Indentificación de regiones cromosómicas candidatas a contener genes de alta penetrancia en cáncer de mama familiar mediante análisis de ligamento basado en SNPs

FACULTAD DE CIENCIAS

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID

I I ^{DE D E NT N T IF I F IC I CA AC C IÓ I ÓN N DE D E} R R ^{E E GI G IO ON NE ES S} C C ^{RO R OM MO OS S ÓM Ó MI IC C AS A S} C C ^{AN A ND DI ID DA AT T A A S S}

A A C C ^{ON O NT TE E NE N ER R} G G ^{E E NE N E S S D DE E} A A ^{LT L TA A} P P ^{E E NE N E T T RA R AN NC CI IA A E EN N} C C ^{ÁN Á NC CE ER R D DE E} M M ^{AM A MA A} F F AM A MI IL LI IA AR R M M E E DI D IA AN NT TE E A A NÁ N ÁL LI IS SI IS S D DE E L L IG I GA AM MI IE E NT N T O O B B AS A S AD A DO O E E N N S S N N P P S S

Tesis doctoral presentada por Juan Manuel Rosa Rosa,

Licenciado con Grado en Biología, para optar al título de Doctor por la Universidad Autónoma de Madrid

Director de Tesis Dr. Javier Benítez Ortiz

Director de Programa de Genética del Cáncer Humano Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas

GRUPO DE GENÉTICA HUMANA

PROGRAMA DE GENÉTICA DEL CÁNCER HUMANO

CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIONES ONCOLÓGICAS (CNIO)

Dr. Javier Benítez, Director del Programa de Genética del Cáncer Humano del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO) y Profesor Honorario del Departamento de Biología Molecular de la Universidad Autónoma de Madrid, como Director y Tutor,

CERTIFICA:

Que D. Juan Manuel Rosa Rosa, Licenciado con Grado en Biología por la Universidad Complutense de Madrid, ha realizado la presente Tesis Doctoral “Identificación de Regiones Cromosómicas Candidatas a Contener Genes de Alta Penetrancia en Cáncer de Mama Familiar Mediante Análisis de Ligamiento Basado en SNPs” y que a su juicio reune plenamente todos los requisitos necesarios para optar al Grado de Doctor en Biología, a cuyos efectos será presentado en la Universidad Autónoma de Madrid. El trabajo ha sido realizado bajo su dirección, autorizando su presentación ante el Tribunal Calificador.

Y para que así conste se extiende el presente certificado,

Madrid, septiembre 2009.

V^o B^o del Director y Tutor de la Tesis:

Javier Benítez

Esta tesis doctoral ha sido realizada en el Grupo de Genética Humana del Programa de Genética del Cáncer Humano del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas

(CNIO), bajo la supervisión de Javier Benítez Ortiz.

Esta tesis doctoral se realizó gracias a la financiación ofrecida por:

¾ Ministerio de Educación y Ciencia - Ayuda de Formación de Profesorado Universitario FPU-AP-2005-1720.

¾ Asociación Española Contra el Cáncer.

¾ Fondo de Investigaciones Sanitarias – Proyecto PI061090.

Juvenal-Poeta satírico romano (67-127)

“Todos desean saber, pero pocos pagar el trabajo que vale”

Claude Bernard-Fisiólogo francés (1813-1878)

“El experimentador que no sabe lo que está buscando no comprenderá lo que encuentra”

Friedrich Nietzsche-Filosofo alemán (1844-1900)

“Sólo comprendemos aquellas preguntas que podemos responder”

Galileo Galilei- Físico y astrónomo italiano (1564-1642)

“En lo tocante a la ciencia, la autoridad de un millar no es superior al humilde razonamiento de una sola persona”

“Y, sin embargo, se mueve”

A todos aquellos que creyeron en mí,

ellos saben quienes son

Todo principio tiene final, y todo final supone un principio. La escritura de esta tesis ha supuesto la culminación de un proyecto personal emprendido años antes de mi incorporación a este grupo, antes incluso del inicio de la Licenciatura en Biología. Ha supuesto la meta más importante que un chico de 18 años se plantease antes de acabar el instituto. Sin embargo, aún a pesar de que una empresa así requiere de un gran esfuerzo personal así como de un gran afán de autosuperación, esta tesis no hubiese sido posible sin ayuda, consejo y comprensión de muchas personas. Por ello quiero agradecerles a todos aquellos que han colaborado, en cierta medida, en la tarea de llevar a buen puerto este proyecto:

En primer lugar quiero agradecer al Doctor Javier Benítez la oportunidad que me brindó, aún a pesar de que no contaba con un expediente excepcional, y la confianza depositada a lo largo de estos casi cinco años. Debe de ser muy difícil compaginar la creación y dirección de un Programa de Investigación dentro de un centro tan exigente como es el CNIO con la tutela de varios estudiantes de doctorado. Leonardo Da Vinci dijo una vez: “mediocre alumno el que no supera a su maestro”, sin embargo Javier ha hecho casi imposible esa afirmación. Gracias por todo.

Cuando me incorporé a este centro, me ubicaron en el laboratorio 207A, donde se encuentra el CeGen Nodo Madrid. Para mí suponía la integración en uno de los mejores centros de investigación de España, es decir, saltar a la “Champions League” de la ciencia, cosa que, en principio, asusta. Sin embargo, las personas que encontré en este lugar cambiaron mi visión: se puede ser un gran profesional a la vez que una gran persona. Por ello quiero agradecer a Anna (González-Neira) aquel año que dedicó a enseñarme no sólo a trabajar en ciencia sino a pensar en ciencia, a comprender que el diseño de un experimento es tan importante como las técnicas que se utilizan para llevarlo a cabo. También quiero agradecer a Emilio sus enseñanzas, su rectitud a la hora de llevar a cabo un experimento y ante todo su sinceridad, franqueza y ética, y sobretodo su amistad. A Roger también he de agradecerle muchas cosas, para mí es un referente en muchos aspectos, pero sobretodo admiro su carácter calmado, abierto y dialogante. Tampoco puedo olvidar de aquel CeGen

“original” a Christian, aunque conviviésemos pocos meses, a los que llegaron después, Jesús, Charo, Daniella, Tais, y a Guille, especialmente, por haber pasado tanto tiempo enseñándome a comunicarme con los ordenadores, espero estar a la altura de sus esfuerzos.

En este laboratorio compartí también muy buenos ratos con Eva “la canaria”, cuya alegría siempre será recordada por todos (no sólo del 207A). Continúo así con el grupo de Genética Humana, esa gran “familia”. He de agradecer mucho a muchos, empezando por los técnicos, Ali, Fernando, Toya y, especialmente, Fátima (¿quién será el centro de tus críticas a partir de ahora?). Sin duda, la investigación no podría ser llevada a cabo sin el apoyo de estos profesionales. Tampoco puedo olvidarme de los becarios, desde los que ya no están hasta los que quedarán cuando me vaya, Marta, Emiliano, Lara, Loren, Ricardo, Magda, Miljana y, aquellas que me soportan a diario, Laura Paula, Bárbara y Eva. Hemos vivido buenos momentos, que en el fondo serán los que prevalezcan en la memoria.

Un objetivo muy importante en la realización de cualquier tesis es la formación de la persona para que sea capaz de enfrentarse en un futuro a la responsabilidad de realizar investigación, con el diseño de nuevos proyectos, la tutela de estudiantes, etc. Para ello no hay mejor modelo que trabajar codo con codo con investigadores de elevado nivel, como los que se encuentran en este grupo. He de agradecer a Gloria (Ribas), Bea, Miguel (Urioste), María y especialmente a Ana (Osorio), los conocimientos adquiridos a lo largo

Agradecimientos

de estos años, gracias en gran parte a las críticas constructivas que en cada lab-meeting permiten continuar y mejorar del trabajo realizado en el laboratorio. No sé en qué categoría meterlo, pero quiero agradecer a Javi “el postdoc” por estos meses en los que hemos compartido responsabilidades, conocimientos y alguna que otra alegría, espero que sigamos colaborando. Gracias también a Iván “er gaditano” (ojo que lleva premio) porque en este año hemos disfrutado mucho juntos. Por último, no puedo olvidarme de una persona a la que considero muy especial, Maika, capaz de convencer a casi cualquiera para que colabore en nuestros proyectos. Gracias a todos.

Algo que, considero, es de envidiar en nuestro programa, es la estrecha interacción, no sólo profesional sino también personal, entre los diferentes grupos que lo conforman. Me gustaría empezar agradeciendo a la gente de Endocrino todos los buenos momentos vividos, en especial a Meme, su jefa, y Cristina (Rodríguez) y Alberto, expertos

“MLPAistas” y “qPCRistas”. Por supuesto no puedo olvidarme de los becarios, aquellos que ya no están como Cristina (Montero) o Sergio (Ruíz), y a los que siguen, Iñigo, Susanna (amante de la burocracia española y del sushi), Javier (Leandro) y, especialmente, a Elena (López). Tampoco puedo olvidarme de Rocío “la Rambo” Letón porque es capaz de hacerte olvidar un mal día, o de Leti, experta bailadora de samba. Gracias chicos por estos años.

Aunque de más reciente incorporación, considero al grupo de Epidemiología un conjunto interesante de personas interesantes. Gracias Nuria por tu trato, siempre amable y elegante, y tus conversaciones científicas, de las que se puede aprender mucho. Gracias también a los integrantes del grupo, André, Evelina, Gaelle, Mat, Paco Toni, (¡no, no voy a repetirte Roger!) porque hemos compartido buenos ratos durante las comidas. Sin duda conseguiréis grandes objetivos.

Para cerrar los agradecimientos a los grupos del programa, he dejado al grupo de Citogenética Molecular. La razón es sencilla, siempre guardaré para ellos un especial cariño, aunque no hayamos coincidido mucho durante el último año. En primer lugar quiero agradecer a Juan Cruz el haberme tratado casi como a uno más de sus becarios. No sólo representa un modelo científico sino que en el plano personal es insuperable. Gracias Juan, espero que sigamos en contacto. Siguiendo en Citogenética, quiero recordar a la

“vieja guardia”, aquel grupo homogéneo capaz de crear una burbuja temporal en las comidas, donde el trabajo dejaba lugar a una reunión de amigos en la que se trataba cualquier tema perteneciente al “mundo exterior”. Fueron muy buenos ratos al lado de Blesa, Sergio (Hernández), Laura (Valle), Cristina (Largo), Javier (Suela), Gloria (Soler), Sara, Miguel (Urioste), Carra, Mamen, Loren, a los que después se unieron Bibiana, Francesco, Miguel (Grillo), Sandra o Carol. No sé si me dejo a alguien más, pero gracias a todos.

No puedo pasar por alto los bueno momentos que el fútbol me ha brindado en los últimos años. Quiero agradecer estos momentos a un grupo de personas que, sin tener en cuenta su posición dentro del CNIO, se reúne cada lunes para disputar un partido de fútbol y olvidar así los quebraderos de cabeza que supone esta profesión. No puedo nombrarlos a todos, pero aún así muchas gracias. No os preocupéis que yo haré como Ramón Calderón, dejaré suficiente dinero en las arcas del club para que podáis fichar a Cristiano Ronaldo si os apetece.

Llegado este punto, quiero agradecer a aquellos que hicieron posible que mi estancia en Cold Spring Harbor fuese provechosa. A Greg Hannon, por darme la oportunidad de realizar esta estancia que ha cambiado mi vida, sobretodo en el plano profesional. A Emily Hodges que se portó muy bien conmigo y se mostró como una muy buena profesora y profesional, gracias Emily, aprendí mucho. Agradezco a Andrés Canela su amistad y ayuda ofrecidas en tan singular paraje, en el CNIO apenas nos cruzamos por el pasillo mientras que en CSHL llegamos a compartir buenos y malos momentos. Eres un tío grande.

También quiero recordar a José Silva, Agustín Chicas, Oliver Tan, y una lista muy amplia de personas que me ayudaron a ver la situación desde un punto de visto mucho más positivo.

Entramos ya en el plano más personal de los agradecimientos, un punto dónde hay que recordar a aquellos, ajenos o no al centro de trabajo, que guardan una posición privilegiada dentro de los sentimientos del abajo firmante. Alguien dijo una vez que “al CNIO no he venido a hacer amigos”, yo he de darle la razón, sin embargo, qué bueno poder decir que tras estos años me llevo del CNIO algo más que recuerdos. Por orden cronológico inverso, quiero agradecer a Elenita estos últimos meses, en los que hemos superado aquella primera discusión (lo siento pero el andaluz no es una lengua) a compartir secretos, sentimientos y opiniones. Espero poder visitarte en Amsterdam, eso significaría que ya has mandado la cartita. Iván, ¿qué puedo decirte a estas alturas? Simplemente que sigas así y no cambies, que la gracia no se aprende sino que es algo con lo que se nace, ¡aprovéchalo! Con Susanna me pasó lo mismo que con Elena, tras un inicio un poco tenso, descubrimos que en el fondo no pensamos de manera tan diferente, además de que gracias a ella el verano en Cold Spring Harbor no fue tan duro. Guardo un recuerdo muy especial para una muy buena amiga que conocí en el CNIO aunque no trabaje en Madrid. Me refiero a Elena (Grau), con la que he compartido mucho y con la que espero poder seguir compartiendo buenos momentos (me debes una paella). Eres especial y lo sabes, sigue así. Tengo que agradecer tanto a Mamen como a Carol (y sus respectivos eposos, Tini y Pedro) todos esos momentos

“series frikis”, Wii, pizza, etc. Espero que pronto podamos hacer la fiesta de tres días en la casa de Carol y Pedro. Carilla, Carilla, eres, simplemente, un crack, espero que no cambies y que nos veamos más a menudo, con nuestro amigo “dicti”.

Llega el momento “pendin”. Estos años hubiesen sido muy duros sin la amistad de un brasileiro especial, de nombre Ricardo pero también conocido como Ramiro Ramires.

Simplemente, tu filosofía de vida es impresionante y tu futuro está destinado a algo grande (¿Consejero de Lula?, ¿Presidente de Brasil?). Imposible olvidar todas las fiestas que hemos vivido, retreats, congresos, fiestas de verano, fiestas de navidad, etc. Espero que tu aventura en el norte termine con un gran éxito, aunque todos sabemos que al final regresarás a tu Brasil natal donde vivirás como Dios y nos darás envidia a todos. Quizás algún día montemos ese Consorcio Pendinero Iberobrasileiro. Suerte.

Mi aventura en el CNIO no hubiese sido posible sin aquella llamada telefónica realizada una mañana de febrero del año 2005. La llamada fue realizada por Lorenzo Melchor, con una frase que jamás olvidaré: “mi jefe (Javier Benítez) está buscando a alguien con un perfil al que te podrías ajustar para desarrollar un proyecto”. Creo que jamás podré agradecerte lo suficiente esa llamada. Quizás esperes un momento “suavito”, pero bien sabes que yo no soy de esos. Sin embargo, he de reconocer que me siento afortunado de contar con la amistad de alguien como tú, a pesar de todas nuestras discusiones. Bien sabes que nos ajustamos a los perfiles de Trancas y Barrancas, pero hay que tener en cuenta que el uno no sería lo mismo sin el otro, y juntos son mucho más que

Agradecimientos

la suma de ambos. Espero que el nuevo ciclo que se abre ante nosotros nos deje momentos tan buenos como el que se cierra en estos días.

También quiero agradecer a Manuel Fernández Hontanilla y a su mujer Nuria todos los buenos momentos vividos durante cinco largos años, desde aquellos inicios en la residencia Arti hasta aquel estudio en el Paseo de la Florida. Quiero darles la enhorabuena porque en pocos días será padres. Que sigais siendo muy felices por muchos años.

Además, en Madrid he encontrado el apoyo de gente muy especial, Quiero agradecer los momentos vividos a la familia “política”, a Nicanor y Antonia, Mari Ángeles y Gonzalo y Antonio José y Paloma. Espero que podamos seguir compartiendo muchos momentos juntos.

Hay un refrán que dice: “detrás de un gran hombre hay una gran mujer”. Poco somos sin la ayuda de una persona especial, que complete nuestras deficiencias y saque lo mejor de nosotros. Tengo que agradecer que durante estos últimos casi seis años haya contado con el apoyo y la compañía de alguien muy especial, Cristina Gómez. Poco más puedo decir, sólo pedirte que tengas paciencia y fe en que la vida seguirá igual aún a pesar de que haya momentos en los que la distancia física pueda ser un obstáculo. Con paciencia, el futuro nos compensará. Además, siempre nos quedará París.

Para finalizar esta sección, quiero empezar agradeciendo a mis padres el encontrarme aquí, en el mundo, pues sin ellos sería casi imposible. Me siento afortunado por tener la familia que tengo, unos padres que han luchado mucho y siempre juntos por sacar adelante a sus hijos, desde la honradez, el trabajo y el cariño. Hay quienes ven en la sociedad actual el mejor modelo para la educación de las nuevas generaciones. Siento discrepar, me siento afortunado por haber crecido como crecí, arropado por una madre (Ricarda) y una tía (Juani) que me cuidaron en todo momento, un padre (Félix) que me educó para comprender que todo lo que merece la pena se consigue a través del esfuerzo, y unos hermanos (Félix y Eva) que han sido siempre un modelo a seguir, así como mis cuñados (María José y Jose). No puedo olvidar a mis sobrinos (Jose, Jesús y Alba, en Zafra, y Daniel y Carlos, en Madrid) con los que he aprendido que en verdad la sonrisa de un niño es el mejor de los regalos.

Muchas gracias a todos.

Juan Manuel

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ÍNDICES ...I ÍNDICE GENERAL...III ÍNDICE DE TABLAS ...VI ÍNDICE DE FIGURAS ... VII ABREVIATURAS ...IX RESUMEN / ABSTRACT ... XV

INTRODUCCIÓN... 1

1. CÁNCER DE MAMA: DE LA GLÁNDULA AL TUMOR ... 3

1.1. ANATOMÍA DE LA MAMA... 3

1.2. EL CÁNCER DE MAMA... 4

1.2.1. Clasificación... 5

1.2.2. Epidemiología ... 6

1.2.3. Factores de riesgo de cáncer de mama ... 7

2. EL CÁNCER DE MAMA FAMILIAR: BRCA1 Y BRCA2... 9

2.1. CÁNCER DE MAMA: FAMILIAR VS ESPORÁDICO ... 9

2.2. FAMILIAS DE RIESGO ... 9

2.2.1. Familias de alto riesgo... 9

2.2.2. Familias de riesgo moderado... 10

2.3. GENERALIDADES SOBRE BRCA1 Y BRCA2 ... 10

2.4. MUTACIONES GERMINALES EN BRCA1 Y BRCA2 ... 11

2.5. LA PENETRANCIA DE LAS MUTACIONES EN BRCA1 Y BRCA2... 13

2.6. LAS ALTERACIONES SOMÁTICAS EN LOS GENES BRCA1 Y BRCA2... 14

2.7. LAS FAMILIAS non-BRCA1/2 ... 14

3. ESTUDIOS DE LIGAMIENTO Y EL CÁNCER DE MAMA ... 17

3.1. BASES HISTÓRICAS DE LA GENÉTICA ... 17

3.1.1. Los avances del siglo XIX... 17

3.1.2. La teoría cromosómica de la herencia: ligamiento y recombinación... 18

3.2. MARCADORES GENÉTICOS MOLECULARES... 20

3.2.1 VNTRs: Polimorfismos en el Número de Repeticiones en Tándem... 21

3.2.2 Polimorfismos en una única posición... 22

3.3 ESTUDIOS DE LIGAMIENTO: BASES TEÓRICAS ... 23

3.3.1 Método del LOD score ... 23

3.3.2 Umbrales de significación para el LOD score... 25

3.4 ESTUDIOS DE LIGAMIENTO: GÉNESIS DE BRCA1 Y BRCA2... 27

3.4.1 Identificación y clonación de BRCA1... 27

3.4.2 BRCA2: El segundo gen ... 28

3.4.3 BRCA3: ¿El gen esquivo?... 28

OBJETIVOS ... 33

MATERIAL Y MÉTODOS... 39

1. PRIMER ESTUDIO DE LIGAMIENTO... 41

1.1. SELECCIÓN DE FAMILIAS... 41

1.2. MARCADORES Y GENOTIPACIÓN... 42

1.3. CONTROL DE CALIDAD EN LA GENOTIPACIÓN DE LOS SNPS ... 45

1.4. FRECUENCIAS ALÉLICAS Y MAPAS GENÉTICOS... 45

1.5. TRATAMIENTO DE LOS DATOS... 46

Índices

2. ESTUDIO GENÉTICO DE LA FAMILIA RUL153... 49 2.1. UNA FAMILIA Y DOS REGIONES...49 2.1.2. Regiones candidatas y fine-mapping...49 2.1.3. Tests de significación...49 2.1.4. Análisis citogenéticos ...51 2.1.5. Estudio haplotípico basado en datos de HapMap...51 2.2. BÚSQUEDA DE MUTACIONES ...52

2.2.1. Selección de genes candidatos ...52 2.2.2. Secuenciación de los genes candidatos ...53 3. SEGUNDO ESTUDIO DE LIGAMIENTO ... 55

3.1. SELECCIÓN DE FAMILIAS ...55 3.2. MARCADORES, GENOTIPACIÓN Y ANÁLISIS DE DATOS...56 3.3. ESTUDIO DE LOH EN EL CROMOSOMA 21...58

RESULTADOS... 63 Resultados Parte I ... 67 1. PRIMER ESTUDIO DE LIGAMIENTO: SNPS VS. STRS... 69

1.1. REGIONES CANDIDATAS...69 1.2. FINE-MAPPING EN LAS REGIONES CANDIDATAS ...71 1.3. IMPORTANCIA DEL LD EN LOS RESULTADOS DE LIGAMIENTO ...72 1.4. RESULTADOS DEL ESTUDIO DE SIMULACIÓN ...75 1.5. COMPARACIÓN SNPS VS. STRS...75

Resultados Parte II... 79 2. BÚSQUEDA DE MUTACIONES EN LA FAMILIA RUL153... 81

2.1. DESCARTANDO EL AZAR...81 2.2. MÍNIMAS REGIONES CANDIDATAS ...81 2.3. SECUENCIACIÓN DE LOS GENES CANDIDATOS...82 2.4. SEGUNDA BÚSQUEDA DE MUTACIONES EN LA REGIÓN 11Q13...83 2.5. CONFIRMACIÓN DE LA REGIÓN MÍNIMA DE 7 MB (RS477138 -

RS514933) ...86

Resultados Parte III ... 87 3. SEGUNDO ESTUDIO DE LIGAMIENTO: HOMOGENEIDAD ... 89

3.1. ANÁLISIS DE LIGAMIENTO...89 3.2. RESULTADOS DEL FINE-MAPPING. ...91 3.3. RESULTADOS DEL ESTUDIO DE SIMULACIÓN ...92 3.4. RESULTADOS DEL ANÁLISIS DE SUBGRUPOS FAMILIARES ...93 3.5. RESULTADOS DEL ESTUDIO DE LOH EN EL CROMOSOMA 21 ...94

DISCUSIÓN... 99 1. PAPEL DE LOS SNPS EN ESTUDIOS DE LIGAMIENTO... 101

1.1. CAPACIDAD DE DETECCIÓN DE LA SEÑAL DE LIGAMIENTO...101 1.2. COMPARATIVA ENTRE MARCADORES GENÉTICOS...102 2. ESTUDIO DE LAS REGIONES CANDIDATAS ... 105 2.1. CRITERIOS DE SELECCIÓN Y REGIONES IDENTIFICADAS...105 2.2. ESTADÍSTICA Y AZAR...107 2.3. SELECCIÓN DE FAMILIAS CANDIDATAS ...108 2.4. FINE-MAPPING...110 3. BÚSQUEDA DE MUTACIONES ... 113 3.1. ESTUDIOS PREVIOS A LA BÚSQUEDA DE MUTACIONES ...113

3.1.1. Estudio de la FAM153... 113 3.1.2. Estudio de LOH en el cromosoma 21... 115 3.2. SELECCIÓN Y ESTUDIO DE GENES CANDIDATOS ... 116 3.3 UNA NUEVA ERA EN GENÓMICA ... 117

CONCLUSIONES ... 121 BIBLIOGRAFÍA ... 125 ANEXO I: FAMILIAS non-BRCA1/2 ... 137 1. FAMILIAS DEL PRIMER ESTUDIO DE LIGAMIENTO ... 139

1.1. FAMILIAS CNIO ... 139 1.2. FAMILIAS HOLANDA ... 140 1.3. FAMILIAS LYON... 142 2. FAMILIAS DEL SEGUNDO ESTUDIO DE LIGAMIENTO... 145 ANEXO II: TABLAS SUPLEMENTARIAS... 151 ANEXO III: PROTOCOLOS ... 157 1. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ... 159

1.1. EXTRACCIÓN DE DNA DE SANGRE PERIFÉRICA POR MÉTODO

SALINO... 159 1.2. EXTRACCIÓN DE DNA DE TEJIDOS PARAFINADOS ... 160 2. PROTOCOLO ESTÁNDAR DE PCR ... 161 ANEXO IV: PUBLICACIONES... 163

Índices

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T T

Tabla 1. Resumen de las 19 familias por grupo poblacional...41 Tabla 2. Genes candidatos seleccionados para la búsqueda de mutaciones. ...53 Tabla 3. Resumen de las 41 familias españolas non-BRCA1/2. ...55 Tabla 4. Marcadores utilizados en el estudio de LOH en el cromosoma 21. ...59 Tabla 5. Valores máximos de LOD score en las regiones candidatas...70 Tabla 6. Valores máximos de NPLOD score para las familias ligadas en las regiones

candidatas. ...71 Tabla 7. Comparativa de los valores de LOD score usando SNP-GWS y STR-GWS. ...77 Tabla 8. Lista de todas las variantes encontradas por secuenciación en los genes candidatos

para el individuo IV-1...83 Tabla 9. Lista de los SNPs con menor MAF encontrados por secuenciación en los genes

candidatos para la FAM153...84 Tabla 10. Valores máximos de LOD score en las tres regiones candidatas. ...89 Tabla 11. Efecto del fine-mapping en los valores de HLOD score de las regiones candidatas...91 Tabla 12. Características clínicas de las familias confirmadas en las regiones candidatas. ...92 Tabla 13. Resultados del análisis de los 3 subgrupos familiares considerados. ...94 Tabla 14. Resultados del estudio de LOH en los 10 STRs estudiados en el tumor B004370/1. ...96 Tabla 15. Resumen de los estudios de ligamiento realizados en cáncer de mama familiar

durente los últimos años. ...109 Tabla Suplementaria 1. Marcadores STR utilizados en el fine-mapping. ...153 Tabla Suplementaria 2. Número de marcadores SNP. ...154 Tabla Suplementaria 3. Valores de HLOD score para las familias BRCA positivas. ...155

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F F

Figura 1. Anatomía de la mama... 4 Figura 2. Incidencia del cáncer de mama. ... 7 Figura 3. Representaciones de BRCA1 y BRCA2. ... 12 Figura 4. Los “materiales coloreados”. ... 19 Figura 5. Marcadores genéticos moleculares... 22 Figura 6. Tabla publicada por Lander & Kruglyak (1995)... 26 Figura 7. Esquema del protocolo de Illumina para el ensayo Beadarray. ... 44 Figura 8. Representación del perfil de ligamiento y de los haplotipos comunes compartidos

por los miembros de la FAM153... 50 Figura 9. Representación del método indirecto basado en datos de HapMap para reducir el

tamaño de las regiones candidatas. ... 52 Figura 10. Representación de las familias BRCA positivas. ... 57 Figura 11. Representación del perfil de ligamiento para las 19 familias non-BRCA1-2. ... 70 Figura 12. Variaciones en el valor de NPLOD score usando diferentes medidas para

descartar el LD entre marcadores. ... 75 Figura 13. SNP-GWS vs. STR-GWS... 77 Figura 14. Pruebas citogenéticas utilizadas para descartan una posible traslocación entre los

cromosomas 11 y 14 en la FAM153. ... 82 Figura 15. Esquema de la región candidata en el cromosoma 11... 85 Figura 16. Representación del LD para una región próxima al gen NuMA1. ... 86 Figura 17. Representación del perfil de ligamiento para las 41 familias non-BRCA1-2. ... 90 Figura 18. Efecto diferencial del fine-mapping en dos familias identificadas por SNPs como

posiblemente ligadas a la región del cromosoma. ... 93 Figura 19. Esquema de la región candidata del cromosoma 21... 96

A lo largo del texto aparece una serie de anglicismos y abreviaturas comúnmente empleadas en el argot científico. A continuación se expone la descripción de dichos términos:

AECC Asociación Española Contra el Cáncer

ALL Set de frecuencias alélicas utilizadas en el análisis del ligamiento, extraídas del conjunto de individuos genotipados en el estudio

Array Término utilizado para definir la matriz sobre la que se encuentran impresas las sondas de DNA donde se realizan las hibridaciones genómicas o los cilindros tumorales donde se realizan las hibridaciones inmunohistoquímicas o valoraciones histológicas.

ASO Oligo específico de alelo en una OPA de Illumina (Allele-Specific Oligo) ATM Gen causal de la enfermedad ataxia telangiectasia (Ataxia Telangiectasia

Mutated)

BCLC Consorcio de ligamiento en cáncer de mama (Breast Cancer Linkage Consortium)

BRC Motivos proteicos de interacción, característicos de genes como BRCA2.

BRCA Familias con mutaciones conocidas en BRCA1 o BRCA2 (BReast CAncer) BRCA1 Gen de susceptibilidad al cáncer de mama 1 (BReast CAncer Gene 1) BRCA2 Gen de susceptibilidad al cáncer de mama 2 (BReast CAncer Gene 2)

BRCA3 Término utilizado para representar un posible tercer gen de susceptibilidad al cáncer de mama (BReast CAncer Gene 3)

BRCT Dominio BRCA1 C-Terminal

BRIP1 Helicasa que interactúa con el dominio C-terminal de BRCA1 (BRCA1 Interacting Protein 1)

CCND1 Gen localizado en el cromosoma 11 perteneciente a la familia de ciclinas (Cyclin D1)

CDI Carcinoma ductal infiltrante o invasivo CDIS Carcinoma ductal in situ

CEPH Set de frecuencias alélicas utilizadas en el análisis del ligamiento, extraído del Centre d'Etude du Polymorphisme Humain

CEU Población de individuos caucásicos empleada en el proyecto HapMap CHEK2 Gen homólogo al regulador del ciclo celular CHK2 de S. pombe CLI Carcinoma lobular infiltrante o invasivo

CLIS Carcinoma lobular in situ

CM Carcinoma medular

cM Centimorgan o unidad de recombinación

CNIO Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas

DGGE Electroforesis mediante geles con gradiente de desnaturalización (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

DHPLC Técnica de cromatografía comúnmente utilizada en la detección de variantes en el DNA (Denaturing High-Performance Liquid Chromatography)

DM Modelo dominante utilizado en el análisis paramétrico DNA Ácido desoxirribonucleico

Abreviaturas

FADD Gen localizado en el cromosoma 11 involucrado en la vía de apoptosis (Fas (TNFRSF6)-Associated via Death Domain)

FGF3 Gen localizado en el cromosoma 11 perteneciente a una familia de factores de crecimiento de fibroblastos (Fibroblast Growth Factor 3)

FISH Técnica citogenética basada en la hibridación in situ de fluorescencia (Fluorescence In Situ Hybridization)

FM Fine-Mapping

FOXA1 Gen localizado en el cromosoma 14 perteneciente a una familia de factores de transcripción (Forkhead box A1)

HLOD Valor paramétrico de LOD score (Heterogeneity LOD score)

IACR Agencia Internacional de Investigación en Cáncer (International Agency for Cancer Research)

IC Valor del contenido en información de los marcadores genéticos (Information Content)

ICO Instituto Catalán de Oncología

Indel Polimorfismo SNP cuyos alelos son la inserción o deleción de una o más pares de bases en una secuencia dada

kb Kilobase o 1.000 bases

LD Valor de desequilibrio de ligamiento entre dos marcadores (Linkage Disequilibrium)

LOD Estadístico empleado como valor de ligamiento (Log of Odds ratio) LOH Fenómeno de pérdida de heterocigosidad (Loss Of Heterozygosity) LSO Oligo específico de locus en una OPA de Illumina (Locus-Specific Oligo) MAF Frecuencia del alelo minoritario en un marcador genético (Minor Allele

Frequency)

Mb Megabase o 1.000.000 bases

miRNA MicroRNA o secuencia corta de RNA de función reguladora de la expresión de otros genes a partir de la complementariedad de secuencia

MLPA Amplificación múltiple mediante sondas de ligación, utilizada para detectar grandes deleciones o inserciones (Multiplex Ligation Probe Amplification) MSI Fenómeno producido por errores en la maquinaria de reparación del DNA

asociado a la aparición de diversos alelos en STR en tumores (MicroSatellite Instability)

NCAM Genes pertenecientes a una familia de moléculas de adhesión (Neural Cell Adhesion Molecules)

NCBI Base de datos ampliamente consultado en ciencia (National Center for Biotechnology Information)

NPLOD Valor no paramétrico de LOD score (Non-Parametric LOD)

NuMA1 Gen localizado en el cromosoma 11, involucrado en el checkpoint mitótico (Nuclear Mitotic Apparatus protein 1)

OPA Conjunto de oligonucleótidos utilizados para el genotipado masivo de SNPs (Oligo Pool Assay)

PALB2 Gen de susceptibilidad a cáncer de mama (Partner and Localizer of BRCA2) PCR Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

PTEN Gen mutado en múltiples cánceres avanzados (Phosphatase and TENsin homolog)

RAD51 Gen homólogo a RecA de E. coli RAD9A Gen homólogo a RAD9 de S. pombe

RFLP Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (Restriction Fragment Length Polymorphism)

RM Modelo recesivo utilizado en los análisis paramétricos RNA Ácido ribonucleico

RNF121 Gen localizado en el cromosoma 11, su característica más importante es su dominio RING Finger (RiNg Finger protein 121)

RUNX1 Gen localizado en el cromosoma 21, frecuentemente involucrado en cánceres hematopoyéticos (Runt-related transcription factor 1)

SNP Polimorfismo en un única posición (Single Nucleotide Polymorphism)

SNP-GWS Datos obtenidos en base a los SNPs distribuidos a lo largo del genoma (Single Nucleotide Polymorphism - GenomeWide Scan)

STOET Fundación Holandesa para la Detección de Tumores Hereditarios (STichting Opsporing Erfelijke Tumoren)

STR Polimorfismo de repeticiones cortas en tándem de una secuencia dada (Short Tandem Repeats)

STR-GWS Datos obtenidos en base a los STRs distribuidos a lo largo del genoma (Short Tandem Repeats - GenomeWide Scan)

TP53 Gen de la proteína tumoral p53 (Tumor Protein p53) USA Estados Unidos de América (United States of America)

UTR Región del RNA mensajero no traducida a proteína (UnTranslated Region) VNTR Polimorfismo en el número de repeticiones en tándem de una secuencia dada

(Variable Number Tandem Repeats)

El desarrollo de las nuevas tecnologías para el genotipado masivo de SNPs ha abierto la posibilidad de emprender nuevos estudios de ligamiento del genoma completo para la búsqueda de genes candidatos involucrados en enfermedades hereditarias. Los dos genes más importantes de susceptibilidad a cáncer de mama, BRCA1 y BRCA2, explican el 30% de casos familiares de cáncer de mama, pero la identificación de otros genes de predisposición a cáncer de mama no ha resultado fructífera. Para evaluar el incremento en poder de detección de los SNPs en una situación real, hemos realizado una búsqueda en 19 familias non-BRCA1/2 usando 4.720 SNPs distribuidos a lo largo del genoma completo en base a la tecnología de Illumina (Linkage Panel III). Identificamos cinco regiones candidatas localizadas en los cromosomas 2, 4, 7, 11 y 14. Estos resultados fueron comparados con aquellos obtenidos previamente usando un panel de microsatélites espaciados 10 cM a lo largo de todo el genoma, y encontramos en todos los casos señales menores o no significativas con los datos obtenidos con microsatélites comparado con los obtenidos por SNPs.

Cabe destacar que en la mayoría de los casos encontramos una única familia ligada a cada región identificada. Además, una familia mostró señales de ligamiento en dos regiones localizadas en dos cromosomas diferentes (11q13 y 14q21). Descartamos la posibilidad de una translocación entre estos cromosomas y, mediante el uso de marcadores STR y un método indirecto basado en datos de HapMap, redujimos en tamaño de las regiones candidatas desde 28 a 7 Mb en el cromosoma 11 y de 14,5 a 8,5 Mb en el cromosoma 14. Realizamos una búsqueda de mutaciones en genes candidatos en ambos cromosomas y, aunque no hemos encontrado ninguna mutación deletérea en las regiones codificantes de estos genes, los datos obtenidos confirman la región 11q13 como candidata a contener un gen de susceptibilidad a cáncer de mama.

Este estudio nos mostró que los criterios de selección de las familias, así como diferencias en el transfondo poblacional, o la heterogeneidad clínica y genética entre otros factores, podrían determinar el poder para detectar la señal de ligamiento. Por esa razón, realizamos un estudio de ligamiento basado en un total de 6.000 SNPs distribuidos a lo largo del genoma en 41 familias non-BRCA1/2, que mostraban mayor homogeneidad geográfica (procedentes de la población española) y fenotípica (asociadas sólo a cáncer de mama). Además, incluimos tres familias BRCA positivas para comprobar el poder de detección de ligamiento en una familia de baja complejidad en la que esta segregando una mutación de alta penetrancia. Identificamos tres regiones de interés localizadas en 3q25, 6q24 y 21q22 con valores importantes de LOD score, con varias familias segregando en cada región

Nuestros resultados sugieren que muchas variables deben ser tenidas en cuenta antes de realizar un estudio de ligamiento en cáncer de mama familiar, debido a la alta heterogeneidad genética dentro de las familias non-BRCA1/2. La homogeneidad geográfica y fenotípica podrían ser los factores más importantes.

Abstract

The development of new high-throughput technologies for SNP genotyping has opened the possibility of taking a genome-wide linkage approach to the search for new candidate genes involved in heredity diseases. The two major breast cancer susceptibility genes BRCA1 and BRCA2 are involved in 30% of hereditary breast cancer cases, but the discovery of additional breast cancer predisposition genes for the non-BRCA1/2 breast cancer families has so far been unsuccessful. In order to evaluate the power improvement provided by using SNP markers in a real situation, we have performed a whole genome screen of 19 non-BRCA1/2 breast cancer families using 4720 genomewide SNPs with Illumina technology (Linkage Panel III). We identified five candidate regions located on chromosomes 2, 4, 7, 11 and 14. The results were compared with those obtained previously using a 10cM microsatellite scan and we found lower or not significant linkage signals with STR-GWS data compared to SNP data in all cases.

Interestingly, only a single family was linked to each candidate regions. Moreover, a single family was linked to regions in two different chromosomes (11q13 and 14q21). We then ruled out any possible translocation between the chromosomes and, using both a panel of STRs and an indirect approach based on HapMap data, we narrowed down these regions from 28 to 7Mb in chromosome 11 and from 14.5 to 8.5 Mb in chromosome 14. We performed a mutational screening on candidate genes in both chromosomes and, although we have not found any deleterious mutations in the coding region of these genes, the data obtained confirm 11q13 as a candidate region to contain a breast cancer susceptibility gene.

This study showed that the selection criteria of the families, differences in the population background, or clinical and genetic heterogeneity, among other factors, might determine the power to detect the linkage signal. For that reason, we performed a SNP-based linkage scan using a total of 6,000 SNP markers across the genome in 41 breast cancer families, which had more geographical (Spanish population) and phenotypical (only breast cancer families) homogeneity. In addition, we included three BRCA positive families to test the power in linkage detection from a low complexity family in which a high-penetrance mutation segregates. We have identified three regions of interest, located on 3q25, 6q24 and 21q22, which showed interesting LOD score, and several families were segregating in each of them.

Our results suggest that several variables must be taken into account before performing a linkage study in familial breast cancer due to the high heterogeneity within non-BRCA1/2 families. Phenotypic and geographic homogeneity could be the most important factors.

1. 1 . C C

M M

: : D D

G G

T T

La mama es el órgano glandular característico de los mamíferos y se encuentra situado en la parte media del tórax. El pezón y la areola se sitúan normalmente en el centro de la mama, siendo el pezón más o menos protuberante. La mama está formada por tejido fibroadiposo y por un sistema de conductos o ductos, llamados galactóforos, que unen las glándulas mamarias con el exterior a través del pezón. Los conductos galactóforos más grandes, situados en el pezón, se ramifican en el interior de la mama desembocando en unas agrupaciones de acinos en forma de racimos llamadas glándulas mamarias (Figura 1).

Las glándulas mamarias están formadas por lóbulos y lobulillos. Los lóbulos y los ductos están rodeados por tejido adiposo y conectivo que, junto con el tejido linfático, terminan de constituir el seno mamario. Las células que conforman los lóbulos y ductos se disponen en una bicapa celular: la capa interna está formada por células epiteliales secretoras (luminales), mientras que la capa externa se compone de células mioepiteliales (basales). Finalmente, una lámina basal de tejido conectivo engloba el lóbulo o conducto.

La estructura y función de la glándula mamaria es distinta según el momento del desarrollo en que se encuentre y depende del equilibrio entre los procesos de proliferación, diferenciación y apoptosis o muerte celular programada. El ejemplo más claro de la compleja regulación de la estructura y función de la glándula mamaria en la mujer acontece con el proceso de la reproducción, y sus etapas: la gestación, el parto y la lactancia.

Entre la sexta y séptima semana de gestación crecen los ácinos, como respuesta a los niveles elevados de estrógeno y progesterona, se ramifican los conductos, aumenta la cantidad de tejido adiposo y la irrigación, también disminuye el tejido adiposo y aumenta la infiltración del tejido intersticial con células plasmáticas, linfocitos y eosinófilos.

Durante el tercer trimestre se produce un notable aumento en el tamaño de las mamas, debido a que las hormonas placentarias y luteínicas favorecen la proliferación en los conductos galactóforos, el tejido de los lóbulos y alvéolos.

Tras el parto, la secreción láctea dilata los alvéolos y durante la lactancia, la glándula

Cáncer de mama: de la glándula al tumor

Figura 1. Anatomía de la mama. Vista lateral de una mama derecha, se observan las diferentes estructuras que la forman, desde el exterior hasta el interior. Adaptado de Medical Encyclopedia.

mamaria posee una formación elevada de alvéolos, compuestos por células epiteliales, mioepiteliales y cuboideas. Cuando finaliza la lactancia, la mama comienza un período de involución, que puede ser rápido o algo más progresivo, para volver nuevamente a la situación anterior al embarazo. Se produce la apoptosis del epitelio mamario, la remodelación de la glándula y la vuelta a su estado natural anterior.

Otro ejemplo de remodelación mamaria se observa en el desarrollo mamario durante el ciclo menstrual, que se caracteriza por cambios cíclicos que reflejan las variaciones hormonales. El estrógeno estimula la proliferación del parénquima con la formación y ramificación de los conductos. La progesterona en la fase lútea favorece la dilatación de los conductos y la diferenciación de las células alveolares. Estos cambios no se invierten con la menstruación, lo que permite a la mama continuar su desarrollo durante la edad adulta.

La glándula mamaria es, por tanto, un complejo modelo de regulación tisular basado en la respuesta a agentes exógenos, principalmente hormonales, donde subyace una compleja regulación celular basada en la activación e inhibición de rutas enzimáticas y génicas que desembocan en fenómenos celulares tan contrapuestos como son la división celular y la apoptosis.

11.2.2..EEL LCCÁNÁNCCEERR DDEE MMAAMMAA

El cáncer es, por definición, un crecimiento tisular producido por la proliferación continua de células anormales con capacidad de invasión y destrucción de otros tejidos.

Dentro de esta enfermedad tan compleja y heterogénea, se distinguen tres subtipos

principales: sarcomas, carcinomas y leucemias/linfomas. El cáncer de mama pertenece al grupo de los carcinomas, que se caracteriza porque la transformación se origina en tejidos epiteliales, como la piel o los epitelios que tapizan las cavidades y órganos corporales, y de los tejidos glandulares, como ocurre en la mama.

1.1.22..11.. CCllaassiiffiiccaacciióónn

El cáncer de mama se clasifica de acuerdo al componente celular mayoritario presente en el tumor:

a. Carcinoma ductal in situ (CDIS): es un trastorno precanceroso no invasivo que se origina en las células de las paredes de los conductos mamarios, y en el que se encuentran células transformadas en el revestimiento del ducto. Está muy localizado y, al no haberse extendido a otras zonas, puede ser fácilmente extirpado. Sin embargo, el CDIS puede convertirse en un tipo invasivo, desconociéndose las características que permitan predecir qué tumores pueden sufrir esta conversión. Un dato importante es que este tipo de tumor se puede detectar a través de una mamografía. Afortunadamente, la cifra de curación en las mujeres que presentan este tipo de cáncer ronda el 100%.

b. Carcinoma ductal infiltrante o invasivo (CDI): el cáncer se inicia en el conducto mamario pero logra atravesarlo y pasar al tejido adiposo de la mama. Este tipo canceroso tiene una alta capacidad para metastatizar a otras partes del organismo. Es el más frecuente de los carcinomas de mama, suponiendo, aproximadamente, el 80% de los casos.

c. Carcinoma medular (CM): es una variedad de CDI que presenta un pronóstico más favorable que otros subtipos, a pesar de que esto contrasta con su morfología anaplásica, es decir, con la presencia de un grado nuclear alto correlacionado con aneuploidía y un elevado índice mitótico. Es un tumor maligno de origen ductal que puede alcanzar un tamaño voluminoso, bien definido y que parece estar encapsulado.

d. Carcinoma lobular in situ (CLIS): se refiere a cambios neoplásicos no cancerosos en las células que revisten los lóbulos o lobulillos de la mama en los extremos distales de los conductos mamarios, aumentando el riesgo de que pueda desarrollarse un cáncer en el futuro. En la mujer suele darse antes de la menopausia y rara vez llega a ser invasivo.

e. Carcinoma lobular infiltrante o invasivo (CLI): es un carcinoma con origen en los acinos glandulares cuyas células proliferan rompiendo la membrana basal e

Cáncer de mama: de la glándula al tumor

extender y destruir otros tejidos del cuerpo. Con frecuencia, el carcinoma lobulillar infiltrante puede encontrarse en más de una región del mismo seno (multicéntrico) o bien en ambos senos (bilateral). Este tipo comprende entre el 10% y el 15% de los tumores de mama.

1.1.22..22.. EEppiiddeemmiioollooggííaa

El cáncer de mama es considerado un grave problema de salud pública dentro del ámbito social mundial ya que, según datos de la Asociación Española Contra el Cáncer (AECC), se trata de la neoplasia más entre las mujeres de todo el mundo, a excepción de los cánceres de piel no melanomas, con aproximadamente 1.151.000 nuevos casos en el año 2002. El cáncer de mama es, además, la principal causa de muerte entre los 35 y los 50 años en mujeres que viven países industrializados.

Desde la década de los 70, la incidencia del cáncer de mama ha aumentado progresivamente (Lacey, et al., 2002; Lopez-Abente, et al., 2000), aunque la tasa de mortalidad asociada decrece anualmente, posiblemente debido a mejoras en la detección, el diagnostico y el tratamiento de esta enfermedad. Otro dato a tener en cuenta es que el cáncer de mama también aparece en varones, aunque con una incidencia cien veces menor.

Según datos de la AECC, en España se diagnostican anualmente unos 16.000 nuevos casos, siendo el número anual de fallecimientos de 6.000 mujeres, lo que supone el 16,7%

de las muertes por cáncer en mujeres españolas (Lopez-Abente, et al., 2000). Un dato positivo es que la incidencia y la tasa de mortalidad en España se encuentran entre las más bajas dentro de los países desarrollados (Figura 2A), aunque existe una variación en función de la distribución geográfica (Lopez-Abente, et al., 2000).

El comportamiento en la aparición del cáncer de mama muestra diferencias debidas al nivel de desarrollo de los países. En las primeras edades de aparición (25-45 años) la incidencia aumenta de manera constante a nivel global para estabilizarse a los 45-50 años, pero a partir de esta edad se produce una disminución en la aparición de nuevos casos en los países de baja incidencia, se estabiliza en los de intermedia y sigue aumentando en los de alta incidencia (Figura 2B).

Figura 2. Incidencia del cáncer de mama. A, en todo el mundo. B, en España. Adaptado de datos de la AECC.

1.1.22..33.. FFaaccttoorreess ddee rriieessggoo ddee ccáánncceerr ddee mmaammaa

En el cáncer de mama, tanto la aparición como el progreso dependen de la acción combinada de diferentes factores, tanto exógenos como endógenos. Cómo se ha descrito anteriormente, la glándula mamaria está expuesta a importantes cambios fisiológicos efectuados en respuesta a reguladores exógenos, principalmente hormonales. Por ello no es de extrañar que gran parte de los factores exógenos que incrementan el riesgo de padecer cáncer de mama estén relacionados con mayores niveles de estrógenos circulantes y la exposición de la glándula mamaria a estos factores hormonales.

Entre estos factores exógenos relacionados con los niveles de estrógenos se encuentran dos tipos, uno relacionado con la fisiología propia de cada mujer (menarquia temprana, menopausia tardía, nuliparidad, edad tardía del primer embarazo y obesidad en mujeres posmenopáusicas), y otro relacionado con hábitos personales, como son el uso de anticonceptivos orales o la terapia hormonal posmenopáusica que, se ha demostrado, incrementan ligeramente el riesgo de padecer cáncer de mama (Armstrong, et al., 2000;

Key, et al., 2001).

Se ha observado que existen otros factores ambientales que aumentan el riesgo, entre los que se incluyen determinadas enfermedades benignas mamarias, la edad, el sedentarismo, la exposición precoz a altas dosis de radiaciones ionizantes, el consumo de alcohol, el alto consumo de grasa, el menor consumo de folatos, la exposición a

Cáncer de mama: de la glándula al tumor

frecuencia (Johnson-Thompson and Guthrie, 2000; Key, et al., 2001).

En el caso de los factores endógenos, se consideran así aquellas variantes o alelos génicos que incrementan la probabilidad de padecer cáncer de mama. Dentro de estas variantes existen tres tipos, dependientes del grado en el que incrementan este riesgo, encontrándose variantes denominadas de alta penetrancia o susceptibilidad, variantes de penetrancia media y variantes de baja penetrancia (Stratton and Rahman, 2008; Turnbull and Rahman, 2008).

Las mujeres con alteraciones en alguno de los dos genes de alta penetrancia descubiertos hasta el momento, BRCA1 y BRCA2, presentan una probabilidad de desarrollar cáncer de mama a lo largo de su vida entre 40% y 60% (Antoniou, et al., 2003;

Milne, et al., 2008), aunque previamente las estimas fueron muy superiores (60-85%) (Armstrong, et al., 2000).

Existen mutaciones en genes como TP53, ATM o PTEN que también incrementan el riesgo de desarrollar cáncer de mama, si bien como consecuencia de síndromes generalizados, como son el síndrome de Li-Fraumeni, la Ataxia Telangiectasia o el síndrome de Cowden (Key, et al., 2001). En estudios de análisis mutacional en pacientes non-BRCA1/2, se han encontrado mutaciones en genes involucrados en las rutas de reparación del DNA (CHEK2, BRIP1 o PALB2), que confieren un incremento moderado de entre 2 y 3 veces el riesgo a padecer cáncer de mama en la población general (Stratton and Rahman, 2008; Turnbull and Rahman, 2008). En recientes estudios se ha observado que variantes con moderada frecuencia en la población incrementan el riesgo a padecer cáncer de mama en 1,2–1,5 veces el riesgo de la población general. Esto implica un bajo incremento en el riesgo en comparación con las 10–15 veces el incremento en el riesgo que suponen las mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 (Easton, et al., 2007; Gold, et al., 2008; Hunter, et al., 2007; Stacey, et al., 2008).

En el caso de los varones, ciertas enfermedades como el síndrome de Klinefelter, las orquitis, cirrosis y bilharziasis, favorecen el desarrollo del cáncer de mama. También se encuentran casos de cáncer de mama en varones en familias en las que segregan mutaciones en el gen BRCA2.

2. 2 . E E

C C

M M

F F

: : BR B RC CA A1 1 Y Y BR B R CA C A2 2

22.1.1..CCÁNÁNCCEERR DDEE MMAMAMAA::FFAMAMIILLIIAARR VVSS EESSPPOORRÁÁDDIICCOO

En la mayoría de los casos de cáncer de mama no se observa un patrón claro de herencia, y probablemente son debidos al efecto combinado de múltiples variables, que incluyen tanto componentes genéticos (variantes de baja penetrancia) como modificadores ambientales. Estos casos se incluyen en el tipo denominado Cáncer de Mama Esporádico.

El Cáncer de Mama Familiar representa alrededor de un 5% de los casos de cáncer de mama, e incluye a aquellos casos de cáncer de mama que, dentro de una familia, se distribuyen siguiendo un modelo de herencia mendeliana (suponiendo la segregación de alguna variante en algún gen de susceptibilidad). Cuando la variante que segrega en una familia es descubierta, también se puede denominar Cáncer de Mama Hereditario, puesto que se pueden conocer aquellos individuos dentro de la familia que han heredado dicha variante. A grandes rasgos, el cáncer de mama familiar se caracteriza por una edad temprana de aparición, mayor frecuencia de casos bilaterales y la aparición de otros tipos de tumores en la familia (ovario, colon, próstata, de endometrio y sarcomas).

22.2.2..FFAMAMIILILIAASS DDEE RRIIEESSGGOO

Las consultas de consejo genético son una útil herramienta, no sólo por el beneficio médico de las familias que acuden a ellas, sino también como filtro para diferenciar aquellos casos clínicos que manifiestan un claro trasfondo genético de aquellos casos clínicos en los que es poco probable la existencia de una causa genética, suponiendo un considerable ahorro tanto económico como de tiempo.

En el caso del cáncer de mama, solo unas pocas familias poseen una historia familiar clínica que sugiera la posibilidad de que un gen de alta penetrancia, como BRCA1 ó BRCA2, sea el responsable de la susceptibilidad que muestran los miembros de dichas familias. En este sentido, se propusieron una serie de criterios para dividir las familias con cáncer de mama en dos grupos (Hoskins, et al., 1995):

2.2.22..11.. FFaammiilliiaass ddee aalltoto rriieessggoo

Caracterizadas por la presencia de cáncer de mama en parientes cercanos (al menos tres casos), la enfermedad parece seguir un modelo de herencia autosómico dominante

El cáncer de mama familiar: BRCA1 y BRCA2

(Claus, et al., 1991; Claus, et al., 1990; Easton, et al., 1993). Otras características son la edad media temprana de diagnóstico de cáncer de mama (inferior a 50 años) y la aparición de casos de cáncer de ovario y otros tumores (Easton, et al., 1993; Narod, et al., 1995). La predisposición al cáncer en estas familias es resultado de una mutación en un gen de susceptibilidad de alta penetrancia, como es el caso de los genes BRCA1 y BRCA2.

2.2.22..22.. FFaammiilliiasas ddee rriieessggoo mmooddeerraaddoo

Caracterizadas por la presencia de dos mujeres con cáncer de mama en la familia, ausencia de cáncer de ovario y una edad media de diagnóstico avanzada (Claus, et al., 1991; Claus, et al., 1990). Se desconoce la base genética de estas familias, pero probablemente no se deba a la herencia de un gen de susceptibilidad de alta penetrancia, sino más bien se ajustaría a un modelo de herencia de varios genes de baja penetrancia. A partir de esta primera clasificación, existen distintos criterios de selección más o menos estrictos. En cualquier caso, hay unanimidad en que la implicación de BRCA1 y BRCA2 está por lo general restringida a las familias de alto riesgo.

22.3.3..GGENENEERRAALLIIDDAADDEESS SSOOBBRREE BRBRCCAA11 YY BRBRCCAA22

El gen BRCA1 se localiza en la región cromosómica 17q21 y está compuesto de 24 exones que transcriben un RNA mensajero de 7.173 pb de longitud (Figura 3A). El tamaño medio de los exones es de 140 pares de bases, excepto el del exón 11, de aproximadamente 3.500 pb, que constituye casi el 60% de la región codificante. Este gen codifica una proteína de 1.863 aminoácidos que posee varios dominios funcionales con los que interacciona con multitud de proteínas y con el DNA (Figura 3B). Entre ellos cabe destacar el dominio en forma de anillo (“RING finger domain”), situado cerca del extremo N- terminal, y el dominio BRCT (BRCA1 C-Terminal) compuesto de secuencias repetitivas claves para la interacción con proteínas implicadas en la reparación del DNA o en el metabolismo.

Por otro lado, BRCA2 se localiza en 13q12-q13, siendo mayor que BRCA1 con un total de 10.930 pb distribuidos en 27 exones. Este gen codifica una proteína de 3.418 aminoácidos (Figura 3C). Al igual que BRCA1, también presenta un exón 11 muy grande, con un tamaño de 5.000 pb. La proteína BRCA2 solo contiene dos dominios funcionales conocidos, de los que destacan las repeticiones BRC (similares al BRCT de BRCA1)