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Influencia de diferentes variantes de biofertilización sobre variables morfofisiológicas y el rendimiento del frijol común (Phaseolus vulgaris L )

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Academic year: 2020

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(1)Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas Facultad de Ciencias Agropecuarias Carrera de Agronomía. Influencia de diferentes variantes de biofertilización sobre variables morfofisiológicas y el rendimiento del frijol común (Phaseolus vulgaris L.). Tesis para aspirar al título de Ingeniera Agrónoma. Diplomante: Beatriz Díaz Pérez. Tutora: Dra. C. Ariany Colás Sánchez. Santa Clara, 2017.

(2) Pensamiento.

(3) “La ciencia no tiene anchos caminos reales y sólo puede alcanzar sus cimas radiantes, quien sin temor al cansancio, trepa por sus senderos pedregosos”. Carlos Marx.

(4) Dedicatoria.

(5) A mis padres, y padrastro por su apoyo durante toda mi carrera. A mis tías Dania Bárbara y Ania. A mis hermanos Rubén David, Nelvis Vitalia y Jorge. A toda mi familia y amigos por su apoyo y comprensión en todo momento ..

(6) Agradecimientos.

(7) A mis padres y padrastro, que siempre han confiado en mí. A mis hermanos por su apoyo incondicional. A todos mis familiares y en especial a mis tías Dania Bárbara y Ania por su ayuda y cooperación A mi tutora Dra. C. Ariany Colás Sánchez por toda su ayuda, cooperación y el tiempo dedicado en mi formación. A Mi novio Ernesto Jesús por su ayuda en todos los momentos A mis abuelas por haberme guiado con amor y dedicación A mis compañeros y amigos por toda su ayuda y cooperación. A todos mis profesores que de una forma u otra me educaron, enseñaron y dieron todo lo posible para este final. A la Revolución cubana por todas sus bondades. A todos muchas gracias..

(8) Resumen.

(9) .........................................................................................................................................................Resumen. Resumen Con el objetivo de evaluar el efecto de la inoculación simple Rhizobium pisi y Ecomic sobre variables morfofisiológicas y el rendimiento del frijol común, se desarrolló la presente investigación en la época de siembra intermedia de la campaña 2015-2016 (noviembre – enero), sobre un suelo Pardo mullido medianamente lavado, en áreas de la CCS “Lino del Rio”. En el estudio se utilizó el genotipo local Delicia-364 y fueron evaluados los parámetros de nodulación, la biomasa radicular y del follaje, rendimiento agrícola y sus componentes, así como los posibles mecanismos de promoción del crecimiento vegetal de las cepas utilizadas. Todas las variantes de inoculación incrementaron la nodulación y por consiguiente la biomasa seca. Los valores máximos en el número de nódulos se lograron con la inoculación de la cepa R. pisi 40983. Los componentes del rendimiento agrícola y el rendimiento agrícola fueron positivamente estimulados con la inoculación de R. pisi 40983 y 40982 alcanzando más de 340 kg ha -1. Ambas cepas de R. pisi produjeron AIA y solo el 13% de los productores aplican la biofertilización con Rhizobium en la localidad objeto de estudio..

(10) Índice.

(11) …………………………………………………………………………………………………….…………………………………………Índice. Índice 1. Introducción ........................................................................................................................ 1 2. Revisión Bibliográfica ......................................................................................................... 3 2.1 El frijol común, su origen y distribución .............................................................................. 3 2.2. Bacterias simbióticas ....................................................................................................... 6 2.2.1 Interacción Rhizobium – leguminosa ........................................................................... 7 2.2.2. Las bacterias del género Rhizobium en el suelo.......................................................... 9 2.3 Factores abióticos que influyen en la nodulación ...............................................................10 2.3.1 Acidez de suelo (pH) .................................................................................................10 2.3.2 Temperatura.............................................................................................................11 2.3.3 Nut rient es del suelo (N y P) .......................................................................................12 2.3.4 Estrés hídrico (Nivel de humedad en el suelo) ............................................................13 2.4 Factores bióticos que influyen en la nodulación .................................................................14 2.4.1 Asociación con micorrizas .........................................................................................14 3. Materiales y métodos .........................................................................................................16 3.1 Localización y caracterización de la zona de estudio .........................................................16 3.1.1 Caracterización de las propiedades del suelo y las condiciones climáticas del área de estudio .............................................................................................................................16 3.2 Cepas bacterianas y preparación del inóculo ....................................................................17 3.3 Montaje del experimento y condiciones de crecimiento ......................................................18 3.3.1 Trat amient os ............................................................................................................19 3.4 E valuaciones ..................................................................................................................19 3.1.3 Det erminación de la producción de ácido -3-indolacético..............................................20 3.4 Aplicación de encuesta a productores ..............................................................................20 3.5 Procesamiento Estadístico...............................................................................................20 4. Resul tados y di scusión ......................................................................................................21 4.1 Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre la biomasa seca de la raíz y del follaje a los 21 días después de la siembra (DDS) ............................................................................21.

(12) …………………………………………………………………………………………………….…………………………………………Índice 4.2 Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre la nodulación, la biomasa radicular y del follaje a los 42 DDS .........................................................................................................22 4.3 Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobr e indicadores del rendimiento............24 4.3.1 Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre el rendimiento agrícola ............27 4.3.2 Correlación entre los parámet ros evaluados durante el ciclo del cultivo ........................29 4.4. Producción de ácido indolacético (AIA) por las cepas de Rhizobium empleadas en el estudio ............................................................................................................................................34 4.5 Análisis de la motivación de los productores por la aplicación de variantes de biofertilización ............................................................................................................................................35 5. Conclusione s ......................................................................................................................37 6. Recomendaciones ..............................................................................................................38 7. Referencias bibliográficas ..................................................................................................... 8. Anexos....................................................................................................................................

(13) Índice de figuras.

(14) ……………………………………………………………………………………Índice de figuras. Índice de figuras Figura 1. Duración de las etapas de desarrollo del frijol (VD a R9) y los cuatro hábitos de crecimiento.……………………………………………………………………................... Figura 2. Diagrama esquemático del desarrollo del nódulo.................................................................................................................... Figura 3 Localización del área donde se condujo el experimento de campo (Miller), municipio Placetas, provincia Villa Clara........................................................................................................................... Figura 4. Efecto de la inoculación sobre el número de nódulos (NN) y el peso seco de los nódulos (PSN) a los 42 DDS………………………………………………… Figura 5. Rendimiento agrícola (kg ha-1) al momento de la cosecha………………………………………………………………………………………. Figura 6. Análisis de correlación entre los parámetros de nodulación con el follaje y rendimiento agrícola……………………………………………………………………… Figura 7. Dinámica de crecimiento y producción de AIA en el cultivo de bacterias después de 48 horas de incubación……………………………………………………… Figura 8. Preferencias de los campesinos por la biofertilización…………………….... 4 8 16 22 28 33 34 38.

(15) Índice de tablas.

(16) ………………………………………………………………………………………Índice de tablas. Índice de tablas Tabla 1. Síntesis de los principales factores que inciden en el rendimiento.......... Tabla 2. Factores que afectan la supervivencia de bacterias en el suelo....................................................................................................................... Tabla 3. Propiedades de suelo tomadas a la profundidad de 20 cm en el área del experimento…………………………………………………………………………. Tabla 4. Promedio de datos climáticos durante el ciclo del cultivo (época intermedia)……………………………………………………………………………….. Tabla 5. Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre la biomasa radicular y del follaje a los 21 DDS……………………………………………………. Tabla 6. Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre la biomasa radicular y del follaje a los 42 DDS……………………………………………………. Tabla 7. Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre componentes del rendimiento agrícola en el frijol……………………………………………………. Tabla 8. Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre indicadores del rendimiento agrícola……………………………………………………………………. Tabla 9. Coeficientes de correlación de Pearson entre las direferente parámetros evaluados durante el ciclo del cultivo.................................................. Tabla 10. Principales variedades de frijol cultivadas por los productores de la región…………………………………………………………………………………….... 6 9 17 17 21 24 25 27 30 36.

(17) Introducción.

(18) …………………………………………………………………………………………Introducción. 1. Introducción El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es la especie más transcendental del género Phaseolus, cultivada en gran parte del mundo (Broughton et al., 2003; Martínez-Romero, 2003; Beebe, 2012). Dicha leguminosa es una importante fuente de proteínas, vitaminas y minerales para más 500 millones de personas en Latinoamérica, África y el Caribe (Cortés et al., 2013). Mediante la formación de nódulos en las raíces de dicha planta como toda leguminosa, se lleva a cabo la Fijación Simbiótica del Nitrógeno (FSN), en asociación con rizobacterias denominadas colectivamente rizobios, agrupando los géneros. Rhizobium,. Sinorhizobium,. Mesorhizobium,. Bradyrhizobium,. Allorhizobium y Azorhizobium (Weidner et al., 2003). Este proceso entre el frijol común y bacterias fijadoras de nitrógeno es crucial en la producción de otros cultivos agrícolas. Los mayores beneficios de la interacción simbiótica, leguminosa – rizobios fueron definidos por Giller (2001) como la reducción en la aplicación de fertilizantes nitrogenados y las mejoras en el crecimiento y salud de las plantas. La Fijación Biológica del Nitrógeno (FBN) ha sido extensamente utilizada en lugar de los fertilizantes nitrogenados en la producción de leguminosas por su eficiencia económica en los agroecosistemas sostenibles (Ouma et al., 2016). El uso de cepas nativas de Rhizobium como biofertilizantes contribuye al mantenimiento de la biodiversidad del suelo, mediante la disminución de los efectos negativos de los fertilizantes minerales (Nkot et al., 2015). Sin embargo en la provincia de Villa Clara, aún es insuficiente el uso de variantes de biofertilización, que contribuyan al incremento de los parámetros del rendimiento del cultivo del frijol. Sistemas simbióticos como el de las leguminosas y rizobios pueden ser la mayor fuente de N en la mayoría de los sistemas agrícolas con un promedio de 80% del nitrógeno requerido de la fijación biológica del N2 (Graham y Vance, 2000). Sin embargo, la habilidad de este cultivo para adquirir nitrógeno del suelo es limitada (Hardarson, 2004; Polania et al., 2016), por lo que el frijol común es considerado un pobre fijador de nitrógeno, en comparación con otras leguminosas, con alrededor de 1.

(19) …………………………………………………………………………………………Introducción. un 40% del N2 derivado de la asociación. Puede fijar más de 100 kg ha -1 de nitrógeno en regiones tropicales y regiones templadas, a pesar de que el proceso de FSN en climas cálidos nunca alcanza estos niveles, por lo que incrementar dicho proceso en el cultivo del frijol será una alternativa económica y sostenible para pequeños agricultores. Las consideraciones anteriores conllevan al planteamiento de la siguiente hipótesis: La inoculación de diferentes biofertilizantes, en la época de siembra intermedia, contribuye eficientemente al incremento de las variables morfofisiológicas y el rendimiento del cultivo del frijol común. Para dar cumplimiento a la hipótesis se plantean como objetivos: Objetivo general Evaluar la influencia de diferentes biofertilizantes sobre la nodulación, variables morfofisiológicas y el rendimiento del frijol común. Objetivos específicos 1. Determinar el efecto de las variantes de inoculación en las variables de nodulación y morfofisiológicas del frijol común. 2. Evaluar la influencia de la inoculación sobre el rendimiento agrícola y sus componentes. 3. Determinar los posibles mecanismos de promoción de crecimiento de las las bacterias empleadas. 4. Diagnosticar el uso de la biofertilización por parte de los productores de la región en estudio.. 2.

(20) Revisión bibliográfica.

(21) …………………………………………………………………………………..…Revisión bibliográfica. 2. Revisión Bibliográfica 2.1 El frijol común, su origen y distribución El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es uno de los cultivos más antiguos. Su domesticación. ocurrió. independientemente. en. Sur. América. y. América. Central/México, dando lugar a dos acervos genéticos diferentes, el Andino y Mesoamericano (Hernández-López et al., 2013). El género Phaseolus se clasifica dentro de la familia Leguminoseae. Se cultiva en zonas tropicales y regiones templadas. Esta característica permite agruparla en las denominadas especies termófilas, dado que no soporta bajas temperaturas, y presenta una enorme variabilidad genética (Arias et al., 2007). Según Cronquist citado por Franco et al. (2004) su ubicación taxonómica es: Reino: Plantae, División: Magnoliophyta, Clase: Magnoliopsida, Subclase: Rosidae, Orden: Fabales, Familia: Fabaceae, Género: Phaseolus, Especie: Phaseolus vulgaris L. El frijol es una planta dicotiledónea de consistencia herbácea, el ciclo biológico es de entre 80 – 100 días en el cual la planta requiere de 350-500 mm en dependencia de la profundidad del perfil, el suelo, las condiciones climáticas y el genotipo (Beebe et al., 2013). El ciclo del cultivo está bien distribuido en 10 etapas de desarrollo, incluyendo cinco para el crecimiento vegetativo y cinco para el desarrollo reproductivo. Desarrollo vegetativo son: germinación (Vo), emergencia (V1), hojas primarias (V2), primera hoja trifoliada (V3) y tercera hoja trofoliada (V4) y el desarrollo reproductivo: pre-floración (R5), floración (R6), formación de legumbre (R7), llenado de la legumbre (R8) y madurez (R9), según Polanía (2016). Esta legumbre presenta cuatro hábitos de crecimiento los cuales han sido descritos por (Barbosa et al., 2016): Tipo I: se caracteriza por plantas que presentan brotes e inflorescencias terminales reproductivas (determinadas), erecto rama, y sin capacidad de escalada. 3.

(22) …………………………………………………………………………………..…Revisión bibliográfica. Tipo II: hábito de crecimiento erecto pero con un crecimiento vegetativo terminal de creciente brotes que son indeterminados Tipo III: hábito de crecimiento que también es indeterminado, pero más postrados, con los brotes de crecimiento de terminales Tipo IV: incluye, plantas indeterminadas de altura con un crecimiento alto, entrenudos largos, yemas vegetativas terminales, y una fuerte capacidad trepadora. Figura 1. Duración de las etapas de desarrollo del frijol (VD a R9) y los cuatro hábitos de crecimiento. Fuente: Barbosa (2016).. 4.

(23) …………………………………………………………………………………..…Revisión bibliográfica. Las flores son vistosas, hermafroditas, por lo general zigomorfas (UNEX, 2005). El fruto generalmente es seco y dehiscente (legumbre). Las semillas presentan un hilum especializado y complejo, pueden tener varias formas y ser de un solo color o poseer varios colores (UNEX, 2005). El sistema radical está compuesto por una raíz principal, un gran número de raíces secundarias y raicillas. Al germinar, es de crecimiento rápido. Este cultivo posee la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico por la simbiosis con la bacteria del género Rhizobium a partir de la formación de nódulos en sus raíces (Quintero, 2002). P. vulgaris L. forma parte del grupo de leguminosas comestibles. Considerándose estratégico, teniendo en cuenta sus propiedades nutricionales y culinarias, además de por su amplia distribución mundial, así como su importancia para el desarrollo rural y social de muchas economías (Pacheco et al., 2016). En estudios realizados por la Comisión Económica para América Latina y el Caribe (CEPAL) fue definido este importante grano como alimento tradicional, como fuente de sustento económico, además de un elemento de identificación cultural (CEPAL, 2014). La mayor contribución del frijol común a escala mundial está asociada a la seguridad alimentaria. Sus granos son nutricionalmente ricos en hierro, proteínas y una fuente de fibras y carbohidratos (Beebe et al., 2013). Aunque su mayor valor nutricional es atribuido al alto contenido de proteínas que oscila entre el 12% y el 25% del peso de las semillas secas, es decir, 2.5 veces mayor al de los cereales (IIG, 2013). En Cuba las condiciones edafoclimáticas son favorables para el cultivo del frijol, por lo que se produce en todo el territorio nacional. A pesar de ello, el país como resto del mundo, no se encuentra exento de algunas problemáticas que limitan su producción y rendimiento. En la Tabla 1 se describen valores promedios de algunos de esos indicadores entre los años 2005 y 2014, en países de Centroamérica y el Caribe como Guatemala y Nicaragua. La dependencia de las importaciones para cubrir el consumo doméstico de este componente esencial de la dieta de la población hacen de este un cultivo estratégico (Pacheco et al., 2016).. 5.

(24) …………………………………………………………………………………..…Revisión bibliográfica. Tabla 1. Síntesis de los principales factores que inciden en el rendimiento Factores. Impacto en los rendimientos. Estrés hídricos. Reducción hasta 73%. Incidencia de plagas y enfermedades. Reducción hasta 50%. Ataque de insectos durante la conservación o almacenamiento. Reducción hasta 5%-10%. Resistencia varietal o genética. Mitiga el impacto de los factores anteriores. Manejo y disciplina tecnológica Secado y beneficio del gano. Efecto controlador y preventivo Garantiza más de 0.8 tha-1. Intensidad tecnológica Fuente: (Pacheco et al., 2016). 2.2. Bacterias simbióticas Hasta la actualidad las únicas bacterias capaces de realizar el proceso de Fijación Simbiótica del Nitrógeno (FSN) son aquellas comúnmente conocidas como rizobios. Sin embargo, estas incluyen 6 géneros bacterianos los que se asocian con diferentes plantas pertenecientes a la familia Fabaceae (Weir, 2006), además de taxas independientes reporta que esta interacción incluye los bien conocidos grupos de alfa-proteobacterias de la familia Rhizobiaceae conteniendo los géneros Azorhizobium,. Bradyrhizobium,. Ensifer. (Sinorhizobium),. Mesorhizobium. y. Rhizobium; junto con los taxas: Methylobacterium (Sy et al., 2001) y Devosia (Rivas et al., 2002), Herbaspirillum (Valverde et al., 2005), Ochrobactrum (ZurdoPiñeiro et al., 2007), Phyllobacterium (Valverde et al., 2005), Shinella (Lin et al., 2008). y miembros del grupo de beta-proteobacteria tales como: Burkholderia. (Moulin et al., 2001), Cupriavidus (Ralstonia) (Chen et al., 2001) La taxonomía de los rizobios se ha desarrollado rápidamente y durante los últimos 20 años se han descrito muchas especies y géneros nuevos. La aplicación de los métodos de biología molecular en la taxonomía ha ayudado a descubrir nuevas especies de estos géneros. La taxonomía actual de estas bacterias se basa en un enfoque polifásico que incluye caracterizaciones de morfología, bioquímica, fisiología, genética y filogenia, entre otras (Giller et al., 2001). El uso del enfoque polifásico ha 6.

(25) …………………………………………………………………………………..…Revisión bibliográfica. conferido a la taxonomía una base más natural y más confiable. Se estima que los rizobios no conocidos en el mundo representan un recurso biológico porque las leguminosas son uno de los grupos de plantas más grande y diverso y éstas se encuentran distribuidas en distintos ecosistemas. Sólo se han investigado los microsimbiontes de un pequeño número de ellas. Seguramente nuevos rizobios se conocerán cuando se caractericen más aislados (Wang y Martínez-Romero, 2004). Los rizobia son bacterias del suelo que inducen la formación de nódulos en raíces (y tallos en algunas especies) de plantas leguminosas, en los cuales ocurre el proceso de FSN. Los mayores beneficios de la interacción Rhizobium-leguminosa están atribuidos a la disminución de la aplicación de fertilizantes nitrogenados, el incremento del crecimiento y rendimiento de las plantas y la sanidad vegetal Giller (2001). Esta asociación simbiótica es capaz de incorporar el 80% del N2 biológicamente fijado en sistemas de producción agrícolas (Graham y Vance, 2000). Sin embargo el frijol, es considerado una leguminosa pobre en el proceso de fijación simbiótica (Bacem et al., 2007). Phaseolus vulgaris, como todas las plantas leguminosas, es capaz de realizar el proceso de fijación simbiótica de nitrógeno (FSN) con la asociación de rizobacterias comúnmente conocidas como rhizobia que agrupa a endosimbiontes de los géneros Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium and Azorhizobium (Weidner et al., 2003). 2.2.1 Interacción Rhizobium – leguminosa La formación de nódulos radicales en plantas leguminosas es un complejo proceso que resulta en la fijación simbiótica del nitrógeno y requiere de la interacción armónica entre la planta huésped y las bacterias del género Rhizobium en la rizosfera (Figura 2). Muchas especies de bacterias y plantas son extremadamente. específicas,. sin. embargo. algunas. especies. de. rhizobio. interactúan con un gran número de leguminosas (Pueppke y Broughton, 1999). La nodulación tiene lugar solo cuando adecuadas especies de leguminosas y Rhizobium establecen contacto (Wais et al., 2002). La excreción de compuestos. 7.

(26) …………………………………………………………………………………..…Revisión bibliográfica. específicos y la inducción de la actividad del gen nod en el microsimbionte es el principal papel de la planta huésped en el proceso.. Figura 2. Diagrama esquemático del desarrollo del nódulo. Después de la recepción de las señales flavonoides del exudado de la raíz, las bacterias se adhieren a la superficie de los pelos radiculares. La producción del factor Nod por la bacteria inicia la secuencia de eventos (izquierda a derecha), lo cual al nivel morfológico incluye el engrosamiento, deformación y encrespamiento del pelo radical, la formación del hilo de infección que surgen de las células bacterianas encapsuladas, el crecimiento del hilo de infección hacia el primordio de nódulo con la liberación de las bacterias a través de gotitas de infección (Adaptado de Kinkema et al., 2006).. El intercambio de señales entre ambos simbiontes es el primer paso de la formación de los nódulos (Oldroyd, 2011; Hayashi et al., 2014). La raíz de la planta libera exudados (flavonoides y nutrientes como ácidos orgánicos y amino ácidos) que atrae las bacterias a un sitio partícular de la raíz de la planta y activa la secreción del factor nod por la bacteria (Russelle, 2008). Después del reconocimiento del factor nod por la planta, los rhizobio se adhieren a los pelos de la raíz y promueve su deformación y la división cortical en la corteza de la raíz (Ferguson et al., 2010).. 8.

(27) …………………………………………………………………………………..…Revisión bibliográfica. Las bacterias son después atrapadas en el pelo enroscado de la raíz y penetra en la planta mediante el hilo de infección. Una vez dentro, las bacterias se multiplican rápidamente en las células de la planta y son transformadas en bacteroides, los cuales se convierten rodeadas por las membranas de la planta para formar simbiosomas (Hayashi et al., 2014). En esta estructura, las bacterias inician la conversión de N2 a NH3, el cual resulta en el proceso de fijación de nitrógeno. 2.2.2. Las bacterias del género Rhizobium en el suelo Anterior a la nodulación Rhizobium debe funcionar independiente de la planta hospedera como parte de la población global del suelo y como colonizadora de la rizosfera. Por lo tanto, el suelo es el reservorio de las cepas de Rhizobium y la composición intrínsecas del suelo puede afectar el resultado de la competencia. Sin embargo, pese a numerosos factores limitantes las mismas sobreviven en el suelo (Streeter, 1994), estas bacterias son habitantes comunes del suelo en todas las zonas climáticas del mundo (Fagerli y Svenning, 2005;). La supervivencia de Rhizobium sp.. en el suelo. es influenciada por la combinación de factores,. algunos de ellos son explicados en la Tabla 2. Tabla 2. Factores que afectan la supervivencia de bacterias en el suelo Origen Biótico. Factor Depredación Competencia Crecimiento de la raíz. Abiótico. Minerales arcillosos Presión del agua. Carbono orgánico Nutrientes inorgánico (N, P) pH Temperatura Químicas tóxicos). (residuos. Efecto Disminución del tamaño de la población Disminución del tamaño de la población/ efecto antagonista sobre los patógenos de plantas Liberación de compuestos orgánicos Protección contra los pedradores Alta tensión: almacenamiento del agua, alta osmolaridad Baja tension: anaerobismo, aumento de la disponiblidad de nutrientes por difusión Selección de especies oligotróficas, limita el carbon orgánico lo cual resulta en la reducción de actividad La limitación resulta en inanición Selección de especies; liberación de nutrientes (e.g., P) o compuestos tóxicos (e.g., Al 3+). Actividad metabólica así como biótica (predadores). Inhibición de organismos sensibles; la selección de las formas de biodegradación, resistentes o tolerantes. Fuente: (Van Veen et al., 1997). Numerosos factores abióticos de suelo juegan un importante papel en la supervivencia de las bacterias en la rizosfera (Tipo de textura, pH, temperatura y 9.

(28) …………………………………………………………………………………..…Revisión bibliográfica. humedad (Evans et al., 1993), disponibilidad de nutrientes y sistema de manejo agrícola (Laguerre et al., 2006).. Además, numerosos factores bióticos puede. influir en el número y diversidad de de bacterias indígenas, particularmente la competencia con otros microorganismos de suelo, como hongo y protozoos. Comprender como las bacterias de Rhizobium que habitan en la rizosfera de la planta son afectados por los factores medioambientales es de crucial importancia para incrementar la disponibilidad de nitrógeno en una agricultura en la que la principal fuente de nitrógeno son las leguminosas. 2.3 Factores abióticos que influyen en la nodulación 2.3.1 Acidez de suelo (pH) La diversidad y persistencia de las bacterias del género Rhizobium en el suelo significativamente afectada por la acidez del suelo (Andrade et al., 2002). Los suelos ácidos han sido asociados con baja nodulación (Chemining’wa y Vessey, 2006). Numerosos eventos en el proceso de simbiosis son muy sensibles a los bajos niveles de pH (Duzan et al., 2004). La acidez extrema del suelo es frecuentemente vinculada a la toxicidad por Al y Mn, los cuales inhiben el crecimiento de la leguminosa y reducen el suministro de Ca. Este estrés adicional impacta en la densidad de población de Rhizobium en el suelo (Campo, 1995). El microsimbionte es usualmente más sensible al pH Hungria y Vargas (2000), la acidez parece ejercer una mayor influencia en algunas bacterias formadoras de nódulos, mientras que otras son más resistentes, dentro de las especies, las cepas pueden variar enormemente en su resistencia a un pH bajo (Vlassak, 1996; Brockwell et al., 1995; Hungria et al., 1997). Incluso cuando el pH óptimo para el crecimiento de Rhizobium es entre 6 y 7 (Jordan, 1984), algunas especies son capaces de sobrevivir a pH ≤5.0 (Ademar et al., 2012). Algunas especies han sido reportadas como altamente sensibles a la acidez del suelo, dentro de estas Rhizobium tropici, Mesorhizobium loti, Bradyrhizobium sp. y Sinorhizobium meliloti (Brockwell et al., 1995). En ese sentido (Appunu et al., 2009) reportaron que cepas de Bradyrhizobia, aisladas de plantas de caupí pudieron resistir condiciones ácidas extremas, la cuales sobrevivieron y crecieron a pH bajo, incluso a 3,5. Sin 10.

(29) …………………………………………………………………………………..…Revisión bibliográfica. embargo, Bradyrhizobium japonicum pudo tolerar mayores valores de acidez que Sinorhizobium fredii. En extremas condiciones de acidez, la capacidad de nodulación. de. estas. especies. fue. principalmente. influenciado. por. sus. características fisiológicas (Yang et al., 2001). 2.3.2 Temperatura Temperaturas extremas en el suelo y especialmente el calor son factores que afectan el crecimiento y supervivencia de Rhizobium y consecuentemente la densidad de población. Las altas temperaturas de suelo en las regiones tropicales son la principal limitante para la FSN por las plantas leguminosas Revisado por Zhara (1999). En estos suelos los límites superiores para la supervivencia están entre 32-47 °C aunque la tolerancia entre especies y cepas (Hungria y Vargas, 2000). La temperatura óptima para la mayoría de las bacterias de este género es 25–30 °C (Zhang et al., 1995). Sin embargo, durante su ciclo de vida, las bacterias son con frecuencia expuestas a altas temperaturas, nodulación efectiva en garbanzo (Cicer arietinum L.) a bajas temperaturas (9–15°C) fue reportado por (Ogutcu et al., 2008). La tolerancia a las altas temperaturas de cepas de Rhizobium han sido atribuidas a la fuente de carbono en el medio de cultivo (Naeem et al., 2008). Aunque se debe descartar que la tolerancia a la temperatura de estas cepas puede depender también de las condiciones medioambientales, las cuales no se pueden reproducir en condiciones de laboratorio. De hecho, otros estudios indican que rhizobio tolera mayores temperaturas en el suelo que el medio de cultivo (Räsänen et al., 2001). Las diferencias en la tolerancia a las altas temperaturas entre especies y cepas de Rhizobium ha sido reconocida y la selección de cepas tolerantes ha sido sugerida como solución para la disminución del estrés antes las altas temperaturas (Surange et al., 1997). Algunos estudios han confirmado que R. tropici soporta mayores temperaturas que R. leguminosarum and R. etli (Sá et al., 1993). Algunas cepas aisladas de ambientes con temperaturas extremas en África mostraron un alto porcentaje de supervivencia a 40°C. Hungria y Stacey (1997) demostraron que. 11.

(30) …………………………………………………………………………………..…Revisión bibliográfica. diferencias de 6 °C a 5 cm en el perfil de suelo redujo la población de Bradyrhizobium por más de 10,000 celulas g-1 de suelo. La temperatura de la rizosfera impacta en la supervivencia de Rhizobium en el suelo y el intercambio de señales moleculares entre el macro y micro simbionte. 2.3.3 Nutrientes del suelo (N y P) El nitrógeno (N) y el fósforo (P) son también nutrientes importantes para el crecimiento de las plantas, sin embargo su habilidad es generalmente baja en suelos cultivados, haciendo de ellos los mayores factores limitantes para el crecimiento y rendimiento de las plantas, especialmente en regiones tropicales y subtropicales (Hardarson y Atkins, 2003). En la actualidad, solo 30–50% de fertilizante nitrogenado aplicado y 10–45% de fertilizante de fosfórico son tomados por la planta (Garnett et al., 2009). Particularmente la nodulación y fijación de N2 por numerosas leguminosas es limitado por la disponibilidad de nutrientes del suelo como N, P y macronutrientes. Para algunos autores los bajos niveles de P en el suelo son el principal factor limitante en la FSN (Miklas et al., 2006). Incluso cuando las reservas de P en suelo son significativas, la cantidad disponible para las planta es una pequeña porción del total, en este sentido cada aspecto del proceso de fijación simbiótica limitado por la disponibilidad de fósforo (Gyaneshwar et al., 2002). Los nódulos son considerados muy dependiente de las concentraciones de P, teniendo en cuenta que demandan altos niveles de ATP para el funcionamiento de la nitrogenasa (Al-Niemi et al., 1998). La significación de P en los nódulos es reforzada por la mayor concentración de este elemento en los nódulos en comparación con los demás tejidos (Vadez et al., 1997). Debido a los altos requerimientos de P de nódulos, distribución y utilización de P disponible es esencial para una óptima interacción simbiótica bajo deficiencia de P (Le Roux et al., 2006). Las aplicaciones de fertilizantes nitrogenados al suelo afectan el proceso de nodulación y puede ser estimulado por niveles relativamente bajos de nitarto y amonio. La cantidad de N2 fijado simbioticamente está fuertemente correlacionado 12.

(31) …………………………………………………………………………………..…Revisión bibliográfica. con el total de biomasa nodular (Voisin et al., 2003). El análisis del transcriptoma en Medicago truncatula confirmó que las señales de larga distancia que conectan el estado global de N de la planta, provocan la regulación de los mecanismo de fijación de nitrógeno y de desarrollo de nódulos (Ruffel et al., 2008). En este estudio se indicó que las señales sistémicas de los niveles de controlan la adquisición de N por las raíces. Algunos resultados experimentales demostraron que la aplicación fertilizantes de nitrogenados redujo el número de nódulos en frijol común (Otieno et al., 2009). Por otra parte, (Namva et al., 2011) demostraron la aplicación que la aplicación de elevadas cantidades de N, impactó negativamente la nodulación de garbanzo. 2.3.4 Estrés hídrico (Nivel de humedad en el suelo) El establecimiento y efectividad de la simbiosis Rhizobium – leguminosa es particularmente sensible al estrés hídrico. Específicamente, la fijación de nitrógeno es más sensible que otros procesos fisiológicos (Serraj et al., 1999). Dos etapas del proceso simbiótico están involucradas en la disminución de la actividad de la nitrogenasa en condiciones de sequía: i. disminución de la permeabilidad cortical del nódulo, lo cual limitanta la respiración, y resulta en una reducción de la actividad de la nitrogenasa, ii. disminución de la actividad de los nódulos en la actividad de la nitrogenasa puede ser inhibida por contenido de leghemoglobina (Hungría y Vargas, 2000). La habilidad de Rhizobium sp. para sobre vivir a un bajo potencial de agua en el suelo ha sido demostrada por numerosos estudios. Numerosas cepas de R. leguminosarum aisladas de suelos salinos mostraron gran supervivencia a bajo potencial de agua. En dos de ellas, la producción de células viables fue mayor que 107 rhizobios g-1 de suelo Athar (1998). La respuesta de rhizobia al bajo potencial de agua resulta en modificaciones fisiológicas y morfológicas tales como variaciones en la estructura de corteza del nódulo e incrementos de carbohidratos en los nódulos deshidratados (Vriezen et al., 2007). Recientemente Vicente et al. (2012) determinaron que cepas nativas de Rhizobium, el desarrollo de los nódulos y la fijación simbiótica de nitrógeno con el 13.

(32) …………………………………………………………………………………..…Revisión bibliográfica. incremento. de. los. niveles. de. sequía.. Bajo. condiciones. de. elevadas. concentraciones de sal u otros osmolitos, el estrés hídrico es dominado por el movimiento de agua en respuesta al gradiente de potencial hídrico (Sadowsky, 2005). 2.4 Factores bióticos que influyen en la nodulación Las bacterias del género Rhizobium no son las únicas habitantes de la rizosfera de las plantas leguminosas, su proporción en la población total del suelo depende de factores como la fertilidad de suelo. Una variedad de interacciones plantamicroorganismo se desarrolla en la rizosfera de la planta, donde varios microorganismos encuentran un ambiente adecuado para la colonización en y alrededor de las raíces (Albaneda et al., 2006). 2.4.1 Asociación con micorrizas El efecto beneficioso de los Hongos Micorrízicos Arbusculares (HMA) en la simbiosis de plantas leguminosas y Rhizobium puede ser explicada por un incremento en el número de nódulos (Giri y Mukerji, 2004; Garg y Manchanda, 2008) y la eficiencia de P en la planta (Smith et al., 2009). Las plantas leguminosas alcanzan su máximo crecimiento en interacción con micorrizas, la interacción HMA – rhizobia ocurre cuando ambos microrganismos interactúan en la micorrizosfera, durante el estado de precolonización o cuando la planta-HMArhizobia están en interacción, proceso que se le denomina simbiosis tripartita (Azcón-Aguilar y Barea, 1992). Por otra parte, numerosos investigadores han demostrado que los HMA pueden promover el crecimiento de la planta y la tolerancia a la salinidad. La densidad promedio de HMA ha sido discutida por numerosos investigadores (Yamato et al., 2008). Aliasgharzadeh et al. (2001) reportaron un buen número de HMA en suelos salinos lo cual fue asociado con el mayor número de esporas. Las especies asociadas a condiciones extremas de suelo en este estudio fueron. Glomus. intraradices, G. versiform and G. etunicatum. Supresión en la formación de HMA bajo salinidad ha sido reportado por (Sheng et al., 2008). Sin embargo, algunos HMA aislados de la costa en Japón se adaptaron a las condiciones de salinidad 14.

(33) …………………………………………………………………………………..…Revisión bibliográfica. manteniendo los niveles de colonización (Yamato et al., 2008). Incrementos significativos en la colonización de HMA fueron reportados por (Li et al., 2009) después de la rotación de cultivo, la cual resultó en la estimulación de la noculación y asimilación de N y P. La aplicación de HMA puede aliviar el efecto negativo de la salinidad en la nodulación y la fijación de nitrógeno en plantas leguminosas (Evelin et al., 2009). El efecto positivo de la inoculación combinada de Rhizobium y HMA mejora el crecimiento y rendimiento de numerosas leguminosas (Barea et al., 1992; Giri y Mukerji, 2004; Talaat y Abdallah, 2008; Garg y Bhandari, 2012;). Sin embargo, Franzini et al. (2010) demostraron que la simbiosis HMA-Rhizobium disminuye el número total de nódulos y la fijación de nitrógeno. Plantas inoculadas con micorrizas mostraron una mayor asimilación de P asimilable comparado con las no inoculadas, lo cual pudiera ser explicado por la mayor profundidad explorada `por las raíces de las plantas inoculadas y originadas por las hifas de los hongos (Ruiz-Lozano y Azcón, 2000).. 15.

(34) Materiales y métodos.

(35) …………………………………………………………………………………..…Materiales y métodos. 3. Materiales y métodos 3.1 Localización y caracterización de la zona de estudio El experimento fue conducido en un área perteneciente a un campesino privado de la Cooperativa de Créditos y Servicios (CCS) “Lino del Río” en el municipio Placetas (22°18′42″ N 79°39′15″ O), provincia Villa Clara (Figura 3). En el período comprendido entre noviembre del 2015 y enero del 2016, correspondiente a la época de siembra intermedia.. Figura 3. Localización del área donde se condujo el experimento de campo (Miller), municipio Placetas, provincia Villa Clara;. – Sitio del experimento. 3.1.1 Caracterización de las propiedades del suelo y las condiciones climáticas del área de estudio El suelo del área de estudio se clasifica como Pardo Mullido medianamente lavado (Hernández et al., 1999), que correlaciona con un Cambisol eútrico en la World Reference Database de la FAO/UNESCO (1988) y con un Inceptisol del suborden Ustept, subtipo: Mollic Eutrudept en la clasificación de la Soil Taxonomy (1999), de acuerdo con Hernández et al. (2005). 16.

(36) …………………………………………………………………………………..…Materiales y métodos. Las muestras de suelo fueron tomadas a la profundidad de 20 cm, a partir de una diagonal imaginaria trazada en el campo, de la cual se tomaron aproximadamente 12 submuestras que se reagruparon resultando en un total de 4. Todas las muestras fueron secadas al aire y tamizadas a 0.5 mm para análisis químico, que incluyeron el pH (pH (H2O), pH (KCl); método potenciométrico con una relación suelo-solución 1:2.5, materia orgánica (MO), método colorimétrico de Walkey y Black, P - Olsen y K2O; Oniani (Tabla 3). Durante el ciclo del cultivo se tomó el promedio de temperatura, humedad relativa y precipitaciones de la Estación Meteorológica “Valle del Yabú (343)” (Tabla 4). Tabla 3. Propiedades químicas de suelo tomadas a la profundidad de 20 cm en el área del experimento. Sitio Placetas (Miller). pH (H2O). (KCl). MO (%). 6.16. 6.60. 3.49. P2O5 (mg 100g-1). K2O. 3.70. 27.5. Tabla 4. Promedio de datos climáticos durante el ciclo del cultivo (época intermedia).. Sitio. Placetas (Miller). Mes. Precipitaciones (mm. mes-1). Temperatura. HR. (°C). (%). noviembre. 61.9. 19.4. 88. diciembre. 85.6. 20.9. 82. enero. 51.4. 20.7. 80. Fuente: Centro Meteorológico Provincial, HR: Humedad relativa. 3.2 Cepas bacterianas y preparación del inóculo Las especies de Rhizobium pisi (40982 y 40983) fueron aisladas de nódulos de frijol común Phaseolus vulgaris L. en Cuba y caracterizadas genéticamente en el Laboratorio de Microbiología en la Universidad de Gante en Bélgica. Para la preparación del inóculo, las cepas fueron crecidas en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Agropecuarias. Todas las bacterias utilizadas se sembraron en medio Fred modificado (MgSO4 7H2O 0.4 g; CaCO3 0,4_g; K2HPO4 0.75 g; Extracto de levadura 3 g; Sacarosa 10 g; Agar 15 g; por 1_L-1) durante 72 h a 30 ºC. El pH se ajustó a ± 7 añadiendo HCl 1N. 17.

(37) …………………………………………………………………………………..…Materiales y métodos. Para la preparación del pre-inóculo se dispuso de 5 ml de medio Fred Modificado líquido, inoculado con las diferentes cepas e incubados a 20 ºC durante 24 h en incubadora zaranda (Gerhardt, THO-500, Alemania). La titulación arrojó un mínimo de 109 unidades formadoras de colonias por ml (UFC ml-1) para las cepas de Rhizobium pisi. Al cabo de 48 h, el cultivo de cada cepa fue transferido a 100 ml de medio Fred Modificado, el cual fue incubado 30 ºC durante 24 h. Posteriormente 100 ml del cultivo fueron mezclados con 115 g de humus, resultando en el inóculo final. Las semillas fueron recubiertas con almidón 8%, mezcladas con el humus inoculado y secadas al aire. Las bolsas con las semillas inoculadas fueron almacenadas a temperatura ambiente durante 24 h, hasta el momento de la siembra. EcoMic®: las semillas fueron peletizadas en el momento de la siembra con este inoculante sólido que contiene propágulos de hongos micorrízicos arbusculares (HMA), producido en el INCA. Se utilizó el 10% del peso total de la semilla mezclado con agua, hasta que la mezcla alcanzó una consistencia pastosa. Metodología que responde a la propuesta por Mederos (2012). 3.3 Montaje del experimento y condiciones de crecimiento La variedad de frijol empleada en el estudio fue Delicia-364, teniendo en cuenta que es la más generalizada en la región por su adaptabilidad a las condiciones edafoclimáticas y resistencia a plagas. Los tratamientos evaluados, fueron distribuidos en un diseño experimental en bloques al azar con 4 réplicas, para un total de 16 parcelas de 5 m2 (2.5 x 2 m) Anexo 1. Conformadas por siete surcos de 5 m de largo y una distancia entre estos de 0.70 m, separados cada uno por un pasillo de aproximadamente 1 m. se realizó la preparación de suelo tradicional, con tracción animal. Las labores agrotécnicas fueron conducidas durante el ciclo biológico del cultivo e incluyeron, dos pases de guataquea con una diferencia aproximada de 38 días uno de otro, comenzando a los 15 días después de la germinación. El riego se realizó según los requerimientos del cultivo. Se tomaron en cada momento de evaluación 5 plantas por parcelas (en los 5 surcos centrales).. 18.

(38) …………………………………………………………………………………..…Materiales y métodos. 3.3.1 Tratamientos 1. R. pisi (40983); 2. R. pisi (40982); 3. EcoMic®; 4. Control 3.4 Evaluaciones Las evaluaciones fueron realizadas a los 21, 42 y 87 días después de la siembra (DDS), un total de cinco plantas por parcela (Hamaoui et al., 2001) fueron removidas por cada tratamiento. A los 21 (DDS), fue determinado el peso seco de la raíz (PSR, g) y el follaje (PSF, g) los cuales fueron medidos después de mantener las plantas 72 h a 65°C en la estufa, posteriormente fueron pesadas en una balanza (Kern PRS 3203). Durante la fase reproductiva 42 DDS, fueron determinados el Número de nódulos (NN), Peso seco de los nódulos (PSN, g), Peso seco de la raíz (PSR, g), Peso seco del follaje (PSF, g). En el momento de la cosecha aproximadamente a los 87 DDS las evaluaciones incluyeron: Número de plantas por parcela (NPP), Peso de 100 semillas (P100, g), Número de frutos por planta (NFP), Número de semillas por planta (NSP), Peso seco de los frutos (PSF, g), Peso seco de las semillas por planta (PSSP, g), Peso seco de las plantas (PSP, g) y el Peso seco de las semillas por parcela (PSSP, kg). El rendimiento agrícola fue estimado siguiendo la metodología propuesta por (Remans et al., 2008). Donde: 𝑅=. 𝑃𝑆𝑃 ∗ 𝑁𝑃ℎ𝑎 − 1 𝑁𝑃𝑃. R: Rendimiento. NPP:. número. de. plantas de la. parcela PSP: peso seco de las semillas de la NPha-1: número de plantas en una parcela (kg). hectárea. 19.

(39) …………………………………………………………………………………..…Materiales y métodos. 3.1.3 Determinación de la producción de ácido-3-indolacético El cultivo líquido de ambas cepas de Rhizobium fue inoculado en 250 ml de Minimal Medium en un Erlenmeyer de 500 ml, el cual contiene por cada litro: 0.53 g NH4Cl; 1.18 g succinic acid; 0.5 g MgSO4 . 7H2O; 0.2 g NaCl; 4.2 g MOPS; 0.5 ml 1M K2HPO4 y 1 ml Solución A. El pH fue ajustado a pH 7 mediante la adicción de HCl (1 M), este medio fue además suplementado con triptófano (2.5 mgml-1). Las soluciones fueron autoclaveadas y los siguientes compuestos se adicionaron consecutivamente; Solución A (150 mg CaCl2.2H2O; 6.6 mg FeSO4.7H2O) y solución vitamínica 10 mg Thiamine HCl; 20 mg D-Phanthothenic acid Ca salt; 10 µl Biotin). Los aislados fueron incubados a 30°C por 48 h en agitadora mecánica (200 rpm), en cada momento el cultivo líquido tomado cada 6 horas, fue centrifugado a 6000 rpm por 5 minutos. La detección de auxina fue realizada mediante el método colorimétrico, con el reactivo Salkowski (12 g L-1 de FeCl3 en 7.9 M H2SO4) como describe Glickmann y Dessaux, (1995). El sobrenadante fue mezclado con el reactivo Salkowski (1:1) e incubado a temperatura ambiente por 30 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, fue medida la absorbancia a 530 nm y correlacionada con la concentración de AIA a partir de la curva estándar de AIA (Sigma). 3.4 Aplicación de encuesta a productores En el mes de enero del 2016 fue realizada una encuesta (Anexo 2) a un total de 23 productores de frijol [46% del total (50)], pertenecientes a la CCS “Lino del Río” ubicada en el poblado de Miller. 3.5 Procesamiento Estadístico. Se utilizó el paquete estadístico STATGRAPHICS Centurion XV.2.14 sobre el sistema operativo Windows 7. Las diferencias estadísticas entre los tratamientos, se determinaron mediante el análisis de varianza simple con nivel de significación p<0.05, empleando la prueba de comparación de medias paramétrica TukeyHSD, verificando la normalidad y la homegeneidad de varianza, y la prueba de comparación de medias no paramétrica de Kruskal- Wallis en los casos que no cumplían las condiciones anteriores. Se establecieron las correlaciones de Pearson entre todas las variables y se realizó análisis de regresión simple. 20.

(40) Resultados y discusión.

(41) ………………………………………………………………………..…………...Resultados y discusión. 4. Resultados y discusión 4.1 Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre la biomasa seca de la raíz y del follaje a los 21 días después de la siembra (DDS) Al estudiar el efecto de los tratamientos sobre la biomasa seca de la raíz y el follaje a los 21 días después de la siembra (DDS) (Tabla 5), se puede observar el efecto de los tratamientos sobre ambos indicadores. En el caso específico del peso seco de la raíz (PSR) en todos los tratamientos se observaron diferencias significativas desde el punto de vista estadístico y numérico con respecto al control. Tabla 5. Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre la biomasa radicular y del follaje a los 21 DDS PSR. Tratamiento. PSF g. R. pisi 40983. 0.069 b. 0.39 a. R. pisi 40982. 0.077 a. 0.40 a. EcoMic®. 0.087a. 0.31 b. Control. 0.042 c. 0.24 c. EE (±). 0.04. 0.02. Los valores representan el promedio de 20 plantas. Medias con letras no comunes para una misma columna, difieren por Tukey a (P<0,05). PSR: Peso seco de la raíz; PSF ;Peso seco del follaje.. Lográndose los mayores incrementos en los tratamientos en que fueron inoculadas las semillas con EcoMic® y R. pisi 40982 respectivamente y en ambos casos superiores al 50% con respecto al control. La respuesta en la estimulación de la raíz ocasionada por el EcoMic® pudiera estar asociada al efecto que ejercen los Hongos micorrízicos arbusculares (HMA) sobre la raíz de la planta. Los mayores resultados obtenidos en la biomasa del follaje estuvieron asociados a la inoculación de la cepa R. pisi 40982 y sin diferencias significativas con la cepas 40983, alcanzando estas valores superiores y con diferencias estadísticas con el resto de las variantes de inoculación, con un 21% de incremento con respecto al control.. 21.

(42) ………………………………………………………………………..…………...Resultados y discusión. 4.2 Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre la nodulación, la biomasa radicular y del follaje a los 42 DDS La respuesta del genotipo al número y biomasa seca de los nódulos mediante la inoculación de los diferentes variantes a los 42 días DDS (Figura 4), demuestra el efecto positivo de los tratamientos con respecto al control. La presencia de nódulos en el tratamiento control indica la existencia de cepas nativas de Rhizobium spp. en la zona de estudio, aunque en menor cantidad y masa seca, lo que indica que se requiere la selección de cepas eficientes para conseguir la maximización de la FBN en el cultivo de frijol. La mayoría de los nódulos radiculares mostraron coloración rosada, lo que indica la presencia de la proteína que contiene hierro necesario para la fijación efectiva de nitrógeno. La presencia de la coloración rosada en los nódulos es un indicio de la presencia y expresión activa los genes nifH que codifican la síntesis de enzimas nitrogenasas responsables de la reducción de N a NH3 (Rondon et al., 2007).. 0,12. a. Número de nódulos. a a. 30. 0,08. 20. b 0,04. 10. 0. 0 Control. Ecomic. R. pisi 40982. Peso seco de los nódulos (g). 40. R. pisi 40983. Tratamientos NN. PSN. Figura 4. Efecto de la inoculación sobre el número de nódulos (NN) y el peso seco de los nódulos (PSN) a los 42 DDS a, b: medias con letras no comunes difieren por Tukey-LSD a (P<0.05). 22.

(43) ………………………………………………………………………..…………...Resultados y discusión. En todos los casos en que fueron inoculadas las semillas con los diferentes tratamientos se observaron los mayores incrementos en el número de nódulos, mostrando siempre los mejores resultados estadísticos, resultados que coinciden con los obtenidos en el peso seco de los nódulos, parámetro que ha sido declarado como indicador de la efectividad en la interacción y que además correlaciona con el nivel de nitrógeno fijado por la planta (Tahir et al., 2009). Los incrementos en la biomasa nodular reflejan una mayor eficiencia en la FBN, que podría resultar en un aumento de la biomasa del follaje. Ha sido planteado que mientras mayor sea el número de nódulos, mayor será la asimilación de N2 atmosférico. Aunque la eficiencia de una determinada especie para formar nódulos no necesariamente esté vinculada al proceso de fijación biológica del nitrógeno FBN, teniendo en cuenta que la competitividad de cada especie de Rhizobium en la nodulación depende no sólo de sus características genéticas intrínsecas, sino que también está influenciada por el genotipo de la leguminosa huésped (Brutti et al., 1999; Raposeiras et al., 2006). Otros autores atribuyen la eficacia de la inoculación a la competencia de las bacterias en la rizósfera de las leguminosa huésped (Martínez-Viveros et al., 2010). La relación positiva existente entre la estimulación de los parámetros de nodulación, la biomasa radicular y del follaje fueron vinculados por Alfonso (2012) con los mecanismos directos que realizan las sustancias excretadas por las bacterias sobre el sistema radicular y de modo indirecto sobre el follaje de las plantas, además del incremento de las tasas de N fijado al follaje como resultado de la eficiencia de la interacción. En esta etapa del ciclo del cultivo fue evaluado también el PSR sin diferencias significativas entre los tratamientos y el PSF (Tabla 6) en el que los mayores incrementos se lograron con la inoculación de la cepa Rhizobium 40982 con incrementos superiores con respecto al control de hasta un 15%.. 23.

(44) ………………………………………………………………………..…………...Resultados y discusión. Tabla 6. Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre la biomasa radicular y del follaje a los 42 DDS PSR. PSF. Tratamientos g R. pisi 40983. 0.60 a. 3.21 b. R. pisi 40982. 0.63 a. 4.39 a. EcoMic®. 0.66 a. 3.24 b. Control. 0.66 a. 3.79 b. EE (±). 0.027. 0.232. Los valores representan el promedio de 20 plantas. Medias con letras no comunes para una misma columna, difieren por Tukey a (P<0,05). PSR: Peso seco de la raíz; PSF: Peso seco del follaje.. El efecto positivo de este tratamiento sobre el follaje pudiera estar atribuido a los aportes de la inoculación de la cepa en el contenido de N transferido a través de los nódulos y al resto de la planta (Groppa et al., 1998). Por otra parte, la biomasa seca del follaje puede ser interpretada fisiológicamente como el resultado de la fotosíntesis neta acumulada del cultivo y ha mostrado estar relacionada con rendimiento de numerosos cultivos (Araus et al., 2002 K). Como en el presente estudio Mungai y Karubiu (2011) reportaron que cepas nativas de Rhizobium aisladas de frijol común en Kenya mostraron incrementos notables en la biomasa del follaje comparadas con biofertilizantes comerciales Biofix y USDA 9030. 4.3 Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre indicadores del rendimiento Al evaluar el efecto de los tratamientos sobre algunos componentes del rendimiento (Tabla 7) en el genotipo estudiado a los 87 días de sembrado el experimento,. fueron. observados. incrementos. significativos. en. todos. los. tratamientos con respecto al control, aunque en algunos casos sin diferencias estadísticas significativas.. 24.

(45) ………………………………………………………………………..…………...Resultados y discusión. Todos los componentes evaluados fueron notablemente estimulados con la inoculación de la cepa 40983, con diferencias estadísticas significativas con el tratamiento control. Los incrementos con respecto al testigo fueron de, 51% en el número de frutos por planta (NFP), 68% en el número de semillas por planta (NSP), 53% en el pesco seco de semillas por plantas (PSSP) y 78% en el peso seco de los frutos por planta (PSF). Es importante destacar el efecto positivo obtenido con la aplicación de EcoMic® en todos los indicadores evaluados con resultados muy similares a los obtenidos con la inoculación de la cepa 40983 en la mayoría de los tratamientos. Tabla. 7.. Efecto. de. las. diferentes. variantes. de. inoculación. sobre. componentes del rendimiento agrícola en el frijol PSSP Tratamientos. NFP. PSF. NSP g. R. pisi 40983. 9.75 a. 48.50 a. 10.60 a. 3.15 a. R. pisi 40982. 8.25 b. 39.85 a. 9.17 b. 2.35 b. EcoMic®. 9.60 ab. 44.65 a. 8.96 b. 2.68 b. Control. 6.45 c. 28.85 b. 6.89 c. 1.76 c. EE (±). 0.40. 2. 36. 0.24. 0.06. Los valores representan el promedio de 20 plantas. Medias con letras no comunes para una misma columna, difieren por Tukey a (P<0,05). NFP: Número de frutos por planta; NSP: número de semillas por planta; PSSP: Pesco seco de semillas por planta; PSF: Peso seco de los frutos por planta.. 25.

(46) ………………………………………………………………………..…………...Resultados y discusión. El efecto beneficioso de los HMA ha sido asociado al efecto que estos ejercen en la. rizosfera. sobre. las. cepas. de. Rhizobium. en este caso la nativas,. específicamente en cuanto a la disponibilidad de P y otros nutrientes necesarios por las bacterias (Smith, 2002). Resultados similares fueron obtenidos por Abdel – Fattah et al. (2016) quienes reportaron incrementos significativos en componentes del rendimiento agrícola como el número de legumbre, largo de la legumbre, peso de 100 semillas y peso de semillas por plantas con la inoculación de HMA. El efecto de los tratamientos sobre el peso de semillas por parcela (PPS/PP) y peso de 100 semillas (PSS/100) se muestra en la tabla 7. Se evidencia que las diferencias entre los tratamientos no fueron tan marcadas comparadas con otros indicadores. Para el caso específico del PPS/PP (peso seco de las semillas por parcelas) no se observaron diferencias estadísticas entre los tratamientos, solo entre estos y el control y por otra en el PPS/100 (peso de cien semillas) no existieron diferencias significativas incluso con el tratamiento control. No obstante los mejores incrementos en ambos indicadores coinciden con aquellas plantas que fueron inoculadas con la cepa R. pisi 40983. El efecto positivo de esta cepa pudiera estar asociado a su eficiencia en la interacción con el genotipo objeto de estudio. Fue demostrado que el peso de 100 semillas está estrechamente relacionado con el rendimiento agrícola, además de ser un indicador que contribuye a definir normas de siembra en cualquier cultivo e indica la cantidad de semillas y posibles plantas a lograr en un peso determinado (Ponce et al., 2002). En concordancia con este estudio resultados superiores en el peso de 100 semillas fueron obtenidos por Martins et al., (2017) en plantas inoculadas con aislados de Rhizobium, demostrando además que con la inoculación se obtuvieron valores similares en este indicador a los de las plantas en que se aplicó fertilizante nitrogenado a razón de 80 kg ha-1, como ocurre en el estudio al compararlo con el EcoMic®.. 26.

(47) ………………………………………………………………………..…………...Resultados y discusión. Tabla 8. Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre indicadores del rendimiento agrícola PSS/100. PSS/PP. g. kg. R. pisi 40983. 22.45 a. 0.73 a. R. pisi 40982. 22.16 a. 0.72 a. EcoMic®. 21.16 a. 0.66 a. Control. 21.96 a. 0.38 b. EE (±). 0.57. 0.06. Tratamientos. Los valores representan el promedio de 20 plantas. Medias con letras no comunes para una misma columna, difieren por Tukey a (P<0,05). PSS/PP: Peso seco de las semillas por parcelas; PSS/100: Peso seco de 100 semillas. 4.3.1 Efecto de las diferentes variantes de inoculación sobre el rendimiento agrícola Coincidentemente el efecto de los tratamientos sobre el rendimiento agrícola fue superior al control en todas las variantes de inoculación y sin diferencias estadísticas entre ellas (Figura 5). Los mejores resultados fueron alcanzados en las plantas inoculadas con las cepas de R. pisi 40983 y 40982 respectivamente. Aunque con la aplicación del EcoMic® se lograron incrementos notables con respecto al control, estos no fueron diferentes estadísticamente ni con el control ni con los tratamientos de biofertilización. Los resultados obtenidos con la inoculación de las cepas nativas ponen de manifiesto que cuando los microorganismos son inoculados en condiciones agroclimáticas similares a las de su aislamiento, se obtienen resultados muy favorables en la estimulación del crecimiento y rendimiento de la planta.. 27.

Figure

Figura  1.  Duración  de  las  etapas  de  desarrollo  del  frijol  (VD  a  R9)  y  los  cuatro
Figura 1. Duración  de las etapas de desarrollo del frijol  (VD a R9)  y los cuatro  hábitos de crecimiento
Figura  2.  Diagrama  esquemático  del  desarrollo  del  nódulo.  Después  de  la  recepción  de  las señales  flavonoides  del  exudado  de  la  raíz,  las  bacterias  se  adhieren  a  la  superficie  de  los  pelos  radiculares
Figura 3. Localización del área donde se condujo el experimento de campo (Miller),  municipio Placetas, provincia Villa Clara;     – Sitio del experimento
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