Ajuste de la técnica de cultivo de linfocitos T para la obtención de cromosomas en ovinos de pelo en condiciones mínimas de laboratorio
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(2) REVISTA N414, Primer Semestre 1997. Este ajuste permite disminuir el costo de implementaciOn de Ia técnica, incrementar a eficiencia de la utilizaciOn del tiempo del investigador y obtener material adecuado para los estudios citogenéticos. Los resultados concuerdan con los reportes revisados de Ia literatura nacional e internacional sobre concentraciOn de mitogeno, tiempo de incubaci6n, tiempo de acciOn de Ia colchicina y Ia soluciOn hipotónica y demuestra Ia factibilidad de utilizar menores volémenes de medio de cultivo y un mInimo equipo de laboratorio, con resultados semejantes a los reportados por Ia literatura.. REVISION DE LITERATURA La citogenética es una ciencia hIbrida que trata de correlacionar los procesos celulares, especialmente aquellos de los cromosomas, con fenómenos genéticos. MCFeelIy 1990, define a esta ciencia, como el estudio de Ia morfologia y fisiologla de los cromosomas. La citogenética se ha aplicado en diversos campos; como Ia filogenetica, el estudio de anomalias del desarrollo, monstruosidades, disfunciôn reproductiva, pruebas de paternidad y se convierte en Ia entrada lOgica del conocimiento de Ia estructura y funciOn del DNA, su manipulación y potencialidades. (McFeelly, 19901. Long, Susan en Mc Feelly 1990, indica que los estudios citogenéticos pueden realizarse a partir d células en tres estados: el interfásico, el mitótico y el meiOtico. La técnica más utilizada es el cultivo de linfocitos, cuyo procedimiento modal mphca Ia toma de una muestra aproximada de un centimetro cübico de sangre periférica. Ia cual puede ser sembrada cornleta o separando Ia fracción blanca par media de técnicas quim!cas o fisicas (Yunis, 1974). 5c. El ambiente en que se desarrolla el cultivo se basa en Ia disolución en un media de una sustancia promotora del crecimiento (suero fetal); un promotor de la division celular (mitogeno) y supresores del crecimiento microbiano (antibiOticos y antimicOticos) (Ehdridge, 1985). Bueno, 1991; Hare, 1979; y otros autores; enfatizan Ia importancia de Ia desinfecciOn de equipos, esterilizaciOn en materiales y asepsia del procedimiento. Para la toma de Ia muestra se recomienda una muy buena desinfecciOn del area a funcionar. En general se utilizan tubos al Vado impregnados en heparina sOdica; y se escoge un vaso periférico de fácil acceso (ejemplo vena yugular) (Alvarez y Pineda, 1993). La muestra debe Ilevarse al laboratorio en condiciones de refrigeraciOn. Henao y GOmez recomiendan Ia recolecciOn de 210 cc y comentan observaciones personalas que han permitido cultivos viabies en bovinos, porcinos, equinos y bOfalos hasta 24 noras después de Ia toma; siempre y cuando se efectOe un correcto proceso de ref rigeraciOn (Henao, 1993). El crecimiento celular puede ser inducido y mantenido en medios sintéticos de cultivo; estos medios se adquieren comercialmente y consisten básicamente en una mezla de aminoácidos y sales balanceadas. Los medios más comunes son ei TC-199 , el Mc Coy's, 5A, Ham'sf-lO, M.E.M y el RPMI. (Eldridge, 1985). Generalmente Ia preparaciOn del media implica su solubilizaciOn, la esterilizaciOn fIsica, gracias al paso a través de una mombrana de 20 micras y el establecimiento de un ph de 7,2-7,4 (Manual: DIFCO 1990). El suero fetal se utiliza como fuente suplementaria de proteinas y su acciOn se denota en un incremento del 10-250/,'Cl oe Ia mobtiplicaciOn celular (Verma Y, 1985)..
(3) GALLO J., Técnica de cultivo de linfocitos Ten ovinos. Se obtiene a nivel de mataderos procedente de fetos, sienda inactivado al sameterlo a temperaturas de 562 por 30 minutos y esterilizado por medios fisicos. Otros autores comentan la bondad del uso del suero de Neonato. o el suero autolago. En general la recomendación de suplementaciOn oscila entre un 10-20% del total de media a utilizar en cada cultivo (McFeelly, 1990; Roonev CzepuHcowski, 1987; Verma & Babu. 1985: Yunis, 1974). En el cultivo debe garantizarse una cornpleta esterilidad en equipos. reactivos y gran asepsia en los procedimientos de muestreo y siembra. Para lograr este requerimiento, se adiciona al media de cultivo sustancias antimicrobianas coma la penicillina, a estreptomicina y un fungicida. La recomendacibn modal indica agregar 100 U.I. penicilina 100 microgramos de estreptomicina y 25 microgramos de fungizone por cada centImetro de media a preparar (Edridge, 1985). Los mitógeaos rnás utilizados son las Phitohemaglutininas; las cuales son mucoprateinas obtenidas a partir del frijol rojo (Phaseolus vulgaris); y utilizados nicialmente gracias a su actividad aglutinante. Como mitágeno, se conoce que Ia actividad de Ia Phitohemaglutinina A (PhA), es exclusiva sobre los linfocitos T, lo mismo que otros mitógenos como el Pokeweed tipo 1, 2, 3 y 4 (PKW) y Ia concanavalina (Con A). Otras pratelnas coma Ia Con A-5, inducen Ia transformación y duplicaciOn de los linfacitos B. La posolagia recamendada para el usa coma rnitógeno de Ia Phitohemoglutinina pomedia 59 Ug/mI de media (Alvarez y Pineda. 1993). E proceso de siembra se inicia con Ia desinfeccion con Etanol a 70% de cabina de fiUja laminar; se enciende con 12 horas de antelaciOn Ia luz ultravioleta, disponiendo. los materiales de vidria a utilizar. Cumplido el plaza, se debe apagar la luz ultravioleta; se preparan los medios y se adiciona 1-2 cc de sangre campleta; por cada frasco de cultivo de 10cc. (Henao, 1993). Eldridge, 1985 recomiendadispaner Ia incubaclora a 39,1C, con un perloda de cultivo de 66 a 72 haras. Veinte minutos previas a Ia finalizacián del perfoda de cultivo, se adicianan 0,1cc de cotchicina a de colcernid y se mantiene en Ia incubadora (McFeelly, 1990).. Cumplido ei perlodo He cultivo. Se centrifuqan a 1200 rpm por 10 minutos, se descarta el sobrenadante y Se le adicianan 8 centimetras de solución hipotónica KCL 0,075 M procediéndose a incubar por 20 minutos, luega de este plaza se adiciona 1 cc de soluciOn fijadora Carnoy, se hamogeniza y centrifuga a 1200 rpm por 10 minutos. Posteriormente se pracede a adicianar 5 cm de soluciOn fijadora Carnoy, humogenizar y refrigerar de 4-7C por 30 minutos. Se centrifuga, se adiciona fijador (8 cc) y se pracede asI por 3 a 4 veces con periodos de acción del fijador de 15 a 5 minutos (Alvarez y Pineda, 1993; Buena, 1991; Henao, 1993).. Buena, 1991, recomienda lavar las láminas previamente por 30 minutos en etanol, 15 minutos en metanol y pasarlas con Carnoy, fratándolas energéticamente con un trapa Iimpio que no desprenda fibras y cambiándola entre cada pase, después guardarlas en cajas preferiblemente en un congelador. Para el gatea debe tomarse Ia lámina con una pinza y desp render Ia gota a través de una pipeta pasteur a una altura minima de 30 centImetros.. Caidas 4-5 gatas por Iámina se procede a flamear Ia misma para conseguir el desprendimiento de los alcohales en forma de vapor (Abadia, 1990; Henao, 1993). 51.
(4) REVISTA. Primer Semestre 1997. La lámina una vez lista es dispuesta para observaciOn bajo campo oscuro, donde se visualizará su calidad; y luego se procederá a las tinciones y bandeos del caso, segun sea Ia necesidad y Ia técnica elegida (Bueno 1991; Henao, 1993).. MATERIALES V METODOS Población a muestrear Se seleccionaron 28 ovinos colombianos de pelo, del cruce Sudan por Etiope, hembras y de 1 a 2 años de edad, pertenecientes a Ia granja El Palmar, ubicada en el Municipio de Venadillo (Tolima) y propiedad de Ia Secretaria de Desarrollo del Departamento. Los muestreos sangulneos se realizaron durante el año de 1995 en el primer semestre.. Técnica de Laboratorio Se utilizaron los procedimientos generales recomendados por varios autores e incorporándose pequenas variaciones. tales como: Freparación previa de los medios, con 24 horas de antelación y guardados en Ia incubadora. Este procedimiento permitia detectar fallas en Ia asepsia y desinfecciOn antes de implementar el cultivo. Dentro de las técnicas de campo implementadas, Ia toma de Ia muestra se realizO con jeringa desechable de 5cc y aguja No. 20, desinfectando el area de Ia vena yugular con productos yodados 6 etanol al 70%. Siembra de icc por cada frasco de cultivo aplicado directamente de Ia jennga y con camblo previo de Ia aguja.. Materiales y equipos. Variables de Respuesta. En general, se utilizaron equipos corrientes de laboratorio con una variación como Ia no utilizacián de cabina de flujo laminar que fue reemplazada por el trabajo con mechero bunsen y desinfección estricta del area de cultivo, con etanol al 70%.. El efecto de los tratamientos se evidenciO mediante Ia medición del Indice mitótico, el conteo del nümero de metafases, nUmero de metafases incompletas y Ia proporciOn de las mismas.. El proceso se realizO en las instalaciones del Centro de Diagnástico de Ibagué.. El Indice mitótico, se obtiene a partir de Ia siguiente relaciOn: I.M. = Mitosis (No.) X 100 Células Totales. Método Se determinô el comportamiento de éstos a variaciones en el volumen total de rnedio (10cc Vs 5cc); el efecto de 3 niveles de Phitohemaglutinina F (0,1-0,2-0,3); y 3 periodos de incubación (60 horas, 66 horas y 72 horas). También se evaluO el efecto de 2 perIodos de soluciOn hipotOriica y de colcemid (20 minutos Vs 60 mimutos). 52. Se evaluaron 100 campos nor cada tratame ntc Método EstadIstico Se utilizó un diseno completo al azar con arreglo factorial 2 X 3 X 3, donde el primer factor (A) correspondiO al volumen, contando con dos niveles:a1 = volumen de 5 cm y a2 = 10cm..
(5) GALLO J., Técnica de cultivo de lirifocitos Ten ovinos. El segundo factor (B) fueron los niveles de mitogeno (Phitohemaglutinina) donde se consideraron 3 niveles; b1 = 0.1cc, b2 = 0.2cc y b3 = 0.30. El tercer factor (C) fue el tiempo de incubaciOn, doride el nivel Cl fue igual a 60 horas, el 02 = 66 horas y el C = 72 horas. Para probar el efecto del tiempo do Coichicina y solución hipotónica, se utilizó una prueba de 1", con base en el muestreo de 10 animales y a implementacion de dos TABLA 1.. cultivos por animal. R ES U LTA DOS Análisis de varianza del arreglo factorial En Ia tabla No. 1 se presentan los valores obtenidos y su respectiva desviaciOn standart.. i,dices mitóticos riedios, Jesv;aciones standart obtenidos al evaluar 2 nivees de volumen. 3 niveles de mitogeno y 3 perIodos de incubación.. Volumen. cc. 1 CC. Nrvel Mitogeno. Periodo Incubación (horas). tndiceMitótico D.S.. 0,1 0.1 0.1 0,2 0.2 0.2 0.3 0,3 0,3. 60 66 72 60 66 72 60 66 72. 0.826 222 216 2.26 2,53 2,23 2.23 2,03 2,6. 0,11 0,10 0.15 0,05 0.15 1.15 0,2 0.05 0,1. 0,1 0.1 0,1 (.0.. 60 66 72 60. 0,1 0,11 0.11 0.1 .25. 0.2 0,3 0.3 0,3. 00 66 72. 0,73 2,23 2,06 2.3 2,53 2,16 2,2 2,08 2,03. .. 1. En ia tacla 2 pucde coservarse ns cuadrados medios v niveles de probabilidad para as variables independientes volumen Phitohemagiutinina y tiempo de ncubaión a partir de las variables dependiente mdice mitótico. El modelo general es altamente significativo, denotándose un coeficiente de deteminaciOn elevado (0.94), con un promedlo general del indice mitOtico de TABLA2.. IndiceMitótico Medio. 0,2 0,17 0,05 0.05. 2,05. A partir de este análiss, se ooserva quo 00 se detectarcn diferencias estadisticas entre los volumenes de rnedio evaluados, ni entre as interacciones volumen por concentración de Phitohemoglutinina p, volumen por tiempo de incubaciOn y volumen por Phitohemoglutinina por tiempo de incubación.. El efecto del volumen. Ia corlcentración de mitógeno y el tiempo de incuoación sobre el Indice mitótico obtenido en cultivos de linfocitos ovinos.. Fuente. GL*. Periodc do incubaciOn (Pi) Fitohemaglutinina(Fhm) VxFhm PertodoincubaciOn (Pi) VxPi Fhm x Fl VxFhmxPi. 1 2 2 2 2 4 4. Suma de cuadrados 449074 861111 675926 621111 635926 297778 394074. Cuadrado medio 0.02449074 1.85430556 0.00337963 1.27310556 0.01817963 1.42324444 0.00348519. F. Pr> F. 1.27 96.16 0.18 66.02 0.94 73.81 0.18. -0.2672 0.0001 -0.8399 0.0001 -0.3990 0.0001 -0.9469. 53.
(6) REVISTAN66#4, Primer Semestre 1997. La tabla 3 nos muestra ios rangos crIticos. Phitohemaglutinina. El mayoindice. y las diferencias establecidas mediante Ia. mitótico se observO cuando se utilizaron. prueba de Duncan. para la variable. 0,2cc del mitOgeno Phitohemaglutinina p.. TAI3LA3. Prueba de Duncan para Ia variable Indice mitôtico obtenido segün el nivel de Phitohemaglutinina evaluada.. Agrupamiento Duncan*. Media. n. Nivel de Fhm. A. 2.3389. 18. 0.2. B. 2.1278. 18. 0.3. C. 1.7083. 18. 0.1. *Medias con Is misma letra no son significativamente diferentes. La tabla 4 nos enseña los rangos criticos y las diferencias establecidas mediante Ia prueba de Duncan, para la variable mdcoendiente tiempo de incubaciOn. El mayor indice se determinó a las 66 horas y ci TABLA 4.. menor a las 60 horas. La deterrninación de Ia existencia de interacciones altamente significativas, obliga a Ia evaluaciOn de sus tendencias mediante un análisis de regresián.. Prueba de Duncan para Ia variable indice mitótico obtenido segün el periodo de incubacián evaluado.. Agrupamiento Duncan*. Media. n. Nive1 de Fhm. A. 2.2706. 18. 66h. B. 2.1444. 18. 72h. C. 1.7600. 18. 60h. Medias con la misma letra no son sgniticativamente diferentes.. Ariálisis de Regresión La detecciOn de una interacciOn altamente significativa entre los niveles de mitógeno (Phitohemaglutinina) y el tiempo de incubaciOn obligan a determinar el tipo de dependencia entre estas variables. Una manera de establecer esta relaciOn es a trayes del análisis de regresiOn. 54. Se evaluaron las regresiones lineales simpIes y polinomiales para los niveles de mitógeno (0,1 - 0,2 - 0,3 cc) en donde se determinb un modelo altamente significativo para el nivel 1 (0,1 cc), con un coeficiente de determinaciOn del 67%..
(7) GALLO J., Técnica de cultivo de linfocitos T en ovinos. En Ia tabla 5, puede apreciarse los valores estimados para los respectivos parámetros de la ecuación; en donde explorar Ia respuesta cuadrática de los niveles de mitógeno (Phitohemaglutinina); se determi-. nO un modelo altamente significativo para el nivel 1 (0,1 cc), en donde el valor dcl coeficiente de determinaciOn, alcanzaba el 97,47%.. TABLA5. Análi&s de regresión lineal simple para las variables interactuantes Fhm y Pit.. Modelo. Nivel FHm*. F. Prob>F. Intercepto (a). Pi (b). R2. 1. 0.1. 32.5. 0.0001. -5.64. 0.11. 0.67. 2. 0.2. 0.489. 0.4945. 2.79. -0.007. 0.02. 2. 0.3. 1.678. 0.2136. 2.67. -0.008. 0.09. Fhm: FitohemaqIunnna. Pi: Periodo de incubaciOn. En la tabia 6, se presentan los parámetros estimados para esta regresiOn. Tabla6.. P i\'!odeio. Análisis de regresión cuadrática para las variables interactuantes Phitohemaglutinina por perIodo de incubación.. Nivel. 'FHrnl. Vir F. Pro>F. *pj. Intercepto (bi). R2 (b2). 1. 0.1. 288.7. 0.0001. -99.5. 2.97. -0.021. 0.97. 2. 0.2. 7.927. 0.0045. -32.3. 1.06. -0.008. 0.51. 3. 0.3. 2.734. 0.0972. 16.71. -0.43. 0.003. 0.26. Fhm: Fitohemaglutinina. Pruebas de. *Pi: Perodo de incubaciOn. "t.". El efecto del tiempo de acciOn de Ia coichicina (colcemid), y de Ia soluciOn hipotónica (KCL 0.07 M) se determiná mediante Ia comparacián de medics de ias "ariabies respuestas, nürnero de metafases completas y nümero de metafases noornpletas. También se evalud la prcporciOn de metafases incompletas; se determinO que no existe diferencia entre las variables ovauadas.. DISCLJSION Equipo de Iaboratorio Mediante el ajLlste de Ia técnica, se deterrninó la posibilidad de suprimir el uso de Ia cabina de flujo laminar, la cual se utiliza corno una herramienta tendiente a facilitar as condiciones asépticas en ci cultivo (Abadia, D. Gast, P. 1960; Bueno, 1991: E!dridge, 1985; Hare, 1979; I.S.C.N.D.A., 1989). 55.
(8) REVISTAN6Ø*6, Primer Semestre 1997. La cabina fue reemplazada por una desinfección a fondo del area de trabajo mediante el uso de etanol comercial al 700/o. La siembra se acompañó del uso de dos mecheros de Bunsen y el aislamiento del cuar to designado para el cultivo. Esta posibilidad habia sido explorada en el laboratork de citogenetica de la Facultad de Medicina Vetednaria de Ia Universidad Nacionai de Bogota en 1991. Toma de Ia muestra En general se siguieron las recomendacic,nes de diferentes autores, efectuándose una variación ünicamente en el uso de tubos heparinizados al vaclo. Estos fueron reemplazados porjeringas desechables con capacidad de 5 centImetros cübicos, preparadas mediante Ia adición de una fina capa de heparina comercial diluida en Ia proporciOn 1 :2 y adicionando a cada jeringa 0.3 centimetros aproximadamente. Eldridge recomienda utilizar 143 unidades de heparina por cada tubo al vaclo, teniendo en cuenta que un exceso de este anticoagulante disminuye Ia viabilidad del cultivo celular (McFeelly 1990).. Procedimiento de Cultivo En general, se siguieron las recomendaciones de Bueno 1991 y Henao 1993. Se sembró aproximadarnente un centImetro de sangre completa detenléndose el proceso de fijación cuando el botón celular preseritaba un aspecto limpio, lo cual requeria un promedio de 3 pases.. Volumen del medio El análisis estadIstico no detectó diferencia entre los indices mitoticos al utilizar 5 centimetros o 10 centImetros totales de medio de cultivo. El promedio para el volumen menor fué de 2.07 y para el mayor de 2.03. 56. La utilización de volimenes reducidos de medio de cultivo ha sido una práctica poco comUn, sin embargo, Bueno, 1991 recomienda procesar Ia muestra total en dos frascos separados con volümenes de 5 centimetros que se unen en el momento de Ia cosecha.. No se conocen evaluaciones de los contenidos individuales. Los indices mitóticos contenidos al utilizar 5 centimetros totales de medio son semejantes a ios hallados por Perilla, 1994, en bovinos : cuando al utilizar el mitogeno fitohemaglutinina P ccn volümenes de 10 cc de medio, encontró indices mitóticos que oscilaban entre 0.83 y 2.27. Estos resultados indican Ia factibilidad de emplear voiümenes reducidos de medio, disminuyendo los costos de cada cultivo, y obteniéndose cultivos viables, aptos para el estudio citogenético.. Coiicentración de mitoqeno El mayor Indice mitótico, se determinO al utilizar 0.2 cc de phitohemaglutinina P en una concentraciOn de 14 microgramos por centImetro ciibico de cultivo establecido. Los indices mitóticos encontrados muestran una media de 2.33, siendo más altos que los reportados por Perilta en bovinos, at utilizar Ia misma concentración. Alvarez, 1992 utilizã concentraciones considerablemente màs altas para el cultivo de lint ocitos ovnos; recomendando Ia utilzación de 59 rng de phitohemoglutinina por cada centimetro de cultivo y realizando cultivos de 10 cc de volumen totaL Al parecer Ia reducción del volumen de medio y de concentración de fitohemaglutinina P establece un equilibrio que no es tOxico a las células y hace viable el cultivo. Los resultado obtenidos permiten recomendar niveles inferiores de fitohemaglutinina.
(9) '3ALLO J., Técnica de cultivo de linfocitos T en ovinos. que los ofrecidos por Henao, Bueno, Verma y Babü y Roone y Czepulkowski.. Periódo de incubación El análisis estadisUco permifirla la recornendaciOn de incubar los cultivos por 66 horas, ya que en éstos fué donde se abtuvieron los mayores indices mitOticos (2.27 en promedio). En general, varios autores recomiendan perlodos de cultivos que osciIan entre las 60 y72 horas. (Eld ridge, 1985; McFeelly, 1990; Rooney Czepulicowski, 1987). El perIodo de incubaciOn presentO una interacción importante con el nivel de fitohernaglutinina, el cual al ser analizado, presentO el mejor ajuste al determinarse una relaciOn de tipo cuadrático entre el nivel de 0.1 cc del mitogeno y el perlodo de incubaciOn. Al observar las predicciones basadas en las ecuaciones en los periodos experimentados, se detectaron mayores indices a las 66 horas de incubaciOn. El mayor ajuste en la interacciOn del menor nivel de mitogeno (0.1 cc) podrIa indicar Ia posibilidad de utilizar este nivel en cultivos p05teriores; sin embargo el análisis individual del efecto del mitogeno sobre el Indice mitOtico señala claramente el segundo nivel como un nivel Optima y de mayor respuesta.. metafases incompletas o poliploides y Ia proporciOn de las mismas. Un exceso de Colchicina o de Colcemid, hubiese producido un acortamiento excesivo de los cromosomas, el cual fue solamente ocasional o provocado seguramente por el efecto del reactivo sabre metafases en periodos tempranos de Ia mitosis (McFeelly, 1990). La insuficiencia de este inhibidor del huso mitotico se hubiera detectado gracias a Ia apariciOn de la endoreduplicación. En este fenômeno, el huso mitOtico es inhibido parcialmente y Ia persistencia de algunas fibras ocasionan la no separaciOn de los cromosomas presentándose mitosis con un ntmero superior al diploide, segOn Ta cantidad de cromosomas que hayan quedado unidos. Este fenOmeno no se detectO en ninguno de los cultivos. La baja incidencia de estos fenOmenos y los resultados del análisis estadIstico permiten establecer que Ia concentraciOn y el tiempo de exposiciOn al reactivo son Optimos y que debido a Ia necesidad de incrementar Ia eficiencia en el uso del tiempo del investigador, seria recomendable utilizar el me nor tiempo de exposiciOn.. Efecto de Ia solución hipotónica. El efecto cuadrático determinado evidencia un decrecimiento de los indices mitoticos al prolongar el perlodo de incubaciOn, To cual concuerda con 10 reportado por Yunis, 1974; Eldridge, 1985 yotros (Buena, 1991; l-lenao 1993; McFeelly, 1990; Rooney Czepulicowski, 1987).. El análisis estadistico no detectO diferencias entre el efecto del cloruro de potasio 0.07 M actuando por 20 minutos ó por 60 minutos. El efecto se considerO al determinar el nUmero de metafases por contea, el nOmero de metafases incompletas y la praporciOn de las mismas.. Efecto de Ia exposición a Colcemid. El exceso de cloruro de potaslo en cancentraciOn o perIodo de acciOn ocasionarla un rompimiento brusco de las cOlulas mitOticas provocando Ia dispersiOn de los cromosomas contenidos y por tanto Ia detecciOn de cromosomas salitarios y mitosis. El análisis estadistico no detecta diferencias entre el efecto de Colcemid por 20 minutos o por 60 minutos, respecto al nOmero de metafases por conteo, nOmero en. 57.
(10) REVISTA N4. .Ø'4, Primer. Semestre 1997. con un nümero inconstante de cromosomas. Una deficiencia de Ia soluciOn hiootOnica provocaria Ia presencia de mitosis con un gran nümeo de cromosomas sobreimpuestos 0 amontonados que no permiten el anälisis citogenético. La no detecciOn de estos fenOmenos y los resultados del análisis estadistico, permten establecer que la concentración y tiempo de exposición al reactivo son óptimos y que debido a la. necesidad de incrementar Ia eficiencia en el tiempo de dedicación del laboratorista, seria recomendable el uso del perlodo de exposición de 20 minutos.. Proceso de cosecha, goteo y tinciOn Se siguieron las recomendaciones de Bueno, 1991 y Henao. 1993. No se encontraron dificultades en su aplicabilidad. Los conteos coinciden con los ha!lazgos de Alvarez y Fineda 1993, y permiten Ia implementaciOn de las técnicas corrientes de bandeos cromosomicos. CONCLUSION ES El uso de 5 centImetros cübicos totales de medio de cultivo no ocasiona diferencias estadisticas en Ia cantidad y calidad de Ia mitosis estudiad as. Los mayores indices mitóticos (X = 2.33), se obtuvieron al utilizar 0.2 cc del mitógeno Phitohemaglutinina P en solucián de uso diario: (14 microgramos/cc). El periodo de incubación optima fue el de 66 horas, donde se obtuvo tin Indice mitOtico medio de 2.27. No existe diferencia estadistica entre los periodos de exposiciOn de 20 minutos y 60 minutos a los reactivos Colcemid y Ia soluciOn hipotOnica, obteniéndose mitOsis de buena call58. dad para estudios de citogenética cIasica. Se reconfirmO el ndmera diploide del ovino colombiano de pelo (ovis aries variedad sudan X variedad etiope) 2n = 54.. RECOMENDACONES. Teniendo en cuenta, que se trabaja con el minima de refinamientos técnicos, es pertinente advertir que deben extremar las medidas de seguridad con el propOsito de evitar accidentes con agentes contaminantes que podrIan danar reactivos vitales, costosos y propiciar pOrdida de tiempo. A Ia luz de Ia establecido en esta serie de experimentas, se recomienda utilizar para el cultivo de infocitos ovinos, el siguiente protocolo Preparación del medio para siembra con 24 horas de antelación y en el orden referido. *. * * *. 5ccrpmi1640 Suero fetal bavino al 20% (icc) 0.2 cc ae phitohemaglutinina P soluciOn diana Guarder en incubadora a 37 00, no utilizar si se observan entubiamientos a cambios drásticos de color.. Toma de Ia muestra Jeringa desechable de 5 cc conteniendo 0.3 cc de heparina sOdica (liquernine R) en diluciOn 1 :2. DesinfecciOn quimica (Etanol al 70%) del area a puncionar. Ref rigeraciOn de la muestra (2-4 cc) ; sin que se ponga en contacto directo con el medio refrigerante (hielo)..
(11) GALLO J., Técnica de cultivo de linfocitos T en ovinos. lentamente tratando de obtener una mezcla perfecta. Si es necesario, golpear suavemente al fondo del tubo; agregar 8 centimetros más do solución Carnoy, agitando permanentemente.. Siembra *. LimpiezaydesinfecciOnprofundadel area de trabajo.. *. Control de corrientes de aire.. *. Usa de 2 mecheros Bunsen (1 a cada lado). *. Gambia de aguja a lajeringa. *. Flameado do tapas y boca de frascos do cultivo.. *. AdiciOn de 1 centimetro do sangre, flameado de boca del frasco y tapado.. *. incubación a 37 2C por 66 horas.. *. Centrilugar a 1000 rpm por 10 minutos *. Desechar el sobrenadante. *. Agregar 8 cc de soluciôn Carnoy, mezciando de tal forma que no se produzcan grumos o compactaciones. Dejar reposar por 15 minutos en nevera; repetir el proceso, dejando en reposo por 5 minutos. La fijaciOn estará completa cuando el baton tenga aspecto traslucido.. Cosecha *. *. 20 minutos previo al cumplimiento do las 66 horas de cultivo, se adicionaran 0.1 cc de soluciOn comercial de Colcemid ; mezclar con movimientas suaves. A las 66 horas se pasará el contenido del frasco a tubos de punta cOnica y se centrifugara por 10 minutos a 1.000 revoluciones.. Dejar en reposo por 30 minutos a ternperatura de 4-7 o (nevera).. E! goteo *. Preparar las láminas lavándolas por 30 minutos en metanol, 15 en etanol y 5 minutos en soluciOn Carnoy.. *. Mediante el uso de pipetas Pasteur; se desechará el sobrenadante.. *. Ordenar las láminas y colocarlas en un congeiador.. '.. Adicionar al botOn obtenido previamente, 8 centimetros do solución hipotOnica (KCI 0.07M).. *. Disponer el botOn celular con una cantidad relativa de soluciOn Carnoy (1-2 cc) y dejar caer 4-5 gotas por iámina, desde una aitura de 1 m. Dejar secar.. *. Guardar láminas en caja para los bandeos.. *. Efectuar la coloraciOn normal con Giemsa segOn ci método de Bueno (3) y Henao (7).. Se recomienda adicionar inicialmente 2 centimetros y mezclar con movimientos suaves. Dejar en incubadora por 20 minutos. * *. Centrifugar a 1000 rpm por 10 minutos, desechar sobrenadante. Adicionar 1 cc do soiución Carnoy,. 59.
(12) REVISTAN44ZM4, Primer Semestre 1997. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Abadia, D. Gasta, P. 1990 IntroducciOn a Ia citogenética de bovinos. Postgrado de reproducciOn animal. Universidad Nacional de Colombia. Santafé de Bogota, 60 p. Alvarez, C.S. y Pineda A. ZR. 1993. Estandarizacián del cultivo de linfocitos de sange periferica para estudios citogenéticos en ovinos de Ia raza Black Belly West African. MédiCo Veterinario. Tesis. Corporacián Universitaria de Ciencias Agropecuarias. Santafé de Bogota. Colombia. Bueno, M. 1991. Citogenetica Humana: Manual de Procedimientos. INS. Santafé de Bogota. Burrells, C. and Wells, P.W. 1977. In vitro stimulation of ovines limphocytes by various mitogens. Research in Veterinary Science. 23,84 :86. Eldridge, F.E. 1985. Cytogenetics of livestock. Avi. Pub. Co. 295 pp. HareW. SingE. 1979. Citogenetica de Ia reproducciOn animal. De. Acribia, pp 150. Henao Uribe, Francisco Javier. 1993. Frecuencia de regiones organizadoras de nucleolo. (NORs) en bovinos de raza normando. MSc. Tesis. Universidad Nacional de Colombia. Santafé de Bogota. Colombia.. 60. I.S.CN.D.A 1989. International Sistem for Cytogenetics Nomenclature of Domestric Animals. Cit Cell Genet. 53 :65-79. Long, Susan, 1990. Chromosome Techniques en : Aduanies in Vet Sci and Corn. Med. McFeely R. 1990 Domestic Animals Cytogenetics en : Advances in Vet. Sci and Corn. Med. Pp 19-40 Perilla, Martha. 1994. Normalización de Ia Técnica de Cultivo de Linfocitos Bovinos : Msccc. Tesis. Universidad Nacional de Colombia. Santafé de Bogota. Colombia.. 12. Rooney D.E. Czepulicowski, A. 1987. Tissue Culture Methods in Human Cytogenetics Oxford Eng.. 13. Steel Torrie. 1985. Bioestadistica principios y procedimientos. Segunda ediciOn.. Verma R.S. & Babu A. 1985. Human Chromosomes pergamon Press N. Y. Pp 57-63.. Yunis, JJ. 1974. Human Chromosomes methodology second edition. Academia Press..
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