CONTROL EPIGENÉTICO EN LA DIFERENCIACIÓN OSTEOBLÁSTICA

CONTROL EPIGENÉTICO EN LA DIFERENCIACIÓN

OSTEOBLÁSTICA

Adriana Patricia Rojas Moreno, Msc, PhD.

Línea de Investigación: Citogenética, estructura y función cromosómica Instituto de Genética Humana

Partitura Genoma

Orquesta, etc Epigenoma

EPIGENÉTICA: cambios heredables

en la expresión génica que ocurren en ausencia de modificaciones de la secuencia de ADN.

(Cromatina abierta= eucromatina) (cromatina condensada= heterocromatina)

TRANSCRIPCIÓN: MODO «ON» TRANSCRIPCIÓN: MODO «OFF» Marcas de

activación Marcas de _{represión heterocromatin}Proteínas de a Metilación de CpG Factores de transcripción H3K27me3 H3K9me3 Metilación DNA H3K4me3 H3 Acetilación Modificado de Tejon, 2014

Células que no expresan Runx2/p57

Células que expresan Runx2/p57

Modificaciones covalentes de histonas en el promotor P1

Henríquez., 2009. Tesis Doctoral

Myoblast Myotube Osteoblast HS BMP-2 C2C12 Runx2 WDR5,UTX,JARID1B, Runx2. WDR5,UTX,JARID 1B, MLL2 RT- PCR WB ChIP Runx2-II/p57, Miogenina WDR5,UTX,JARID1B, MLL2 *Análisis de modificaciones en la Histona H3 y H4 (H3K4Me, H3K4Me3, H3K27Me3, H3K9Me3,H3K27Ac.

*Evaluación de proteínas modificadoras de las histonas H3 y H4 asociadas al promotor P1 del gen Runx2

shRNA PCR WB ChIP Runx2-II/p57, miogenina,, Mll2 . • modificaciones covalentes: H3K4me3, H3K27me3..

• *Unión de las enzimas

al promotor P1.

CARACTERIZACION CELULAR

Myoblast Myotube Osteoblast HS BMP-2

C2C12

pc ₄₈h ₇₂h 0 2 4 6 8 10 ** *** R un x2 -II /p 57 A RNm n o rm a li za d o c o n tr a G AP DH BMP2 RESULTADOS pc ₄₈h ₇₂h 0 2 4 6 8 10 HS R un x2 -II /p 57 A RNm n o rm a li za d o c o n tr a G AP DH pc ₄₈h ₇₂h 0 50 100 150 *** *** HS M io g A RN m n o rm a li za d o c o n tr a GA P D H pc ₄₈h ₇₂h 0 50 100 150 BMP2 Mi o g A RN m no rm a li za do c on tra GA P D H Runx2-II/p57 Runx2-II/p57 Myog Myog Runx2 TFIIB 48h 72h 48h 72h HS BMP 2 pC

RESULTADOS

Modelo resumen de resultados de ChIP obtenidos a partir de células C2C12 diferenciadas a osteoblastos mediante el tratamiento con BMP2

C2C12+BMP2

pC

Efecto de shWDR5 en la expresión de Runx2-IIp57 en células C2C12 diferenciadas al linaje osteogénico.

RESULTADOS pC _V.V shW DR5 V.V shW DR5 0 5 10 15 *** 48h 72h R un x 2 -II /p 57 A RN m n o rm a li za d o c o n tra GA P D H BMP2 C2C12+BMP2 WDR5 H3K4Me3 V.V shW DR5 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 *** W d r5 RN A m V.V shWDR5 WDR5 TFIIB 48h 72h V.V ₄₈h 72h 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 shWDR5 *** *** N ive les d e ex p res ió n d e p ro te ín a (u .r .)

ChIP

Análisis de la trimetilación en el residuo de la lisina 4 de la histona H3 en células C2C12 luego del silenciamiento de WDR5.

C2C12+BMP2 0.0 0.5 1.0 1.5 ** % Inpu t *** % Inpu t % Inpu t V.V shWDR5 V.V shWDR5 1.5 1.0 0.5 0.0 IgG WDR5 IgG H3K4Me3 H3K4Me3

C2C12+BMP2 pc _V.V shM LL2 VV SHM LL2 0 10 20 30 40 ** 48h 72h Ru n x2 -I I/p 57 m RNA le v e ls re la ti v e t o G A P D H

Efecto de shMll2 en la expresión de Runx2-IIp57 en células C2C12 diferenciadas al linaje osteogénico.

Mll2 H3K4Me3 VV shM LL2 VV shM LL2 0.0 0.5 1.0 1.5 ** *** 48h 72h M L L 2/ KM T 2B m RNA le ve ls re la ti ve t o G A P DH

Efecto de shUTX en la expresión de Runx2-IIp57 en células C2C12 diferenciadas al linaje osteogénico.

RESULTADOS pc _V.V shUT X V.V shUT X 0 5 10 15 *** 48h 72h R un x 2 -II /p 57 A RN m no rm a li za do c on tr a GA P D H BMP2 C2C12+BMP2 JMJD3/UTX H3K27Me3 V.V shUT X 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 *** UT X A RNm n o rm al iza d o c o n tr a G A PD H POL II UTX E.V sh UTX 48h 72h V.V 48h 72h 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 sh UTX *** ***

ChIP

Análisis de la trimetilación en el residuo de la lisina 27 de la histona H3 en células C2C12 luego del silenciamiento de WDR5.

C2C12+BMP2 H3K27Me3 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 V.V shUTX % Inpu t ***

RESULTADOS UTX / Wdr5 IgG UTX/ Wdr 5 0.00 0.02 0.04 0.06 Inpu t % *** COMPLEJO WDR5/UTX UTX/WDR5 UTX/MLL2

UTX 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 V.V shWDR5 *** % Inpu t H3K27Me3 0.0 0.5 1.0 1.5 *** V.V shWDR5 % Inpu t WDR5 0.0 0.5 1.0 1.5 % Inpu t H3K4Me3 0.0 0.5 1.0 1.5 % Inpu t *** *** V.V shWDR5 V.V shWDR5

Reclutamiento de UTX y trimetilación de la lisina 27 de la histona H3 en células C2C12 estimuladas con BMP2 e infectadas con shWDR5

ChIP

Reclutamiento de WDR5 y trimetilación de la lisina 4 de la histona H3 en células C2C12 estimuladas con BMP2 e infectadas con shUTX

ChIP UTX 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 % Inpu t V.V shUTX H3K27Me3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 % Inpu t *** *** V.V shUTX H3K4Me3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 V.V shUTX *** % Inpu t WDR5 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 V.V shUTX *** % Inpu t C2C12+BMP2

Ezh2 PRMT5 Suz12 NO66 NO66 JARID1B COPR5 H3 K27 K4 H4 R3 me3 me me2

X

H3 K27 K4 H4 R3 me3 WDR5 MLL UTX

Silenciamiento de WDR5 en Osteoblastos primarios. V.V shW DR5 V.V shW DR5 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 2d 4d A WD R 5 m RN A no rm a li za do c on tr a GA P D H *** *** CULTIVO DE OSTEOBLASTOS PRIMARIOS

Silenciamiento de UTX en Osteoblastos primarios. V.V shUT X V.V shUT X 0.0 0.5 1.0 1.5 *** *** 4d 6d UT X m RN A no rm a li za do c on tr a GA P D H CULTIVO DE OSTEOBLASTOS PRIMARIOS

Sobreexpresión de WDR5 en Osteoblastos primarios. TFIIB WDR5 GFP GF P-WDR 5 0 1 2 3 4 N iv el es d e ex p re si ó n d e p ro te ín a (u .r .) GFP GFP-WDR5 2d GFP GF P-WDR 5 GFP GF P-WDR 5 0 10 20 100 200 300 400 *** *** *** 4d 6d W DR 5 m RN A le ve ls re la ti ve to G A P D H GFP GFP-WDR5

Control-GFP

GFP/WDR5

A B C

Figura 59. Sobre-expresión de WDR5 en Cultivo de Osteoblastos primarios. Cultivo de osteoblastos primarios en 40% de confluencia fueron

infectados tal como se describió en la figura 61. 4 días posteriores a la

infección se adquirieron imagenes utilizando un microscopio de

epifluorescencia con un objetivo 40x en campo claro (A) ó fluorescencia para determinar la infección con GFP (B). C. Superposición de A y B.

Sobre-expresión de Wdr5 en Cultivo de Osteoblastos primarios. Cultivo de osteoblastos primarios en 40% de confluencia fueron infectados 4 días posteriores a la infección. Se adquirieron imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia con un objetivo 40X en campo claro ó fluorescencia para determinar la infección con GFP.

CULTIVO DE OSTEOBLASTOS PRIMARIOS

Runx2-II/P57 od 3d 5d 7d 9d 0 20 40 60 R un x2 -II /p 57 A RN m Oc od 3d 5d 7d 9d 0 500 1000 6000 7500 9000 ** *** *** *** *** *** n o rm a li za d o c o n tra GA P D H O c m RN A n o rma li za d o c o n tra GA P D H CULTIVO DE OSTEOBLASTOS PRIMARIOS RESULTADOS Runx2-II/P57 od 3d 5d 7d 9d 0 20 40 60 R un x2 -II /p 57 A RN m Oc od 3d 5d 7d 9d 0 500 1000 6000 7500 9000 ** *** *** *** *** *** n o rm a li za d o c o n tra GA P D H O c m RN A n o rma li za d o c o n tra GA P D H Runx2-II/p57 Oc Runx2-II/P57 TFIIB 0d 3d 5d 8d Runx2-II/P56 **

Silenciamiento de WDR5 en osteoblastos primarios de rata

R un x2 -II /p 57 A RN m no rm a li za do c on tr a GA P D H 2d _V.V shW DR5 V.V shW DR5 0 5 10 15 *** 4d 6d 2d _V.V shW DR5 V.V shW DR5 0 50 100 150 200 250 *** 4d 6d RESULTADOS Runx2-II/p57 Oc

Cross-link

Cell-lysis

Sonication

Inmunoprecipitation

Reverse cross-links and purification of DNA

DNA analysis

Chromatine Inmunoprecipitation. ChIP

Silenciamiento de UTX en osteoblastos primarios de rata

RESULTADOS 2d _V.V shUT X V.V shUT X 0 5 10 15 * *** 4d 6d 2d _V.V shUT X V.V shUT X 0 50 100 150 200 250 *** 4d 6d Runx2-II/p57 _Oc

2d _GFP GF P-WDR 5 GFP GFPW DR5 0 5 10 15 50 100 150 200 250 *** *** 4d 6d 2d GFP GF P-WDR 5 GFP GF P-WDR 5 0 50 100 150 200 250 *** 4d 6d RESULTADOS

Sobre-expresión de WDR5 en Osteoblastos primarios de rata

H3

K27 K4

H4

R3 me3

WDR5

MLL

UTX

CONCLUSIÓN

H3 K27 K4 H4 R3 me JARID1B NO66 NO66 me3 Ezh2 Suz12 me2 PRMT5 COPR5

X

H3 K27 K4 H4 R3 me3 WDR5 MLL UTX

H3

K27 K4

H4

R3 me3

WDR5

MLL

UTX

BMP2 HS pC E.V shJ1 B E.V shJ1 B 0 100 200 300 400 500 48h 72h *** *** M yog m RN A leve ls re la ti ve to G A P D H pC _E.V shJ1 B E.V shJ1 B 0 50 100 300 400 500 48h 72h *** ** M yog m RN A leve ls re la ti ve to G A P D H