Cinética de la hidrólisis enzimática del almidón en un reactor de lecho empacado con Alfa Amilasa Inmovilizada

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(1)UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN ESCUELA DE POSGRADO UNIDAD DE POSGRADO DE LA FACULTAD DE INGENIERIA DE PROCESOS. “CINÉTICA DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN EN UN REACTOR DE LECHO EMPACADO CON ALFA AMILASA INMOVILIZADA”. TESIS PRESENTADO POR:. Bachiller ELÍAS ESCOBEDO PACHECO PARA OPTAR EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS Y TECNOLOGÍAS DE ALIMENTOS. ASESOR: Ph. D. FÉLIX JOSÉ SUEROS VELARDE AREQUIPA – PERÚ. 2009.

(2) 2. AGRADECIMIENTOS. Mi más sincero agradecimiento:. A Dios, de quien siempre he recibido bendiciones para mi y para mi familia, por su inmenso amor y por que siempre ha preparado el camino para el logro de mis metas espirituales y temporales.. A mi Esposa Lilia Mary y a mis Hijos Daniel Elías y Nefi Moroni por su apoyo, cariño, comprensión, consejos y sobre todo por su paciencia.. A mis Padres y a toda mi familia, por su apoyo incondicional e invalorable apoyo.. A mis amigos de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Nacional del Altiplano de Puno por su amistad y apoyo..

(3) 3. RESUMEN. En el presente trabajo de investigación se ha realizado la hidrólisis de almidón en un reactor de lecho fijo empacado con alfa amilasa inmovilizada con alginato de sodio y cloruro de calcio.. Se ha trabajado en un reactor de vidrio de doble tubo; en su interior se ha cargado 100 pellets de la enzima inmovilizada, de 5 mm de diámetro promedio. Se ha realizado 12 experimentos que corresponden a un diseño factorial multinivel, siendo los factores independientes: la temperatura, T; el flujo de alimentación, F y la concentración inicial de almidón, CAo. Para el seguimiento de la hidrólisis se ha utilizado el método yodométrico, Fuwa-1954, y manteniendo el pH constante (pH = 7,02) con tampón fosfato.. Se ha logrado una conversión de 98,29% cuando CAo = 1 g/l, T = 50 ºC y F = 100 ml/h. En estas condiciones, la constante de Michaelis – Menten, CM = 0,088 g/l; constante de velocidad, k = 6,038 y el orden de reacción, n = 0,596.. También se ha realizado un análisis de los resultados experimentales con ayuda del programa Statgraphics 5.1, obteniendo el modelo matemático ajustado. siguiente:. % X  43, 2108  0, 020575F  1, 26783T  5, 06667C Ao ;. considerando %X (porcentaje de conversión por hidrólisis enzimática), F (flujo de alimentación de almidón al reactor, en ml/h), T (temperatura de proceso de hidrólisis, en ºC) y CAo (concentración inicial de almidón, en g/l)..

(4) 4. SUMMARY. Presently investigation work has been carried out the hydrolysis of starch in a reactor of fixed bed packed with alpha amylase immobilized with alginate of sodium and calcium chloride.. One has worked in a reactor of glass of double tube; in its interior 100 pellets of the enzyme immobilized has been loaded, of 5 mm of diameter average. It has been carried out 12 experiments that correspond to a multilevel factorial design, being the independent factors: the temperature, T; the feeding flow, F and the initial concentration of starch, CAo. For the follow-up of the hydrolysis the iodometric method, Fuwa-1954, has been used and maintaining the constant pH (pH = 7,02) with tampon phosphate.. A conversion of 98,29% has been achieved when CAo = 1 g/l, T = 50 ºC and F = 100 ml/h. Under these conditions, the constant of Michaelis – Menten, CM = 0,088 g/l; constant of speed, k = 6,038 and the reaction order, n = 0,596.. Also has been done an analysis of the experimental results with the help of the program Statgraphics 5.1, obtaining the following fit mathematical model: where % X (conversion percentage for enzymatic hydrolysis), F (flow of feeding of starch to the reactor, in ml/h), T (temperature of hydrolysis process, in ºC) and CAo (initial concentration of starch, in g/l)..

(5) 5. INDICE Página Nº AGRADECIMIENTOS. 2. RESUMEN. 3. SUMMARY. 4. INDICE GENERAL. 5. INDICE DE TABLAS. 9. INDICE DE FIGURAS. 11. CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN. 14. ANTECEDENTES. 15. OBJETIVOS. 16. HIPÓTESIS. 16. CAPÍTULO II REVISIÓN DE LITERATURA 2.1.. CARBOHIDRATOS. 17 17. 2.1.1. CLASIFICACIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS. 17. 2.1.1.1.. MONOSACÁRIDOS. 18. 2.1.1.2.. OLIGOSACÁRIDOS. 19. 2.1.1.3.. POLISACÁRIDOS. 20. 2.2.. ALMIDÓN. 22. 2.2.1. AMILOSA. 25. 2.2.2. AMILOPECTINA. 27. 2.2.3. COMPLEJOS DE ALMIDÓN. 28. 2.3.. 29. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN. 2.3.1. ENZIMAS. 30. 2.3.1.1.. 32. PRINCIPALES TIPOS DE ENZIMAS. 2.3.2. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN. 33. 2.3.2.1.. ENZIMAS ESPECÍFICAS DEL ENLACE α(1-4). 37. 2.3.2.2.. ENZIMAS ESPECÍFICAS DEL ENLACE α(1-6). 39. 2.3.2.3.. ENZIMAS ESPECÍFICAS DE LOS ENLACES α(1-4) Y α(1-6). 39. 2.3.2.4.. AMILASAS. 41.

(6) 6. 2.3.2.4.1. INHIBIDORES DE α-AMILASA 2.3.2.5.. ENZIMAS. INMOVILIZADAS. 42 EN. EL. PROCESO. DE. ALIMENTOS. 42. 2.3.2.5.1. MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS. 43. 2.3.2.5.2. CRITERIOS USADOS PARA OPTAR POR UN MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN. 44. 2.3.2.5.3. ALGINATOS PARA INMOVILIZAR ENZIMAS. 44. 2.3.2.6.. 47. MÉTODOS DE MEDIDA DE LA ACTIVIDAD AMILOLÍTICA. 2.3.2.6.1. MÉTODOS SACAROGÉNICOS. 47. 2.3.2.6.2. MÉTODOS CROMOGÉNICOS. 49. 2.3.2.6.3. MÉTODOS AMILOCLÁSTICOS. 49. 2.4.. 50. CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS. 2.4.1. REACCIONES DE ENZIMAS INMOVILIZADAS 2.4.2. FACTORES. QUE. INFLUYEN. EN. LAS. 53 REACCIONES. ENZIMÁTICAS. 53. 2.4.2.1.. EFECTO DEL pH. 54. 2.4.2.2.. EFECTO DE LA TEMPERATURA. 55. 2.4.2.3.. ENERGÍA DE ACTIVACIÓN DE LA REACCIÓN CATALIZADA ENZIMÁTICAMENTE.. 2.4.2.4.. 56. DEPENDENCIA DE LA TEMPERATURA SEGÚN LA LEY DE ARRHENIUS. 59. 2.4.3. REGULACIÓN DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS. 60. 2.4.4. LA ECUACIÓN CINÉTICA. 60. 2.4.4.1.. MECANISMO PARA LA REACCIÓN ENZIMA – SUSTRATO. 61. 2.4.5. REACTORES DE FLUJO PISTÓN EN ESTADO ESTACIONARIO. 63. 2.4.5.1.. 66. OTROS MÉTODOS PARA EVALUAR k y CM. 2.4.6. INHIBICIÓN POR UNA SUSTANCIA EXTRAÑA, INHIBICIÓN COMPETITIVA Y NO COMPETITIVA. 67. 2.4.6.1.. CINÉTICA DE LA INHIBICIÓN COMPETITIVA. 68. 2.4.6.2.. CINÉTICA DE LA INHIBICIÓN NO COMPETITIVA. 68. 2.4.6.3.. COMO DISTINGUIR ENTRE INHIBICIÓN COMPETITIVA Y NO COMPETITIVA A PARTIR DE DATOS EXPERIMENTALES. 69. CAPÍTULO III MATERIALES Y MÉTODOS 3.1.. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS. 70 70.

(7) 7. 3.1.1. MATERIALES. 70. 3.1.2. EQUIPOS. 71. 3.1.3. REACTIVOS. 71. 3.2. MÉTODO YODOMÉTRICO PARA EL SEGUIMIENTO DE LA REACCIÓN. 72. 3.2.1. PREPARACIÓN DE DISOLUCIÓN DE I2 – KI (DISOLUCIÓN MADRE). 73. 3.2.2. PREPARACIÓN DE LA DISOLUCIÓN TAMPÓN FOSFATO 0.1M. 74. 3.2.3. PREPARACIÓN DE DISOLUCIÓN DE ALMIDÓN, USANDO COMO DILUYENTE LA SOLUCIÓN TAMPÓN. 74. 3.2.4. PREPARACIÓN DE LA ENZIMA INMOVILIZADA. 75. 3.2.5. SELECCIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA DE MEDIDA. 75. 3.2.6. CONSTRUCCIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN. 76. 3.2.7. EXPERIMENTOS. DE. HIDRÓLISIS. ENZIMÁTICA. EN. UN. REACTOR DE LECHO EMPACADO CON ALFA AMILASA INMOVILIZADA. 77. 3.2.7.1.. CARACTERÍSTICAS DE LA ENZIMA INMOVILIZADA. 3.2.7.2.. CARACTERÍSTICAS DEL REACTOR EMPACADO CON LA ENZIMA INMOVILIZADA. 3.2.7.3.. 77. 78. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PARA LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN. 3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL. 78 79. CAPÍTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1.. CARACTERÍSTICAS DE LA ENZIMA INMOVILIZADA. 4.2.. CARACTERÍSTICAS DEL REACTOR EMPACADO CON LA. 4.3.. 81 81. ENZIMA INMOVILIZADA. 81. SELECCIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA DE MEDIDA. 81. 4.4. CONSTRUCCIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN. 84. 4.5. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA A 30 ºC y C Ao = 1g/l. 86. 4.6. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA A 50 ºC y C Ao = 1g/l. 87. 4.7. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA A 30 ºC y CAo = 5g/l. 89. 4.8. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA A 50 ºC y C Ao = 5g/l. 90. 4.9. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN INICIAL DE ALMIDÓN. 92. 4.10.. 95. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA.

(8) 8. 4.11.. EVALUACIÓN. COMPARATIVA. CONCENTRACION INICIAL DE ALIMENTACIÓN. Y. LA. DEL. EFECTO. DE. LA. ALMIDÓN, EL FLUJO DE. TEMPERATURA. SOBRE. EL. PORCENTAJE DE ALMIDÓN HIDROLIZADO 4.12.. 97 –. DETERMINACIÓN DE LA CONSTANTE DE MICHAELIS MENTEN. 4.13.. 99. CONSTANTE DE MICHAELIS – MENTEN (CM) A DIFERENTES CONDICIONES DE C Ao Y TEMPERATURA. 103. 4.14.. DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD Y ORDEN DE REACCIÓN. 104. 4.15.. ENERGÍA DE ACTIVACIÓN. 110. 4.16.. ANÁLISIS ESTADÍSTICO. 114. 4.16.1.. EFECTOS ESTIMADOS PARA CONVERSIÓN POR HIDRÓLISIS. 4.16.2.. COEFICIENTE DE REGRESIÓN PARA LA CONVERSIÓN POR HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA. 4.16.3.. 4.16.4.. SUPERFICIES. DE. RESPUESTA. 114. 116 EN. EL. PROCESO. DE. HIDRÓLISIS.. 117. RESPUESTA OPTIMIZADA. 119. CONCLUSIONES. 120. REFERENCIA BIBLIOGRÁFÍCA. 122.

(9) 9. INDICE DE TABLAS Página Nº Tabla 1. Producción Agropecuaria en el Perú de principales materias primas para obtener almidón. (En miles de toneladas). 14. Tabla 2. Clasificación de los carbohidratos más importantes. 18. Tabla 3. Características de los polisacáridos. 22. Tabla 4. Características de almidones en la industria alimentaria. 25. Tabla 5. Enzimas empleadas en la hidrólisis de almidón.. 33. Tabla 6. Propiedades funcionales de los productos de la hidrólisis del almidón. 34. Tabla 7. Energía de activación para algunas reacciones de interés en alimentos. 51. Tabla 8. Energía de activación de algunas reacciones. 51. Tabla 9. Preparación de muestras para selección de longitud de onda. 75. Tabla 10. Preparación de muestras para recta patrón. 76. Tabla 11. Factores o variables del Proceso. 79. Tabla 12. Diseño de Experimentos, Factorial Multinivel. 80. Tabla 13. Barrido de Longitudes de Onda. 82. Tabla 14. Coeficientes de absortividad para diferentes longitudes de onda. 83. Tabla 15. Lecturas de Absorbancia para curva de calibración. 85. Tabla 16. Lecturas de absorbancia a la salida del reactor, para distintos flujos de alimentación, habiendo diluido 50 veces.. 86. Tabla 17. Lecturas de absorbancia a la salida del reactor, para distintos flujos de alimentación, habiendo diluido 50 veces.. 88. Tabla 18. Lecturas de absorbancia a la salida del reactor, para distintos flujos de alimentación, habiendo diluido 125 veces.. 89. Tabla 19. Lecturas de absorbancia a la salida del reactor, para distintos flujos de alimentación, habiendo diluido 125 veces.. 91. Tabla 20. Influencia de la concentración inicial de almidón a una temperatura constante de 30 ºC.. 92. Tabla 21. Influencia de la concentración inicial de almidón a una temperatura constante de 50 ºC.. 94. Tabla 22. Influencia de la temperatura, manteniendo constante CAo = 1g/L.. 95.

(10) 10. Tabla 23. Influencia de la temperatura, manteniendo constante la concentración inicial, C Ao = 5g/l. Tabla. 24.. Conversión. alimentación,. distintas. del. 96 almidón,. para. concentraciones. distintos. iniciales. y. flujos. de. diferentes. temperaturas. 97. Tabla 25. Datos para graficar curva para hallar CM, (CAo = 1 g/l y T = 30 ºC). 99. Tabla 26. Datos para graficar curva para hallar CM, (CAo = 1 g/l y T = 50 ºC). 100. Tabla 27. Datos para graficar curva para hallar CM, (CAo = 5 g/l y T = 30 ºC). 101. Tabla 28. Datos para graficar curva para hallar CM, (CAo = 5 g/l y T = 50 ºC). 102. Tabla 29. Resumen de resultados de determinación de la constante de Michaelis – Menten para diferentes condiciones de temperatura y concentración inicial.. 103. Tabla 30. Datos para graficar curva para hallar constante de velocidad y orden de reacción (CAo = 1 g/l y T = 30 ºC). 105. Tabla 31. Datos para graficar curva para hallar constante de velocidad y orden de reacción (CAo = 1 g/l y T = 50 ºC). 106. Tabla 32. Datos para graficar curva para hallar constante de velocidad y orden de reacción (CAo = 5 g/l y T = 30 ºC). 107. Tabla 33. Datos para graficar curva para hallar constante de velocidad y orden de reacción (CAo = 5 g/l y T = 30 ºC). 108. Tabla 34. Resumen de los resultados de velocidad y orden de reacción.. 109. Tabla 35. Datos para hallar Energía de Activación, cuando CAo = 1 g/l para diferentes temperaturas.. 110. Tabla 36. Datos para hallar Energía de Activación, cuando C Ao = 5 g/L para diferentes temperaturas.. 111. Tabla 37. Resumen de Resultados Tabla 38. Análisis de la Varianza para Conversión. 113. Tabla 39. Resultados de la Estimación para Conversión. 116. Tabla 40. Respuesta optimizada. 119. 114.

(11) 11. INDICE DE FIGURAS Página Nº Figura 1. Representación de la α-D-glucopiranosa (dextrosa). 18. Figura 2. Representación de la β-D-fructofuranosa (levulosa). 19. Figura 3. Estructura de la sacarosa (glucosa-fructosa). 20. Figura 4. Estructura de la maltosa (glucosa-glucosa). 20. Figura 5: Enrollamiento helicoidal de la amilosa. 25. Figura 6: Porción de una molécula de amilosa. 26. Figura 7. Estructura de la Amilosa. 26. Figura 8. Estructura de la Amilopectina. 27. Figura 9. Estructura ramificada de la amilopectina.. 28. Figura 10. Principales productos obtenidos por degradación del almidón. 40. Figura 11. Puntos de ataque del almidón por diferentes tipos de amilasas.. 42. Figura 12. Unidades G y M de alginatos. 45. Figura 13: Bloques G y M de alginatos. 45. Figura 14: Formación de gel de alginato de calcio: unidades de ácido gulurónico en solución. 46. Figura 15: Formación de redes de gel con cadenas homopoliméricas unidas a través de iones calcio. 46. Figura 16: Unión entre cadenas homopoliméricas a través de iones de calcio situados entre los grupos con carga negativa. 47. Figura 17. Diagrama de energía para una reacción química efectuada (a) con catalizador y (b) sin catalizador. El cambio de energía (c) representa la diferencia de energía libre entre los estados inicial y final de la reacción.. 52. Figura 18: Efecto del pH en la actividad enzimática: (a) pH óptimo; (b) intervalo de estabilidad de la enzima; (c) intervalo de inactivación reversible y (d) inactivación instantánea.. 54. Figura 19: Efecto de la temperatura en la actividad catalítica de las enzimas. Figura 20. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de formación de producto. Las líneas continuas son las de los valores experimentales; las líneas discontinuas están basadas en las velocidades iniciales (por. 55.

(12) 12. ej., líneas trazadas tangencialmente a los valores experimentales a tiempos cercanos a cero).. 57. Figura 21: Efecto de la temperatura sobre la constante de velocidad de una reacción.. 58. Figura 22: Nomenclatura para un reactor de flujo pistón. 63. Figura 23: Representación gráfica de las ecuaciones de diseño para el reactor de flujo pistón. 65. Figura 24. Gráficas que puede utilizarse para probar y ajustar la ecuación de M-M a partir de datos provenientes de un reactor de flujo pistón.. 67. Figura 25. Representación simple de la acción de dos tipos de inhibidores. 68. Figura 26. Efecto de la inhibición sobre los datos provenientes de reactores de flujo pistón o de reactores intermitentes. 69. Figura 27. Esquema de la instalación del reactor para hidrólisis enzimática. 77. Figura 28. Barrido de Longitud de Onda. 82. Figura 29. Coeficiente de Absortividad para diferentes longitudes de onda. 84. Figura 30. Curva de Calibración. 85. Figura 31. Concentración de Almidón a la salida del reactor a 30 ºC y CAo = 1 g/l. 87. Figura 32. Concentración de Almidón a la salida del reactor a 50 ºC y CAo = 1 g/l. 88. Figura 33. Concentración de Almidón a la salida del reactor a 30 ºC y CAo = 5 g/l. 90. Figura 34. Concentración de Almidón a la salida del reactor a 50 ºC y CAo = 5 g/l. 91. Figura 35. Influencia de la concentración inicial de almidón para su hidrólisis, a 30 ºC. 92. Figura 36. Influencia de la concentración inicial de almidón para su hidrólisis, a 50 ºC. 94. Figura 37. Influencia de la temperatura de hidrólisis, cuando C Ao = 1 g/l. 95. Figura 38. Influencia de la temperatura de hidrólisis, cuando C Ao = 5 g/l. 96. Figura 39. Influencia de la Concentración inicial de almidón, el flujo de alimentación y la temperatura en el porcentaje de almidón hidrolizado. 97.

(13) 13. Figura 40. Curva para hallar CM, cuando CAo = 1 g/l y T = 30 ºC. 99. Figura 41. Curva para hallar CM, cuando CAo = 1 g/l y T = 50 ºC. 100. Figura 42. Curva para hallar CM, cuando CAo = 5 g/l y T = 30 ºC. 101. Figura 43. Curva para hallar CM, cuando CAo = 5 g/l y T = 50 ºC. 102. Figura 44. CM a diferentes CAo y diferentes T. 103. Figura 45. Velocidad y orden de reacción, cuando C Ao = 1 g/l y T = 30 ºC. 105. Figura 46. Velocidad y orden de reacción, cuando C Ao = 1 g/l y T = 50 ºC. 106. Figura 47. Velocidad y orden de reacción, cuando C Ao = 5 g/l y T = 30 ºC. 107. Figura 48. Velocidad y orden de reacción, cuando C Ao = 5 g/l y T = 50 ºC. 108. Figura 49. Velocidades de reacción a 30 ºC, para diferentes concentraciones iniciales. 109. Figura 50. Velocidades de reacción a 50 ºC, para diferentes concentraciones iniciales. 109. Figura 51. Curva para hallar Energía de Activación, C Ao = 1 g/l. 110. Figura 52. Curva para hallar Energía de Activación, C Ao = 5 g/l. 111. Figura 53. Energía de Activación a diferentes C Ao. 112. Figura 54. Gráfico de Pareto estandarizado para Conversión. 115. Figura 55. Gráfico de Efectos Principales para Conversión. 115. Figura 56. Superficie de Respuesta Estimada, Concentración Inicial de almidón = 3 g/l. 117. Figura 57. Superficie de Respuesta Estimada, Temperatura = 40 ºC. 118. Figura 58. Superficie de Respuesta Estimada, Flujo de alimentación = 300 ml/h. 118.

(14) 14. CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN. En el Perú, hay importante reserva y fuentes de materia prima que contiene almidón; incluso hay muchos de estos son desperdiciados por diversas razones. Existe la necesidad de aprovechar estas materias primas y además darle valor agregado con tecnologías accesibles y eficientes.. En la Tabla 1, se muestra datos oficiales hasta el año 2008 de la producción agropecuaria en el Perú de las principales materias primas a partir de las cuales se puede obtener almidón.. Tabla 1. Producción Agropecuaria en el Perú de principales materias primas para obtener almidón. (En miles de toneladas) Principales productos Arroz Cáscara. 2004. 2005. 2006. 2007. 2008. 1 844,896 2 468,357 2 363,498 2 435,134 2 782,700. Cebada Grano. 177,169. 193,085. 191,627. 177,479. 186,619. Maíz Amiláceo. 216,891. 241,506. 249,169. 245,326. 250,558. 26,997. 32,590. 30,428. 31,824. 29,852. Trigo. 170,411. 178,460. 191,094. 181,552. 206,286. Maíz Choclo. 377,904. 351,341. 360,600. 332,255. 375,345. Camote. 184,375. 184,422. 198,635. 184,765. 185,186. Olluco. 120,636. 135,340. 144,878. 156,379. 158,745. Quinua. Papa. 3 008,159 3 289,699 3 248,416 3 383,020 3 588,086. Yuca. 971,035 1 004,454 1 138,553 1 158,042 1 153,425. Fuente: Ministerio de Agricultura - Dirección General de Información Agraria Dirección de Estadística – 2009.. El almidón es un polisacárido que se encuentra abundantemente en la naturaleza. Además, este polisacárido tiene muchas opciones para ser aprovechado por el hombre; una de estas opciones es la hidrólisis enzimática..

(15) 15. Puesto que la hidrólisis enzimática es un proceso donde ocurre reacción química en presencia de un biocatalizador, es necesario un reactor adecuado y de preferencia debe ser continuo, puesto que en la industria se recomienda los procesos continuos por cuestiones de economía y eficiencia.. Los reactores de lecho empacado son reactores de flujo continuo que tienen en su interior un lecho fijo que al pasar uno de los reactantes a través de este relleno ocurren reacciones químicas. Por ello es importante definir que tipo de relleno debe estar en el reactor. En el caso de reacciones enzimáticas, la enzima es la que debe estar en el lecho fijo.. Los biorreactores enzimáticos de lecho empacado tienen relleno de enzimas inmovilizadas, estás enzimas deben ser específicas para el tipo de sustrato que se desea catalizar y reaccionar.. A nivel de investigación experimental, se puede desarrollar métodos o tecnologías que lleven a cabo procesos que se pueden escalar a planta piloto y luego a escala industrial. Una de las cuestiones más importantes que se requiere responder es en qué condiciones de operación se desarrolla mejor un proceso de hidrólisis enzimática del almidón. Estas condiciones pueden ser Temperatura de operación, Flujo de alimentación de sustrato en el reactor, pH, Concentración de sustrato, tipo de enzima, inmovilización de enzima, tamaño de lecho, etc.. ANTECEDENTES Existen diversos trabajos de investigación con respecto a la hidrólisis enzimática. Estos demuestran que la hidrólisis enzimática cumple con el modelo de la cinética de Michaelis – Menten, sea este en proceso batch o contínuo10,28,53.. Además hacen notar que la hidrólisis enzimática en un reactor de lecho fijo empacado con enzima inmovilizada dependen del flujo de alimentación del sustrato9,60, de la concentración del sustrato65, del pH del proceso65, del grado de agitación y de la temperatura53 y del tipo de enzima36..

(16) 16. En el caso de la hidrólisis del almidón con alfa amilasa inmovilizada en proceso batch, se han encontrado antecedentes en las que las condiciones óptimas son: alginato de sodio al 2% p/v y CaCl2 al 5% p/v.35 Estos antecedentes conducen a proponer un trabajo de investigación sobre la hidrólisis del almidón en un reactor de lecho empacado con la enzima alfa amilasa inmovilizada con alginato de sodio, en la que se evalúe si la cinética de hidrólisis, bajo estas condiciones, cumple con el modelo de Michaelis – Menten y evaluar la influencia de la temperatura, flujo de alimentación y concentración de sustrato, de tal manera que se obtenga los parámetros que favorezcan las condiciones óptimas para un alto grado de conversión o hidrólisis del almidón.. OBJETIVOS 1. Evaluar la cinética de hidrólisis del almidón en un reactor de flujo continuo con alfa amilasa inmovilizada como lecho fijo. 2. Evaluar la influencia de la Temperatura, Flujo de alimentación de sustrato y concentración inicial de sustrato en la hidrólisis del almidón en un reactor de flujo continuo con alfa amilasa inmovilizada como lecho fijo. 3. Determinar los parámetros óptimos, Temperatura, Flujo de alimentación de sustrato y concentración inicial de sustrato, para obtener un alto grado de conversión en la hidrólisis del almidón.. HIPÓTESIS 1. La cinética de hidrólisis del almidón, en un reactor de flujo continuo con alfa amilasa inmovilizada como lecho fijo, se ajusta al modelo de MichaelisMenten. 2. La Temperatura, Flujo de alimentación de sustrato y la concentración inicial de sustrato influyen en la hidrólisis del almidón en un reactor de flujo continuo con alfa amilasa inmovilizada como lecho fijo. 3. Es posible encontrar valores óptimos de Temperatura, Flujo de alimentación de sustrato y concentración inicial de sustrato que permitan alcanzar el más alto grado de hidrólisis del almidón..

(17) 17. CAPÍTULO II. REVISIÓN DE LITERATURA. 2.5.. CARBOHIDRATOS Los hidratos de carbono o carbohidratos son compuestos con estructura de polihidroxialdehido o de polihidroxiacetona; son la fuente más abundante y barata de alimentos de la naturaleza y por lo tanto los más consumidos por los seres humanos.. Son los principales compuestos químicos almacenadores de la energía radiante del sol; de hecho, la glucosa sintetizada en las plantas por el proceso de fotosíntesis representa la materia prima fundamental para la fabricación de la gran mayoría de ellos; el dióxido de carbono reacciona con agua para formar glucosa, con el consecuente desprendimiento de oxígeno: 6CO2  12 H 2O   C6 H12O6  6O2  6 H 2O. H º  2802,96kJ / mol. (1). A su vez, mediante diversas rutas bioquímicas, éste azúcar da origen a muchos otros como la sacarosa y la fructosa, o bien a polímeros como la celulosa y el almidón.2. 2.5.1. CLASIFICACIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS Los carbohidratos más importantes en alimentos tienen una clasificación general, tal como se muestra en la Tabla 2:. Su clasificación se hizo de acuerdo con diversos criterios: estructura química, abundancia en la naturaleza, uso en alimentos, poder edulcorante, etc. Normalmente se prefiere el criterio de la estructura química, que se basa en el tamaño de la molécula o en el número de átomos de carbono que contiene, según la cual, los hidratos de carbono pueden ser monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos..

(18) 18. Tabla 2. Clasificación de los carbohidratos más importantes Carbohidratos. Ejemplo. Pentosas a) Monosacáridos. b) Oligosacáridos. c) Polisacáridos. Hexosas. Xilosa, arabinosa, ribosa, etc. Aldohexosas. Glucosa, galactosa, manosa, etc.. Cetohexosas Fructosa, sorbosa, etc.. Disacáridos. Lactosa, sacarosa, maltosa, etc.. Trisacáridos. Rafinosa, etc.. Tetra y pentasacáridos. Estaquiosa, verbascosa, etc.. Homopolisacáridos. Almidón, glucógeno, celulosa, etc.. Heteropolisacáridos. Hemicelulosa, pectinas, etc.. Fuente: BADUI DERGAL. 2.5.1.1.. MONOSACÁRIDOS Estos compuestos son insolubles en etanol y en éter; solubles en agua y sus soluciones tienen, en general, un sabor dulce aunque existen algunos que son amargos; comparativamente, la cantidad de monosacáridos en estado libre es muy inferior a la que se encuentra combinada integrando los diversos polisacáridos.. La glucosa es el monosacárido más abundante; se encuentra en diferentes. frutas. y. hortalizas,. y. su. concentración. depende. básicamente del grado de madurez del producto.. La fructosa se encuentra principalmente en los jugos de diversas frutas y en las mieles, y se producen en cantidades equimoleculares con la glucosa cuando se hidroliza la sacarosa. OH O H. H H OH. O. HO HO. H. HO. OH. H. H. OH H. OH. H. H H OH. OH. Figura 1. Representación de la α-D-glucopiranosa (dextrosa).

(19) 19. H H. HO OH. O H. O. HO. OH H. H. HO. H OH. H. OH. HO. OH H OH. Figura 2. Representación de la β-D-fructofuranosa (levulosa). Los monosacáridos tienen un grupo aldehído o una cetona y varios hidroxilos y consecuentemente los cambios químicos a los que están sujetos se relacionan con las transformaciones de estas funciones; se ven afectados por los ácidos, los álcalis, las altas temperaturas y los agentes oxidantes y reductores, que provocan su isomerización, enolización, deshidratación, ciclización, oxidación, reducción, etc.. 2.5.1.2.. OLIGOSACÁRIDOS Se considera tradicionalmente como el producto de la condensación de dos a 10 monosacáridos mediante un enlace glucosídico.2. En el área de los alimentos, los más importantes son los disacáridos y algunos tri y tetrasacáridos. Un disacárido se sintetiza por la unión de dos monosacáridos, con la consecuente pérdida de una molécula de agua, pero también se pueden obtener por la hidrólisis de los polisacáridos. En general, los disacáridos se han dividido de acuerdo con su poder reductor, y así tenemos aquellos que son capaces de reducir las soluciones de Fehling, como la lactosa, la celobiosa, la isomaltosa y la maltosa, y los que no la reducen, como la sacarosa.. Al igual que sucede con los polisacáridos, el organismo humano sólo utiliza los oligosacáridos después de que han sido hidrolizados enzimáticamente en el intestino delgado y convertidos en sus correspondientes monosacáridos; en esta forma se absorben a.

(20) 20. través de la pared intestinal para llegar a los sitios donde finalmente son aprovechados.. La. hidrólisis. química. de. los. enlaces. glucosídicos. de. los. oligosacáridos depende de factores como el pH, la temperatura, la configuración anomérica y el tamaño del anillo glucosídico; en general, estas uniones son más lábiles en los ácidos que en los álcalis y las de configuración β resisten más que las de configuración α. OH HO O H. H OH. H. H. OH. H. O. HO. OH. O. H. HO. OH. OH. H. -D-fructofuranosil--D-glucopiranosido. Figura 3. Estructura de la sacarosa (glucosa-fructosa) OH. OH O H. H. O OH. H H. H OH. H. HO H. OH. O. OH. H H. H. OH. 4-O--D-glucopiranosil--D-glucopiranosa. Figura 4. Estructura de la maltosa (glucosa-glucosa). 2.5.1.3.. POLISACÁRIDOS Convencionalmente, se ha considerado polisacárido aquel polímero constituido por más de 10 monosacáridos unidos por distintos enlaces glucosídicos. A pesar de esta distinción, la gran mayoría de los polisacáridos naturales contienen cientos de monómeros y, en ocasiones, varios miles.2. No producen verdaderas soluciones, sino más bien dispersiones de tamaño coloidal; puros no tienen color, aroma o sabor. Su peso molecular, que puede llegar a ser hasta de millones, es en realidad.

(21) 21. un promedio, puesto que las moléculas no son iguales y siempre presentan una distribución de valores.. Se encuentran como cadenas lineales, o bien, ramificadas, que a su vez pueden estar integradas por un solo tipo de monosacárido (homopolisacárido), como el almidón y la celulosa, o también por varios tipos de monosacáridos (heteropolisacárido), como es el caso de la mayoría de las gomas. De cualquier manera, sus componentes siempre están unidos regularmente con una secuencia y estructura repetitivas,. representando. polímeros. con. un. alto. grado. de. ordenación. Su nomenclatura se basa en la adición de la terminación “ana” a las primeras letras que identifiquen el nombre del azúcar que lo integra; por ejemplo, aquellos constituidos por glucosa exclusivamente se denominan glucanas, los que contienen solo galactosa, galactanas, etc. Cuando contienen más de un monómero se hace una combinación, como galactomanana, arabinogalactana, etc.. De acuerdo con su función biológica se han dividido en dos grandes grupos: los que constituyen la estructura celular y le confieren rigidez a los tejidos (celulosa, pectinas, gomas, etc.), y los que representan la reserva energética de animales y vegetales (glucógeno, inulina y almidón); cada grupo tiene propiedades físicas y químicas muy distintas que se resumen en la tabla 3.. Los polisacáridos se encuentran en forma natural en muchos alimentos, pero en algunas ocasiones se añaden a otros para obtener la formulación correcta, como en el caso del almidón, la carragaenina y las pectinas, que se utilizan por sus propiedades funcionales. Por su gran capacidad de retener agua, producen partículas coloidales muy hidratadas, razón por la cual a los polisacáridos se les da el nombre de hidrocoloides..

(22) 22. Tabla 3. Características de los polisacáridos Estructurales . Forman puentes de hidrógeno. De reserva alimenticia . intermoleculares muy fuertes. Pocos puentes de hidrógeno intermoleculares y débiles. . Producen fibras muy rígidas. . No producen fibras. . Insoluble en agua. . Solubles en agua. . Enlaces glucosídicos. . Enlaces glucosídicos. generalmente β . . Muy resistentes a enzimas,. generalmente α . Muy atacables por enzimas,. microorganismos y agentes. microorganismos y agentes. químicos. químicos. Sus dispersiones son de alta viscosidad. . Sus dispersiones no son muy viscosas. Fuente: Badui 1997.. 2.6.. ALMIDÓN El almidón es la sustancia de reserva alimenticia predominante en las plantas, y proporciona el 70 – 80% de las calorías consumidas por los humanos de todo el mundo.. Tanto el almidón como los productos de la hidrólisis del almidón constituyen la mayor parte de los carbohidratos digestibles de la dieta habitual.. El almidón se diferencia de todos los demás carbohidratos en que en la naturaleza se presenta como complejas partículas discretas (gránulos). Los gránulos de almidón son relativamente densos e insolubles, y se hidratan muy mal en agua fría. Pueden ser dispersados en agua, dando lugar a la formación de suspensiones de baja viscosidad que pueden ser fácilmente mezcladas y bombeadas, incluso a concentraciones mayores del 35%.20.

(23) 23. La capacidad de formar soluciones viscosas (capacidad espesante) es alcanzada solo cuando la suspensión de los gránulos es sometida a la acción del calor. Calentando una suspensión al 5% de gránulos de almidón no modificado hasta unos 80 ºC (175 ºF), con agitación, se produce una alta viscosidad.. Los gránulos de almidón son insolubles en agua fría, debido a la fuerza de cohesión de los puentes de hidrógeno, que mantienen unidas las cadenas, pero a medida que la temperatura se eleva hasta lo que se conoce como temperatura inicial de gelatinización, comienzan a absorber agua. La gelatinización corresponde a los fenómenos de hinchamiento irreversible y solubilización observados cuando los granos de almidón se calientan a temperaturas superiores a 60 ºC en presencia de exceso de agua.. Las temperaturas iniciales de gelatinización son características de cada tipo concreto de almidón, pero generalmente se hallan en el intervalo 55 a 70 ºC. A medida que los granos absorben agua se produce una pérdida progresiva de la birrefringencia y de su cristalinidad. La solubilización del almidón conduce a la destrucción parcial de la estructura granular dependiendo de la especie botánica y del tipo cristalino del almidón nativo. Conforme prosigue el hinchamiento aumenta espectacularmente la viscosidad de la suspensión-disolución; las moléculas de amilosa son lixiviadas de los granos hinchados y contribuyen también a la viscosidad. Si se sigue calentando mientras se agita, la viscosidad comienza pronto a decaer a medida que los granos pierden su integridad. Si se deja que la pasta se enfríe, la viscosidad vuelve a elevarse, a medida que las uniones a través de puentes de hidrógeno entre la amilopectina y la amilosa se restablecen para dar un producto de consistencia tipo gel.14. Los geles obtenidos tienen estructuras tridimensionales y porosas. Esquemáticamente estos geles se forman a partir de una matriz continua de uno de los polímeros que retienen pequeñas gotas del otro polímero..

(24) 24. La composición de cada una de las dos fases depende principalmente del. grado. de. gelatinización. (parcial/total). y. de. la. relación. amilosa/amilopectina en el grano de almidón. Resumiendo, las características del gel de almidón dependen, entre otros factores, del tamaño, de la estructura morfológica de los granos, de la relación amilosa/amilopectina, de la temperatura y del tiempo de cocción.74. Debido a los cambios morfológicos que se producen durante la gelatinización del almidón, éste adquiere una estructura más asequible al ataque enzimático.70. Cuando se dejan en reposo durante unas horas, las disoluciones de almidón o las pastas de esta sustancia, comienzan a mostrar cambios en sus propiedades reológicas; las disoluciones diluidas pierden viscosidad pero las pastas concentradas y los geles se tornan gomosos y exudan agua. Los dos tipos de cambios señalados se deben al fenómeno denominado retrogradación, que afecta a las moléculas de amilosa. Éstas en el transcurso del tiempo se asocian y cristalizan.14. La tendencia a la retrogradación se ve incrementada por las bajas temperaturas, especialmente alrededor de los 0 ºC, el pH neutro, las altas concentraciones de almidón. También depende del peso molecular y del tipo de almidón.4. El fenómeno de recristalización de la amilosa en la retrogradación dificulta la hidrólisis enzimática del almidón por las amilasas 70.. Otra propiedad importante es que la mayoría de los gránulos de almidón están compuestos de una mezcla de polímeros: un polisacárido esencialmente lineal denominado amilosa y otro muy ramificado llamado amilopectina.. En. términos. generales,. los. almidones. contienen. aproximadamente 17 – 37% de amilosa y el resto de amilopectina, tal como se muestra en la Tabla 4..

(25) 25. Tabla 4. Características de almidones en la industria alimentaria. 27. Temperatura de gelatinización (ºC) 62-72. Tamaño del gránulo (micras) 5-25. 20-45. 55-80. 67-80. 5-25. Papa. 78. 22. 58-67. 5-100. Arroz. 83. 17. 62-78. 2-5. Tapioca. 82. 18. 51-65. 5-35. Maíz céreo. 99-100. 0-1. 63-72. 5-25. Sorgo céreo. 99-100. 0-1. 67-74. 5-25. 76. 24. 58-64. 11-41. Tipo. Amilopectina (%). Amilosa (%). 73. Maíz Maíz rico en amilosa. Trigo Fuente: BADUI – 1997.. 2.6.1. AMILOSA La amilosa es un polímero lineal formado de unidades D-glucosa unidas por enlaces α(1-4). Tiene la facilidad de adquirir una conformación tridimensional helicoidal, en la que cada vuelta de la hélice consta de 6 moléculas de glucosa.2. Figura 5: Enrollamiento helicoidal de la amilosa El acoplamiento de la posición axial-ecuatorial de las unidades α-Dglucopiranosilo con enlaces (1  4) en las cadenas de amilosa da a las moléculas una forma de hélice o espiral con giro a la derecha. (Fig. 5). El interior de la hélice contiene solo átomos de hidrógeno, y por tanto.

(26) 26. lipofílico, mientras que los grupos hidroxilo están situados en el exterior de la hélice.. Figura 6: Porción de una molécula de amilosa OH. OH O H. H. O H. H. H OH. H. OH. H. Extremo no reductor. OH. H H. O H. O H. H. H. O OH. OH O H. H. H. HO H. OH. OH. OH. H. O H. OH. Enlaces glicosídios  (1-4) de la amilosa. OH H. OH. Extremo reductor. Figura 7. Estructura de la Amilosa. Debido a su carácter prácticamente lineal y a la presencia casi exclusiva de los enlaces α(1-4), es susceptible de complejar moléculas hidrófobas (yodo, ácidos grasos, cadenas hidrocarbonadas); su capacidad de fijación de yodo es del orden de 20 mg por 100 mg de amilosa.12. Esta propiedad se debe a la conformación en hélice de esta macromolécula, en la cual todos los grupos hidrófilos están orientados hacia el exterior mientras que los grupos hidrófobos lo están hacia el interior. Esto forma una cavidad hidrófoba de un diámetro de 4,6 Amstrong que puede ser ocupada por diversos compuestos. Esta capacidad de fijación del yodo es la base de la cuantificación analítica.

(27) 27. del almidón25, de la caracterización de la amilosa 32 y de la determinación de su proporción en el almidón en relación a la amilopectina44.. El tamaño molecular de la amilosa es muy variable; así en los cereales presenta un grado de polimerización entre 1 000 y 2 000, mientras que en la patata puede alcanzar los 4 500. Ello determina pesos moleculares comprendidos entre 150 000 y 750 000 Dalton4.. 2.6.2. AMILOPECTINA La amilopectina es el polímero mayoritario del almidón, ya que supone entre el 70 y el 80% en peso. Se trata de una macromolécula ramificada en la que las unidades de glucosa anhidra (D-glucosa) están principalmente unidas por enlaces α(1-4) cuando forman parte de cadenas lineales y por enlaces α(1-6) cuando actúan como nexo de unión entre dos cadenas para formar ramificaciones.. Alrededor del 4-5% de las unidades de glucosa están implicadas en los enlaces α(1-6)14. La amilopectina se diferencia de la amilosa en que tiene ramificaciones que le dan una forma molecular similar a la de un árbol (Figura 9); las ramas están unidas al tronco central (semejante a la amilosa) por enlaces α-D-(1-6), localizadas cada 15-25 unidades lineales de glucosa.2 OH. OH O H. H. O H. H. H OH. H H. OH. O. H. O H. OH. O H. OH. OH O H. H. O H. H. H OH. OH. CH2. H. OH. H H. O. HO H. O H. H. H. OH. OH. H. O H. OH. O H. Ramificación (1-6) de la amilopectina. Figura 8. Estructura de la Amilopectina. OH.

(28) 28. La amilopectina se trata, en esencia, de un esqueleto de cadenas monorramificadas de aproximadamente 40 unidades de glucosa que llevan consigo familias (“clusters”) de cadenas, en su mayor parte no ramificadas de unas 15 unidades de longitud. La estructura de la amilopectina que se representa se basa en los estudios de Robin 1981 sobre almidón de patata. Generalmente se supone que las cadenas de amilopectina se orientan radialmente en el gránulo de almidón, con sus extremos no reductores proyectados hacia la superficie. En la figura 9, la flecha indica regiones concéntricas, separadas aproximadamente unas 6 μm, en las que se concentra la ramificación.. Extremo reductor. Figura 9: Estructura ramificada de la amilopectina.. La amilopectina es una molécula muy grande y altamente ramificada, con enlaces de ramificación que constituyen alrededor del 4-5% del total de los enlaces. Las ramas de las moléculas de amilopectina toman la forma de un racimo (Fig. 9) y se presenta como dobles hélices. Tienen pesos moleculares desde 107 hasta 5x108 Dalton.. 2.6.3. COMPLEJOS DE ALMIDÓN Las moléculas de amilosa son helicoidales, con la zona interior hidrófoba (lipófila), y son capaces de formar complejos con porciones lineales hidrófobas de moléculas que se ajusten a las dimensiones del tubo hidrofóbico. El yodo (como I 3 ) es capaz de formar complejos tanto con amilosa como con amilopectina. También en este caso, el complejo se forma cuando se introduce el yodo en el interior hidrofóbico del segmento de hélice..

(29) 29. En el caso de la amilosa, los largos segmentos helicoidales permiten la formación de largas cadenas de poli ( I 3 ), que dan lugar al color azul característico que puede ser utilizado como diagnóstico de la presencia de almidón. El ion yoduro (I-) puede combinarse con el yodo elemental (I2) para producir el anión triyoduro (I3-). Este ion triyoduro se combinará con la amilosa del almidón y se tornará de color azul rojizo, según se muestra en las siguientes reacciones: I   I 2   I 3. (2). I3  amilosa   complejotriyoduro  amilosa. (3). color azul rojizo. El complejo amilosa-yodo contiene un 19% de yodo, y la determinación de la cantidad de complejo sirve para medir la cantidad de amilosa aparente presente en el almidón. La amilopectina se colorea de rojo púrpura con el yodo, debido a que las ramas de amilopectina son demasiado cortas para la formación de largas cadenas de poli ( I 3 ).20. El yodo reacciona con la amilosa y genera un fuerte color azul característico debido al complejo que se establece entre una molécula de este con cada 7-8 glucosas; como para desarrollar perfectamente la coloración se requiere un mínimo de 40 residuos de monosacáridos, las cadenas muy cortas de amilosa, en lugar de azul, producen una coloración roja.2. 2.7.. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN El comienzo del desarrollo de la hidrólisis del almidón tuvo lugar en el siglo XVIII. El químico alemán Kirchhoff descubrió que hirviendo almidón en medio ácido y neutralizándolo posteriormente aquel podía ser convertido en azúcar..

(30) 30. Sin embargo, la acción catalítica no específica del ácido daba lugar a la formación de productos de sabor y color indeseables. Además el sirope obtenido. tenía. un. contenido. salino. relativamente. alto.. Estas. características indeseables en los siropes causadas por la hidrólisis ácida dieron lugar al desarrollo de tecnologías enzimáticas que solventan estos problemas.. Así la historia moderna de las enzimas comienza en 1833, cuando el francés Payen logró aislar el componente activo (α-amilasa) en la malta, el cual llamó diastasa. Takamine, en 1894, utilizó una mezcla enzimática procedente del Aspergillus oryzae como suplemento alimenticio para la población asiática que tenía dificultades para digerir el arroz (en concreto el almidón)24. Este preparado constituye posiblemente el primer producto enzimático de origen microbiano (los anteriores fueron obtenidos de tejidos animales o vegetales).. La identificación y el uso de esas enzimas del aspergillus oryzae permitió la producción de siropes de las características deseadas y que no eran factibles con la hidrólisis ácida. El verdadero impulso en términos industriales se produjo a mediados de la década de los 60, con el desarrollo de la amiloglucosidasa, la cual hizo posible que el almidón fuera completamente hidrolizado a glucosa41. Finalmente en 1973 se optimizó el proceso enzimático a nivel industrial cuando se introdujo una amilasa obtenida del Bacillus licheniformis, que era estable a altas temperaturas. El uso de esta enzima permitió la producción de siropes con un contenido en glucosa de hasta el 98%, que eran el sustrato ideal para que la glucosa isomerasa convirtiera la glucosa en fructosa 40.. 2.7.1. ENZIMAS Las enzimas son proteínas que, debido a su poder de activación específica y de conversión de sustratos en productos, tienen actividad catalítica: enzima Sustrato( s)   producto( s). (4).

(31) 31. Las enzimas son catalizadores positivos; esto es, incrementa la velocidad de las reacciones por un factor de entre 103 y 1011 respecto a las reacciones no catalizadas enzimáticamente.20. En relación con su velocidad de acción, algunas de ellas tienen la capacidad de transformar más de un millón de moléculas de sustrato, por segundo, por molécula de enzima; cabe indicar que, al igual que otros catalizadores, solo acelera la velocidad de aquellas reacciones que termodinámicamente son posibles.. Tiene que ocurrir un mínimo de dos sucesos para que se detecte actividad enzimática: . La enzima tiene que unir estereoespecíficamente un compuesto en el centro activo (no covalentemente). . Tiene que producirse la conversión química del compuesto inicial en un nuevo compuesto.. El empleo de enzimas tiene muchas ventajas:2 a) Son de origen natural y por lo tanto no deben ser tóxicas; b) Son muy específicas en su manera de actuar, por lo que no propician reacciones secundarias indeseables; c) Funcionan en condiciones moderadas de temperatura y de pH y no requieren de condiciones de procesamiento drásticas que puedan alterar la naturaleza del alimento, ni de equipo muy costoso; d) Actúan a bajas concentraciones; e) Su velocidad puede ser controlada al ajustar el pH, la temperatura y la concentración de enzimas; y f) Son fácilmente inactivadas una vez alcanzado el grado de transformación deseado.. La principal limitante es que algunas de ellas son muy caras y no se consiguen fácilmente; sin embargo, es conveniente hacer un balance de las ventajas y las desventajas que trae consigo llevar a cabo una.

(32) 32. determinada reacción con enzimas, o con otros métodos químicos o físicos.. 2.7.1.1. . PRINCIPALES TIPOS DE ENZIMAS Oxidoreductasas. Son enzimas que oxidan o reducen sustratos por transferencia de hidrógeno o electrones o mediante oxígeno.. . Transferasas. Son enzimas que eliminan grupos (sin incluir el H) de los sustratos y los transfieren a moléculas aceptoras (sin incluir el agua). . Hidrolasas. Son enzimas que catalizan reacciones en las que el agua participa en la ruptura de enlaces covalentes de un sustrato con la adición concomitante de elementos del agua a los elementos de ese enlace.. . Liasas. Son enzimas que eliminan grupos de un sustrato (no por hidrólisis) dejando un doble enlace, o que por el contrario adicionan grupos a dobles enlaces.. . Isomerasas. Son enzimas que llevan a cabo la isomerización de un sustrato.. . Ligasas. Son enzimas que catalizan la unión de dos moléculas acoplada a la ruptura de un enlace pirofosfato con el del ATP. Este grupo de enzimas se denominó «sintetasas» anteriormente.. Las enzimas responsables de la degradación del almidón son las Glucosil Hidrolasas (Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica), y su acción irreversible sobre un sustrato se puede esquematizar como sigue: E R  O  R ' H  OH   R  OH  R ' OH. (5). Donde R y R’ son cadenas que contienen de 1 a n moléculas de glucosa anhidra..

(33) 33. 2.7.2. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN Durante la hidrólisis enzimática se rompen los enlaces α(1-4) y α(1-6) presentes en el almidón para liberar cadenas más cortas: dextrinas, maltosa y glucosa. Las enzimas actúan específicamente sobre un tipo de enlaces o en algunos casos sobre los dos. En la tabla 5 se clasifican las enzimas utilizadas en la hidrólisis del almidón45.. Tabla 5. Enzimas empleadas en la hidrólisis de almidón. Enzima α-amilasa. Tipo de. Tipo de. Productos Terminales. enlace. ataque. Amilosa Amilopectina. α(1-4). Endo. E.C.3.2.1.1 β-amilasa. Dextrinas. Maltosa α(1-4). Exo. E.C.3.2.1.2 Pululanasa. Glucosa. Glucosa. Maltosa. Maltosa. Dextrinas. α(1-6). Endo. Ninguno. Dextrinas. α(1-6). Endo. Ninguno. Dextrinas. Exo. Glucosa. Glucosa. E.C.3.2.1.41 Isoamilasa E.C.3.2.1.60 Amiloglucosidasa α(1-4) E.C.3.2.1.3. α(1-6). Fuente: Mercier 1982.. La hidrólisis de dispersiones de almidón, tanto con ácidos como con enzimas, produce maltodextrinas. Las maltodextrinas son descritas y clasificadas normalmente de acuerdo con su equivalencia en dextrosa (ED). El ED está relacionado con el grado de polimerización (GP) a través de la siguiente ecuación:. ED . 100 GP. (6). En consecuencia, el ED de un producto de hidrólisis es igual a su poder reductor como porcentaje del poder reductor de la dextrosa pura (Dglucosa), y por tanto, el ED está inversamente relacionado con el peso molecular medio.20.

(34) 34. Las maltodextrinas se definen como productos cuyos valores de ED son medibles, pero inferiores a 20. Las maltodextrinas de menor ED no son higroscópicas, mientras que las de mayor ED (es decir las de menor peso molecular medio) tienden a absorber humedad.. Las maltodextrinas son más bien insípidas y prácticamente sin sabor dulce, y son excelentes para contribuir al cuerpo o volumen de muchos sistemas alimenticios. La hidrólisis hasta valores de ED de 20 – 60 proporciona mezclas de moléculas que, cuando son desecadas, se llaman sólidos de jarabe de maíz. Estos sólidos de jarabe de maíz se disuelven muy rápidamente y poseen un ligero sabor dulce.. Tabla 6. Propiedades funcionales de los productos de la hidrólisis del almidón Propiedades obtenidas por el. Propiedades obtenidas por el. alto grado de hidrólisisa. menor grado de conversiónb. . Dulzura.  Viscosidad. . Higroscopicidad y.  «Cuerpo». humectación.  Estabilización de espumas. Depresión del punto de.  Prevención de la cristalización. . congelación . Incremento del sabor. . Fermentabilidad. . Reacción de pardeamiento. de azúcar  Prevención del crecimiento de cristales de hielo.. a: jarabes de alto índice de conversión (alto ED) b: jarabes de bajo ED y maltodextrinas.. La hidrólisis continua del almidón produce una mezcla de D-glucosa, maltosa y otros maltooligosacáridos. Los jarabes con esta composición se producen en la industria en enormes cantidades. Uno de los más.

(35) 35. comunes tiene un ED de 42. Estos jarabes son estables a causa de que la cristalización no se produce con facilidad en tales mezclas complejas.. Se comercializa en concentraciones de alta osmolalidad, tan elevada que la mayoría de los organismos no pueden vivir en ella.. Para la hidrólisis industrial del almidón a D-glucosa se utilizan 3 o 4 enzimas diferentes. La α-amilasa es una endoglicosidasa que hidroliza internamente tanto las moléculas de amilosa como las de la amilopectina, dando lugar a la formación de oligosacáridos.. Los más grandes de ellos pueden estar ramificados una, dos o tres veces por enlaces (16), puesto que la enzima actúa solo sobre los enlaces (14) del almidón. La α-amilasa no ataca tampoco a los segmentos del polímero de almidón que están formando dobles hélices, ni a los que se encuentran en forma de complejo en un líquido polar (segmento de hélice sencilla estabilizado).. La glucoamilasa (amiloglucosidasa) se utiliza comercialmente en combinación con una α-amilasa, para producir jarabes de D-glucosa y Dglucosa cristalina. La enzima actúa sobre el almidón completamente gelatinizado como un exoenzima, liberando de forma secuencial unidades sencillas D-glucosilo a partir de los extremos no reductores de las moléculas de amilosa y amilopectina, incluso de aquellos que están unidos por enlaces (16). En consecuencia, esta enzima puede hidrolizar el almidón por completo, para dar solo moléculas de Dglucosa, pero se usa en general en almidón que ha sido previamente despolimerizado con α-amilasa para generar pequeños fragmentos y más extremos no reductores.20 La β-amilasa libera unidades de disacárido maltosa de manera secuencial desde el extremo no reductor de la amilosa. También ataca los extremos no reductores de la amilopectina liberando maltosa, pero no puede hidrolizar los enlaces (16) de los puntos de ramificación, por.

(36) 36. lo que da lugar a la formación de un residuo redondeado de amilopectina denominado dextrina límite, y más específicamente dextrina β-límite.. Existen varios enzimas desramificadores que catalizan de manera específica la hidrólisis de los enlaces (16) de la amilopectina, produciendo numerosas moléculas lineales de bajo peso molecular. Una de estas enzimas es la isoamilasa; entre ellos, la pululanasa.. La ciclodextringlucanotransferasa es un enzima procedente de bacillus de propiedades únicas, puesto que forma anillos de unidades D-αglucopiranosa unido por enlaces (14) a partir de polímeros de almidón. La enzima puede formar anillos de seis, siete u ocho unidades que se denominan respectivamente alfa-, beta- y gamma- ciclodextrinas.. Puesto que la conformación helicoidal normal de una porción lineal de una molécula de almidón contiene seis o siete unidades glucosílicas por cada vuelta de la hélice, la transferencia de un enlace glucosídico que une unidades adyacentes de una espiral a otra que forma una estructura circular a modo de rosquilla es fácil de imaginar. Estos productos, llamados originalmente dextrinas de Schardinger, por su descubridor, ahora son conocidos como ciclodextrinas o cicloamilosas. Poseen la capacidad de formar complejos con sustancias hidrofóbicas que son mantenidas en el centro del anillo.. El jarabe de maíz es la mayor fuente habitual de D-glucosa y D-fructosa. Para hacer el jarabe de maíz, se mezcla el almidón de maíz embebido en agua con una α-amilasa termoestable, y al calentarse se produce rápidamente la gelatinización y la hidrólisis (licuefacción) catalizada por la enzima. Después de enfriar a 55 – 60 ºC (130 – 140 ºF), la hidrólisis se continúa con glucoamilasa, tras lo cual el jarabe es clarificado, concentrado, refinado con carbón activo y sometido a intercambio iónico. Si el jarabe es adecuadamente refinado y sembrado con núcleos de cristalización monohidrato.. se. obtiene. D-glucosa. cristalina. (dextrosa). o. su.

(37) 37. Para la producción de D-fructosa, la solución de D-glucosa se pasa a través de una columna que contiene (de forma inmovilizada) glucosa isomerasa. La enzima cataliza la isomerización de D-glucosa a Dfructosa hasta alcanzar una mezcla de equilibrio de aproximadamente un 58% de D-glucosa y un 42% de D-fructosa. En la industria se desean normalmente mayores concentraciones de D-fructosa; por ejemplo el jarabe de maíz de alta concentración de fructosa (HFCS) utilizado como edulcorante en la elaboración de bebidas refrescantes, contiene alrededor de un 55% de D-fructosa. Para incrementar la concentración, el jarabe isomerizado se pasa a través de una columna con una resina de intercambio catiónico en forma de sal sódica. La resina une la Dfructosa, que puede ser recuperada hasta alcanzar la concentración deseada en el jarabe enriquecido en este azúcar.. 2.7.2.1.. ENZIMAS ESPECÍFICAS DEL ENLACE α(1-4) Se llaman genéricamente Amilasas y fueron clasificadas en α y β por Khun en 1925. Las α-amilasas liberan productos de reacción que tienen el grupo –OH situado en el carbono C1 en configuración α, mientras que en las β-amilasas se encuentra en configuración β. Las α-amilasas son las más utilizadas a escala industrial y su origen puede ser vegetal, animal o microbiano (bacterias, mohos y levaduras). Se caracterizan por hidrolizar al azar los enlaces α(1-4) presentes en las cadenas de amilosa y amilopectina produciendo como sustancias terminales, en el primer caso, glucosa y maltosa, y en el segundo, además de los sacáridos anteriores, cadenas más o menos ramificadas llamadas α-dextrinas límite45. Las α-amilasas atacan al almidón al azar y nunca por los extremos, lo que permite clasificarlas como endoenzimas. Este ataque sobre las regiones interiores del sustrato causa un rápido descenso en la viscosidad de los almidones hinchados y también un cambio en la coloración del complejo yodo-almidón.24,32,41.

(38) 38. Las α-amilasas comerciales pueden ser de orígen bacteriano (Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus amiloliquefaciens, …) o de origen fúngico (Aspergillus oryzae, Aspergillus Níger, …). Las de origen bacteriano son más termoestables que las fúngicas. Las. α-amilasas. termolábiles. de. origen. fúngico. se. utilizan. fundamentalmente para la obtención de productos que contienen unas elevadas proporciones en maltosa.3. La utilización de enzimas termoestables presenta muchas ventajas, entre. ellas. se. eliminan. riesgos. de. contaminación. por. microorganismos y disminuyen la viscosidad del medio ya que actúan a altas temperaturas. Sin embargo las α-amilasas fúngicas son más eficaces cuando no es necesario gelatinizar previamente el almidón además de que ofrecen la posibilidad de trabajar a bajas temperaturas. Las β-amilasas son exo-enzimas que atacan las cadenas de almidón por sus extremos no reductores. Convierten la amilosa en β-maltosa si estas cadenas contienen un número par de unidades de glucosa anhidra, mientras que los productos de reacción son β-maltosa y glucosa cuando el número de unidades de glucosa es impar. Estas β-amilasas se extraían tradicionalmente a partir de vegetales (cebada, boniato); sin embargo a partir de 1974 se preparan fundamentalmente a partir de microorganismos, tales como B. polymxa,. B.. megaterium,. B.. cereus. y ciertas especies de. 45. Streptomyces y Pseudomonas . Estas β-amilasas bacterianas presentan múltiples ventajas sobre las de origen vegetal. Producidas en mayores cantidades por el microorganismo, pueden ser fácilmente purificadas y actúan a temperaturas entre 60 y 70 ºC y a un pH comprendido entre 7 y 7,5, más elevado que el de sus equivalentes vegetales..

(39) 39. Las β-amilasas tienen un pH óptimo más elevado que las α-amilasas y no requieren de iones calcio (Ca2+) para su estabilización térmica o para el aumento de su actividad.61. 2.7.2.2.. ENZIMAS ESPECÍFICAS DEL ENLACE α(1-6) Son las llamadas enzimas desrramificantes. Las más importantes son la pululanasa, descubierta por Bender y Wallenfels 1961 a partir de un cultivo de Enterobacter aerogenes, y la isoamilasa, descubierta por Harada y col 1968 en Japón y Parrish y col 1970 en EEUU a partir de cultivos de Pseudomonas y Citofaga respectivamente. Sus parámetros de actividad óptima están situados a pH entre 5 a 6,5 y Temperatura entre 40 a 50 ºC.. La pululanasa hidroliza la amilopectina del almidón, pero es incapaz, debido a su gran volumen, de hidrolizar completamente el glucógeno (polímero de reserva dos veces más ramificado que la amilopectina). La isoamilasa tiene una actividad complementaria a la pululanasa ya que desrramifica tanto la amilopectina como el glucógeno. Ambas enzimas. completan. al. 100%. las. acciones. dextrinizantes. y. sacarificantes de las α y β amilasas cuando actúan sobre el almidón, consiguiendo hidrolizados con alta conversión en maltosa.. 2.7.2.3.. ENZIMAS ESPECÍFICAS DE LOS ENLACES α(1-4) Y α(1-6) El descubrimiento en los años 50 y 60 de enzimas microbianas capaces de hidrolizar los dos tipos de enlaces α(1-4) y α(1-6) ha mejorado la industria del almidón, ya que la comercialización de estas enzimas, a partir de 1960, permitió la producción industrial de dextrosa o D-glucosa por vía enzimática en vez del proceso clásico e hidrólisis ácida.. Estas enzimas se denominan Amiloglucosidasas o Glucoamilasas. Son exo-enzimas que tienen una actividad óptima a pH entre 4,5 a 5 y Temperatura entre 50 a 60 ºC. Liberan β-D-glucosa por hidrólisis repetitiva de los enlaces glucosídicos, empezando por sus extremos.

(40) 40. no reductores16,45. Provienen de microorganismos del género Rhizopus y Aspergillus, y por su forma de actuar, aunque varía según el origen de estas enzimas, parece ser que tienen más facilidad para unirse a las cadenas largas que a las cortas e hidrolizan antes los enlaces α(1-4) que α(1-6)41. La amiloglucosidasa presenta un efecto sinérgico con la α-amilasa. Esta sinergia disminuye conforme lo hace el peso molecular del sustrato de modo que por debajo de los 5 000 Dalton puede despreciarse la acción de la α-amilasa. El papel de la α-amilasa es la aceleración de la velocidad de formación de glucosa suministrando, al hidrolizar el almidón, nuevas moléculas que sirven de sustrato a la amiloglucosidasa.23. Los principales productos obtenidos de la degradación del almidón, se representa en la figura 10: MALITOL. Hidrogenación MALTOSA MALTOOLIGOSACARIDOS. CICLODEXTRINAS. f g. e. ALMIDÓN a. e b,c. JARABE DE ALMIDON. ALMIDON-SACAROSA GLUCOSA. a = Alfa-amilasa bacteriana b = Alfa-amilasa fúngica c = Amiloglucosidasa d = glucosaisomerasa. d FRUCTOSA. Hidrogenación. SORBITOL. e = ciclodextringlucosiltransferasa f = beta-amilasa g = Oligosacaridasa. Figura 10. Principales productos obtenidos por degradación del almidón.

(41) 41. 2.7.2.4.. AMILASAS Las amilasas se encuentran no solo en los animales sino también en las plantas superiores y en los microorganismos. Hay tres tipos principales de amilasas: α-amilasas, β-amilasas y glucoamilasas. Actúan primariamente sobre el almidón y el glucógeno. Las α-amilasas, que se encuentran en todos los organismos, hidrolizan los enlaces glucosídicos, α(1-4) del interior del almidón (tanto de la amilosa como de la amilopectina), del glucógeno y de las ciclodextrinas. manteniendo. la. configuración. α. del. carbono. anomérico. Dado que es un enzima del tipo «endo», su acción tiene un gran efecto sobre la viscosidad de los alimentos que tienen el almidón como base. La α-amilasa es una endohidrolasa que actúa de manera aleatoria sobre los enlaces internos α(1-4) de la amilosa y de la amilopectina, con lo cual se producen dextrinas; se le da el nombre de enzima licuante debido a que su presencia provoca la rápida reducción de la viscosidad de las soluciones de almidón. Es capaz de romper las uniones glucosídicas adyacentes a ambos lados del enlace α(1,6) de la amilopectina, aunque no ataca específicamente este enlace. 2 Las β-amilasas, que se encuentran en las plantas superiores, hidrolizan los enlaces glucosídicos α (1-4) del almidón en el extremo no reductor para dar β-maltosa. Dado que son enzimas de tipo exo, tiene que hidrolizar muchos enlaces antes de que se observe un efecto apreciable en la viscosidad de las pastas de almidón. La amilosa se puede hidrolizar en un 100% hasta maltosa mediante la βamilasa, pero no es capaz de seguir hidrolizando después del primer enlace glicosídico α-1,6 que se encuentra en la amilopectina.20. Se han conseguido éxitos importantes en la utilización de enzimas en la tecnología alimentaria. La producción de jarabe de maíz de alto contenido en fructosa es un ejemplo. Este proceso requiere una α-.

(42) 42. amilasa relativamente termorresistente, glucoamilasa y glucosa isomerasa:glucosa   amilasa glucoamilasa Almidón   dextrinas   glucosa. glucosa isomerasa. fructosa. (7). Los puntos de ataque del almidón por diferentes tipos de amilasas, se puede representar tal como muestra la figura 11:. -amilasa. Amiloglucosidasa. Amiloglucosidasa. Pululanasa. -amilasa. Glucosa Maltosa. Figura 11. Puntos de ataque del almidón por diferentes tipos de amilasas. 2.7.2.4.1. INHIBIDORES DE α-AMILASA Son tres los tipos de inhibidores de la α-amilasa:20 a) Proteínas producidas por plantas superiores, b) Polipéptidos pequeños producidos por varias especies de streptomyces y c) Carbohidratos pequeños que contienen nitrógeno, producidos por streptomyces.. 2.7.2.5.. ENZIMAS INMOVILIZADAS EN EL PROCESO DE ALIMENTOS Los objetivos de inmovilizar enzimas son permitir su uso repetido para fabricar productos y, al final, conseguir un producto libre de enzima. Actualmente, el costo de preparaciones más puras de enzimas sería prohibitivo si solo se usara una vez. La ventaja de las.

(43) 43. enzimas inmovilizadas es que pueden ser usadas repetidamente, lo que disminuye mucho el costo total.. La mayoría de los alimentos son demasiado complejos, físicamente. La complejidad química no es un problema. Debido a la alta especificidad de las enzimas, un único compuesto como la glucosa, por ejemplo, puede ser seleccionado entre una compleja mezcla, unirse a la glucosa oxidasa y convertirse en producto. Los otros miles de compuestos no cambian.. En un sistema con enzimas inmovilizados es necesario tomar medidas especiales para conseguir que haya contacto entre la enzima y el sustrato. Esto puede realizarse añadiendo la preparación de la enzima inmovilizada y haciéndola circular extensamente o haciendo fluir el alimento por una enzima inmovilizada estática (columna, pared de un tubo recubierto, etc.). La enzima inmovilizada puede usarse durante varios meses.20. 2.7.2.5.1. MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS Las enzimas pueden ser inmovilizadas por diversos métodos: a) Fijación covalente a un material de soporte insoluble como metales, cristal, cerámica, nylon, celulosa, sheparosa o sephadex; b) Inclusión en la matriz de un gel hecho de, por ejemplo, poliacrilamida, sephadex o agar; c) Adsorción a una matriz insoluble por métodos hidrófobos electrostáticos u otros métodos por semejanza no covalente; d) Adsorción a una matriz insoluble y unión posterior a esta por enlaces covalentes; e) Entrelazamiento intermolecular de enzimas para formar una matriz insoluble que se usa en forma granular; f) Unión a membranas semipermeables; y g) Suspensión de partículas insolubles de enzimas en disolventes orgánicos inmiscibles..

(44) 44. 2.7.2.5.2. CRITERIOS USADOS PARA OPTAR POR UN MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN a. Estabilidad de la enzima durante el uso repetido; b. Mantenimiento de la actividad de la enzima después de la inmovilización; c. Estabilidad de la matriz frente a otros enzimas y condiciones como el flujo, la presión y la temperatura; d. Accesibilidad del sustrato a la enzima (difusión del sustrato hacia la enzima y separación de los productos de la enzima); e. Susceptibilidad del enzima a la degradación por el sustrato que se le suministre; f. Eficiencia de la conversión del sustrato en producto; g. Compatibilidad del sistema con los pasos subsiguientes de la conversión y recuperación del producto; h. Necesidad de cofactores; i.. Compatibilidad del enzima puro, de la enzima sin purificar o de las células con la inmovilización;. j.. Susceptibilidad a la contaminación microbiana;. k. Eficacia de la renovación; y l.. Costo.. Idealmente, el sistema de una enzima inmovilizada debería ser reutilizable cientos de veces (de 3 a 6 meses) antes de que se perdiera un 50% de la actividad enzimática.. 2.7.2.5.3. ALGINATOS PARA INMOVILIZAR ENZIMAS El alginato comercial es una sal, la mayoría de las veces la sal sódica, de un ácido poliurónico, el ácido algínico, que se obtiene a partir de algas pardas. El ácido algínico está compuesto de dos unidades monoméricas, ácido β-D-manopiranosilurónico y ácido α-Lgulopiranosilurónico.. Estos dos monómeros se encuentran, bien en regiones homogéneas (compuestas exclusivamente de una unidad o de la otra) o bien en.

(45) 45. regiones en las que están mezclados. Los segmentos que contienen solo unidades de ácido β-D-manopiranosilurónico se les conoce como bloques M, y los que contienen solo unidades de ácido α-Lgulopiranosilurónico, como bloque G.. Figura 12. Unidades G y M de alginatos. Las regiones de bloques M son planas y en forma de cinta, similar a las cadenas de celulosa debido a que el tipo de enlace es siempre ecuatorial-ecuatorial.. Las regiones de bloque G poseen una conformación plegada (corrugada), como resultado de los enlaces de tipo axial-axial.. Figura 13: Bloques G y M de alginatos.

(46) 46. Porcentajes diferentes de los dos tipos de bloques dan lugar a que los alginatos de algas distintas poseen propiedades diferentes. Los alginatos con un elevado contenido en bloques G producen geles muy fuertes.. Figura 14: Formación de gel de alginato de calcio: unidades de ácido gulurónico en solución. Las soluciones de los alginatos sódicos son muy viscosas. La sal cálcica, por su parte, es insoluble. Esta insolubilidad resulta de la reacción autocooperativa entre los iones calcio y las regiones de bloques G de la cadena. Los agujeros formados entre dos cadenas de bloque G constituyen cavidades que ligan iones calcio. El resultado es una zona de unión que da lugar a un ordenamiento conocido como «caja de huevos» en el que los iones de calcio se encuentran fijados en los huecos similares a los de estos recipientes. La fuerza del gel depende del contenido de bloques G en el alginato utilizado y de la concentración de iones calcio.. Las sales de calcio y de amonio producen soluciones viscosas estables en un intervalo de pH de 5 a 10; debido a su naturaleza iónica, estos polímeros se ven afectados por la presencia de sales y por pH inferiores a 5.2. Figura. 15:. Formación. de. redes. de. gel. homopoliméricas unidas a través de iones calcio. con. cadenas.