la línea de investigación planteada por el Grupo de Bitransformación de la Universidad Javeriana.
1. INTRODUCCION
Los hongos filamentosos son microorganismos, eucarióticos, heterótrofos incapaces de sintetizar clorófila, aerobios que se reproducen de manera natural por medio de esporas, sexual o asexualmente; morfológicamente se ven como cuerpos alargados o filamentosos, y por lo general ramificados, que aumentan de tamaño por crecimiento apical, característica que los hace diferentes de las bacterias; dichos filamentos pueden ser septados o no y se les denomina hifas; que en conjunto constituyen el micelio. Las hifas pueden ser uniformes en su diámetro o presentar cambios a lo largo de ellas, (Pelczar, 1986), base morfológica importante en la determinación del crecimiento de cultivos lentos y cultivos rápidos, ya que ellas pueden crecer en forma sumergida, o sobre el medio, o ser aéreas. Fisiológicamente los hongos se adaptan a condiciones mas severas que otros microorganismos, soportando concentraciones elevadas de azúcares hasta del 10% (Pelczar, 1996), y de acidez soportando escalas de pH entre el 2.0 y 9.0, siendo la óptima 5.6, y temperaturas de 0 y 62ºC, siendo la óptima de 28ºC, (Koneman, 1987).
Para hallar características específicas al estudiar el crecimiento de hongos filamentosos, es importante determinar el crecimiento radial y el
crecimiento específico en medios determinados, ya que actualmente éstos parámetros se emplean como un factor de aporte al estudio de su desarrollo y crecimiento en cultivos de laboratorio, dado que la tasa de crecimiento específico da una valoración más exacta y real de la verdadera formación del micelio de superficie, aéreo y sumergido.
Para dicha valoración, del crecimiento específico y del crecimiento radial del hongo filamentoso, se utilizan solidificantes diferentes al agar-agar, substancias como el Pluronic F 127 y el Carrageenan X 4910, que han sido empleados con buenos resultados en este tipo de investigac ión, siendo el último el preferido porque gracias a su composición física permite mantener y separar la biomasa del gel, a temperaturas no destructivas para el hongo (60º), y además evita la presencia de residuos adicionales que puedan alterar el verdadero peso del hongo, (Reeslev, 1991).
El grupo de Investigación en Biotransformación de la Universidad Javeriana (GIBUJ) está interesado en la caracterización fisiológica y química de hongos filamentosos aislados de algunas especies de la planta Espeletia, dentro de ésta caracterización pretende correlacionar el crecimiento radial y el crecimiento específico; empleando un medio de papa, solidificado con Carrageenan X 4910 (PDC X-4910), proyecto
(Correlación de la tasa de crecimiento radial y crecimiento es pecífico de hongos filamentosos aislados de la planta Espeletia barclayana), que se encuentra enmarcado dentro de la línea de investigación transformación de Terpenoides, obtenidos de Asteraceas por hongos nativos, del programa de Biotransformación del Departamento de Química de la Facultad de Ciencias de la Universidad Javeriana, (Figura 1).
FIGURA 1.
PROGRAMA
BIOTRANSFORMACION DE TERPENOIDES, FLAVONOIDES, ALCALOIDES Y ACIDOS GRASOS, OBTENIDOS DE PLANTAS PROMISORIAS COLOMBIANAS POR HONGOS NATIVOS
τ
LINEAS DE INVESTIGACION
BIOTRASNFORMACIÓN DE TERPENOIDES, OBTENIDOS DE ASTERACEAS POR HONGOS NATIVOS
τ
CORRELACION DE LA TASA DE CRECIMIENTO RADIAL Y LA TASA DE CRECIMIENTO ESPECÍFICO EN MEDIO PDC X 4910, DE ALGUNOS HONGOS NATIVOS AISLADOS DE LA PLANTA Espeletia barclayana.
2. MARCO TEORICO
2.1 GENERALIDADES.
Fisiológicamente, los hongos filamentosos se adaptan a condiciones mas severas que otros microorganismos, su desarrollo en substratos puede ser con concentraciones de azúcares elevados (hasta el 10%, (Pelczar, M.J.1996)), ya que este tipo de microorganismos no es sensible a la presión osmótica elevada; ellos crecen muy lentamente (5 a 7 días), y se desarrollan en condiciones de acidez relativamente elevadas, soportando escalas de pH entre 2.0 a 9.0, siendo el óptimo para casi todas las especies de 5.6. Aunque necesitan humedad para su desarrollo y pueden obtener agua de la atmósfera libre y el medio, los hongos filamentosos pueden sobrevivir en ambientes deshidratados (⇓Aw). Casi todos los hongos son aerobios, y se desarrollan en condiciones de temperatura entre 0°C y 62°C, pero entre 22°C a 30ºC, es la óptima para la mayoría de las especies, (Carone, M. D. 1986).
La glucosa es una fuente de carbono muy aprovechada por muchos hongos, (entre otros azúcares), así como compuestos de carbono orgánico más complejos (almidón y la celulosa); ellos también se sirven
de nitrógeno inorgánico que contiene sales de amonio o nitratos;
empleando además, substratos con nitrógeno orgánico y carbono, como el extracto de levadura y la peptona, (Pelczar, 1996).
El crecimiento de hifas envuelve la extensión de la pared primaria, y por ende la biosíntesis de los componentes de la pared (Trinci, 1990). Los estudios de algunas variedades de hongos han demostrado la presencia de enzimas, intra y extracelulares capaces de utilizar substratos orgánicos empleados para su nutrición.
Para el crecimiento en laboratorio, se emplean medios de cultivo Naturales, como pedazos o infusiones de frutas, vegetales, granos de cereales, tejidos de animales u otros medios como los preparados con peptonas y levadura, agares y otros gelificantes (Carrageenan) (Reeslev, 1995), y finalmente, medios de cultivo Sintéticos con composiciones químicas definidas, (Willems, 1991), que sirven para promover la esporulación y crecimiento del micelio, además de erradicar la variación fenotípica.
Materiales en crudo como el carrageenan X 4910, (Reeslev, 1995), un complejo extraído de algas marinas (Eucheuma cottonii), que se emplea como agente solidificante en medios de cultivo específicos, se ha utilizado para determinar la tasa de crecimiento específico porque debido a su punto de fusión de 60°C, no nos destruye la biomasa total obtenida, y por
lo tanto arroja resultados verdaderos con respecto al peso del hongo.
(Reeslev, 1995).
Los hongos filamentosos, son altamente eficientes en transformar material nutritivo en sustancia celular, en medios en los que el material nutritivo está en cantidades moderadas, pero si el alimento abunda, se acumula como reserva en el micelio (Carbohidratos y lípidos), y muchos productos del catabolismo son excretados al medio, (Roger, 1996).
La mayor parte de los hongos son inmóviles, si bien pueden tener células reproductoras móviles. Las esporas son cuerpos resistentes que forman los hongos en estado latente o de reposo, que se producen de dos maneras diferentes, sexual y asexualmente. Las sexuales tienen núcleo derivado de las células progenitoras, y sus esporas son haploides; dos núcleos de las células antecesoras se funden para formar un núcleo diploide (zigoto) y las estructuras que producen las esporas sexuales, son casi siempre, morfológicamente diferenciadas de las esporas asexuales.
Las esporas asexuales se producen por simple diferenciación la hifa en crecimiento, (Carone, 1986).
Existen dos tipos de esporas: Las formadas dentro de un saco cerrado (asco de la división Ascomycota), que se denominan ascosporas, o esporos endógenos y las esporas producidas en los extremos de una estructura en forma de trebol (basidios de la división Basidiomycota), llamados basidiosporas, o esporos exógenos.
Los hongos de la división Ascomycota, poseen estructuras vegetativas de reproducción sexual por medio de ascosporos producidas entre ascos, que consisten de una sola célula (como las levaduras), o filamentos septados perforados por un poro de modo que la continuidad citoplasmática ocurre entre los segmentos adyacentes, cada segmento posee generalmente varios núcleos, el poro es también suficientemente ancho para permitir a través del mismo el paso de mitocondrias y núcleos.
Si en una sola célula o micelio se dan varios núcleos, éstos no son siempre idénticos genéticamente. A diferencia de los Ascomycotas, en la división Basidiomycota, como característica estructural principal, es la de portar esporos exógenos en la basidia, con proyecciones llamadas esterigmas. El número de esporos por basidia es generalmente de cuatro, pero basidias con dos núcleos son comunes, ésta estructura es típicamente cilíndrica no septada portando cuatro basidiosporas en el ápice de setas venenosas y aliados (generalmente se les conoce como holoblásticas).
Las esporas presentan generalmente un incremento del contenido citoplasmático que origina la formación de una larga estructura tubular denominada hifa, las hifas pueden ramificarse y extenderse al nivel de las puntas, que se entretejen y que terminan en una masa filamentosa con apariencia algodonosa, que en conjunto se denomina micelio. La mayor parte de los hongos son filamentosos, aunque algunos, como las
levaduras, son unicelulares. Los hongos filamentosos pueden tener dos tipos de hifa:
No septada (cenocítica). Estas hifas no presentan tabiques transversales o septos derivados de sus paredes. De hecho se forman algunos tabiques pero sólo en la base de las estructuras reproductoras.
Septadas con células multinucleadas. Los tabiques se encuentran a lo largo de las hifas, se forman del crecimiento interno de la pared de las hifas que forman un anillo periférico en la hifa, dejando un por o central a través del cual pasa el citoplasma y el núcleo de un compartimiento a otro.
Es importante señalar que cada compartimiento se considera como una célula, además, como hay corrientes protoplásmicas y migración de los núcleos entre las células o compartimientos de las hifas septadas, podrían ser consideradas como cenocíticas, (Roger, 1996).
Podemos distinguir también algunas fases del crecimiento del micelio en medios sólidos, a partir de una espora como es la formación de:
El micelio indiferenciado:
a- Formación del tubo germinal (crecimiento exponencial).
b- Alcanzada una velocidad exponencial de crecimiento de mm/h, se inicia la fase de crecimiento lineal.
c- Se producen ramificaciones; aunque cada hifa tenga un crecimiento lineal, el conjunto de hifas en crecimiento tiene un crecimiento exponencial, (la formación de nuevas hifas es exponencial con el tiempo).
Existe el efecto de dominancia apical.
El micelio diferenciado:
a- Cuando empieza a existir un gradiente de substratos y / o productos metabólicos, el micelio crece a una tasa lineal .
b- Empiezan a aparecer estructuras diferenciadas como :
1- Esporocarpos: Aparecen regularmente, en función de la tasa de crecimiento y número total de células.
2- Esclerotias: (Tejido de soporte). No tiene una disposición regular sobre las hifas.
3- Zona productora: Zona donde existe el crecimiento de biomasa.
4- Zona fructífera: Zona con ausencia de crecimiento y presencia de esporas, es incapaz de absorber nutrientes. ( Análogo en la idiofase de un cultivo en batch - en medio líquido), (Michel, 1996).
La clasificación de los hongos; se basa en las características morfológicas de los estadios sexuales y las esporas. La morfología de la hifa y las esporas asexuales están en segundo lugar de importancia en la taxonomía de los hongos, (Michel, 1996).
La zona de crecimiento periférico (ZCP), es la parte del micelio en la que el citoplasma y orgánulos participan en el crecimiento de la hifa. Las hifas pueden ser uniformes en su diámetro, o presentar unas partes de menor diámetro que otras; dentro de la misma hifa o en diferentes porciones del mismo micelio, ellas pueden ser ramificadas; siendo su crecimiento a través de los compartimientos apicales, en estos compartimientos, se puede distinguir una zona de extensión, que es la parte del micelio que está creciendo por alargamiento, (Prosser, 1991).
Aquellos hongos que muestran una zona de crecimiento periférico, mayor, son los que tienen un grosor de hifa mayor, porque el flujo citoplasmático (como cua lquier flujo), es proporcional al diámetro de la luz del canal de transporte, (Ley de Hagen Poseulle); el aporte de nutrientes al ápice se efectúa por transporte citoplasmático, (Translocación), ocasionado por el aumento de la presión osmótica en compartimientos subapicales debido al transporte de nutrientes. La corriente protoplásmica es fácilmente observada en hongos con gran diámetro de hifa, y no apreciable, o casi no, en hongos con poca luz de hifa.
En las zonas de extensión existen acúmulos de cuerpos apicales o de Spitzenkoper, (dirección del crecimiento), que no se aprecian en hifas con ausencia de crecimiento. El diámetro de las hifas puede variar de 0.5 mm, hasta 100 mm, en tamaño o en extensión, ya que el micelio puede tener solo algunos mm de largo o extenderse por varios metros. La dirección
puede ser en línea directa o por zig-zag, (dada por movimientos de las proteínas del citoesqueleto), (Gow, 1994).
Estos microorganismos poseen enzimas como la quitina sintetasa, enzima que presumiblemente actúa en la célula agregando unidades de N- acetilglucosamina, a las moléculas de quitina preexistentes en la pared de la célula, (Watkinsan, 1996).
Los citosomas, microvesículas en los que se da la síntesis de quitina, en una forma “zimógena” (inactiva), han sido solo demostradas en un grupo de hongos, en los que se producen microfibrillas (Trinci, 1971). En la célula es probable que los citosomas se fusionen a la membrana plasmática en cuya etapa el zimógeno, es activado por una enzima proteolítica para sostener la síntesis de la quitina activa. Además de la síntesis de quitina, la enzima lítica quitinasa es producida por hongos en crecimiento; es posible que esta enzima esté envuelta en el rompimiento controlado de la pared microfibrilar de quitina, cuando un brazo lateral se produce. En un ciclo de N-acetil glucosamina en cuyos momentos relajados por la quitinasa, son reincorporados en la quitina, (Watkinson, 1996); los hongos provistos con N-acetilglucosamina, incorporan este precursor a la quitina, (Jung, 1990.), autoradriografías, de N-acetil- glucosamina marcada con tritium demuestran máxima incorporación del precursor marcado en la punta de la hifa y menor incorporación en toda la zona de extensión. La densidad de la marcación se parece mucho a la
distribución de las vesículas citoplasmáticas confirmando su papel en la biosíntesis de pared, además se nota una prodigiosa actividad en el ápice hifal, con numerosas vesículas desarrollando enzimas líticas y biosintéticas en la membrana plasmática. Cuando las vesículas citoplasmáticas se fusionen con la membrana plasmática ellos también contribuyen a sus propios componentes de membrana, permitiendo su extensión, (Roger, 1996).
Una evaluación de la tasa de crecimiento radial y específico, del microorganismo se mide en función del incremento de la masa celular como ya se ha mencionado (micelio), el crecimiento de la colonia se da rápidamente de una espora germinada en medio sólido logrando una morfología redonda (se puede discutir los mecanismos involucrados en formación de una colonia que generalmente es redonda). El parámetro más obvio para la valoración de crecimiento de la colonia es el radio de la colonia o diámetro. Esto es microscópicamente conveniente durante un crecimiento temprano y, más fácilmente, para el examen macroscópico de los diámetros de colonias que crecen en horas o días. La cinética de crecimiento de las colonias tempranas reflejan el desarrollo de una hifa individual y el aumento exponencial en radio, seguido por una fase de desaceleración y la fase lineal. La fase lineal puede proceder indefinidamente, el medio suficiente dado y la colonia extiende a un radio de crecimiento de proporciones c onstantes, equivalente a la medida
proporcional de la extensión de hifas al margen de la colonia. El desarrollo micelial de la colonia que se da por factores que determinan la dirección de crecimiento de la hifa son menos entendidos, pero los efectos autotróficos negativos se observan durante el crecimiento micelial, que puede ser el resultado de pendientes en la concentración de oxígeno alrededor del crecimiento de la hifa. La reducción en proporción de la extensión que es el resultado de la concentración de oxígeno reducido que produce la reacción de la anulación del mecanismo que es desconocido, pero debe residir en la zona de extensión de hifa pudiendo ser esta la observación más importante en el laboratorio. Cuando estamos estudiando un hongo filamentoso, idealmente el examen de la tasa de crecimiento de los cultivos debe hacerse diariamente, por lo menos por la primera y segunda semanas de incubación (25ºC), sin embargo, los exámenes tres veces a la semana también son satisfactorios, (Roger, 1996).
Dado que muchas colonias de hongos crecen rápidamente, por factores extrínsecos (temperatura, humedad), o por condiciones intrínsecas (pH, Aw) en la superficie de los medios sólidos, el crecimiento se detecta a simple vista, empleando una lente de aumento manual o simplemente sosteniendo inclinada la placa hacia un lado y hacia otro, reflejando la luz incidente con un ángulo apropiado. Para la medición de la tasa de crecimiento radial o estimación lineal del crecimiento radial, podemos
emplear una regla o reglilla apropiada, un método bastante simple y no destructivo, que nos da una idea del tipo de crecimiento, y no una estimación del crecimiento tridimensional, porque como hemos estudiado los hongos filamentosos crecen en tres formas: Sumergido, sobr e la superficie del medio o aéreo. Empleamos también otro método para determinar la tasa de crecimiento específico, método en el que se emplea generalmente medios naturales como Papa Dextosa, que nos determinan biomasa total.
El examen visual, si una colonia de hongos es filamentosa o levaduriforme, se determina básicamente por su aspecto morfológico, que se ve en diferentes formas, algodonoso, pulverulento, velloso o acordonado, o puntos cremosos; todo a partir de la acomodación del micelio.
Este tipo de metodología es importante para la caracterización inicial de los aislamientos, a evaluar, además debe observarse la consistencia de la superficie de la colonia, el plegamiento (rugae), la nitidez del borde de las colonias y la presencia de pigmento en la superficie o en el reverso de la colonia y su difusión hacia el medio circundante; (de rutina debe examinarse la superficie y el reverso de la colonia), (Koneman, 1987).
El uso de un microscopio (Koneman, 1987), puede ser útil para determinar el patrón de crecimiento micelial y para detectar la presencia y características morfológicas de los elementos de fructificación. Aunque
estas observaciones pueden ser útiles, la evaluación del crecimiento y de la morfología de las colonias en general tiene un valor limitado, debido a las variaciones causadas por diferencias en las condiciones ambientales (Temperatura y pH), durante la incubación y en los medios de cultivo empleados.
2.2. ALGUNOS HONGOS FILAMENTOSOS.
2.2.1. IDENTIFICACION Y APLICACION INDUSTRIAL.
2.2.1 Mucor sp.
Subdivisión: Zigomycota Clase: Zigomycetes
Orden: Mucorales Género: Mucor
Pertenecen al orden mucorales caracterizados por poseer esporangiosporas asexuales en esporangios. (Ver anexo 1. Figura 2).
2.2.2.1 Morfología macroscópica.
Por pertenecer al grupo de los zigomycetes al igual que Rhizopus , los mohos de este género presentan colonias con crecimiento rápido, el
micelio es abundante, algodonoso y empuja la tapa de la placa de Petri.
Inicialmente son blancas pero cambian a gris, marrón o negro con la madurez, a medida que forman esporas, (Bayona, 1999).
2.2.2.2. Morfología microscópica.
Los caracteres más salientes de los mohos pertenecientes a este género son: Presentar un micelio no septado, a partir del cual se elevan los conidióforos naciendo de estos últimos la columela y el esporangio. Los esporangióforos se hallan presentes en todas las partes aéreas del moho, pudiendo ser simples o ramificadas, la columela puede ser esférica, cilíndrica o piriforme. Las esporas son pequeñas regulares, lisas y se forma n dentro del esporangio, los suspensores de la zigosporas son de gran tamaño. Además carecen de estolones, rizoides y esporangiolos (pequeños esporangios con unas pocas esporas), (Koneman, 1987).
2.2.2.3. Hábitat.
Los miembros que hacen parte del género Mucor, se hallan en el suelo y no tienen requerimientos especiales para el crecimiento, pues pueden incluso crecer a temperaturas de refrigeración. Sin embargo también pueden proliferar dentro de un gran número de alimentos.
2.2.2.4. Aplicación Industrial.
Los Mucor toman parte en la alteración de algunos alimentos y en la elaboración de otros. Una especie muy difundida es el M. racemosus, u M. rouxxi, que intervienen en el proceso “Amylo”, de sacarificación del almidón. Además al gunos Mucor, toman parte en la maduración de ciertos quesos, y en la elaboración de alimentos orientales,( Bayona. 1999).
♣Mucor spp: Produce lipasas implicadas en la producción de jarabes de
alto contenido en fructosa, detergentes y utilizadas en industrias lácteas, enzimas coagulantes de la leche como la renina implicada en la coagulación de la leche, α-amilasas, glucosa isomerasas.
♣M. flavus : Absorbe arcillas no esterilizadas y lodo a temperaturas que oscilan entre 5 a 15ºC.
♣M. miehei: Produce renina microbiana para la fabricación del queso.
♣M. pucillus: Genera proteasas ácidas, útiles para la fabricación del pan, y de la cerveza embotellada que soporta la refrigeración. También produce renina microbiana para la fabricación del queso.
♣M. mucedo: Produce material fibroso, que sirve para colocarlo sobre las
heridas manteniéndolas húmedas y ayudándolas a cicatrizar. Se puede extraer la quitina cuyas concentraciones altas absorben materiales iónicos.
♣M. javanicus y M. isabellana: Se utilizan para pr oducir ácidos grasos poliinsaturados de importancia en la dieta como el ácido g-linoleico.
2.2.2. Curvularia sp.
Subdivisión: Deuteromycotina Clase: Deuteromicete
Subclase: Hyphomycetidae Orden: Moniliales
Familia: Dematiaceae Género: Curvularia
2.2.2.1. Morfología macroscópica.
Crece dando colonias verdosas oscuras con micelio aéreo denso, bien desarrollado. Color Inicial blanco grisáceo que pronto cambia al marrón
oscuro a rojo púrpura. Bordes enteros bien nítidos. Reverso rojo púrpura negro, (Bayona, 1999).
2.2.2.2. Morfología microscópica.
Hifas de color amarillo castaño, claramente septadas. Los conidióforos son doblados y engrosados en los puntos de unión con los conidios, además son diferenciados, genticulados, septados , de color café ramificados o simple, solitarios o en grupo, y con crecimiento simpodial.
Macroconidios, color marrón oscuro divididos en cuatro a seis células por septos transversales, con apariencia curvada, (Koneman 1987), (Ver anexo 1 Figura 3).
2.2.2.3. Hábitat.
El microorganismo primariamente es un saprofito del suelo aunque se conocen casos ocasionales de infecciones humanas.
2.2.2.4. Aplicación Industrial.
♣Curvularia lunata: Este hongo puede ser inmovilizado por alginato y poliacrilamida para la producción de enzimas a gran escala.
Produce epooxidación de esteroides que contienen doble enlace, por ejemplo el cortizol. También es utilizado para la transformación de esteroles y para al utilización de sedantes de terapia antitumoral.
Este hongo puede ser utilizado para degradar la lignocelulosa del material vegetal. La conversión se lleva a cabo en condiciones anoxigénicas añadiendo hongos celulolíticos que son incubados a 30ºC, convirtiendo el substrato en metano, hidrocarburos y dióxido de carbono los cuales pueden ser quemados como combustibles, (Bayona, 1999).
2.2.3. Alternaria sp.
Subdivisión: Deuteromycotina Clase: Deuteromicetes
Subclase: Hyphomycetidae Orden: Moniliales
Familia: Dematiaceae Género: Alternaria
2.2.3.1. Morfología macroscópica.
Crece dando colonias afelpadas o algodonosas por el desarrollo de un micelio aéreo denso bien desarrollado. Inicialmente de color gris pero a
medida que envejecen se tornan oscuras o casi negras. Bordes enteros bien nítidos. Reverso rojo púrpura a negro, (Bayona, 1999).
2.2.3.2. Morfología microscópica.
Hifas de color amarillo castaño, claramente septadas. Macroconidios color marrón oscuro, multicelulares, con septos transversales y longitudinales, con aspecto de pico o palillo de tambor dispuestos en largas cadenas, (Koneman, 1987), (Ver anexo 1 Figura 4)
2.2.3.3. Hábitat.
Se halla en suelos, es un patógeno de vegetales, causa la podredumbre negra.
2.2.3.4. Aplicación Industrial.
♣A. tenuis: Afecta frutas como limones, naranjas, manzanas, causan el
deterioro del bacon y jamones curados, produce el ablandamiento de encurtidos por la presencia de pectinasas, (Bayona, 1999).
♣A. citri: Produce la podredumbre de los frutos cítricos.
♣A. solani: Causa mildiu, enfermedad en las hojas de las plantas.
2.2.4. Cladosporium sp.
Subdivisión: Deuteromycotina Clase: Deuteromicetes
Subclase: Hyphomycetidae Familia: Dematiaceae Género: Cladosporium
2.2.4.1. Morfología macroscópica.
Colonias color marrón intensa a negro, lisas, cariáceas y rugosas, o bien variantes aterciopeladas, color verde intenso, cubiertas por un micelio bajo y velloso. Las primeras colonias pueden ser lisas y del tipo de las levaduras, (Bayona, 1999).
2.2.4.2. Morfología microscópica.
Hifas color amarillo castaño, claramente septadas. Conidióforos libremente ramificados, con aspecto de pincel, de cuyos extremos parten largas cadenas de pequeños conidios oscuros, oval o elípticos, con
evidentes puntos terminales oscuros de inserción denominados disyuntores, color amarillo castaño. Las células con disyuntores tienen forma de escudo, (Koneman, 1987), (Ver anexo 1, figura 5).
2.2.4.3. Hábitat.
El Cladosporium, es un saprofito contaminante muy común de crecimiento rápido a temperatura ambiente pero no a 37ºC, que con frecuencia se recupera del aire y está implicado en enfermedades respiratorias alérgicas.
2.2.4.4. Aplicación Industrial.
♣Cladosporium spp: Algunas especies tienen actividad proteolítica
hidrolizando la gelatina, (Bayona, 1999).
♣C. herbarum: Produce moteado negro en la carne de vacuno, y en la
carne congelada de carnero. Algunos, alteran la mantequilla y la margarina, mientras que otros causan una podredumbre limitada de las frutas con hueso, y la podredumbre negra de la uva.
♣C. resinae: Actúa como contaminante de carburantes y, además, absorbe rápidamente metales iónicos.
♣C. cladosporioides : Puede ser aislado de la superficie de los circuitos
deteriorados, esta especie es muy común como contaminante de frutas y hortalizas.
♣C. cucumerinum: Causa manchas sobre las hojas, y manchas hendidas sobre los frutos de pepino.
♣C. fulvum: El crecimiento de esta especie se facilita sobre las hojas del
tomate, donde forma manchas pardas o violetas, algunas de gran tamaño;
en esta especie los conidióforos son poco ramificados, los conidios son uniseptados y raramente aparecen en cadenas.
2.2.5. Nigrospora sp.
Subdivisión: Deuteromycotina Clase: Deuteromicetes
Subclase: Hyphomycetidae Familia: Dematiaceae Género: Nigrospora
2.2.5.1.Morfología macroscópica.
Crece rápidamente dando colonias algodonosas compactas de color gris blancuzco, se disemina difusamente sobre la superficie del agar con un borde irregular. Cubiertos por un micelio algodonoso bien desarrollado con el tiempo, la colonia se oscurece visiblemente debido a la producción de conidios, (Bayona, 1999).
2.2.5.2. Morfología microscópica.
Hifas inicialmente hialinas y septadas; al madurar presentan coloración amarillo-castaño. Los conidióforos son hialinos, dilatados en el centro, y adelgasa abruptamente en el punto donde se forma la conidia, la cual es de origen holoblástica, (ver anexo 1, figura 6).
Los conidióforos se forman en ángulos de 90 grados, con respecto a la hifa vegetativa; pueden ser determinados o percurrentes. Son cortos, algo helicoidales, con extremo ensanchado que les da un aspecto de jarrón.
Las conidias son grandes, solitarias y terminales, subglobosas u ovoides, achatadas horizontalmente, negras brillantes y cafés oscuras, sin septos con aspecto de sombrero de tres picos en miniatura; a su vez están provistas de un mecanismo que le permite ser liberadas violentamente, (Koneman, 1987).
2.2.5.3. Hábitat.
Parásito de plantas o saprofítico.
2.2.5.4. Aplicación Industrial.
♣Nigrospora orizae: Moho negro de los granos, pudrición seca de la mazorca y pudrición azulosa de la tusa,(Bayona, 1999).
2.2.6 Acremonium sp.
Subdivisión: Deuteromycotina Clase: Deuteromicetos
Orden: Moniliales Género: Acremonium
2.2.6.1. Morfología Macroscópica.
Moho hialino que forma conidios en racimos. Las colonias son de rápido crecimiento, algodonosas blancas grisáceas o rosadas. Se ven variantes de colonias blancas y gris-amarillas. Su micelio aéreo es muy delicado.
(Rippon 1980).
2.2.6.2 Morfología Microscópica.
Las fiálides son solitarias, erectas, hialinas, delgadas hacia el ápice, están separadas de la hifa por un septo. Las conidias son unicelulares, ocasionalmente son de dos células, hialinas o ligeramente pigmentadas, globosas, ovoides o cilíndricas, basipétalas y se acumulan en el ápice de la fiálide (ocasionalmente forman cadenas que son muy frágiles). Con frecuencia las hifas vegetativas forman micelio entrelazados, (Koneman, 1987), (Ver anexo 1, figura 7).
Comentario: Anteriormente se denominaba el género como Cephalosporium.
2.2.6.3. Hábitat.
Se encuentra en el suelo y en algunas aguas marinas.
2.2.6.4.3 Importancia Industrial.
Este género es importante en la industrial por la producción de importantes antibióticos como lo son las cefalosporinas eficaces contra las bacterias gram positivas y gram negativas. Las cefalosporinas tienen propiedades antibacterianas similares a las penicilinas semisintéticas.
Tienen eficacia terapéutica y baja toxicidad.
2.2.7 Trichoderma sp.
Subdivisión: Deuteromycotina Clase: Deuteromicetes
Subclase: Hyphomycetidae Orden: Moniliales
Familia: Monilaceae Género: Trichoderma
2.2.7.1. Morfología macroscópica.
Las colonias son de crecimiento rápido con un desarrollo difuso que cubre toda la superficie del agar como un cesped amarillo o amarillo verdoso.
Superficie granular o verdosa, (Bayona, 1999).
2.2.7.2. Morfología microscópica.
Hifas hialinas y septadas, conidióforos generalmente cortos y erectos que dan origen a esterigmas romos con puntas pausadas. Conidios de una a dos micras, esféricos o elípticos mantenidos en racimos compactos
mediante una secreción micinosa, (Koneman, 1987), (ver anexo 1, figura 8).
2.2.7.3. Hábitat.
Se hallan especies de Trichoderma, como hongos que aparecen en cualquier tipo de suelo y se consideran no patógenos.
2.2.7.4. Aplicación Industrial.
♣Trichoderma spp: Algunas especies son utilizadas para separar
isómeros óptico en la producción de mentol, producen lactonas que se usan ampliamente en la industria como saborizantes y están caracterizadas por su agradable olor y sabor. Se describe “frutales”,
“similares al coco”, “mantecosas y dulces”. El olor a coco producido por algunas especies de Trichoderma, a sido caracterizada como 6-pentil - α - pirona. Producen dextranasas y celulasas (hidrólisis de la celulaosa), (Bayona, 1999).
Las especies de Trichoderma, son importantes agentes de control, ya que son particularmente efectivas como antagonistas del crecimiento de otros hongos, muchos de ellos patógenos de plantas.
♣T. viride: Produce celulasas y antibióticos capaces de difundirse en el
agua como la alametcina, trichodermicina y otros mas de amplio espectro contra hongos y bacterias; este hongo es utilizado para la producción comercial, de celulasa debido a la facilidad con que esta enzima se separa del micelio. Pueden hidrolizar el herbicida malatión detoxificando los pesticidas y eliminado su actividad.
Pueden producir paja enriquecida en Nitrógeno fertilizador, excelente acondicionador del suelo.
♣T. harzianum : Este hongo es usado como agente de biocontrol contra la
podredumbre blanca en la cosecha de la cebolla. Produce el matabolito harzianopiridona.
♣T. reesei: Este hongo es empleado para la producción de proteínas de
uso industrial. También pueden producir mezclas de importancia biotecnológica.
♣T. polysporum : Produce ciclosporinas (inmunosupresor, previene el
rechazo de órganos), metabolitos secundarios aislados de la fermentación de este hongo. Son polipéptidos cíclicos, no polares que tienen actividad antifúngica. Solamente han sido utilizadas las ciclosporinas A y C, como inmunosupresores en donde la A, es la potent e, ya que tienen actividad
predominante contra las células T ayudadoras. Estas ciclosporinas son utilizadas en el transplante de médula ósea, hígado y páncreas. Pueden presentar síntomas como mareos, temblores, neflotoxicidad, (Bayona, 1999).
2.2.8 Fusarium sp.
Subdivisión: Deuteromycotina Clase: Deuteromicetes
Subclase: Hyphomycetidae Orden: Moniliales
Familia: Tuberculariaceae Género: Fusarium
2.2.8.1. Morfología macroscópica
El aspecto del cultivo es variable. Sin embrago, generalmente las colonias son de crecimiento rápido, inicialmente blancas, cubiertas por un micelio aéreo plumoso, bien desarrollado. Al madurar producen un pigmento de color lavanda a rojo púrpura en la superficie del micelio y en el reverso del agar. Ocasionalmente pueden verse variantes amarillas. La consistencia de colonia habitualmente es algodonosa o lanosa con menos tendencia a hacerse granulosa, (Konema, 1987).
2.2.8.2. Morfología microscópica.
El Fusarium es uno de los hongos saprofitos que producen macroconidias y microconidias. Las microconidias son unicelulares, miden de 2 a 3 micras, elípticas y se originan en pequeñas cabezuelas en las puntas de las fiálides cortas, formando racimos. La identificación de este hongo puede confirmarse observando los característicos macroconidios, multicelulares grandes, puntiagudos con forma de bote, hoz o banana.
Las hifas son hialinas y septadas, (Koneman, 1987), (Ver anexo 1, figura 9).
2.2.8.3. Hábitat.
Las especies de Fusarium son la causa más común de queratitis micótica.
Pueden producir una endoftalmitis en casos que hay penetración de la órbita, como el causado por una espina. También ha sido reportado en lesiones cutáneas en pacientes quemados o en casos de infecciones cutáneas.
2.2.8.4. Aplicación Industrial.
Este género posee varias especies que tienen aplicaciones a nivel industrial, entre estas se encuentran (Bayona, 1999)
♣Fusarium sp: Especie empleada para la producción de proteína
unicelular a partir de su micelio. Miembros de este género producen micotoxinas T-2, F-2, zearalenona y vomitina.
♣F. semitectum: Produce penicilina, acilasa semisintética.
♣F. moniliforme: Es fitopatógno y toxigénico, causa la pudrición roja del maíz y el arroz. Es productor de ácido giberílico y de ácido fusárico.
♣F. graminearum: Pres enta una morfología filamentosa que da una
textura y consistencia de carnes blancas, lo cual posibilita el proceso de producción de micoproteínas para el consumo humano. Entre sus metabolitos secundarios produce zearalenona (promotor del crecimiento en ganado).
♣F. aquaeductuns: Este hongo comúnmente está presente en aguas de desechos domésticos.
2.3. LA PLANTA Espeletia barclayana.
2.3.1 Descripción Botánica del género Espeletia.
Constituyen un conjunto de plantas características de los páramos. El género Espeletia de la familia Asteraceae, tribu Helianthae, subtribu Espelettiinae, como el representante más característico de la vegetación de los páramos, conocidas popularmente como “frailejón”, “orejas de burro”, “trementina”, “tabaquero” o “tabaquillo. Su abundancia es marcada y posee gran diversidad morfológica debido a sus adaptaciones ecológicas y a los factores físicos que incluyen en ellas, (García, 1975).
2.3.2 Descripción de la especie.
Es una planta erecta, de aproximadamente 1.2 metros de altura, de hojas lanceoladas, cariáceas, ligeramente horizontales, formando roseta, medianamente carnosas, desentemente lanosas, de 28 centímetros de largo, pseudopecioladas y con pelos amarillos blanquecinos. Lámina foliar de 19 centímetros de larga y de 4.5 a 9.0 centímetros de ancho, de forma ovadolancelada, margen foliar entero revoluto, nervadura plana por el haz, incospicua por el envés, con pelos tenuamente torcidos en los extremos reclinados; vaina foliar (parte que abraza el tallo) rígido carnosacoriácea base de 6.5 a 9.0 centímetros de largo y de ancho de 7.0
a 10.5 centímetros multinervia. Influorescencia de 40 a 57 centímetros de largo, erecto, consistencia dura, sin hojas, carnoso, lanoso amarillo banquecino, la parte terminal con brácteas que protegen de 5 a 11 cabezuelas turbinada-globosas de aproximadamente 3 centímetros de diámetro. Involucro en forma de capa amarillo-balnco-lanoso, flores fértiles de 10 a 14 milímetros de largo por 2.2 a 5 milímetros de ancho.
Flores feminadas con estilos de 6.0 a 10 milímetros que se unen al ovario ovoideo triangular. Flores masculinas con anteras de 3 a 3.5 milímetros de bas, tenuamente sagitadas apéndice ovado oblongado. Receptáculo plano-convexo de 9.0 a 10 milímetros de diámetro, sin pelos, carola amar illa formando un tubo de 28 a 35 milímetros de largo, (Cuatrecasas, 1950).
2.3.3 Clasificación taxonómica.
Según el sistema filogénico realizado por Cronquist ( Cuatrecasa, 1950), la planta de estudio se encuentra incluída en las siguientes categorías taxonómicas:
Tabla 1. Taxonomía de la Espeletia barclayana
REINO Plantae
DIVISION Spermatophyta
SUBDIVISION Magnoliophyta
CLASE Magnoliateae
SUBCLASE Asteriadae
ORDEN Asterales
FAMILIA Compositae
TRIBU Heliantheae
GENERO Espeletia
ESPECIE Espe letia barclayana
2.4. Métodos de Conservación.
En la Industria Biotecnológica es necesario mantener un stock de cepas que conserven las características originales. Una de las causas más frecuentes de resultados erróneos de micología, es el uso de cultivos contaminados. Los cultivos de organismos de interés que se mantienen en el laboratorio para su estudio y como referencia recibe el nombre de
cultivos de referencia. Un cultivo de referencia debe mantenerse libre de contaminación, estable y genéticamente homogéneo.
Los cultivos que se utilizan con poca frecuencia se pueden conservar en colecciones comerciales. Para conservar durante largo tiempo los cultivos, se pueden utilizar técnicas diferentes, como son la criopreservación, congelación en nitrógeno líquido, cuya temperatura mantiene la viabilidad efectiva, también puede ser desecados por congelación (liofilización), en suelo o en aceite mineral, (Casas, 1989).
2.4.1. Conservación en suelo.
Forma de mantener microorganismos en substratos como suelos de diferentes texturas, los cuales en bajas condiciones de humedad mantienen viables los microorganismos reduciendo su capacidad reproductiva. Estas muestras deben mantenerse a temperatura ambiente, ya que a mostrado la viabilidad de muchos hongos por años. (Casas, 1989). Se utiliza una suspensión de esporas crecida en un medio estéril por alrededor de 10 días, los cultivos son introducidos en suelo estéril en una suspención de tween, y llevados a refrigeración a una temperatura de 5 – 8 ºC. Este método es recomendable para especies de Fusarium sp.
por largos periodos de tiempo (Gordon, 1980).
Algunas ventajas en el mantenimiento de cepas de hongos filamentosos en suelo estéril, son que estas no presentan cambios morfológicos
visibles, se pueden conservar con un periodo de tiempo de 10 años, la recuperación de las cepas es fácil y rápida, se puede utilizar un poco de la muestra preservada y el resto pude ser guardada para futuros pases de la cepa teniendo en cuenta sistemas de esterilidad para evitar una contaminación de la cepa preservada, el método es poco costoso y no requiere un equipo sofisticado para la implementación en un laboratorio (Chang, 1986).
Su preparación en laboratorio es fácil, se somete el suelo previamente sernido (libre de partículas gigantes) a una Tindalización, luego se someten los hongos o el microorganismo a conservar a un lavado con Tween al % 0.25, para que suelten sus esporas y se agrega al suelo, se pueden almacenar en nevera o a temperatura ambiente, éste método es el que se está empleando para conservar lo hongos de este proyecto.
3. JUSTIFICACIÓN
Teniendo en cuenta la importancia de la evaluación del crecimiento de hongos filamentosos nativos aislados de plantas promisorias Colombianas, y la poca información que hay acerca de ello en nuestro país, el Grupo de Biotransformación del Departamento de química de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana, ha venido adelantando una serie de estudios sobre manifestaciones químicas y
morfológicas de dichos microor ganismos, entre los que sobresale la determinación de la tasa de crecimiento hifal en medio Agar Papa Dextrosa y extractos de levadura, por crecimiento radial y Carrageenan X 4910 con el peso específico de algunos de los hongos filamentosos aislados de la planta Espeletia barclayana; planta recolectada en el páramo el tablazo en el Municipio de Subachoque Cundinamarca sobre uno 3.800 m.s.n.m. aproximadamente en el año de 1998.
Dando así un nuevo paso en el estudio químico y biológico del género Espeletia, que viene realizando dicho departamento (GIBUJ).
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL.
Obtener la tasa de crecimiento radial en medios Papa Dextrosa Agar y Papa Dextrosa Carageenan X 4910 y la tasa de crecimiento específico en medio Papa Dextrosa Carageenan X 4910, de hongos filamentosos aislados de la planta Espeletia barclayana, y correlacionar los resultados obtenidos determinando cual de los dos métodos es el apropiado para medir el crecimiento de hongos filamentosos en un cultivo sólido.
4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS.
•Obtener la tasa de crecimiento radial en medio Papa Dextrosa
Carageenan X 4910 y medio Papa Dextrosa Agar, de algunos hongos filamentosos aislados, de la planta Espeletia barclayana
•Determinar la tasa de crecimiento específico en el medio Papa Dextrosa Carageenan X 4910, de algunos hongos filamentosos aislados de la planta Espeletia barclayana.
•Correlacionar la tasa de crecimiento radial con la tasa de crecimiento
específico, de los hongos filamentosos aislados de la planta Espeletia barclayana.
5. HIPOTESIS
•La tasa de crecimiento específico, da una aproximación mayor del grado de crecimiento de los hongos filamentosos aislados de la planta Espeletia barclayana, que la tasa de crecimiento radial.
6. MATERIALES Y METODOS
El desarrollo del proyecto presentado, se llevó a cabo en el laboratorio de bioensayos, (Lab. 128. Edificio, Carlos Ortíz), del Departamento de Química de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana.
Los hongos trabajados, fueron del cepario del GIBUJ, los cuales se encontraban conservados en suelo, desde 1998 año en el cual fueron realizados los primeros estudios con Espeletia barclayana.
La población, fue de 22 hongos aislados de las hojas de la planta Espeletia barclayana. Las condiciones del crecimiento para los hongos filamentosos y su desarrollo en el trabajo fueron: 23ºC, 10 horas luz y de 10 a 15 días.
6.1. Activación.
Se esparcieron gránulos del suelo con el hongo conservado, con una pinza de kelly en 5 cajas de petri con Agar Papa Dextrosa (PDA), después de 5 o 7 días el crecimiento sospechoso del hongo a recuperar se pasó a una nueva caja de petrí con PDA, de la cual se obtuvo el hongo puro que fue resembrado en medio PDC X 4910.
6.2. Identificación Macroscópica y Microscópica.
En la identificación de hongos filamentosos juega un rol muy importante las características morfológicas macroscópicas y microscópicas, por lo que se tuvo en cuenta lo siguiente:
6.2.1. OBSERVACION MACROSCOPICA.
El micelio se debe describir según:
- Su situación aérea (razante a la superficie o elevado) o profundo - Su morfología. Velludo, glabro, rugoso, aterciopelado, pulverulento, algodonoso etc.
*Su coloración, café, negro, grisáceo etc.
*Producción o no de pigmentos que difundan al medio
6.2.2. OBSERVACION MICROSCOPICA.
Se observó las estructuras lo más intacta posible.
Se observó directamente la placa de Petri (microcultivos), con bajo aumento, (10 X). Las preparaciones se hicieron entre lámina y laminilla.
Se colocó en un portaobjeto una gota de una solución aclarante de Lactofenol o KOH al 10 % o de una solución colorante de azul de
metileno.
Se cortó, con el asa, una pequeña porción del material a estudiar. Para disminuir el daño, aunque se puede utilizar un trocito de cinta adhesiva que se presiona suavemente sobre el cultivo.
Se coloca el material o el trozo de cinta en la gota, se cubre con un cubreobjeto y se presiona suavemente. Se observa con bajo aumento (40 X), (Barnett, 1984).
6.3. Determinación del crecimiento radial.
Al obtener el crecimiento en un medio de cultivo con la cepa pura con un saca bocado de 0.25mm de diámetro se hizo un subcultivo en 20 cajas de petrí de 5cm de diámetro con PDC X-4910 por punción en el centro.
Después de 24 horas se empezaron a efectuar las correspondientes mediciones del crecimiento radial por duplicado del hongo a evaluar durante 10 a 15 días de forma transversal y longitudinal empleando reglillas , (Prosser, J. I. 1991), Figura 13, ( Ver anexo 2 y 3).
6.4. Determinación del crecimiento específico.
Después de medir el crecimiento radial, se sometió la muestra a 60ºC en un horno graduado y se retiró el medio PDC X 4910 desgelficado de 15 a
