CONTROL EPIGENÉTICO EN LA DIFERENCIACIÓN
OSTEOBLÁSTICA
Adriana Patricia Rojas Moreno, Msc, PhD.
Línea de Investigación: Citogenética, estructura y función cromosómica Instituto de Genética Humana
Partitura Genoma
Orquesta, etc Epigenoma
EPIGENÉTICA: cambios heredables
en la expresión génica que ocurren en ausencia de modificaciones de la secuencia de ADN.
(Cromatina abierta= eucromatina) (cromatina condensada= heterocromatina)
TRANSCRIPCIÓN: MODO «ON» TRANSCRIPCIÓN: MODO «OFF» Marcas de
activación Marcas de represión heterocromatinProteínas de a Metilación de CpG Factores de transcripción H3K27me3 H3K9me3 Metilación DNA H3K4me3 H3 Acetilación Modificado de Tejon, 2014
Células que no expresan Runx2/p57
Células que expresan Runx2/p57
Modificaciones covalentes de histonas en el promotor P1
Henríquez., 2009. Tesis Doctoral
Myoblast Myotube Osteoblast HS BMP-2 C2C12 Runx2 WDR5,UTX,JARID1B, Runx2. WDR5,UTX,JARID 1B, MLL2 RT- PCR WB ChIP Runx2-II/p57, Miogenina WDR5,UTX,JARID1B, MLL2 *Análisis de modificaciones en la Histona H3 y H4 (H3K4Me, H3K4Me3, H3K27Me3, H3K9Me3,H3K27Ac.
*Evaluación de proteínas modificadoras de las histonas H3 y H4 asociadas al promotor P1 del gen Runx2
shRNA PCR WB ChIP Runx2-II/p57, miogenina,, Mll2 . • modificaciones covalentes: H3K4me3, H3K27me3..
• *Unión de las enzimas
al promotor P1.
CARACTERIZACION CELULAR
Myoblast Myotube Osteoblast HS BMP-2C2C12
pc 48h 72h 0 2 4 6 8 10 ** *** R un x2 -II /p 57 A RNm n o rm a li za d o c o n tr a G AP DH BMP2 RESULTADOS pc 48h 72h 0 2 4 6 8 10 HS R un x2 -II /p 57 A RNm n o rm a li za d o c o n tr a G AP DH pc 48h 72h 0 50 100 150 *** *** HS M io g A RN m n o rm a li za d o c o n tr a GA P D H pc 48h 72h 0 50 100 150 BMP2 Mi o g A RN m no rm a li za do c on tra GA P D H Runx2-II/p57 Runx2-II/p57 Myog Myog Runx2 TFIIB 48h 72h 48h 72h HS BMP 2 pCRESULTADOS
Modelo resumen de resultados de ChIP obtenidos a partir de células C2C12 diferenciadas a osteoblastos mediante el tratamiento con BMP2
C2C12+BMP2
pC
Efecto de shWDR5 en la expresión de Runx2-IIp57 en células C2C12 diferenciadas al linaje osteogénico.
RESULTADOS pC V.V shW DR5 V.V shW DR5 0 5 10 15 *** 48h 72h R un x 2 -II /p 57 A RN m n o rm a li za d o c o n tra GA P D H BMP2 C2C12+BMP2 WDR5 H3K4Me3 V.V shW DR5 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 *** W d r5 RN A m V.V shWDR5 WDR5 TFIIB 48h 72h V.V 48h 72h 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 shWDR5 *** *** N ive les d e ex p res ió n d e p ro te ín a (u .r .)
ChIP
Análisis de la trimetilación en el residuo de la lisina 4 de la histona H3 en células C2C12 luego del silenciamiento de WDR5.
C2C12+BMP2 0.0 0.5 1.0 1.5 ** % Inpu t *** % Inpu t % Inpu t V.V shWDR5 V.V shWDR5 1.5 1.0 0.5 0.0 IgG WDR5 IgG H3K4Me3 H3K4Me3
C2C12+BMP2 pc V.V shM LL2 VV SHM LL2 0 10 20 30 40 ** 48h 72h Ru n x2 -I I/p 57 m RNA le v e ls re la ti v e t o G A P D H
Efecto de shMll2 en la expresión de Runx2-IIp57 en células C2C12 diferenciadas al linaje osteogénico.
Mll2 H3K4Me3 VV shM LL2 VV shM LL2 0.0 0.5 1.0 1.5 ** *** 48h 72h M L L 2/ KM T 2B m RNA le ve ls re la ti ve t o G A P DH
Efecto de shUTX en la expresión de Runx2-IIp57 en células C2C12 diferenciadas al linaje osteogénico.
RESULTADOS pc V.V shUT X V.V shUT X 0 5 10 15 *** 48h 72h R un x 2 -II /p 57 A RN m no rm a li za do c on tr a GA P D H BMP2 C2C12+BMP2 JMJD3/UTX H3K27Me3 V.V shUT X 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 *** UT X A RNm n o rm al iza d o c o n tr a G A PD H POL II UTX E.V sh UTX 48h 72h V.V 48h 72h 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 sh UTX *** ***
ChIP
Análisis de la trimetilación en el residuo de la lisina 27 de la histona H3 en células C2C12 luego del silenciamiento de WDR5.
C2C12+BMP2 H3K27Me3 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 V.V shUTX % Inpu t ***
RESULTADOS UTX / Wdr5 IgG UTX/ Wdr 5 0.00 0.02 0.04 0.06 Inpu t % *** COMPLEJO WDR5/UTX UTX/WDR5 UTX/MLL2
UTX 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 V.V shWDR5 *** % Inpu t H3K27Me3 0.0 0.5 1.0 1.5 *** V.V shWDR5 % Inpu t WDR5 0.0 0.5 1.0 1.5 % Inpu t H3K4Me3 0.0 0.5 1.0 1.5 % Inpu t *** *** V.V shWDR5 V.V shWDR5
Reclutamiento de UTX y trimetilación de la lisina 27 de la histona H3 en células C2C12 estimuladas con BMP2 e infectadas con shWDR5
ChIP
Reclutamiento de WDR5 y trimetilación de la lisina 4 de la histona H3 en células C2C12 estimuladas con BMP2 e infectadas con shUTX
ChIP UTX 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 % Inpu t V.V shUTX H3K27Me3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 % Inpu t *** *** V.V shUTX H3K4Me3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 V.V shUTX *** % Inpu t WDR5 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 V.V shUTX *** % Inpu t C2C12+BMP2
Ezh2 PRMT5 Suz12 NO66 NO66 JARID1B COPR5 H3 K27 K4 H4 R3 me3 me me2
X
H3 K27 K4 H4 R3 me3 WDR5 MLL UTXSilenciamiento de WDR5 en Osteoblastos primarios. V.V shW DR5 V.V shW DR5 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 2d 4d A WD R 5 m RN A no rm a li za do c on tr a GA P D H *** *** CULTIVO DE OSTEOBLASTOS PRIMARIOS
Silenciamiento de UTX en Osteoblastos primarios. V.V shUT X V.V shUT X 0.0 0.5 1.0 1.5 *** *** 4d 6d UT X m RN A no rm a li za do c on tr a GA P D H CULTIVO DE OSTEOBLASTOS PRIMARIOS
Sobreexpresión de WDR5 en Osteoblastos primarios. TFIIB WDR5 GFP GF P-WDR 5 0 1 2 3 4 N iv el es d e ex p re si ó n d e p ro te ín a (u .r .) GFP GFP-WDR5 2d GFP GF P-WDR 5 GFP GF P-WDR 5 0 10 20 100 200 300 400 *** *** *** 4d 6d W DR 5 m RN A le ve ls re la ti ve to G A P D H GFP GFP-WDR5
Control-GFP
GFP/WDR5
A B C
Figura 59. Sobre-expresión de WDR5 en Cultivo de Osteoblastos primarios. Cultivo de osteoblastos primarios en 40% de confluencia fueron
infectados tal como se describió en la figura 61. 4 días posteriores a la
infección se adquirieron imagenes utilizando un microscopio de
epifluorescencia con un objetivo 40x en campo claro (A) ó fluorescencia para determinar la infección con GFP (B). C. Superposición de A y B.
Sobre-expresión de Wdr5 en Cultivo de Osteoblastos primarios. Cultivo de osteoblastos primarios en 40% de confluencia fueron infectados 4 días posteriores a la infección. Se adquirieron imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia con un objetivo 40X en campo claro ó fluorescencia para determinar la infección con GFP.
CULTIVO DE OSTEOBLASTOS PRIMARIOS
Runx2-II/P57 od 3d 5d 7d 9d 0 20 40 60 R un x2 -II /p 57 A RN m Oc od 3d 5d 7d 9d 0 500 1000 6000 7500 9000 ** *** *** *** *** *** n o rm a li za d o c o n tra GA P D H O c m RN A n o rma li za d o c o n tra GA P D H CULTIVO DE OSTEOBLASTOS PRIMARIOS RESULTADOS Runx2-II/P57 od 3d 5d 7d 9d 0 20 40 60 R un x2 -II /p 57 A RN m Oc od 3d 5d 7d 9d 0 500 1000 6000 7500 9000 ** *** *** *** *** *** n o rm a li za d o c o n tra GA P D H O c m RN A n o rma li za d o c o n tra GA P D H Runx2-II/p57 Oc Runx2-II/P57 TFIIB 0d 3d 5d 8d Runx2-II/P56 **
Silenciamiento de WDR5 en osteoblastos primarios de rata
R un x2 -II /p 57 A RN m no rm a li za do c on tr a GA P D H 2d V.V shW DR5 V.V shW DR5 0 5 10 15 *** 4d 6d 2d V.V shW DR5 V.V shW DR5 0 50 100 150 200 250 *** 4d 6d RESULTADOS Runx2-II/p57 OcCross-link
Cell-lysis
Sonication
Inmunoprecipitation
Reverse cross-links and purification of DNA
DNA analysis
Chromatine Inmunoprecipitation. ChIP
Silenciamiento de UTX en osteoblastos primarios de rata
RESULTADOS 2d V.V shUT X V.V shUT X 0 5 10 15 * *** 4d 6d 2d V.V shUT X V.V shUT X 0 50 100 150 200 250 *** 4d 6d Runx2-II/p57 Oc2d GFP GF P-WDR 5 GFP GFPW DR5 0 5 10 15 50 100 150 200 250 *** *** 4d 6d 2d GFP GF P-WDR 5 GFP GF P-WDR 5 0 50 100 150 200 250 *** 4d 6d RESULTADOS
Sobre-expresión de WDR5 en Osteoblastos primarios de rata
H3
K27 K4H4
R3 me3WDR5
MLLUTX
CONCLUSIÓNH3 K27 K4 H4 R3 me JARID1B NO66 NO66 me3 Ezh2 Suz12 me2 PRMT5 COPR5
X
H3 K27 K4 H4 R3 me3 WDR5 MLL UTX
H3
K27 K4H4
R3 me3WDR5
MLLUTX
BMP2 HS pC E.V shJ1 B E.V shJ1 B 0 100 200 300 400 500 48h 72h *** *** M yog m RN A leve ls re la ti ve to G A P D H pC E.V shJ1 B E.V shJ1 B 0 50 100 300 400 500 48h 72h *** ** M yog m RN A leve ls re la ti ve to G A P D H