EXPOSIÇÃO AO MANCOZEB DURANTE DESENVOLVIMENTO LARVAL INDUZ DANO OXIDATIVO E PREJUDICA LOCOMOÇÃO EM DROSOPHILA MELANOGASTER

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(1)EXPOSIÇÃO AO MANCOZEB DURANTE DESENVOLVIMENTO LARVAL INDUZ DANO OXIDATIVO E PREJUDICA LOCOMOÇÃO EM DROSOPHILA MELANOGASTER. Cynthia Camila Ziech 1 Nathane Rosa Rodrigues 2 Giulianna Echeverria Macedo 3 Karen Kich Gomes 4 Jéssica Ferreira Rodrigues 5 Thaís Posser 6. Resumo:.

(2) Mancozeb (Etileno-bis-ditiocarbamato de manganês e zinco) é um fungicida muito utilizado na agricultura brasileira, principalmente no cultivo de frutas e hortaliças. A exposição ambiental e ocupacional de humanos a este composto demonstra evidências de carcinogenicidade, desordens reprodutivas, neurotoxicidade e alterações no desenvolvimento cérebro-fetal relacionados à presença de manganês em sua estrutura química e à formação de um metabólito secundário chamado etilenotiouréia. Drosophila melanogaster é um modelo alternativo para estudos toxicológicos, pois apresenta um curto período de vida, e cerca de 75% dos genes relacionados a doenças em seres humanos possuem similaridades neste organismo. Neste estudo foram avaliados os efeitos da exposição larval ao Mancozeb na performance locomotora, indução de dano oxidativo e atividade de enzimas antioxidantes em Drosophila melanogaster adultas. Moscas adultas foram deixadas por 24h em meio de cultura padrão contendo Mancozeb nas concentrações, 0, 0,1 e 0,5 mg/mL para ovoposição, seus ovos foram mantidos nesse meio até a eclosão das moscas. Após isto, a atividade locomotora das moscas foi avaliada através do ensaio de geotaxia negativa. Para a análise da atividade das enzimas glutationa-S-transferase (GST), superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT), 20 moscas foram homogeneizadas, centrifugadas e o sobrenadante foi utilizado para medida da atividade enzimática. A viabilidade celular foi avaliada a partir do ensaio de resazurina, a formação de espécies reativas (EROs) através do ensaio de DCF-DA, e os níveis proteicos e de óxido nítrico também foram avaliados. As moscas recém-eclodidas expostas ao Mancozeb 0,5 mg/mL durante o período de desenvolvimento larval apresentaram dificuldade ao escalar um tubo de vidro de 5 cm com relação ao controle (controle 2,69 ± 1,12 s; tratados 7,1 ± 3,78 s). A análise de resazurina demonstrou também uma diminuição na viabilidade celular em 30% (0,1 mg/mL) e 42% (0,5 mg/mL). Os níveis de óxido nítrico diminuíram significativamente em ambas as concentrações. A formação de EROs foi aumentada apenas na concentração 0,1 mg/mL em 48%. A atividade da enzima SOD demonstrou uma diminuição próxima a 40% em ambas as concentrações em relação ao grupo controle, enquanto CAT apresentou um aumento de 48 e 70% e GST demonstrou um aumento de 31 e 47%, respectivamente às concentrações de 0,1 e 0,5 mg/mL. Os níveis proteicos demonstraram uma diminuição progressiva conforme o aumento da concentração do composto. Os resultados obtidos indicam que a exposição ao Mancozeb durante o desenvolvimento larval induziu déficits locomotores na vida adulta, efeito acompanhado de diminuição na viabilidade celular e níveis proteicos. Tal dano pode ser consequência do estresse oxidativo celular, evidenciado pela formação de espécies reativas de oxigênio e pela alteração da atividade das enzimas antioxidantes. Devido à importante atuação do óxido nítrico na resposta imune, sugere-se que a diminuição nos níveis do mesmo possa estar relacionada à imunossupressão. Nossos resultados demonstram que a fase de desenvolvimento embrionário é crítica em relação à toxicidade do Mancozeb. Neste sentido, o sistema antioxidante celular e a resposta imune parecem ser alvos importantes da sua ação biológica, podendo acarretar danos ao Sistema Nervoso Central e Periférico.. Palavras-chave: estresse oxidativo; ditiocarbamato; mosca-da-fruta; neurotoxicidade. Modalidade de Participação: Iniciação Científica. EXPOSIÇÃO AO MANCOZEB DURANTE DESENVOLVIMENTO LARVAL INDUZ DANO OXIDATIVO E PREJUDICA LOCOMOÇÃO EM DROSOPHILA MELANOGASTER 1 Aluno de graduação. cynthia.ziech@gmail.com. Autor principal 2 Aluno de pós-graduação. nathane.r.rodrigues@gmail.com. Co-autor 3 Aluno de pós-graduação. giulianna.echeverria@gmail.com. Co-autor 4 Aluno de graduação. karenkich.bio@gmail.com. Co-autor 5 Aluno de graduação. jfrodrigues.bio@gmail.com. Co-autor 6 Docente. thaisposser@unipampa.edu.br. Orientador. Anais do 9º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE.

(3) EXPOSIÇÃO AO MANCOZEB DURANTE DESENVOLVIMENTO LARVAL INDUZ DANO OXIDATIVO E PREJUDICA LOCOMOÇÃO EM Drosophila melanogaster 1. INTRODUÇÃO O Mancozeb (Etileno-bis-ditiocarbamato de manganês e zinco) (MZ) é um fungicida de amplo espectro comercializado desde 1960 em larga escala na agricultura brasileira, principalmente no cultivo de frutas e hortaliças (LOPES, 2016), sendo que, segundo o Portal Global Agrochemicals, em 2015 o Brasil importou 18,7 mil toneladas do mesmo. Apesar de ser considerado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2016) como medianamente tóxico, de classe III, com baixa toxicidade aguda, a exposição ambiental e ocupacional de humanos a este composto demonstra evidências de carcinogenicidade, desordens reprodutivas e neurotoxicidade relacionados à presença de manganês em sua estrutura química e à formação de um metabólito secundário chamado etilenotiouréia (GOLDONI; SILVA, 2012). A exposição de mulheres grávidas a agroquímicos em geral vem sendo relacionada com abortos espontâneos, baixo peso ao nascer e diminuição da circunferência do crânio (WOLFF et al., 2007). Além disso, existem indicativos de alterações no desenvolvimento cérebro-fetal relacionados à exposição ao MZ durante este período (NORDBY et al., 2005). Drosophila melanogaster, conhecida como mosca-da-fruta, é um modelo animal alternativo e complementar para estudos toxicológicos, esta apresenta um curto período de vida, é de fácil manutenção e manipulação e cerca de 75% dos genes relacionados à doenças em seres humanos possuem similaridades com este organismo (PANDEY; NICHOLS, 2011). Ademais, apresenta a vantagem de não haverem imposições éticas para seu uso, permitindo a minimização do uso de mamíferos e outros vertebrados em pesquisas toxicológicas básicas (REZNIKOV, 2010). Neste estudo foram avaliados os efeitos da exposição larval ao Mancozeb sobre a performance locomotora, indução de dano oxidativo e atividade de enzimas antioxidantes em Drosophila melanogaster adultas. 2. METODOLOGIA Moscas adultas foram deixadas por 24h em meio de cultura padrão contendo Mancozeb nas concentrações, 0, 0,1 e 0,5 mg/mL de meio para ovoposição, seus ovos foram mantidos nesse meio até a eclosão das moscas. Após a eclosão, a atividade locomotora das moscas foi avaliada através do ensaio de geotaxia negativa (BLAND et al., 2010). Para a análise da atividade das enzimas glutationa-S-transferase (GST) (HABIG; JAKOBY, 1981), superóxido dismutase (SOD) (KOSTYUK; POTAPOVICH, 1989) e catalase (CAT) (AEBI, 1984), 20 moscas foram homogeneizadas e centrifugadas e o sobrenadante foi utilizado para medida da atividade enzimática. $ YLDELOLGDGH FHOXODU IRL DYDOLDGD D SDUWLU GR HQVDLR GH UHVD]XULQD 2¶%5,(1 HW al., 2000), a formação de espécies reativas (EROs) através do ensaio de DCF-DA (PÉREZ-SEVERIANO et al., 2004), e os níveis proteicos (BRADFORD, 1976), e de óxido nítrico (reagente de Griess, Promega) também foram avaliados. Todos os dados foram analisados em ANOVA de uma via através do teste de TuNH\¶V SRVW KRF QR VRIWZDUH *UDSK3DG 3ULVP.

(4) 3. RESULTADOS e DISCUSSÃO As moscas recém-eclodidas expostas ao Mancozeb 0,5 mg/mL durante o período de desenvolvimento larval apresentaram dificuldade ao escalar um tubo de vidro de 5 cm com relação ao controle (controle 2,69 ± 1,12 s; tratados 7,1 ± 3,78 s), demonstrando que a performance locomotora foi prejudicada pelo Mancozeb (figura 1A). A análise de resazurina demonstrou também uma diminuição na viabilidade celular em 30% e 42%, respectivamente às concentrações de 0,1 e 0,5 mg/mL (figura 1B).. . Figura 1. Efeito da exposição ao Mancozeb (0, 0,1 e 0,5 mg/mL) na habilidade locomotora (A) e na viabilidade celular (B) de moscas recém-eclodidas (1-4 dias). A habilidade locomotora foi avaliada por Ensaio de Geotaxia Negativa. Os dados são expressos como média ± EP; * P <0,05, ** P<0,01 e *** P <0,001 em relação ao controle (Tukey's post hoc test). Os níveis de óxido nítrico diminuíram significativamente em ambas as concentrações (figura 2A). A formação de EROs foi aumentada apenas na concentração 0,1 mg/mL em 48% (figura 2B).. Figura 2. Efeito da exposição ao Mancozeb (0, 0,1 e 0,5 mg/mL) na síntese de óxido nítrico (NO) (A), e na formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) (B) nas moscas recém eclodidas (1-4 dias). Os dados são expressos como média ± EP; ** P<0,01 e *** P <0,001 em relação ao controle (Tukey's post hoc test). A atividade da enzima SOD demonstrou uma diminuição próxima a 40% em ambas as concentrações em relação ao grupo controle (figura 3A), enquanto CAT apresentou um aumento de 48 e 70% (figura 3B) e GST demonstrou um aumento de 31 e 47% (figura 3C), respectivamente às concentrações de 0,1 e 0,5 mg/mL. Os níveis proteicos demonstraram uma diminuição progressiva conforme o aumento da concentração de Mancozeb (figura 3D)..

(5) Figura 2. Efeito do Mancozeb (0, 0,1 e 0,5 mg/mL) na atividade de enzimas antioxidantes Superóxido dismutase (SOD) (A), Catalase (CAT) (B), e Glutationa-STransferase (GST) (C) e nos níveis proteicos (D) das moscas recém eclodidas (1-4 dias). Os dados são expressos como média ± EP; * P<0,05, ** P <0,01 e *** P <0,001 em relação ao controle e # P<0,05 em relação ao grupo 0,1 mg/mL. (Tukey's post hoc test). Os resultados obtidos indicam que a exposição ao composto Mancozeb durante a fase de desenvolvimento larval induziu déficits locomotores na vida adulta, este efeito foi acompanhado de diminuição na viabilidade celular e níveis de proteínas totais. Este dano pode ser consequência da condição de estresse oxidativo celular, evidenciado tanto pela formação de espécies reativas de oxigênio quanto pela alteração da atividade das enzimas antioxidantes. Dentre as alterações enzimáticas, o aumento na atividade de GST pode estar relacionado a aumento da formação de peróxido de hidrogênio (observado pelo DCF-DA), uma vez que esta enzima é responsável pela degradação deste em Drosophila melanogaster (CARLETTI et al., 2008), além de atuar em sua via normal de conjugação de xenobióticos. O óxido nítrico tem importante função na resposta imune (SCHMIDT; WALTER, 1994). Sugere-se, portanto, que a diminuição nos níveis de óxido nítrico possa estar relacionada à imunossupressão e maior susceptibilidade de indivíduos expostos a este compostos a agentes inflamatórios, entretanto, mais estudos são necessários para aprofundar esta hipótese. 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS Nossos resultados demonstram que a fase de desenvolvimento embrionário é crítica em relação à toxicidade do Mancozeb. Neste sentido, o sistema antioxidante celular e a resposta imune parecem ser alvos importantes da sua ação biológica, podendo acarretar danos ao Sistema Nervoso Central e Periférico. 5. REFERÊNCIAS AEBI, H. Catalase in vitro. Methods in Enzymology, v. 105, p. 121±126, 1984..

(6) BLAND, M. L.; LEE, R. J.; MAGALLANES, J. N.; FOSKETT, J. K.; BIRNBAUM, M. J. AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut. Developmental biology, v. 344, n. 1, p. 293-303, 2010. BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v. 72, n. 1, p. 248±254, 1976. Brasil. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Índice monográfico M02 ± Mancozebe [internet]; 2016 [acesso em 08 set 2017]. Disponível em: http://portal.anvisa.gov.br/documents/111215/117782/M02%2B%2BMancozebe.pdf/9 75fdd18-65fd-477c-ab85-217bcb9a0110 CARLETTI T.; SERRA, R.; POLI, I.; VILLANI, M.; FILISETTI, A. Sufficient conditions for emergent synchronization in protocell models.J Theor Biol, v. 254, n. 4, p. 741, 2008. Equipe Global Agrochemicals. Brasil importou 18,7 mil toneladas do defensivo agrícola Mancozeb em 2015 [internet]; 2016 [acesso em 22 jun 2017]. Disponível https://globalagrochemicals.com/noticia.php?id=brasil-importou-18724em: toneladas-de-mancozeb-em-2015 GOLDONI, A.; SILVA, L. B. DA. Potencial mutagênico do fungicida Mancozebe em Astyanax jacuhiensis (Teleostei: Characidae) = Mutagenic potential of the fungicide Mancozeb in Astyanax jacuhiensis (Teleostei: Characidae). Bioscience Journal, v. 28, n. 2, 2012. HABIG, W. H.; JAKOBY, W. B. Assays for differentiation of glutathione Stransferases. Methods in Enzymology, v. 77, p. 398±405, 1981. KOSTYUK, V. A.; POTAPOVICH, A. I. Superoxide--driven oxidation of quercetin and a simple sensitive assay for determination of superoxide dismutase. Biochemistry International, v. 19, n. 5, p. 1117±1124, 1989. LOPES, A. Exposição ao Mancozeb resulta na acumulação de manganês e respostas antioxidantes no cérebro de Cyprinus carpio (Carpa-comum).48f. 2016. Monografia (Bacharelado em Ciências Biológicas), Universidade Federal do Pampa, campus São Gabriel, São Gabriel, 2016. NORDBY, K. C., ANDERSEN, A., IRGENS, I. M., KRISTENSEN, P. Indicators of Mancozeb exposure in relation to thyroiG FDQFHU DQG QHXUDO WXEH GHIHFWV LQ IDUPHUV¶ families. Scand. J. Work Environ. Health, v. 31, p. 89-96, 2005. 2¶%5,(1 - :,/621 , 25721 7 32*1$1 ) ,QYHVWLJDWLRQ RI WKH $ODPDU %OXH (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry, v. 267, n. 17, p. 5421±5426, 2000..

(7) PANDEY, U; NICHOLS, C. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews, v. 63, n. 2, p. 411±420, 2011. PÉREZ-SEVERIANO, F; SALVATIERRA-SÁNCHEZ, R.; RODRÍGUEZ-PEREZ, M.; CUEVAS-MARTÍNEZ, E. Y.; GUEVARA, J.; LIMÓN, D.; MALDONADO, P. D.; MEDINA-CAMPOS, O. N.; PEDRAZA-CHAVERRÍ, J.; SANTAMARÍA, A. SAllylcysteine, a garlic-derived antioxidant, ameliorates quinolinic acid-induced neurotoxicity and oxidative damage in rats. Neurochemistry International, v. 45, n. 8, p. 1175±1183, 2004. REZNIKOV, A. G. Bioethical aspects of experiments on the animals: Klinichna Khirurhiia, v.6, p.8-13, 2010. SCHMIDT, H. H.; WALTER, U. NO at work. Cell, v. 78, n. 6, p. 919, 1994. WOLFF, E. C.; KANG, K. R.; KIM Y. S.; PARK M. H. Posttranslational synthesis of hypusine: evolutionary progression and specificity of the hypusine modification. Amino acids, v. 33, n.2, p.341-350, 2007..

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