Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
INFORME DE PRÁCTICAS PRE-PROFESIONALES
“ESTANDARIZACION DE PROTOCOLO DE CULTIVO PRIMARIO DE CARDIOMIOCITOS DE RATAS NEONATAS APLICANDO LA NORMA ISO
9001:2015 – CHILE 2019”
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE:
QUÍMICO FARMACÉUTICO
AUTOR: Bach. ANTICONA SALAZAR, Enrique Junior ASESOR: Mg. CURO VALLEJOS, Yuri Freddy
TRUJILLO – PERÚ
2020
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
DEDICATORIA A Dios por darme las fuerzas para
seguir adelante con todas las metas que me he propuesto en mi vida.
A mi papá Enrique que desde el cielo me cuida y me guía para cumplir mis metas y a mi mamá Liliana que me alienta cada día para seguir adelante y lograr todos mis triunfos, sin su apoyo no podría alcanzar mis metas, gracias por darme este regalo tan preciado que es la educación, les estaré eternamente agradecido.
A mis hermanas Patricia y Fiorella, que son mi ejemplo, y que me han enseñado el deber humanista del profesional Químico Farmacéutico.
A ti Katherine por estar en los momentos donde necesito un consejo y por brindarme tu amor, sé que serás una
de las mejores profesionales Químico Farmacéutico. Aún tenemos mucho camino por recorrer juntos.
El éxito es la suma de pequeños esfuerzos, repetidos días tras día, soy el único responsable de que esto ocurra.
Enrique Junior Anticona Salazar
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
AGRADECIMIENTO
A la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo y sus docentes por la exigencia y elevado nivel académico brindado a lo largo de la carrera, responsables de nuestra formación Académico-Profesional.
A mis Tutores, PhD. CATALÁN GAETE, Marcelo Aquiles, Dr. VARELA LEKENDA, Diego Hermes y Dra. HERMOSILLA BELLENGER, Tamara Paz, mi más profundo y
sincero agradecimiento por que estuvieron en todo momento orientándome durante la realización de los experimentos, también aprovechar para agradecerles que con sus respectivos fondo de financiamiento de investigación, me permitieron realizar mis practicas Pre-profesionales en el área de investigación fruto del cual pude realizar esta estandarización de protocolo.
Así mismo a mi Asesor, Mg. CURO VALLEJOS, Yuri Freddy, mi más profundo y sincero agradecimiento, respeto y estima; por guiarme en la realización del presente informe de prácticas pre-profesionales.
Al financiamiento de: Proyectos FONDECYT 1160900 (Investigador Responsable Dr.
Diego Varela), 1171135 (Investigador Responsable Dr. Marcelo Catalan) y Núcleo Milenio de enfermedades asociadas a canales iónicos Minicad (Iniciativa científica
Milenio) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile.
A ustedes siempre les estaré agradecido, porque con su apoyo estoy cumpliendo una meta más en la larga carrera de mi vida profesional de Químico Farmacéutico. ¡Muchas gracias!
A los Señores Miembros del Jurado, mí más considerado agradecimiento porque con sus observaciones ayudaron a que el trabajo sea llevado con impecabilidad.
El Autor.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
PRESENTACIÓN
Señores Miembros del Jurado Dictaminador:
Dando cumplimiento a lo establecido por el reglamento de grados y títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, me es satisfactorio someter a vuestra consideración y elevado criterio profesional, el informe de prácticas pre-profesionales titulado:
“ESTANDARIZACION DE PROTOCOLO DE CULTIVO PRIMARIO DE
CARDIOMIOCITOS DE RATAS NEONATAS APLICANDO LA NORMAL ISO 9001:2015 – CHILE 2019”
De modo muy especial agradezco la colaboración de los señores miembros del jurado.
Dejo a vuestra consideración señores miembros del jurado, la respectiva calificación del presente informe.
Trujillo, Setiembre del 2020
______________________________
Bach. Anticona Salazar, Enrique Junior
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
JURADO DICTAMINADOR
___________________________________
Dr. VENEGAS CASANOVA, Edmundo Arturo Presidente
_________________________________
Mg. CURO VALLEJOS, Yuri Freddy Asesor
_________________________________
Mg. GANOZA GASCO, Frizzi Judith Miembro
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
RESUMEN
El presente informe titulado ESTANDARIZACION DE PROTOCOLO DE CULTIVO PRIMARIO DE CARDIOMIOCITOS DE RATAS NEONATAS APLICANDO - ISO 9001:2015 – CHILE 2019, tiene como objetivo principal el estandarizar un protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas, el cual se utiliza como procedimiento previo para la realización de los experimentos. Es por ello que se decidió seguir los pasos básicos, basados en la estandarización de procedimientos mediante la normativa ISO 9001:2015.
Para la realización de la estandarización lo primero que se hizo, es buscar la información de la metodología existente, con lo que se encontró que el laboratorio contaba con un procedimiento escrito. Paso seguido se procedió a ensayar el protocolo usado para cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas existente. Seguidamente se identificaron debilidades, para poder generar observaciones de mejora del protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas. Donde resaltaron, riesgo latente de contaminación de cultivo celular (higiene de campana de flujo laminar), mala asepsia del espécimen, mala manipulación del espécimen, el manejo de medios de cultivos.
Luego se ensayó un primer borrador del protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas, donde se observó si las recomendaciones hechas tuvieron utilidad, luego se generaron recomendaciones finales que se deben tenerse en cuenta durante la realización del protocolo, y finalmente se hizo un documento del protocolo estandarizado para obtención de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas, siguiendo pautas generales de la normativa ISO 9001:2015
Palabras clave: Estandarización de protocolo, ISO 9001:2015; Cultivo celular;
Procedimiento estandarizado.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
ABSTRACT
The present report entitled STANDARDIZATION OF PRIMARY CULTURE PROTOCOL OF NEONATE RAT CARDIOMYOCYTES APPLYING - ISO 9001:2015 - CHILE 2019, has as main objective to standardize a protocol of primary culture of neonatal rat cardiomyocytes applying, which is used as a previous procedure for conducting the experiments. That is why it was decided to follow the basic steps, based on the standardization of procedures through the ISO 9001:2015 standard.
To carry out the standardization, the first thing that was done was to look for the information of the existing methodology, with which it was found that the laboratory had a written procedure. This was followed by testing the protocol used for primary culture of existing neonatal rat cardiomyocytes. Subsequently, weaknesses were identified, in order to generate observations of improvement of the primary culture protocol of neonatal rat cardiomyocytes. Where they highlighted, latent risk of cell culture contamination (laminar flow hood hygiene), poor specimen asepsis, poor specimen handling, handling of culture media
Then a first draft of the primary culture protocol of neonatal rat cardiomyocytes was tested, where it was observed if the recommendations made were useful, then final recommendations were generated that should be taken into account during the implementation of the protocol, and finally a document was made of the standardized protocol for obtaining primary culture of neonatal rats cardiomyocytes, following general guidelines of the ISO 9001:2015 standard
Key words: Protocol standardization, ISO 9001:2015; Cell culture; Standardized procedure.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
ÍNDICE
DEDICATORIA ii
AGRADECIMIENTO iii
PRESENTACIÓN iv
JURADO DICTAMINADOR v
RESUMEN vi
ABSTRACT vii
I. INTRODUCCIÓN 1
II. MATERIAL Y MÉTODO 6
III. RESULTADOS 13
IV. DISCUSIÓN 17
V. CONCLUSIONES 20
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 21
VII. ANEXOS 23
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
I. INTRODUCCIÓN
En la actualidad el mundo tiene conocimiento de miles de procesos productivos, dichos que deben seguir un cierto orden protocolizado y plasmados en reportes escritos a los que se les denomina protocolo estandarizado.
Las razones fundamentales por las que miles de organizaciones y grandes empresas ya hayan implementado la estandarización de procesos es: el tiempo y el dinero, dicho en otras palabras el ahorro de tiempo de trabajo y el ahorro de recursos económicos propios y ajenos. Acompaña a esas razones el tratar de evitar errores en la ejecución de un proceso productivo.1
Estandarizar un proceso es tipificar y normalizar los procesos para que se puedan desarrollar de manera simple y más fluida, evitando en todo el proceder errores típicos.
Siempre que las actividades se realicen de una misma manera. La estandarización conlleva a una organización más fluida, donde todos los procesos realizados entran un protocolo de actuación para cada uno de ellos.2
Es por esta razón que al estandarizar los procesos, nos permite realizar un estudio de todas las actividades, especializarnos en la forma de ejecutar nuestros procesos, mejorar la productividad al hacer más eficientes nuestros procesos y la culminación de la estandarización nos dejara un protocolo estandarizado.3
El protocolo estandarizado, es un documento estructurado en base a un proceso productivo, que permite evitar errores de ejecución, dentro de este se encuentras criterios técnicos y observaciones con respecto a la ejecución de un procedimiento.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Se decide estandarizar una metodología para: mejorar costos en la realización, cuando hay observaciones en la ejecución del procedimiento, inadecuado sistema de control de trabajo, mejora del rendimiento e inadecuada practicidad en la ejecución.4
Para realizar una estandarización se deben seguir 5 puntos muy importantes. Dividir los ciclos productivos de la organización, dividir cada línea de servicio o producto, estudiar cada proceso, establecer un procedimiento, y auditar el proceso.5
Cuando se adopta un sistema de gestión de la calidad, puede ayudar a mejorar su desempeño global y proporcionar una base sólida para las iniciativas de desarrollo sostenible. Los beneficios potenciales: la capacidad para proporcionar regularmente productos y servicios que satisfagan los requisitos del cliente, facilitar oportunidades de aumentar la satisfacción del cliente, abordar los riesgos y oportunidades asociadas con su contexto y objetivos, es por este motivo que se insta al uso y práctica de las normativas ISO, que permitirán estandarizar procesos.6
La ISO 9001 es una norma ISO internacional elaborada por la Organización Internacional para la Estandarización (ISO) que se aplica a los Sistemas de Gestión de Calidad de organizaciones públicas y privadas, independientemente de su tamaño o actividad empresarial. Se trata de un método de trabajo excelente para la mejora de la calidad de los productos y servicios, así como de la satisfacción del cliente.3,6,7.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
El reporte de protocolo estandarizado debe incluir.3, 7, 8, 9 ,10
- Objetivo, definir el fin del activo a obtener que se pretenden alcanzar con el procedimiento
- Responsabilidad, delimitar cuáles serán las funciones, áreas o sectores encargados.
- Definiciones, solo si tienen terminología.
- Desarrollo: describir en orden cronológico las actividades necesarias para cumplir con el procedimiento. Se debe indicar qué hacer, cómo hacerlo, cuándo hacerlo y quién lo ejecutará.
- Formularios y registros: indicar los modelos de formularios que se utilizarán para registrar los datos que se recogerán al ejecutar las actividades indicadas en el procedimiento.
- Referencias: citar documentos o normas aplicables, tales como otros procedimientos, instrucciones específicas, normas internas, que no se encuentran incluidas en el capítulo de Anexos.
- Los Formatos: consta de un encabezamiento y un pie de página.
- El encabezamiento debe contener: el nombre de la institución, el título del procedimiento, el número de codificación y el número de páginas.
- El pie de página debe contener: las fechas de redacción, revisación, aprobación
Para tomar la decisión de redacción de un nuevo procedimiento o la revisión de uno vigente se debe verificar la existencia de la documentación necesaria para la redacción del nuevo procedimiento, analizar el requerimiento de revisión de un procedimiento vigente para determinar si es necesaria su actualización; después de haber recolectado la
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
información y documentación necesaria se desarrolla un borrador del procedimiento, registrando la fecha y el nombre del responsable de la redacción. 3, 7, 8
Después de haber redactado el primer borrador del procedimiento, el mismo se deberá someter a una fase de experimentación en la que se consulta al personal calificado, supervisores y/o operarios afectados pudiendo los mismos sugerir modificaciones o correcciones para mejorar el contenido inicial. Esta fase finalizará con la redacción definitiva del procedimiento, en base al borrador y las sugerencias recibidas. 3, 7, 9
En la redacción definitiva, el procedimiento deberá ser identificado con una codificación adecuada que permitirá identificar el tipo de documento, el número de orden correlativo y el número de revisión. 3, 7, 8, 9 ,10
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
OBJETIVO GENERAL
Estandarizar un protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas aplicando - ISO 9001:2015.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Ensayar el protocolo usado para cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas.
Identificar las debilidades del protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas.
Mitigar las debilidades del protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas.
Ensayar el protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas siguiendo las mejoras.
Dilucidar recomendaciones finales que se deben tenerse en cuenta durante la realización del protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas.
Documentar el protocolo estandarizado para obtención de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas, siguiendo pautas generales de la normativa ISO 9001:2015
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
II. MATERIAL Y MÉTODO
2. PLAN DE MUESTREO
2.2.1. POBLACIÓN Y MUESTRA
2.2.1.1. UNIVERSO MUESTRAL
Protocolos del laboratorio de Fisiología Molecular Cardiovascular.
2.2.1.2. MUESTRA
Protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas.
2.2.1.3. UNIDAD DE ANÁLISIS Y MUESTREO Protocolo
2.2.1.4. TAMAÑO Y SELECCIÓN DE LA MUESTRA Documento del protocolo vigente.
3. MATERIALES Y OTROS
2.3.1. DOCUMENTÓ DE CONSULTA o Normativa ISO 9001:2015 6
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
2.3.2. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
Ratas Sprague Dawley S.E. neonatas de 0 a 3 días de nacidas, (para aplicación y experimentación de mejoras).
2.3.3. MATERIAL
2.3.3.1. Material de vidrio
Pipetas de vidrio de 2mL, 5mL y 10 mL Cover glasses 12mm
2.3.3.2. Material de laboratorio Hielo.
Caja Poliespan.
Alcohol 70°.
Povisept, Povidona Yodada solución (DifenPharma).
Tubos de ensayo desechables.
Tubos Tipo Falcon (15mL, 50mL).
Placas de cultivo desechables, (9.5 cm2, 22.1 cm2 y 60 cm2.) (TPP® tissue culture dishes).
Tips para micropipeta (10uL, 20uL, 200uL, 1000uL) Solución salina Hank.
Suero de Caballo (SC).
Suero Fetal Bovino (SFB).
Solución phosphate buffered saline (PBS).
Solución DMEM LG con 0.5% de SFB, con 5% de SFB y con 15% de SFB.
Parafilm (BEMIS®, Bemis Flexible Packaging).
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
2.3.3.3. Material quirúrgico
Material quirúrgico (pinzas, tijeras, navajas.) Guantes de látex y de nitrilo.
Algodón.
2.3.4. REACTIVOS Cloruro de sodio (NaCl).
Hepes.
Fosfato de disódico (Na2HPO4).
Cloruro de potasio (KCl).
Sulfato de magnesio (MgSO4).
Glucosa.
Fosfato monopotásico (KH2PO4).
Cloruro de calcio (CaCl2).
Cloruro de magnesio (MgCl2).
Bicarbonato de sodio (NaHCO3).
Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA).
Hidróxido de sodio (NaOH).
Ácido Clorhídrico (HCl).
Trisaminometano (Tris- base).
Colagenasa tipo II (Gibco® Lifetechnologies) (0,2 mg/mL).
Pancreatina (Sigma-Aldrich) (1,2 mg/mL).
Gelatina.
Dulbecco´s Modified Eagle Medium Low Glucose (gilco® by lifetechnologiesTM) (DMEM LG.).
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Pen-Strepto (Penicilina y Streptomicina) (Mediatech).
Fungizone (Biological Industries).
2.3.5. INSTRUMENTOS
Micropipetas (P2, P20, P200, P1000) (Gilson™ Micropipetas).
Mechero eléctrico. IBS (INTEGRA BIOSCIENCE / FIREBOY eco) Propipeta electrónica. (CORNING / STRIPETTOREM PLUS).
2.3.6. EQUIPOS
Campana de flujo laminar horizontal.
Incubadora a 37 °C.
Incubadora a 37 °C, con agitación orbital constante.
Bomba al vacío.
Balanza analítica (Explorer / OHAUS).
Microscopio electrónico (OLYMPUS).
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
4. METODOS
2.4.1. Procedimiento: 3, 7, 8, 9, 10.
2.4.1.1. Ensayo del protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas. 3, 7, 8, 9, 10.
En cumplimiento con los parámetros trazados en base a la normativa ISO 9001:2015 se aplicara listado de conformidad, de ítem tomando en referencia de la normativa ISO 9001:2015. (ver anexo 1)
En base al protocolo previo que se tenía documentado en el laboratorio (ver anexo 2), se realizó ejecución del procedimiento de obtención del cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas. Con el cual se generó observaciones técnicas de la ejecución de dicho procedimiento que se registraron en el “Formato de Informe de observaciones técnicas de la ejecución del protocolo” (ver anexo 3).
2.4.1.2. Análisis de Protocolo:3, 7, 8, 9, 10.
Se realizó un análisis del protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas. Con el cual se identificó debilidades basadas en la ejecución técnica de procedimiento.
2.4.1.3. Mejoras del Protocolo: 3, 7, 8, 9, 10.
Se generó un cuadro resumen, en el cual se establecieron las posibles mejoras en base a las debilidades observadas en la ejecución del protocolo previo.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Posterior a esto se documentó un borrador del protocolo estandarizado cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas, el cual tuviera pautas precisas a seguir durante la ejecución del protocolo.
2.4.1.4. Ensayo del protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas siguiendo las mejoras. (Borrador): 3, 7, 8, 9, 10.
Se realizó el protocolo siguiendo las pautas de mejora durante la ejecución del procedimiento. Obteniendo resultados más óptimos del proceso, el cual se plasmó en una tabla mejoras adoptadas.
2.4.1.5. Dilucidar recomendaciones finales en el protocolo: 3, 7, 8, 9, 10.
Después de plasmar en la tabla las mejoras que sirvieron para optimizar el procedimiento. Se tomó la decisión final, de que mejoras incluir en el protocolo a seguir para la obtención de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas.
2.4.1.6. Documentar el protocolo estandarizado de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas aplicando ISO 9001:2015. 3, 7, 8, 9, 10.
Antes de documentar el protocolo estandarizado de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas, se verifica el cumplimiento de la normativa ISO 9001:2015. En el cual se volverá a evaluar algunos puntos aplicables para la ejecución de procedimientos. Esto se realiza mediante un listado de conformidad de ítem tomando en referencia de la normativa ISO 9001:2015. Donde se indica si se adoptó las mejoras correspondientes en el ítem que no se tuvieron conformidad al inicio. (ver anexo 4)
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Se generara la versión actualizada del protocolo estandarizado de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas.
La metodología del protocolo estandarizado de cultivo primario celular fue presentado como parte del trabajo de investigación, “Papel del transporte de bicarbonato en el potencial de acción de cardiomiocitos de ratas neonatas”- Santiago de Chile - 2019.
Realizado por Enrique Junior Anticona Salazar, bajo la supervisión de su asesora y tutores del trabajo antes mencionado.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
III. RESULTADOS
3.1. Ensayo del protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas.
- Se aplicó el listado de conformidad, ítem tomando en referencia de la normativa ISO 9001:2015. (ver anexo 5)
- Se registró observaciones en base al procedimiento del protocolo, el cual se ejecutaba para la obtención de cultivos primarios. (Ver anexo 6)
3.2. Análisis de Protocolo:
Cuadro N° 1: Observación de debilidades a mejorar.
CRITERIOS OBSERVABLES OBSERVACIÓN
-Riesgo latente de
contaminación de cultivo celular (higiene de campana de flujo laminar)
Durante la ejecución del procedimiento se observa una inadecuada sanitización de la campana de flujo laminar, lo cual puede conllevar a la contaminación del cultivo celular.
-Mala asepsia del espécimen. Durante la decapitación se puede generar una contaminación, los especímenes no fueron correctamente tratado y desinfectados.
-Mala manipulación del espécimen
Se detectó que al momento de la extracción del corazón de los especímenes, se accede de mala manera, con lo cual se pierde tejido. Se observa descuido por parte de la persona que ejecuta el procedimiento.
-Uso de medios de cultivos Se puedo observar, que los medios de cultivos usados, no se comprobaron si estaban libre de contaminantes, que puedan afectar el cultivo.
-Mal uso del gelificante. Se pudo observar que en la etapa del pre-paqueo, no se activó correctamente la gelatina. La cual debe calentarse antes de verter a las placas.
Fuente: Observaciones obtenidas durante la ejecución del protocolo.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
3.3. Mejoras del Protocolo:
Cuadro N° 2: Observaciones de mejora y recomendaciones.
Se realizaron observaciones de mejora que permitieron atacar y mitigar las debilidades, procedimentales que el procedimiento pueda tener.
OBSERVACIÓN RECOMENDACIONES
Riesgo latente de contaminación de cultivo
celular (higiene de campana de flujo
laminar)
Se recomienda hacer una correcta santificación de la campana de flujo laminar, para lo cual 30 minutos antes de iniciar con el procedimiento. Se desinfectó el mesón de la campana de flujo laminar con alcohol a 70° y luego se dejó prendido el flujo laminar para que recircule el aire contenido dentro de la campana.
Mala asepsia del espécimen.
Enfatizar en el uso de torundas de alcohol yodado y alcohol de 70° para la correcta desinfección de los especímenes.
Mala manipulación del espécimen
Capacitar al personal que realiza el procedimiento.
Sobre la correcta ejecución de extracción de la porción de tejido de interés.
Uso de medios de cultivos Inspeccionar con la ayuda de un microscopio si las soluciones de cultivo no tienen presente ningún contaminante que pueda alterar la recuperación del cultivo celular.
Mal uso del gelificante. Indicar que la forma correcta de uso de la gelatina es después de haberla atemperado, ya que esto permitirá que en el paso de plaqueo células que no son de interés queden pegadas en la gelatina, y así permitir una mejor discriminación celular.
Fuente: Observaciones, en referencia a las debilidades identificadas.
3.4. Ensayo del protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas siguiendo las mejoras. (Borrador):
- Ver anexos 7, 8 y 9.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
3.5.Dilucidar recomendaciones finales en el protocolo:
Cuadro N° 3: Recomendaciones procedimentales.
OBSERVACIÓN RECOMENDACIÓN
Riesgo latente de contaminación de cultivo celular (higiene de campana
de flujo laminar)
Se decide incluir como recomendación hacer una correcta santificación de la campana de flujo laminar, 30 minutos antes de iniciar con el procedimiento.
Mala asepsia del espécimen. Se decide dar la recomendación de uso de torundas de alcohol yodado y alcohol de 70°.
Mala manipulación del espécimen
Se decide incluir recomendaciones de extracción del tejido de interés.
Uso de medios de cultivos Se decide indicar en el protocolo el inspeccionar con la ayuda de un microscopio si las soluciones de cultivo no tienen presente ningún contaminante que pueda alterar la recuperación del cultivo celular.
Mal uso del gelificante. Se decide indicar la forma correcta de uso de la gelatina.
Fuente: Ejecución del borrador del protocolo con recomendaciones.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
3.6.Documentar el protocolo estandarizado de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas aplicando ISO 9001:2015.
Se generó el documento final, en el cual se incluyeron todos los cambios y recomendaciones adoptadas en la ejecución del protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos. (ver anexo 10)
Se aplicó el listado de conformidad, ítem tomando en referencia de la normativa ISO 9001:2015, (Medidas correctivas).
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
IV. DISCUSIÓN
En el presente informe, se realizó una estandarización de procedimiento que normalmente se desarrolla en un laboratorio de investigación, al que se le denominó un protocolo estandarizado, visto desde la perspectiva de la estandarización aplicando la Normatividad ISO 9001:2015.
Para estandarizar un procedimiento productivo por más pequeño que este parezca y de cualquier índole, si se busca con este evitar errores, además tener un orden correcto y detallado del proceder, se deben seguir pasos básicos durante los cuales se pone en observación la ejecución de un procedimiento.
Para la estandarización de un procedimiento se deben seguir 5 puntos muy importantes, de tal manera para un sistema organizacional en el Laboratorio de Fisiología y Fisiopatología Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile, decidimos dividir todos los procedimientos productivos en ciclos, que en lo practico fueron cada uno de los diferentes procedimientos que se hacían (experimentos), se subdividió por líneas productivas (experimentos realizados en busca de un resultado preciso), luego se estudiaron cada uno de los procesos que se realizan en el laboratorio, uno de los que se estudio fue el protocolo de obtención de cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas.
Para la ejecución de la estandarización se propuso un procedimiento de avaluación en base a la normativa ISO 9001:2015. Por lo cual se inició haciendo un reconocimiento previo y recopilación de los procedimientos y la forma en cómo se hacían. Se pudo observar que el laboratorio contaba con un procedimiento de obtención del cultivo
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
primario de cardiomiocitos de ratas neonatas. Cumpliendo esto con la recolección de la información utilizada para la realización del procedimiento (ver anexo 2).
Paso seguido se aplicó el listado de conformidad, ítem tomando en referencia de la normativa ISO 9001:2015. Con el cual se pudo constatar que fortalezas se tenía el laboratorio para la ejecución del procedimiento (ver anexo 5).
Antes de analizar y decidir si se va a estandarizar un procedimiento se debe de hacer observaciones sobre este. Por lo cual después de haber recabado información se decidió observar la ejecución del procedimiento para la obtención de cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas (ver anexo 6), mismas que se analizan para identificar si tienen impactó en el procedimiento.
En el cuadro N° 1, Observación de debilidades a mejorar, se identifica las debilidades observadas y registradas en el paso anterior; las que se analizaran para determinar los errores que se pueden generar. Entre los datos analizados se encontró: producto de una mala sanitización de la campana de flujo laminar, la mala higiene del espécimen el no comprobar las solucione de cultivo se pueden generar una contaminación inminente del cultivo celular; además de esto la mala manipulación del tejido cardiaco y la gelificación para discriminar las células cardiacas de las plaquetas pueden llevar a un menor rendimiento en la obtención de cultivos primarios de cardiomiocitos.
En el cuadro N° 2, se dan soluciones de mejora para las debilidades observadas, estas están orientadas a mitigar las debilidades que se puedan tener en el procedimiento. Las mismas que nos permitirán desarrollar un borrador del procedimiento teniendo en cuanta
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
las recomendación (ver anexos 7 y 8). Seguidamente se realizó el ensayo del nuevo protocolo estandarizado. Con el cual se obtuvo resultados alentadores, que permiten decir que al incluir recomendaciones se evita los errores procedimentales.
En el cuadro N°3, se dilucida las recomendaciones a incluir en la redacción del protocolo final. Con base a estos resultados Se generó el documento final, en el cual se incluyeron todos los cambios y recomendaciones adoptadas en la ejecución del protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos. (ver anexo 10)
Al finalizar toda la redacción procedimiento, y al igual que al inicio se aplicó el listado de conformidad, ítem tomando en referencia de la normativa ISO 9001:2015, para verificar si los déficit anotados al inicio se pudieron subsanar. Y en que medida se cumplen con el listado elaborado en base a la normativa – ISO 9001:2015. (ver anexo11)
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
V. CONCLUSIÓNES
Se estandarizó un protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas aplicando - ISO 9001:2015.
Se ensayó el protocolo usado para cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas.
Se identificó que las debilidades del protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas fueron el riesgo latente de contaminación y la mala manipulación de las muestras y espécimen.
Se recomendó la sanitización como medida correctiva que ayude a mitigar una de las debilidades asimismo, se propuso la capacitación del personal para mejorar las debilidades operacionales del protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas.
Se ensayó el protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas siguiendo las mejoras (borrador).
Se generaron recomendaciones finales en relación a la asepsia y practicidad que el personal debe tener en cuenta durante la realización del protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas.
Se generó un documento del protocolo estandarizado para obtención de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas, siguiendo pautas generales de la normativa ISO 9001:2015.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. KYOCERA. Document Solutions España S.A. La estandarización de procesos, una ventaja competitiva. En internet. 2020. Visto el 26 de agosto del 2020. Disponible en:
<https://www.kyoceradocumentsolutions.es/es/smarter-workspaces/business- challenges/procesos/la-estandarizacion-de-procesos-una-ventaja-competitiva.html>
2. Torres I. Como Implantar ISO 9001:2015 Paso a Paso. 5 Pasos para Realizar una Estandarización de Procesos en Tu Empresa. En internet. 2020. Visto el 26 de agosto del 220. Disponible en: <https://iveconsultores.com/estandarizacion-de-procesos/>
3. Alzate F. Cómo Estandarizar y Optimizar los Procesos con ISO 9001. En internet.
2020. Visto el 26 de agosto del 2020. Disponible en: <https://iso9001-calidad- total.com/2015/03/03/como-estandarizar-los-procesos-bajo-la-norma-iso-9001/>
4. ITEMSA. Estandarización del trabajo (Métodos y Tiempos). En internet. 2020. Visto
el 26 de agosto del 2020. Disponible en:
<https://www.grupoitemsa.com/estandarizacion-del-trabajo-metodos-y-tiempos/>
5. Tradelog. Qué es la certificación ISO 9001 y por qué es importante. En internet .2020.
Visto el 26 de agosto del 2020. Disponible en: <
https://www.tradelog.com.ar/blog/que-es-la-certificacion-iso-9011/>
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
6. NORMA INTERNACIONAL ISO 9001:2015. Traducción oficial. Sistemas de gestión de la calidad – Requisitos . 5ta. Ed. 2015. En internet. 2020. Visto el 26 de
agosto del 2020. Disponible en: <
http://www.itvalledelguadiana.edu.mx/ftp/Normas%20ISO/ISO%209001- 2015%20Sistemas%20de%20Gesti%C3%B3n%20de%20la%20Calidad.pdf>
7. Elaboración de un Procedimiento Operativo Estandarizado. En internet. 2020. Visto
el 26 de agosto del 2020. Disponible en: <
https://www.paho.org/hq/dmdocuments/2008/1_Taller_POE_00.pdf>
8. ABCM. Estandarización de procesos: aprenda cómo hacerlo y cuáles son los beneficios. En internet. 2020. Visto el 26 de agosto del 2020. Disponible en:
<https://www.myabcm.com/es/blog-post/estandarizacion-de-procesos/>
9. ACEVEDO A, CONDE L. Metodología para el diseño, estandarización y mejoramiento de procesos en una empresa prestadora de servicio. En internet. 2020.
Visto el 26 de agosto del 2020. Disponible en:
<https://repository.ean.edu.co/bitstream/handle/10882/5011/AcevedoAlejandro2013.
pdf?sequence=1&isAllowed=y>
10. KAILEAN. Estandarizar: trabajar de forma organizada y controlada. En internet.
2020. Visto el 26 de agosto del 2020. Disponible en: < http://kailean.es/estandarizar- trabajar-de-forma-organizada-y-controlada/>
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
VII. ANEXOS
Anexo 1: Listado de conformidad, ítem tomando en referencia de la normativa ISO 9001:2015. (Formato)
Anexo 2: Protocolo de laboratorio cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas.
Anexo 3: Formato de Informe de observaciones técnicas de la ejecución del protocolo. (Formato)
Anexo 4: Listado de conformidad, ítem tomando en referencia de la normativa ISO 9001:2015, (Medidas correctivas).
Anexo 5: Listado de conformidad, ítem tomando en referencia de la normativa ISO 9001:2015. (Lleno)
Anexo 6: Formato de Informe de observaciones técnicas de la ejecución del protocolo. (Lleno)
Anexo 7: Borrador de protocolo estandarizado de cultivo celular de cardiomiocitos.
Anexo 8: Evidencias del borrador del protocolo estandarizado.
Anexo 9: Evidencias del ensayo de borrador del protocolo estandarizado.
Anexo 10: Protocolo estandarizado de cultivo primario de cardiomiocitos.
Anexo 11: Listado de conformidad, ítem tomando en referencia de la normativa ISO 9001:2015, (Medidas correctivas). (Lleno).
Anexo 12: Organizador visual del proceso de estandarización.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Anexo: 1
Listado de conformidad, ítem tomando en referencia de la normativa ISO 9001:2015.
Conformidades según normativa ISO
9001:2015 Conforme No
conforme
1.-El área cuenta con un sistema organizacional de supervisiones.
2.- El área de cultivo celular es la adecuada para la ejecución del procedimiento.
3. El área cuenta con los equipos e instrumentos necesarios para la realización del procedimiento.
4. El área de trabajo cuenta con registro de limpieza antes del uso.
5.- El área cuanta con certificados de mantenimiento y calibración de los equipos.
6.- El área cuenta con un protocolo documentado que refrende lo que se ejecuta.
7.- El área cuenta con un sistema de documentación, donde se registra el uso de los equipos.
8.- El personal ejecuta los procedimientos según protocolo.
9.- El personal usa la indumentaria adecuada durante la realización del procedimiento.
10.- El personal cuenta con calificación y capacitación adecuada de los procedimientos.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Anexo 2: Protocolo de laboratorio cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas.
Cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas.
Materiales:
10 – 20 ratas neonatas, de 1 a 3 días de nacidas.
Caja para cultivo celular: (tijera quirúrgica grande y pequeña, pinzas y cuchilla.) (
Guantes
Vasos
Alcohol
Tubos falcon de 15mL y 50mL.
Filtro minisart
Suero Fetal Bobino (SFB)
Pancreatina
Colagenasa II
Caja tecnopor con hielo picado
Bomba al vacio
Filtro auto clavado con membrana de filtro
Preparar soluciones:
1. Solución Hank stock 500 mL : NaCl, 3.39 g; Hepes, 2.38 g; Na2HPO4 0.056 g;
Glucosa, 0.504 g; KCl 0.201 g, MgSO4, 0.0986 g
2. Phosphate Buffered Saline (PBS 1x): Stock 1000 mL , pH=7.7
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
NaCl 8 g; KCl 0.2 g; Na2HPO4 * H2O2.16 g ; KH2PO4 0.24 g
3. Medio DMEM: disolver el sobre en bicarbonato. Este debe tener pH de 7.4 En el presente caso:
- Dimen 0,5% SFB - Dimen 15% SFB
4. Solución enzimática digestiva: El protocolo en 20 y 10 neonatos es en pesos para preparar la solución:
Esta solución a preparar se le agrega 30 ml de solución Hank en ambos casos.
- Pancreatina 22mg (10 neonatos) 36 mg (20 neonatos) - Colágenasa tipos II 4 mg (10 neonatos) 6 mg (20 neonatos)
Ojo: las enzimas siempre están en el frigorífico a una temperatura de -20 °C.
o Mantener la solución enzimática a 37°C.
5. Suero Fetal Bobino (SFB)
Debe estar a -20 °C, por lo cual para ser utilizado dentro del procedimiento se debe llevar a 37°c en una incubadora (Marca y serie)
6. Gelatina al 1%. Esta se usa para agregar a los cubre.
Procedimiento:
1° Poner los materiales necesarios sobre la cámara de flujo laminar
- Alcohol en un vaso (donde se introducen las tijeras, navaja y pinzas que serán utilizadas para extirpar el corazón a las ratas.
- Mechero.
- Caja con hielo picado
- Caja de cultivo celular (conteniendo tijeras, pinzas y navaja para triturar)
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
- Frasco de alcohol y Frasco de povidona. (algodones empapados con estas sustancias.)
- Tuvos de 15mL (4 unidades) y 50mL (2unidades) - Placas Petri de MEDIDAS.
- Pipetas Pasteur, pipeta de 10mL.
Ojo: procurar que todas las cosas a usar dentro de la cámara de flujo laminar estén desinfectadas adecuadamente.
2° Filtrar solución Hank para evitar de que este contaminado. De la solución filtrada se agrega solución en una placa y observar en el microscopio. Para comprobar de que no esté contaminad.
3° Tomar al espécimen y realizar la limpieza con cuidado a las ratas neonatas. Usar torundas con alcohol y povidona.
Después de la limpieza correcta, se corta la cabeza de la rata neonata con rapidez y seguridad con la ayuda de una tijera grande que está en la caja de cultivo celular. El protocolo para el sacrificio de estos especímenes, contempla este paso como importante para evitar el sufrimiento del espécimen al momento de la ejecución del procedimiento.
Cortar por el pecho con ayuda de la tijera pequeña de la caja para cultivo celular para tener acceso al corazón y poder extraerlo.
Extraer el corazón con ayuda de una pinza y poner el corazón extirpado en la placa con solución Hank que está en baño de hielo.
4° Para este procedimiento solo se requieren solo tejido ventricular donde encontramos en su
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
parte superior del corazón extraído y las otras 3 cuartas partes del corazón se ponen en una placa sin solución. Lo mismo con los otros corazones extirpados.
5° Después de haber hecho el paso anterior se tritura con la ayuda de una navaja.
6° Pasar el triturado a un tubo de capacidad adecuada (tubo de 50mL), al que se le agregara la solución Hank antes filtrada para sacar la sangre que aun esta con el tejido cardiaco.
Retirar esta solución con sangre con la ayuda de una pipeta. Cuidando en la forma posible de que el tejido se vaya con la solución. (Hacer este pasó 2 veces).
7° Al tejido decantado en el tubo se le agrega aprox. 5 mL de solución enzimática.
Tapar él tuvo y poner parafil. Llevar a la incubadora con movimiento oscilatorio de 100 a 200 RPM, a 37 °C por 20 min aprox. Se elimina el sobrenadante de la primera digestión hasta donde sea posible, el cual debe contener DNA suelto, células muertas y otras sustancias que podría perjudicar el cultivo.
8° Con el decantado de tejido se le agrega 5mL aprox de solución enzimática y llevar a la incubadora con movimiento oscilatorio de 100 a 200 RPM, a 37 °C por 15 min. (Realizar el mismo procedimiento del 3°a la 6° digestión o hasta que se termine la solución enzimática.) 8° Después del tiempo indicado para la segunda digestión se colecta el sobrenadante en un tubo de 15 ml. Este sobrenadante se centrifuga a 1000 RPM por 5 min. con temperatura entre entres los 22 y 24 °C; en el segundo sobrenadante y los sucesivos contiene cardiomiocitos (vivos y muertos) liberados en la digestión.
Después de la centrifugación se elimina el sobrenadante, quedando un pellet.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
A este pellet se le agrega 2 mL de Suero Fetal Bovino a 37 °C y suspender el pellet. Mantener a 37°C colectar todas las porciones de pellet en suero.
9° Se hará uso de placas según la técnica que posterior al cultivo se aplicara:
o ARN: No se colocan cubre, por que estas no serán expuestas al microscopio investidas.
o Patch Clamp: Se colocan 5 laminillas cubre objeto.
- Agregar 1mL de solución de gelatina al 1%, y llevar a incubar a 37°C.
10° Después de la última digestión y correspondiente suspensión en suero, de su pellet. se le agrega medio DIMEM preparado al 0.5% SFB, hasta completar 10mL en el tubo.
Nuevamente suspender.
El siguiente paso será agregar esta solución en una placa de 60 cm2, y llevar a incubar a 37°C y 5% CO2 por 2h o 2h y 30 min.
11° Tomar la solución flotante de la placa con la ayuda de una pipeta estéril y llevar a centrifugar a 1000 RPM por 5 min. con temperatura entre entres los 22 y 24 °C. Eliminar el sobrenadante y obtener el pellet.
12° Al pellet obtenido en el paso anterior se le agrega medió DIMEM al 15 % SFB. La cantidad a agregar será de acuerdo a la cantidad de placas y la confluencia que se quiere obtener según el método a aplicar después.
13° A las placas incubadas con 1 mL de gelatina 1%, con ayuda de una pipeta pasteur flameada en mechero y adaptada a una bomba al vacío succionara la solución sobrenadante en las placas. Luego lavar las placas 2 veces con 1mL PBS frio . Esta solución de lavado será
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
succionada con ayuda de una pipeta pasteur flameada en mechero y adaptada a una bomba al vacío.
- Luego agregar 1mL de la suspensión de cardiomiocitos a la concentración deseada según el paso anterior.
- Llevar a incubar a 37°C y 5% CO2 por 24 horas aprox. para obtener los cardiomiocitos figados en la gelatina presente en la placa.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Anexo 3: Formato de Informe de observaciones técnicas de la ejecución del protocolo.
INFORME DE OBSERVACIONES DE LA EJECUCIÓN DEL
PROTOCOLO.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Anexo 4:
Listado de conformidad, ítem tomando en referencia de la normativa ISO 9001:2015, (Medidas correctivas).
Conformidades según normativa ISO 9001:2015
Conforme (SI / NO)
Se toman medidas correctivas.
1.-El área cuenta con un sistema organizacional de supervisiones.
2.- El área de cultivo celular es la adecuada para la ejecución del procedimiento.
3. El área cuenta con los equipos e instrumentos necesarios para la realización del procedimiento.
4. El área de trabajo cuenta con registro de limpieza antes del uso.
5.- El área cuanta con certificados de mantenimiento y calibración de los equipos.
6.- El área cuenta con un protocolo documentado que refrende lo que se ejecuta.
7.- El área cuenta con un sistema de documentación, donde se registra el uso de los equipos.
8.- El personal ejecuta los procedimientos según protocolo.
9.- El personal usa la indumentaria adecuada durante la realización del procedimiento.
10.- El personal cuenta con calificación y capacitación adecuada de los procedimientos.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Anexo 5: Listado de conformidad, ítem tomando en referencia de la normativa ISO 9001:2015. (Lleno)
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Anexo 6: Formato de Informe de observaciones técnicas de la ejecución del protocolo. (Lleno)
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Anexo 7: Borrador de protocolo estandarizado de cultivo celular de cardiomiocitos.
Laboratorio de Fisiología Molecular Cardiovascular. Código PLF-001
Protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas
neonatas. Versión 01
Protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas.
1 Objetivo
Permitir realizar el procedimiento estandarizado para la obtención de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas, siguiendo pautas y recomendaciones, que permitan minimizar los errores técnicos durante la ejecución.
2 Responsabilidades
De la ejecución: Personales calificados designados.
De la revisión: Responsable de la sala de cultivo celular.
De la autorización: Jefe del Laboratorio de Fisiología Molecular Cardiovascular.
3 Metodología:
El procedimiento para el aislamiento y generación de cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas utilizado fue elaborado en el laboratorio del Dr.
Diego Varela, el cual fue aprobado por la Comisión de Bioética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile y por la Comisión de Bioética de FONDECYT (Proyecto FONDECYT 1160900).
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
3.1 Soluciones:
Recomendación: Todas las soluciones a usar estuvieron libre de contaminación antes de ser usadas. Por lo cual se tomó una alícuota para verificación en el microscopio electrónico (OLYMPUS).
3.1.1 Solución Hank stock 500 mL titulado a pH 7.4
Se preparan 500mL de solución Hank stock, debe pesarse con: NaCl 3.39 g; Hepes 2.38 g; Na2HPO4 0.056 g; Glucosa 0.504 g; KCl 0.201 g; MgSO4 0.0986 g, luego se disuelve y afora con agua nano pura. Se lleva a titular hasta pH 7.4, después de esto se filtra la solución stock con la ayuda de bomba al vacío. (Nota: este procedimiento debe hacerse bajo cámara de flujo laminar.)
3.1.2 Phosphate Buffered Saline (PBS 1X)
Se preparan 1000mL de PBS 1X stock, pesar NaCl 8 g; KCl 0.2 g; Na2HPO4*H2O 2.16 g; KH2PO4 0.24 g y aforar con agua nano pura, titular a pH 7.4. Luego se lleva a autoclavar las botellas que contienen el PBS 1X.
3.1.3 Medio Dulbecco's Modified Eagle Medium - Low glucose, (DMEM - Low glucose):
Se disuelve el sobre que contiene el medio DMEM - Low glucose en un litro de agua y pesar 3.7 g de NaHCO3. (Nota: Se lleva a un agitador con magneto para mejorar la disolución), ajusta a pH a un valor de 7.4; seguidamente se filtra con la ayuda de bomba al vacío (Nota: bajo cámara de flujo laminar).
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Nota: Durante los procedimientos del cultivo celular primario, se usa medio DMEM que contienen diferentes porcentajes de SFB (Suero Fetal Bovino).
Tener preparado medio DMEM al 0,5% SFB y al 15% SFB.
3.1.4 Solución enzimática digestiva:
El presente protocolo estandarizado es aplicable para diferente cantidad de ratas neonatas. Sin embargo, durante la digestión, la cantidad enzimática de la solución debe variar, es así que para:
- 10 corazones de neonatos, se pesa: Pancreatina 22mg (Sigma-Aldrich) y Colágenasa tipos II 4 mg (Gibco®Lifetechnologies).
- 20 corazones de neonatos, se pesa: Pancreatina 36mg (Sigma-Aldrich) y Colágenasa tipos II 6 mg (Gibco®Lifetechnologies).
Los respectivos pesos deben son disueltos en 30 mL de solución Hank. Esta solución por contener enzimas digestivas se mantuvo a 37°C después de ser preparada, además de ser preparada el mismo día.
3.1.5 Gelatina al 1%
Se prepara 100 mL de gelatina al 1%, se pesa 1g de gelatina y afora con agua nano pura tibia (Nota: entre los 40 -50°C para mejorar la disolución. Se deja en baño maría a 40°C por el laxo de una hora antes de usar la gelatina.)
3.1.6 Suero Fetal Bobino (SFB) y Suero de Caballo (SC):
Se descongela, por lo cual se lleva a un baño térmico programado a 37°C.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
3.2 Procedimiento:
3.2.1 Alistar los materiales en la cámara de flujo laminar:
Nota: Se limpia la superficie de trabajo con alcohol de 70° y se coloca los materiales necesarios sobre la cámara de flujo laminar, correctamente desinfectados, tener cuidado con la asepsia para evitar la contaminación del cultivo primario, durante la extracción del órgano desde el espécimen y en su procesamiento.
Poner dentro de la cámara de flujo laminar: Material quirúrgico, (pinzas, tijeras, navajas.), caja poliespan con hielo, alcohol 70°, povidona yodada, tubos de plástico desechables, algodón, placas de cultivo desechables.
Nota: En este paso se arma la bomba al vacío, el mechero y la pro-pipeta eléctrica ya deben estar dentro de la cámara de flujo laminar.
Se colocó sobre la caja poliespan con hielo, una placa de 22.1 cm2 con un poco de solución Hank. Esto será el baño de hielo donde se colocarán los corazones extirpados.
3.2.2 Eutanasia de ratas Sprague Dawley S.E. neonatas:
Antes de proceder con la eutanasia de los especímenes, se toma al espécimen y se realiza la limpieza con cuidado. Primero con una torunda con alcohol y luego con povidona.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Después de haber desinfectado al espécimen, se procede a decapitar con rapidez y seguridad con la ayuda de una tijera quirúrgica grande. El protocolo estandarizado para el sacrificio de estos especímenes, contempla este paso como importante para evitar el sufrimiento del espécimen al momento de la ejecución del procedimiento.
Se corta en el medio del tórax con ayuda de una tijera pequeña, para tener acceso al corazón y poder extirparlo. Se extirpa el corazón con ayuda de una pinza de punta delgada y se poné el corazón extirpado, en la placa con solución Hank que está en baño de hielo.
3.2.3 Limpieza del corazón, selección de la porción de interés y disgregación mecánica:
Para este procedimiento sólo es requerido tejido ventricular que contiene mayoritariamente miocardio. Por lo cual, con ayuda de las pinzas de punta delgada se corta la cuarta parte superior del corazón extirpado (porción donde está localizada el área auricular, además de las arterias aorta y pulmonar), y las otras 3 cuartas partes del corazón se puso en una placa sin solución pero dentro del baño de hielo. Lo mismo con los otros corazones extirpados. Una vez colectados todos los corazones, el tejido obtenido se disgregó para que la superficie a digerir sea mayor y así se facilite la acción de las enzimas; por tal motivo el tejido se tritura con la ayuda de una navaja.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
3.2.4 Lavado del tejido cardiaco.
Se pasa el triturado a un tubo de capacidad adecuada (tubo de 50mL), al cual fue agregado 30 mL de solución Hank, para eliminar la sangre aún presente en el tejido cardiaco. Se retira esta solución con la ayuda de una pipeta, cuidando al máximo que no se pierda el tejido.
Al tejido decantado en el tubo se le agrega 5 mL de solución enzimática digestiva a 37°C. Se lleva a una incubadora con movimiento oscilatorio, programado de 100 a 200 RPM, a 37 °C por 20 min. Luego se elimina el sobrenadante, hasta donde sea posible, el cual contiene: DNA suelto, células muertas y otras sustancias que podría perjudicar el cultivo.
3.2.5 Digestión del tejido cardiaco.
Al tejido decantado después del lavado con solución enzimática digestiva, le fue agregado 5 mL de la solución enzimática digestiva. Luego se lleva a una incubadora con movimiento oscilatorio, programado de 100 a 200 RPM, a 37 °C por 15 min, repitiendo con cada 5 mL de solución enzimática digestiva restante (en total serán realizadas 5 secuencias de digestiones).
Después de transcurridos los 15 min. de la primera digestión se retira el tubo de la incubadora, y se hace una dispersión mecánica antes de colectar el sobrenadante, se deja reposar por 1 min. y luego se colecta el sobrenadante en un tubo de 15 ml. Después de haber colectado la máxima cantidad de sobrenadante, al tubo que contiene el tejido cardiaco sin digerir se le agrega 5 mL de solución enzimática digestiva y se lleva a incubar con rotación.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
El sobrenadante colectado es centrifugado a 1000 RPM por 5 min. a temperatura entre los 22 y 24 °C. Después de ser centrifugado el sobrenadante, donde se encuentran los cardiomiocitos muertos, se elimina, quedando un pellet, Al cual se le agregan 2 mL de Suero de Caballo a 37 °C para resuspender el pellet. Luego, se mantiene esta resuspención a 37°C hasta obtener el segundo pellet y volver a resuspender. Esto se realiza con cada pellet obtenido después de la centrifugación del sobrenadante de la digestión.
3.2.6 Se prepara placas para el cultivo primario e Incubación de placas con gelatina.
- Se usan placas de diferentes medidas, según el experimento a realizar:
o Placa de 9.5 cm2, usada cuando el cultivo fue para Patch Clamp, fluorescencia (cada placa contiene 5 cubres de vidrio de 12mm) y ARN.
o Placa de 60 cm2, se usó para extracción de proteína (Western Blot).
Antes de sembrar las células, las placas se incuban con 1% gelatina. Para la placa de 9.5 cm2 será agrega 1mL de gelatina, para la placa de 22.1 cm2 se agrega 3 mL de gelatina y, para la placa de 100mm x 20mm se agrega 5mL.
Se incuba las placas por 3 horas en condiciones de 37°C y CO2 5%.
3.2.7 Pre-plaqueo.
Después de la última re-suspensión de pellet en el SC, se agregan 8mL de medio DMEM al 0.5 % SBF a 37°, y la solución es nuevamente resuspendida.
El siguiente paso se agrega esta solución en una placa de 60 cm2, y se lleva a incubar a 37°C y 5% CO2 por 2h o 2h y 30 min.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
3.2.8 Plaqueo de cultivo celular.
Después de las 2 horas de incubación del cultivo el sobrenadante de la placa se retira con la ayuda de una pipeta estéril, y luego centrifuga a 1000 RPM por 5 min. a temperatura entre los 22 y 24 °C. Después de la centrifugación se elimina el sobrenadante, y el pellet nuevamente vuelve a ser resuspendido en medio DMEM al 15 % de SBF, cantidad suficiente para las placas a cultivar. La decisión de cuantos mL de DMEM 15% SFB agregados depende de la confluencia a la que es requerido el cultivo.
Las placas incubadas con 1 mL de gelatina 1%, con ayuda de una pipeta pasteur flameada en mechero y adaptada a una bomba al vacío, se usa para succionar la solución sobrenadante en las placas (gelatina).
Luego se lava las placas 2 veces con 1mL PBS frío.
Nota: Esta solución de lavado es succionada con ayuda de una pipeta pasteur flameada en mechero y estuvo adaptado a una bomba al vacío. La solución debe ser fría para detener la gelificacion.
A continuación, 1mL de la suspensión de cardiomiocitos a la concentración deseada se agrega a la placa.
Luego, se incuba a 37°C y 5% CO2 por 16 horas aprox. para que los cardiomiocitos puedan adherirse a la gelatina presente en la placa. Pasado las 16 horas, las placas de cultivo fueron lavadas con PBS 1X a 37°C (2 veces).
Posteriormente, se adiciona medio DMEM 0.5% SFB (la cantidad depende del tamaño de la placa de cultivo).
Recodar que todo el procedimiento se realizó dentro de la cámara de flujo laminar.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
4 Historial
- Borrador. Enero – 2019
5 Autorización del documento
Elaborado Revisado Aprobado
Fecha Fecha Fecha
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Anexo 8: Evidencias del borrador del protocolo estandarizado.
Figura A:
Figura B:
En las figuras A y B son capturas de pantalla del archivo borrador en revisión. Antes de generar el archivo final del protocolo estandarizado.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Anexo 9: Evidencias del ensayo de borrador del protocolo estandarizado.
Figura N°1: Campana de flujo laminara.
Mesón con materiales usados durante la realización del procedimiento.
Figura N°2: Microscopio marca OLYMPUS – CKX41.
Se utilizó para inspeccionar que las soluciones de cultivó no tengan contaminantes.
Figura N°3: Vista de cultivo primario celular.
Se presenta la vista a 100x del cardiomiocitos, expuesto a una micro pipeta que permite tener acceso a la célula.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Anexo 10: Protocolo estandarizado de cultivo primario de cardiomiocitos.
Laboratorio de Fisiología Molecular Cardiovascular. Código PLF-001 Protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas
neonatas. Versión 01
Protocolo de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas.
1 Objetivo
Ejecutar el procedimiento estandarizado para la obtención de cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas, siguiendo pautas y recomendaciones, que permitan minimizar los errores técnicos durante la ejecución.
2 Responsabilidades
De la ejecución: Personales calificados designados.
De la revisión: Responsable de la sala de cultivo celular.
De la autorización: Jefe del Laboratorio de Fisiología Molecular Cardiovascular.
3 Metodología:
El procedimiento para el aislamiento y generación de cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas utilizado fue elaborado en el laboratorio del Dr.
Diego Varela, el cual fue aprobado por la Comisión de Bioética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile y por la Comisión de Bioética de FONDECYT (Proyecto FONDECYT 1160900).
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
3.1 Soluciones:
Todas las soluciones estuvieron libre de contaminación antes de ser usadas. Por lo cual, una alícuota de cada solución fue inspeccionada en el microscopio de luz transmitida (OLYMPUS) para verificar la ausencia de micro-organismos.
3.1.1 Solución Hank stock 500 mL titulado a pH 7.4
Se preparan 500mL de solución Hank stock, pesando lo siguientes compuestos:
NaCl 3.39 g; Hepes 2.38 g; Na2HPO4 0.056 g; Glucosa 0.504 g; KCl 0.201 g;
MgSO4 0.0986 g, luego se disuelve, se titula a pH 7.4 y se afora con agua nano pura. Después de esto se filtra la solución stock con la ayuda de bomba al vacío, bajo cámara de flujo laminar.
3.1.2 Phosphate Buffered Saline (PBS 1X)
Se preparan 1000mL de PBS 1X stock, pesando lo siguientes compuestos: NaCl 8 g; KCl 0.2 g; Na2HPO4*H2O 2.16 g; KH2PO4 0.24 g; disolver, , titular a pH 7.4 y aforar con agua nano pura. Luego autoclavar las botellas que contienen el PBS 1X.
3.1.3 Medio Dulbecco's Modified Eagle Medium - Low glucose, (DMEM - Low glucose):
Se disuelve el sobre que contiene el medio DMEM - Low glucose en un 800 ml de agua, se le agregan 3.7 g de NaHCO3. Se lleva a un agitador con magneto para mejorar la disolución, ajusta pH a un valor de 7.2, luego se afora a un litro con agua; seguidamente se filtra con la ayuda de bomba al vacío, bajo cámara de flujo laminar.
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
Durante los procedimientos del cultivo celular primario, se usa medio DMEM que contienen diferentes porcentajes de SFB (Suero Fetal Bovino). Tener preparado medio DMEM al 0,5% SFB y al 15% SFB.
3.1.4 Solución enzimática digestiva:
El presente protocolo estandarizado es aplicable para diferente cantidad de ratas neonatas. Sin embargo, durante la digestión, la cantidad enzimática de la solución debe variar, es así que para:
- 10 corazones de neonatos, se pesa: Pancreatina 22mg (Sigma-Aldrich) y Colágenasa tipo II 4 mg (Gibco®Lifetechnologies).
- 20 corazones de neonatos, se pesa: Pancreatina 36mg (Sigma-Aldrich) y Colágenasa tipos II 6 mg (Gibco®Lifetechnologies).
Ambos compuestos son disueltos en 30 mL de solución Hank. Esta solución, por contener enzimas digestivas, debe ser mantenida a 37°C después de ser preparada el mismo día.
3.1.5 Gelatina al 1%
Se prepara 100 mL de gelatina al 1%, se pesa 1g de gelatina y se afora con agua nano pura tibia, entre los 40-50°C para mejorar la disolución; luego, se deja en baño maría a 40°C por el lapso de una hora antes de ser usada.
3.1.6 Suero Fetal Bobino (SFB) y Suero de Caballo (SC):
Se descongela una alicuota de cada uno y se llevan a un baño térmoregulado programado a 37°C.
3.2 Procedimiento:
Biblioteca de Farmacia y Bioquímica
3.2.1 Alistar los materiales en la cámara de flujo laminar:
Se limpia la superficie de trabajo de la cámara de flujo laminar con alcohol de 70° y luego se coloca sobre ella los materiales necesarios, correctamente desinfectados, para evitar la contaminación del cultivo primario durante la extracción del órgano.
Poner dentro de la cámara de flujo laminar: material quirúrgico, (pinzas, tijeras, navajas.), caja poliespan con hielo, alcohol 70°, povidona yodada, tubos de plástico desechables, algodón, placas de cultivo desechables.
En este paso se arma la bomba al vacío, el mechero y la pro-pipeta eléctrica ya deben estar dentro de la cámara de flujo laminar.
Se coloca sobre la caja poliespan con hielo, una placa de 22.1 cm2 con un poco de solución Hank, para ser utilizada como baño de hielo.
3.2.2 Eutanasia de ratas Sprague Dawley S.E. neonatas:
Antes de proceder con la eutanasia de los especímenes, se toma al espécimen y se realiza la limpieza con cuidado usando una torunda, primero con alcohol y luego con povidona (o alcohol yodado).
Después de haber desinfectado al espécimen, se procede a decapitar con rapidez y seguridad usando una tijera quirúrgica grande. El protocolo estandarizado para el sacrificio de estos especímenes contempla este paso como importante para evitar el sufrimiento del animal al momento de la ejecución del procedimiento.
Se corta en el medio del tórax, con ayuda de una tijera pequeña, para tener acceso al corazón y así extirparlo usando una pinza de punta delgada; se coloca el corazón extirpado en la placa con solución Hank previamente colocada en el baño de hielo.