Efecto del ultrasonido endodóntico sobre clorhexidina al 2% en la formación de paracloroanilina Estudio in vitro

www.elsevier.es/piro

Revista

Clínica

de

Periodoncia,

Implantología

y

Rehabilitación

Oral

TRABAJO

DE

INVESTIGACIÓN

Efecto

del

ultrasonido

endodóntico

sobre

clorhexidina

al

2%

en

la

formación

de

paracloroanilina.

Estudio

in

vitro

Daniela

Onetto

_,

_Verónica

_Correa

_,

_Pilar

_Araya

_,

_Ismael

_Yévenes

y

Miguel

Neira

a_{CirujanoDentista,MagisterenOdontoestomatología,DepartamentodeCienciasOdontológicas,EscuelaDental,Universidad}

AndrésBello,Santiago,Chile

b_{CirujanoDentista,EspecialistaenEndodoncia,DepartamentodeCienciasOdontológicas,EscuelaDental,UniversidadAndrés}

Bello,Santiago,Chile

c_{Químico-Farmacéutico,ProfesorAsociado,InstitutodeInvestigaciónenCienciasOdontológicas.FacultaddeOdontología,}

UniversidaddeChile,Santiago,Chile

d_{Bioquímico,ProfesorAyudante,InstitutodeInvestigaciónenCienciasOdontológicas.FacultaddeOdontología,Universidad}

deChile,Santiago,Chile

Recibidoel23dejuliode2014;aceptadoel21dejuniode2015 DisponibleenInternetel21deagostode2015

PALABRASCLAVE

Clorhexidina; Espectrofotometría; Paracloroanilina; Ultrasonido

Resumen

Introducción: Laclorhexidina(CHX)ensoluciónacuosasehidrolizagenerandoparacloroanilina (PCA), procesoaceleradoporelaumentodetemperaturaypH. Elusodeultrasonido endo-dóntico(USE),basadoenfenómenosdeoscilación,cavitación,microcorrienteacústica,genera calorafectandolaCHX.

Objetivo: Identificar y cuantificar in vitro cambios fisicoquímicos, temperatura y pH, y la cantidad dePCAformada conelusodeultrasonidoendodónticosobresoluciones deCHXal 2%.

Materialesymétodos:LaCHX2%seactivódurante30,60,90y120segconUSEa24.500Hz, midiendoantesydespuésdeactivación:pH,temperaturaycantidaddePCA,leyendoa375nm encurvadecalibracióndeestándaresdePCAyformación,registrandoelespectrodeabsorción medianteespectrofotómetroUV-visible.

Resultados: ElUSEaumentólatemperaturaen1◦_{Cindependientedeltiempodeaplicacióny}

acidificólasolucióndeCHX2%,sinvariacionessignificativasenpHytemperatura.Noseobservó coloraciónniformacióndeprecipitadoenmuestrasactivadasporUSEalosdiferentestiempos. LasmuestrasnopresentaronvaloresmediblesdePCAa375nm.Losespectrosdeabsorciónde CHX2%yactivadasporUSEpormásde60segpresentaroncurvasespectrales,peaksyvalores deabsorbanciadiferentes.

∗_{Autorparacorrespondencia.}

Correoelectrónico:[email protected](I.Yévenes). http://dx.doi.org/10.1016/j.piro.2015.06.002

Conclusiones:ElUSEaumentala temperaturayacidificala solucióndela CHXentodoslos tiemposdeaplicación.NosedetectópresenciadePCAporespectrofotometríavisible.Muestras activadasporUSEpor60segomáspresentanespectrosdeabsorcióndiferentesalasmuestras sinactivar.

DiferenciasenlosespectrosdeabsorciónentreCHXactivadasconUSEyconCHXsinactivar indicaríandegradacióndelaCHXyposiblepresenciadePCA.

©2015Sociedadde PeriodonciadeChile, SociedaddeImplantologíaOral deChiley Socie-dad de Prótesis y Rehabilitación Oral de Chile. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Este es un artículo Open Access bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/

licenses/by-nc-nd/4.0/).

KEYWORDS

Chlorhexidine; Spectrophotometry; p-chloroaniline; Ultrasound

Effectofendodonticultrasoundon2%chlorhexidineintheformation ofparachloraniline.Invitro_study

Abstract

Introduction:Chlorhexidine(CHX)inaqueoussolutionishydrolysedtop-chloroaniline(PCA),a processacceleratedbyincreasingtemperatureandpH.Usingendodonticultrasoundbasedon oscillationphenomena,cavitation,andacousticmicrostreaminggeneratesheat,affectingthe CHX.

Objective:Theaimofthisinvitrostudywastoidentifyandquantifythephysical-chemical changes,temperatureandpH,andtheamountofPCAformedbyincreasingthetemperature of2%CHXbyendodonticultrasound.

Materialsandmethods: Samplesof2%CHXwereactivatedfor30,60,90,and120secondswith endodonticultrasound24,500Hz.ThepHandtemperatureweremeasuredbeforeandafter acti-vation,aswellastheformationandamountofPCA,byreadingandrecordingtheresultobtained fromastandardcalibrationcurvereadingat375nminaUV-visiblelightspectrophotometer.

Results:Independent oftime, ultrasoundincreasedthetemperatureof2% CHXby1◦_Cand

acidifiedthesolution.NosignificantchangeswererecordedinpHandtemperature.Nostaining orprecipitateswereobservedinsamplesultrasonicallyactivatedatdifferenttimes.Samples readat375nmshowednomeasurablePCAvalues.Absorptionspectraof2%CHXand2%CHX activatedformorethan60secondsshoweddifferentspectralcurves,peaks,andabsorbance values.

Conclusions:UltrasoundincreasedthetemperatureandacidifiedthesolutionofCHXfor all applicationtimes.NoPCAwasdetectedbyvisiblespectrophotometry.Absorptionspectraof2% CHXactivatedwithultrasoundatdifferenttimesdiffersfrom2%CHXwithoutactivation.

ThesedifferencesindicatedegradationofCHXandpossiblepresenceofPCA.

©2015Sociedadde PeriodonciadeChile, SociedaddeImplantologíaOral deChiley Socie-dad de Prótesis y Rehabilitación Oral de Chile. Published by Elsevier España, S.L.U. This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/

licenses/by-nc-nd/4.0/).

Introdución

Eltratamiento endodónticotiene como objetivolograr un canaldesinfectadoyselladotridimensionalmentepara pre-venirsucontaminación.Lacomplejaanatomíadelsistema decanalesimpidequeeltejidoorgánicoeinorgánico resi-dual,ylas bacteriasque pudieranestaralojadas enellos, puedan ser completamente eliminados,por lo que usual-mentepersisten1,2_.

Variadas terapias antimicrobianasse han recomendado paraeliminarlos microorganismosdesde loscanales radi-culares,incluyendola instrumentacióndelcanalradicular y el uso de diferentes irrigantes, apósitos intracanales y sellantescoronarios3,4_{. Eléxito del tratamiento}

antiinfec-cioso endodóntico se asocia directamente con el control demicroorganismosyladisrupcióndelbiofilmbacteriano5_.

La medicación del canal es la aplicación de un fármaco

en el interior de la cavidad pulpar necesaria para elimi-nar la infección6_{; es requerida en infecciones crónicas,}

rebeldesyentratamientosendodónticosfallidos. La clor-hexidina (CHX) se utilizacomo medicaciónintracanal por susustantividadypor suconcentración7_{.Lasustantividad}

antimicrobiana dependedelnúmerode moléculasdeCHX disponibles para interactuarcon la dentina.Por lo tanto, medicarelcanalconunapreparaciónCHXmásconcentrada dalugar a unaumentode laresistencia ala colonización microbiana.Lasustantividadantibacterianaa concentracio-nes diferentes deCHX despuésde 5min deaplicación ha sidoevaluada.Losresultadosrevelaronunarelacióndirecta entrelaconcentracióndeCHXysusustantividad (Moham-madietal.,2008)7_.

LaCHX se usa como irrigante endodóntico en concen-traciones de 0,2% a 2%8---10_{. Se ha utilizado como agente}

reduccióndelamicrobiotaendodónticadurantelairrigación delcanal radicularsin eliminarendotoxinas11,12_{. La}

molé-cula deCHX planteaunriesgo sistémico debidoa que, al descomponerse,generasubproductosreactivostalescomo para-cloroanilina(PCA)9,13_{.LaPCAesgeneradaporla}

hidró-lisisdeCHXenfuncióndeltiempo,pHalcalinoycalor9,10_.

Adicionalmente, la presencia de PCA se ha detectado en solucionesdeCHX9,13_{.Basranietal.hanobservadoque al}

calentarCHXporencimade45◦_{Celsiusseproducela}

forma-cióndePCAcomosubproducto14_{.LaPCAhasidoclasificada}

porlaAgenciaInternacional paralaInvestigaciónsobreel Cáncer(IARC,2006)ensugrupo2B,comoagente posible-mentecancerígenoparalossereshumanos14,15_.

Enlairrigaciónactivaseintegraalaterapiaendodóntica elusodelultrasonidoamododeincrementarlaeliminación de detritus ymicroorganismos, basándoseen los fenóme-nosdeoscilación, cavitación,microcorrienteacústicaque ademásgeneracalor16_.

Elobjetivodeesteestudiofueidentificarycuantificarin vitrocambiosfisicoquímicos,temperaturaypH,yla canti-daddePCAformadoconelusodeultrasonidoendodóntico sobresolucionesdeCHXal2%.

Material

y

método

Consideracioneséticas

Esteestudioprospectivo,experimentalyexplicativoinvitro

recibiólaaprobacióndelComitédeÉticadeInvestigación HumanadelaFacultaddeOdontologíadelaUniversidadde Chile(Chile),bajoelnúmerodeprotocoloFIOUCH13-015.

Materiales

Se empleó 4-cloroanilina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO., EE.UU.),solucióndigluconatodeclorhexidinaal20%enH2O

(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO.,EE.UU.).Todaslassoluciones ydilucionesusadasenlainvestigaciónfueronpreparadasen ellaboratoriodequímicadelaFacultaddeOdontologíade laUniversidaddeChile.

Tama˜nodelamuestra

Debidoa las mínimasvariacionesobservadas enlas medi-cionesexperimentalesintraparámetro(pH,temperatura)se fijóeltama˜nodemuestraen10.

Medicionesfisicoquímicasensolución

declorhexidinaal2%

En tubos eppendorf de 1,5ml se colocaron 10 muestras de 1ml de CHX al 2% y se procedió a aplicar ultraso-nidoendodóntico(USE)conequipomarcaMECTRON®_Model

piezo smart (Mectron s.p.a., Carasco [GE], Italia) a una frecuencia de 24.500Hz con lima #55K de 31mm marca KERR-SYBRONENDOModelK3(SybronEndoCorporation,1717 WestCollinsOrange,CA92867)por30,60,90y120seg.En las muestrasseprocedió amedirantesydespuésdeUSE: pH,temperatura, concentracióndePCA yespectrogramas deabsorción.

DeterminacióndepH

LasmedicionesdepHantesydespuésdelaaplicaciónde USE se hicieron con el pHmeter marca WTW, modelo pH 537(WTWWissenschaftlich-TechnischeWerkstättenGmbH, Weilheim,Alemania)calibradoentrepH4-11.

Determinacióndelatemperatura

SeusóunsensordetemperaturamarcaWTW,modelo TFK 325(WTWWissenschaftlich-TechnischeWerkstättenGmbH, Weilheim,Alemania)conectadoalpHmetermarcaWTW.

Determinacióndeconcentraciónde4-cloroanilina

Estándares de PCA al 0,039mg/ml, 0,0237mg/ml, 0,0117mg/ml y 0,0039mg/ml se leyeron al máximo de375nmenespectrofotómetroUV-visible(Thermo Spec-tronicUnicamUV-530UV-Visible, Rochester,NY, EE. UU.). Seconstruyó curva de calibración absorbancia vs concen-tración de PCA y se determinó concentración de PCA de muestrastratadasconUSEleyendosuabsorbancia.

Espectrogramasdeabsorción

MuestrasdeCHXtratadasconUSEynotratadasy estánda-resdePCAselesdeterminósusespectrogramasdeabsorción (absorbanciavslongitudonda)de400a600nmen espectro-fotómetroUV-visible.

Análisisestadístico

Los datosfueron analizados medianteel paquete estadís-ticoparacienciassociales(SPSSparaWindows,versión18.0, SPSSInc,Chicago,IL,EE.UU.).Elanálisisdescriptivodelas variablesserealizóparacaracterizarlamuestra.Resultados depHytemperaturaantesydespuésdelaaplicacióndeUSE fueroncomparados.Sellevaronacabo lostest deShapiro WilkydeLeveneparadeterminar lanormalidaddela dis-tribucióndedatosylahomogeneidaddelasvarianzas.Se utilizólapruebade«t»-testparacompararambos grupos.

Seadoptóunnivelde significaciónde0,05 paratodaslas pruebas.

Resultados

Despuésde aplicarUSEa una frecuenciade 24.500Hz por 30,60,90y120seglosvaloresdepHseacidificaronentre 0,06y0,16unidades depH,perosinvariaciones significa-tivasentreelantesyeldespuésparatodoslostiemposde aplicación(fig.1).Latemperaturaseincrementóentre1,0 y1,1◦_{C,perosinvariacionessignificativasprevioyposterior}

alaaplicacióndeUSE(fig.2).

Ecuacióndelacurvadecalibración

de4-cloroanilina

5,5

Figura1 ValorespromediosdepHydesviaciónestándarpara clorhexidina2%sometidaaultrasonidoendodóntico(USE)auna frecuenciade24.500Hrtz.Lasdiferenciasentreelantesy el despuéspara todoslostiempos de aplicaciónde USE noson significativas.

Figura 2 Valores promedios de temperatura y desviación estándarparaclorhexidina2%sometidaaultrasonido endodón-tico(USE)aunafrecuenciade24.500Hrtz.Lasdiferenciasentre elantesyeldespuésparatodoslostiemposdeaplicaciónde USEnosonsignificativas.

[PCA]-0,040 y con un coeficiente de correlación de R2_=0,999.

Determinacióndep-cloroanilina

Utilizandolaecuacióndelacurvasetransformaronlos valo-resdeabsorbanciaenconcentracióndePCA.Enningunade lamuestrastratadasconUSEadiferentestiemposseobservó coloración.Todoslosvaloresdeabsorbanciamedidosenlas muestrastratadasconUSEadiferentestiemposfueron infe-rioresalvalormínimodePCAestándarde0,0039mg/ml.

Espectrogramasdeabsorción

Los espectros de absorción de CHX 2% y activadas por USE presentaron curvas espectrales, peaks y valores de absorbanciadiferentes.Losespectrogramasobtenidosalos diferentestiemposdeaplicacióndeultrasonidoendodóntico sobreclorhexidinaal2%sevisualizanenlafiguras3---6.

Discusión

LageneracióndePCAesconsecuenciadelahidrólisisdela CHX, quesepuedeconseguir aumentandosutemperatura y/osometiéndolaaunpHalcalino15_.

SeevidencióqueelpHdelassolucionesdeCHXactivadas porUSEpresentaron unabaja, perosinvariaciones signifi-cativas, lo queexplicaría la ausencia dePCA coloreado o precipitado.LassolucionesdeCHXsonestablesenel inter-valodepHde5,0-8,0.SobrepH8,0laclorhexidinaprecipita, yencondicionesmásácidasseproduceundeteriorodela actividad debidoa que esmenosestable17_{. Elultrasonido}

produjo un aumento de la acidez;esto se explica por el carácterácidodelaCHX,dondeunaumentodela tempe-raturaproduceunadisminucióndesupKa,quellevaauna disminucióndelpH18_.

Lageneracióndecaloryaumentodelatemperaturason efectosqueproducelaaplicacióndeultrasonidodentrodel canalradicular.Estoresultadelaenergíaliberadadurante lacavitación,conimplosióndemicroburbujasdegasopor fricción de la lima oscilatoria con las paredes del canal

600

Longitud de onda (nm)

b

Longitud de onda (nm)

a

Figura3 Elespectrograma«a»correspondealespectrodeabsorcióndeCHXal2%notratadayelespectrograma«b»corresponde

600

Longitud de onda (nm)

a

Longitud de onda (nm)

Figura4 Elespectrograma«a»correspondealespectrodeabsorcióndeCHXal2%notratadayelespectrograma«b»corresponde

alespectrodeabsorcióndeCHXal2%activadaconultrasonidoendodónticopor60seg.

600

Longitud de onda (nm)

a

Longitud de onda (nm)

Figura5 Elespectrograma«a»correspondealespectrodeabsorcióndeCHXal2%notratadayelespectrograma«b»corresponde

alespectrodeabsorcióndeCHXal2%activadaconultrasonidoendodónticopor90seg.

radicular19_{.Lageneracióndecalorproducidoporlafricción}

delinstrumentoconlasparedespotenciaelefectosobrelos compuestosorgánicoscomohipoclorito desodioyla clor-hexidina,tal como lo proponenCunninghany Balekjian20_,

pero que puede producir la formación de microfracturas enlaestructuradentinariadebidoalcalorgeneradoporla

friccióndelinstrumentoyporla instrumentaciónconuna intensidadde energía excesiva. En clínica el volumen de irrigante empleado en canales radiculares está confinado aunespacio reducidoeinextensible, dándolea la micro-corrienteacústicaocirculacióndelfluidounamenoráreade movimientoquelautilizadaenestetrabajo,dondeeltubo

600

Longitud de onda (nm)

a

Longitud de onda (nm)

Figura6 Elespectrograma«a»correspondealespectrodeabsorcióndeCHXal2%notratadayelespectrograma«b»corresponde

eppendorfesdemayortama˜noyvolumen.Por estarazón sepodríaesperarunmayoraumentodetemperaturaenlos canales.Alllevarnuestrosresultadosalaclínicadebiéramos esperarresultadosequivalenteperoaumentados,esdecir, unamayoracidezyunmayor aumentodelatemperatura, valoresnodescritosenlaliteratura.Enpróximos estudios sedebencomprobarestosresultados,utilizandocondiciones similaresalasexistentesenlaclínica.

LahidrólisisdeCHXproducePCA,reducidaatemperatura ambiente,peroaumentaporcalentamientoespecialmente apHalcalino21_{.Esta últimaseincrementóen1}◦_{C en}

pro-medioporelusodelUSE.Estavariacióndetemperaturano produjocambios enCHX que se tradujeran enun cambio visibledecoloroaparicióndeprecipitado15_.Esto

corrobo-radoconmedicionescuantitativasdePCA enlas muestras deCHXactivadasconUSE,dondenosedetectaronvalores mayoresdePCAde0,0039mg/ml,mínimocuantificablepor espectrofotometríavisible.Estosresultadospermiten esta-blecerque el USE enla CHX al 2% nogenera cambiosde colorniprecipitadocoloreado,alutilizarparámetros simi-laresdefrecuencia(24.500Hz)ytiempodeaplicación(30, 60,90y120seg)alosusadosenlaprácticaclínica,loque sugiereuncomportamientosimilaralinteriordeloscanales radiculares.

LosefectostóxicosdelaPCAsepresentana concentra-cionesde 0,1 a 1,0mg/ml, ylos efectos inmunotóxicosa concentracionesde0,01a0,001mg/ml22_{.Elvalor mínimo}

cuantificable de PCA con la metodología usada es de 0,0039mg/ml,concentraciónqueproduciríaefectos inmu-notóxicos, pero la cuantificación espectrofotométrica no arrojóvaloresmedibles,porlotantonopodemos conocer cuántoPCAseformó;enúltimainstanciasepuedesostener quelaPCAformadaporaccióndelultrasonidoseríamenor a0,0039mg/mlbajoellímitedetoxicidad.Paracuantificar laPCAformadasepodríautilizarunmétodosimpleyrápido descritoenlaliteraturaquepermitecuantificar simultánea-mente CHX y PCA mediante HPLCcon detección UV.Este métodopresentaunabuenaresoluciónentrePCAylaCHXy tiempodeejecucióncorto,permitiendodetectarPCAentre 0,05a10␮g/l23.

LosespectrosdeabsorcióndelaCHXal2%ydelas mues-trastratadasconUSEpor60segomásmostrarondiferentes

peaksdeabsorbanciaycurvasespectrales.Elespectrode absorcióndelaCHXal2%noactivadapresentasumáxima absorbanciaa los460nm, similar ala CHX al2% activada por30segyconcurvasespectralessimilares,evidenciando quelaCHXal2%despuésde30segdeactivaciónconUSEa 24.500Hrtznovaríasuestructuramolecular(fig.3).

Diferenteeselresultado delasmuestras activadaspor 60seg (fig. 4), 90seg (fig. 5) y 120seg (fig. 6), hay un corrimientoenelmáximodeabsorbancia(464nm,470nm, 474nm)yconcurvasespectralesdiferentesalamoléculade CHXal2%sinactivación;estopermitepostularuncambio estructuraldela CHX,yaque cualquiersustanciaquímica sometidaainteracciónconotrocompuesto, oalvariarsu temperaturaopresión,seasocianloscambiosen propieda-desfisicoquímicascomo indicadoresdecambio molecular. SepuedeinferirentoncesquelaestructuradelaCHXsufre uncambio,evidenciableacausadelaactivaciónconUSEa partirdelos60seg.Losresultadosnopermitencomprobar quelamoléculageneradaporUSEseaparacloroanilina;se sugierequelamolécularesultantedelaactivaciónpormás

de60segpodríaserPCA,yaquepresentancurvas espectra-lesyvaloresdeabsorbanciamuysimilaresalosobtenidos conelespectrovisible delaPCAestándar1_{.Esimportante}

cuantificarPCAdondepuedaproducirseyasegurarquesus nivelesseanmenoresallímiteaceptado(0,001mg/ml), por-quelaPCA,comoprincipalproductodeladegradaciónde CHX14_{,puedetenerefectos tóxicos,atendiendoala}

reco-mendaciónactualparaimpurezasgenotóxicas24_.

Conclusiones

ElUSEaumentalatemperaturayacidificalasolucióndela CHXentodoslostiemposdeaplicación.

NosedetectópresenciadePCA porespectrofotometría visible.

MuestrasdeCHXactivadasporUSEpor60segomás pre-sentanespectrosdeabsorcióndiferentesalasmuestrassin activar.

Diferencias en los espectros de absorción entre CHX activadasconUSEyconCHX2%sinactivarindicarían degra-dacióndelaCHXyposibleaparicióndePCA.

Financiación

Publicación financiada por el proyecto FIOUCH 13-015, FacultaddeOdontología,UniversidaddeChile.

Conflicto

de

intereses

Losautoresdeclarannopresentarconflictodeinteresesde ningúntipo.

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