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ARTIGO
DE
REVISÃO
Peroxidac
¸ão
lipídica
e
obesidade:
Métodos
para
aferic
¸ão
do
estresse
oxidativo
em
obesos
Bruna
Karoline
Franc
¸a
a,∗,
Maria
Rosa
Melo
Alves
b,
Fernanda
Maria
Silveira
Souto
a,
Larissa
Tiziane
a,
Raquel
Freire
Boaventura
b,
Adriana
Guimarães
be
Antonio
Alves
Jr
a,caDepartamentodeMedicina,UniversidadeFederaldeSergipe(UFS),SãoCristóvão,SE,Brasil bDepartamentodeBiomedicinaUniversidadeTiradentes(UNIT),Aracaju,SE,Brasil
cServic¸odeCirurgiaBariátrica,HospitalUniversitário(HU),UniversidadeFederaldeSergipe(UFS),SãoCristóvão,SE,Brasil
Recebidoa28dejunhode2012;aceitea14deabrilde2013 DisponívelnaInterneta4deoutubrode2013
PALAVRAS-CHAVE Estresseoxidativo; Peroxidac¸ãolipídica; Biomarcadores; Obesidade
Resumo A obesidade é uma doenc¸a cada vez mais comum, cuja prevalência já atinge proporc¸õesepidêmicas,porestarassociadaainúmerasdoenc¸ascrônicastemsidoalvode mui-taspesquisas.Oestresseoxidativo,aferidopelaperoxidac¸ãolipídicanoplasma,éapontado comoalterac¸ãomarcantenaobesidade;sendo,portanto,umdistúrbioquedeveser detalha-damenteestudadoafimdeelucidarpossíveisabordagensparaessacondic¸ão.Oobjetivodesta revisãoéapresentarmétodosquecomprovamoaumentodoestresseoxidativonaobesidadee suainfluêncianascomorbidadesdoobeso.
©2012SociedadePortuguesadeGastrenterologia.PublicadoporElsevierEspaña,S.L.Todosos direitosreservados. KEYWORDS Oxidativestress; Lipidperoxidation; Biomarkers; Obesity
Lipidperoxidationandobesity:Methodstomeasuretheoxidativestressoftheobese paciente’splasma
Abstract Obesityisanincreasinglycommondisease,whichprevalencehasreachedepidemic proportions,andextensiveresearchhasbeendoneinmanyresearchesbecauseofthe associa-tionwithmanyisassociatedwithmanyimportantchronicdiseases.Oxidativestress,measured throughlipidperoxidationinplasma,hasbeenpointedasaremarkablechanginginobesity,and therefore,adisorderthatshouldbethoroughlystudiedinordertoelucidatepossible appro-achestothiscondition.Theobjectiveofthisreviewistopresentmethodswhichconfirmthe increasedoxidativestressinobesityanditsinfluenceonthecomorbiditiesoftheobese. ©2012SociedadePortuguesadeGastrenterologia.PublishedbyElsevierEspaña,S.L.Allrights reserved.
∗Autorparacorrespondência.
Correioeletrónico:bpfranca@yahoo.com.br(B.K.Franc¸a).
0872-8178/$–seefrontmatter©2012SociedadePortuguesadeGastrenterologia.PublicadoporElsevierEspaña,S.L.Todososdireitosreservados.
Introduc
¸ão
Aobesidadeé umadoenc¸aquetemalcanc¸adoproporc¸ões alarmantesem todoo mundoeé umimportantefatorde risco para o desenvolvimento de diversas comorbidades deelevada morbidade e mortalidade como diabetes mel-litus, dislipidemia, aterosclerose, hipertensão arterial, resistênciaàinsulina,esteatosehepática,doenc¸ahepática nãoalcoólicaentreoutras1---5.Nospacientesobesoshá
diver-sosfatoresqueinterferem nasuscetibilidadedoindivíduo à presenc¸a do excesso de lesões oxidativas contribuintes paraascomorbidades.Dentreelessedestacama hipergli-cemia,aatividademuscularaumentada,osníveiselevados delipídiosteciduais,ainflamac¸ãocrônica,asdefesas antio-xidantesinadequadas e a hiperleptinemia. Vários estudos mostram ainda, acúmulo de subprodutos da peroxidac¸ão lipídicanoplasma depacientesobesos6---8,noentanto são
escassosnaliteraturaartigosqueversemsobreos mecanis-mosespecíficosenvolvidosnesseprocesso.
A cirurgia bariátrica tem se mostrada como o método mais efetivo para o tratamento e a profilaxia das complicac¸ões causadas pela obesidade mórbida, já tendo sidobemdemonstradaaeficáciaeaseguranc¸ados procedi-mentoscirúrgicos bariátricos em aumentar a longevidade e a qualidade de vida dos obesos mórbidos. A cirurgia é realizadaparaotratamentodascomorbidadesrelacionadas àobesidade mórbida, sendoa gastroplastia com«bypass»
emYdeRoux,considerado oprocedimentomaisefetivoe recomendadocomopadrãoourodetratamento9.Alguns
tra-balhosdemonstram oimpactodacirurgiabariátrica sobre areduc¸ãodoestresseoxidativonopacienteobeso, melho-randoascomorbidadesadvindasdoexcessoderadicaislivres eperoxidac¸ãolipídicaexistentenaobesidade10.
Devidoàescassezdeartigosquedetalhemos mecanis-mosrelacionados àslesõesoxidativas noindivíduo obeso, esseartigo possui aimportância de apresentar asviasde aumento de estresse oxidativo e sua mensurac¸ão. Assim, talfatopodepermitir arealizac¸ãode pesquisasfuturase adescobertadeintervenc¸õesnessesmecanismosque sabi-damentepredispõemàscomorbidadesdessespacientes.
Estresseoxidativoelipoperoxidac¸ão
A peroxidac¸ão lipídica constitui uma reac¸ão em cadeia dosácidosgordospolinsaturadosdasmembranascelulares, gerandoradicaislivresquealteramapermeabilidade, flui-dez e integridade das mesmas11,12. Esses danoscelulares,
queseencontramaumentadosnosindivíduosobesos, predis-põemàscomorbidadesjácitadas,comohipertensãoarterial sistêmica,dislipidemia,eventostromboembólicos,diabetes mellitus,alémdeneoplasias13---16.
No entanto, a gerac¸ão de radicais livres constitui um processo contínuo e fisiológico. Eles são necessários para quefunc¸õescomo a sinalizac¸ãocelular ea defesacontra micro-organismosocorramde maneiraadequada. Durante osprocessosmetabólicos,essesradicaisatuamcomo medi-adoresparaatransferênciadeeletrõesnasváriasreac¸ões bioquímicas. Porém, a produc¸ão excessiva pode conduzir a lesões oxidativas17. Estes radicais livres, cujo eletrão
desemparelhadoseencontracentrado nosátomos de oxi-gênioounitrogênio sãodenominados espéciesreativasde
Redução tetravalente 4
e-O2 H2O
(O2-, H2O2, OH-) Compostos intermediários
Figura1 Reduc¸ãotetravalentedamoléculadeO2.Formac¸ão de compostos intermediários, espécies reativas ao oxigênio (ROS),comoO2−(ânionsuperóxido),H2O2(peróxidode hidro-gênio),OH−(radicalhidroxila).(Fonte:Franco38).
oxigênio (ERO) e espécies reativas de nitrogênio (ERN), respectivamente18,19(fig.1).
AsERO sãoprodutosinstáveis, decorrentesdareduc¸ão tetravalente sofrida pela molécula de oxigênio, aceita-dora final de eletrões, durante a produc¸ão de energia na etapa de fosforilac¸ão oxidativa20 (fig. 1).As principais
ERO distribuem-se em 2 grupos, os radicalares: hidroxila (HO•),superóxido(O2•−),peroxila(ROO•)ealcoxila(RO•); e os não-radicalares: oxigênio, peróxido de hidrogênio e ácidohipocloroso.DentreasERNincluem-seoóxidonítrico (NO•), óxido nitroso (N2O3), ácido nitroso (HNO2), nitri-tos (NO2−), nitratos (NO3−) e peroxinitritos (ONOO−)21.
Enquanto alguns deles podem ser altamente reativos no organismoatacandoapenaslipídios,outrossãoreativoscom essese comproteínase DNA.Natabela 1estão represen-tadasalgumascaracterísticasdasespéciesradicalaresmais importantes.
A produc¸ão contínua de radicais livres durante os processos metabólicos culminou no desenvolvimento de mecanismos de defesa antioxidante, que têm o objetivo delimitarosníveisintracelularesdetaisespéciesreativas econtrolaraocorrênciadedanosdecorrentes17.
Ainstalac¸ãodoprocessodeestresseoxidativodecorreda existênciadeumdesequilíbrioentrecompostosoxidantese antioxidantes, em favor da gerac¸ão excessiva de radicais livresouemdetrimentodavelocidadederemoc¸ãodesses. Talprocessoconduzàoxidac¸ãodebiomoléculascom conse-quenteperdadesuasfunc¸õesbiológicase/oudesequilíbrio homeostático,cujamanifestac¸ãoéodanooxidativo poten-cialcontracélulasetecidos22.
Osantioxidantes,sejamnaturaisousintéticos,possuem elevadaestabilidadeoxidativaemfunc¸ãodesuaestrutura molecular e, por isso, desempenham papel fundamental na prevenc¸ão daoxidac¸ãoresultantedaac¸ão dosradicais livres23.Ossistemasantioxidantesexistemsobaformade
compostosenzimáticosenãoenzimáticos.Osistema anti-oxidante enzimático incluia superóxido dismutase (SOD), glutationaperoxidase (GSH-PX),glutationaredutase (GSH-Rd)eacatalase(CAT).Estasenzimassãoresponsáveispela remoc¸ãodoâniãosuperóxido(O2·−),hidroperóxidos orgâni-coseperóxidodehidrogênio(H2O2),respectivamente19,24.
Jáosistemaantioxidantenãoenzimáticorelaciona-secom umgrupodeantioxidantesquepodemsercongregadosem compostosproduzidosinvivo,comoéocasodaglutationa, da ubiquinona e do ácido úrico, e em compostos obtidos diretamentedadietataiscomooa-tocoferol(vitamina-E),
-caroteno (pro-vitamina-A),ácidoascórbico(vitamina-C), e compostos fenólicos onde se destacamos flavonoidese
Tabela1 Característicasdasespéciesradiculares
Espéciesreativas Características
Ânion-radicalsuperóxidoO2•--- Geradocontinuamentepordiversosprocessoscelulares.Emsoluc¸ãoaquosaé umforteagenteredutor.Épermeávelamembranaseemfagócitos,como neutrófilosemacrófagos,éumdosmicrobicidasmaisimportantes PeróxidodehidrogênioH2O2 Intermediárioformadopelareac¸ãodedismutac¸ãodeO2---catalisadapela
enzimaSOD,pelareduc¸ãode2e−namoléculadeO2epelaac¸ãodediversas enzimasoxidasesinvivo,localizadasnosperoxissomas.Éumfracoagente oxidanteeumfracoagenteredutor,masproduzdanoscelularesquando produzidosemexcesso
Radicalhidroxila•OH Éomaisreativoemaislesivoradicalconhecidoeparaoqual,umavez formado,oorganismohumanonãodispõedemecanismodedefesa.Écapaz dereagircomumasériedeendobióticos,modificaroDNA,inativarenzimase causardanosaproteínasegerarperoxidac¸ãolipídica.Possui,contudo,âmbito limitadodeac¸ão(poucosdiâmetrosmoleculares)
Radicaisperoxila(RO2•)ealcoxila(RO•) Formadosduranteadecomposic¸ãodeperóxidosorgânicosereac¸ões decarbonoradicalarcomoxigênio,comonaperoxidac¸ãolipídica Oxigêniosinglete1O2* Estadoeletronicamenteexcitadodooxigênio,produzidoporreac¸ões
fotoquímicasouporoutrasradiac¸õesquereagecomumgrandenúmerode moléculasbiológicas,incluindolipídiosdamembrana,iniciandoprocessos deperoxidac¸ão
OzônioO3 Produzidonoaratmosféricopoluídoeporfontesdeluzintensadealgumas fotocopiadoraseoutrosequipamentos.Éextremamentelesivoparaopulmão, oxidandorapidamenteproteínas,DNAelipídios
ÓxidonítricooumonóxidodenitrogênioNO• Sintetizadonosorganismosvivospelaac¸ãodaenzimaóxidonítricosintase (NOS),queconverteoaminoácidoL-argininaaNO•+L-citrulina.Éumradical abundantequeageemváriosprocessosbiológicos,incluindorelaxamento muscular,neurotransmissãoeregulac¸ãoimune.Potentevasodilatador, envolvidonaregulac¸ãodapressãoarterial.Quandoexpostoaoar,reage comoxigênioparaformarNO2•
DióxidodenitrogênioNO2 Potenteiniciadordaperoxidac¸ãolipídicaemfluidosbiológicos
PeroxinitritoONOO--- Instável,tempodevidacurto,oxidantepotente,propriedadessemelhantesao radicalhidroxila,causadanosamuitasmoléculasbiológicasalémdesercapaz deformar•OH
Fonte:Vasconcelosetal.27
poliflavonoides20,26.Natabela2estãorepresentadosos
anti-oxidantesenzimáticoseosantioxidantesnãoenzimáticos O desequilíbrio entre os sistemas antioxidante e pró-oxidante, com predomínio da ac¸ão oxidante e dano consequente,resultanoestresseoxidativo23,25---27.Este
pro-movealterac¸õescomo peroxidac¸ãolipídica,fragmentac¸ão de DNA e oxidac¸ão de diferentes moléculas, levando à mortecelular17.Algunsestudostêmdemonstradométodos
Tabela2 Antioxidantesenzimáticosenãoenzimáticos Antioxidantesenzimáticos Antioxidantesnão
enzimáticos
Glutationaperoxidase Vitaminaslipossolúveis (␣-tocoferol,ß-tocoferol)
Catalase Ácidoascórbico
Metionina-redutase Oligoelementos (Zinco,cobre,selênio,magnésio)
Superóxido-dismutase Flavonoides Fonte:Franco38.
capazes de quantificar os níveis de estresse oxidativo no plasma12,13,15.
Obesidadeeestresseoxidativo
Ospacientesobesoscomumentepossuemumdesequilíbrio entregordura,pesocorporal,lipoproteínaselipídios,oque interferena suscetibilidadedoorganismoalesões oxidati-vas.
Sabe-seque existempelomenos3mecanismosatravés dosquaisaobesidadepodeproduzirperoxidac¸ãolipídica28.
Aobesidadeaumentaanecessidademetabólicado miocár-dio,comoconsequenteaumentodoconsumodeoxigênio. Comisso,aproduc¸ãodeespéciesreativasdeoxigênio(ROS) comoossuperóxidoseosperóxidosdehidrogênioaumenta devidoàmaiorrespirac¸ãomitocondrial.Seaproduc¸ão des-sasespéciesdeoxigênioexcederacapacidadeantioxidante dacélula,oestresseoxidativopodeocorrer,resultandoem peroxidac¸ão lipídica29. O segundo mecanismo através do
quala obesidadepode aumentara peroxidac¸ão lipídica é atravésdalesãocelularprogressivaecumulativadevidoà pressãopelagrande massa corporal.Ainjúriacelular,por
suavez,liberacitocinas como ofatordenecrosetumoral quegeraespéciesreativasdeoxigênio30.Umúltimo
meca-nismopropostoé queatravés deumadieta hiperlipêmica sealtereometabolismodooxigênio,poisasmoléculasdos ácidosgordoscomduplasligac¸õessãovulneráveisareac¸ões oxidativaseconsequentementepodemlevaraperoxidac¸ão lipídica31.
Em crescente discussão na literatura é a hipótese de que a obesidade «per se» causa aumentoda peroxidac¸ão lipídica plasmática e diminuic¸ão das enzimas citoprote-toras eritrocitárias32. O estudo de Olusi (2002), com o
objetivodeconfirmaressahipótese,avaliouaperoxidac¸ão lipídica e a citoprotec¸ão eritrocitária através da medida dasconcentrac¸õesplasmáticasdomalondialdeído(p-MDA) e daatividade dasenzimassuperóxido dismutase (SOD)e glutationaperoxidase(GPX)empacientesobesossemoutras comorbidades. Esse estudo chegou à conclusão que a obesidade, mesmo não associada ao tabagismo, à diabe-tes mellitus, à hipertensão arterial, à hiperlipidemia, a doenc¸asrenaisouhepáticasestárelacionadaaoaumentoda peroxidac¸ãolipídicaeàdiminuic¸ãodaatividadedeenzimas citoprotetoras,edeve,portanto,receberamesmaatenc¸ão queaobesidadeassociadaacomplicac¸ões28.A
consequên-ciadeumabaixaatividade deenzimascitoprotetorasé o danocelularprogressivoquepodelevaraaterosclerose,ao cancroeaoutrasdoenc¸as.
Diversas medidas como intervenc¸ões farmacológicas e cirúrgicas, prática de atividades físicas para reduc¸ão do peso,restric¸ãocalóricaemudanc¸as comportamentaistêm sido propostas para o tratamento da obesidade e con-sequente reduc¸ão do estresse oxidativo. Terapia com antioxidantes,desdequeem doseetempodetratamento adequado,tambémpareceválida.Todasessasintervenc¸ões favorecemaperdadepesoqueseassociaaumareduc¸ãona produc¸ãodeespéciesoxidanteseaumamelhorcapacidade antioxidante,favorecendoumareduc¸ãodosfatoresderisco eumamelhoriadascomorbidades33.
Em crescente destaque encontra-se a cirurgia da obe-sidade,tendoem vista onúmerocrescentedeobesos ea efetividadedastécnicascirúrgicasemmelhoraras comor-bidadesassociadaseemaumentaraqualidadedevida33,34.
Alguns estudos têm sido realizados com intuito de com-provarasmelhoriaspromovidaspelacirurgiabariátricana obesidadeeemsuascomorbidadesdecorrentesdoestresse oxidativo.Estudocompacientesdoservic¸odecirurgia bariá-tricanoHospitalUniversitário daUniversidadeFederalde Sergipe (HU-UFS) submetidos à cirurgia de «bypass» gás-tricoanalisou o perfillipídico dos indivíduos antese após acirurgiabariátrica.Comoresultado,houveumamelhoria apósoprocedimento,sendoamaiorreduc¸ãoconstatadanos níveismédiosdetriglicerídeos(32,0%),alémdeumaumento do colesterol associado à lipoproteína de alta densidade (HDL)33.Outroestudo,realizadonamesmainstituic¸ão,
ava-liouoimpactodacirurgiabariátricasobreoriscodeevento cardiovascularemobesosatravésdoescoredeFramingham, que foi calculado antes e após 6 meses de cirurgia. Os resultadosforamsignificativamente diferentes,sendoque oriscodeFramingham,ocolesteroltotal,oHDLeapressão arterialobtiveramvaloresmelhoresquandocomparadosao pré-operatório,comprovandoqueacirurgiabariátricareduz oriscodeocorrênciadeeventocardiovascularem pacien-tesobesos40.Além destes benefícios, a análiseda fibrose
hepáticaanteseapósacirurgiabariátricaatravésdoNAFLD FibrosisScorecomprovouqueháreduc¸ãonograudefibrose hepáticadospacientessubmetidosàgastroplastia35.
Estudodesenvolvido peloDepartamento deCirurgia da UniversidadeFederal doParanáacompanhou 50pacientes com obesidade mórbida e portadores de doenc¸a hepática não-alcoólica duranteoperíodo de1anoapósterem sido submetidos à gastroplastia com «bypass» em Y de Roux. O trabalho comprovou a melhora significativa da doenc¸a hepática não alcoólica, cuja fisiopatologia envolve o aumentodoestresseoxidativopresentenoobeso10.
Métodos
para
aferic
¸ão
da
peroxidac
¸ão
lipídica
Osestudosacerca daavaliac¸ão doestresseoxidativo vêm adquirindorelevânciasignificativa,poisosmarcadores oxi-dativos desempenham fundamental papel na gênese de enfermidadescrônicasdegenerativas.Assim,são importan-tesferramentasquepossibilitamoplanejamentodeac¸ões eficazesnocontroleeprevenc¸ãodetaisdoenc¸as35.
Atualmente,noentanto,nãohá consensosobrequal o métodomaisútil,maisconfiável,maisacuradoouespecífico para osdiferentestipos dedano oxidativo36.Enquanto os
trabalhos de sistematizac¸ão prosseguem, é útil conhecer osprincipaismarcadoreseosmétodosmaisutilizadospara suaquantificac¸ão.
Adetec¸ãodiretadasEROemsistemasbiológicosé difi-cultadapelassuasconcentrac¸õesextremamentebaixas(da ordemde10−11M)epelassuasaltasvelocidadesdereac¸ão, chegando ao ponto deas taxasde produc¸ão serem iguais àstaxasdereac¸ãocombiomoléculas35.Ossubprodutosdas
EROpodemseraferidosdiretamenteportécnicade resso-nânciaparamagnéticadeeletrões,porémocustoeoutras limitac¸õesdestaavaliac¸ãodificultamseuusoregular38.
Osmétodosmaisutilizadosparaaferic¸ãoindiretadasERO e, consequentemente,daslesõesoxidativassão os espec-trofotométricosecromatométricos,quemedemaatividade enzimática(superóxidodismutase-SOD,catalase, glutati-ona peroxidase - GSH-Pxe glutationa redutase- GSH-Rd) e/ou a concentrac¸ão detripeptídeos (glutationa reduzida - GSH) e aldeídos (malondialdeido - MDA).Estas medidas podemserrealizadasem tecidos,sangue eoutrosfluidos. A lipoperoxidac¸ão de membranas é habitualmente moni-torada pelométododoMDA(malondialdeido)e oestresse oxidativo,pordosagensdeGSSG(formaoxidadada glutati-ona)e/oupelocálculodarazãoGSSG/GSH26.
Essesmétodosbaseiam-senousodebiomarcadoresque, segundoZwartetal.29eLaBaer39,possuemcaracterísticas
passíveis deavaliac¸ãoemensurac¸ão,comoindicadorasde processos biológicos normais, processos patogênicos ou derespostafarmacológicaaumaintervenc¸ãoterapêutica. Comotal,refletiriammudanc¸asemsistemasbiológicos rela-cionadas à exposic¸ão ou aos efeitos de xenobióticos, ou outrostiposdefatores,comoosrelacionadosadoenc¸as.
Osmarcadoresdeperoxidac¸ãolipídicasãoclassificados em primários (os hidroperóxidos lipídicos) e secundários, que derivam da -ruptura dos hidroperóxidos lipídicos. As principais metodologias utilizadas para a avaliac¸ão da lipoperoxidac¸ãooxidativaemsistemasbiológicosmedema formac¸ãodeprodutosgeradosduranteasdiferentesfases deste processo. Portanto, é importante utilizar as várias
Tabela3 Biomarcadoresdedanooxidativoemalgumasdoenc¸ashumanas
Doenc¸as BiomarcadoresdeDano
Câncer;doenc¸acardiovascular;aterosclerose MDA,razãoGSH/GSSG,NO2−Tyr,F2−isoprostano Doenc¸adeAlzheimer MDA,HNE,razãoGSH/GSSG,acrileína,
Doenc¸adeParkinson MDA,HNE,razãoGSH/GSSG,acrileína,isoprostano,proteínas carboniladas,níveldeferro
Diabetesmellitus MDA,razãoGSH/GSSG,proteínasS-glutationadas,F2− isoprostano,NO2−Tyr
Fonte:Vasconcelosetal.27
técnicasdisponíveis,poisasuaescolhadependerádo pro-pósitodoinvestigador,ouseja,dafasedoprocessodeLPO quesepretendaavaliarAtabela3exemplificaalguns bio-marcadoresparadoenc¸asselecionadas39.
Malondialdeido
Omalondialdeido(MDA)éumbiomarcador,produto secun-dário da peroxidac¸ão lipídica, derivado da -ruptura de endociclizac¸ãodeácidosgordos polinsaturados,taiscomo ácidolinoléico,araquidônicoedocosahexaenóico20,40.Eleé
considerado,atualmente,umcandidatopotencialparaser escolhidocomoumbiomarcadorgeraldelesãooxidativaem plasma26,27.
O métodointroduzido porYagi (1976) temsido ampla-mente utilizado. O princípio deste método consiste na reac¸ãodoMDAcomoácidotiobarbitúrico(TBA),formando comoprodutoumcromógenodecorrosafluorescentecapaz deserdetectadoatravésdeleituraespectrofotométricae cuja absorc¸ão ocorre em de 532nm e fluorescênciaem 553nm37,39.
Apesar de sua simplicidade e facilidade de execuc¸ão, o teste do TBA não é específico para o malondialdeido, reagindo com uma ampla variedade de compostos como ac¸úcares,aminoácidos,proteína,aminase bilirrubina.Por este motivo é também denominadoteste das substâncias quereagemcomoácidotiobarbitúrico(Thiobarbituric Acid-ReactiveSubstances---TBARS)35,41.
O testedeTBARS,apesardesabidamenteinespecífico, aindaapresentaamplaaplicac¸ãodevido,especialmente,à suafacilidadedeexecuc¸ãoebaixocustoemcomparac¸ãoaos demaismétodos.Apossibilidadedereac¸ãodoTBAcom subs-tânciasintervenientestemcomoconsequênciasuperestimar aextensãodoprocessodeperoxidac¸ãolipídica,decorrente dadetecc¸ãonãosódomalondialdeido,mastambémde com-postos interferentes. Assim, umaadaptac¸ão relevante de taltécnicaconsisteemassociá-lacomaseparac¸ãodo com-postomalondialdeido-TBA(MDA-TBA),pormeiodetécnicas cromatográficas22,41,42.
Algunsestudosreferemousodométododeavaliac¸ãodo estresseoxidativopeloTBARSemobesos.NoHospital Uni-versitário daUniversidadeFederal de Sergipe, realizou-se estudoemindivíduosobesosem pré-operatóriodecirurgia bariátrica para quantificac¸ão da lipoperoxidac¸ão plasmá-tica utilizando o MDAcomo marcador (técnica de análise daformac¸ãodesubstânciasreativasaTBARS).Nesteestudo, foram analisados22 indivíduos deambos osgêneros, dis-tribuídosem grupoobesidadeecontrole. Comoresultado,
o nível médio de MDA foi estatisticamente superior no grupoobesidade(p=0,04),permitindo inferiraumento da produc¸ãodeespéciesreativasdeoxigênioemaiorestresse oxidativoemobesos6.
Sobreoefeitodadietarestritivaedaperdadepesona gerac¸ãodasERO,outroestudoconcluiuqueaconcentrac¸ão plasmáticadeTBARSdiminuiu87,9±5,8%nogrupoobesona quartasemana dedieta43.Em pesquisa experimentalcom
ratos Cani et al. observaram que os animais tratados com dieta hipercalórica apresentaram concentrac¸ão de TBARS significativamente mais elevada que o grupo controle44.
Detecc¸ãodo4-hidroxinonenal
O 4-hidroxi-2-nonenal (HNE), um aldeído insaturado, é o produtoquantitativamentemaisimportantedadegradac¸ão peroxidativadeácidosgraxosômega641.
Mais recentemente,a quantificac¸ão deHNE noplasma passouaserrealizadacompentafluorobenzil-hidroxilamina paraformaroderivadopentafluorobenziloxima,queé anali-sadoporcromatografiagasosaacopladaàespectrometriade massascomionizac¸ãoquímicanegativa(GC/NICI-MS)usando HNEdeuteradocomopadrãointerno.Nessemétodo,apesar dehaverumaumentosignificativonarecuperac¸ãodeHNE doplasma(60-80versus8%),suaconcentrac¸ãopermanece, ainda,maisbaixadoqueadeoutrosaldeídosmarcadoresde peroxidac¸ãolipídica,devido,provavelmente,àligac¸ãoaos grupossulfidrilaouaminadeproteínas42,45,sendomotivode
crítica.UmproblemaadicionaléqueoHNEpodesergerado durante as fases de armazenamento, extrac¸ão e análise, produzindoresultadoserroneamenteelevados5,12.
Detecc¸ãodosisoprostanos(8-epi-prostaglandina 2␣,8---epi-PGF2␣)
Outrométodo deavaliac¸ãodo estresseoxidativo baseado naoxidac¸ãolipídica,consistenaaferic¸ãodosisoprostanos, compostos derivados da ac¸ão de radicais livres sobre os ácidosgraxospolinsaturados35,46---49.Osisoprostanos
perten-cemàfamíliadoseicosanoides,deorigemnãoenzimática e são produzidos pela oxidac¸ão do ácido araquidônico. Inicialmente,sãoformadosnosfosfolipídiosdamembrana celulare depois liberados para os fluidos biológicos pela fosfolipase37. Ao contrário do que ocorre com os
hidro-peróxidos lipídicos (produtos primários da peroxidac¸ão lipídica), que se decompõem rapidamente nos fluidos e tecidoshumanos,F2-isoprostanossãoprodutossecundários
da peroxidac¸ão lipídica quimicamente estáveis podendo, inclusive,serdosadosnaurina.Essaestabilidadeéarazão pela qual a sua quantificac¸ão desperta interesse, com o aparecimentodemuitosprotocolosparasuaanálise.Além disso, são produtos específicos da peroxidac¸ão lipídica, estando presentes em quantidades detectáveis em todos os fluidos biológicos e tecidos, sua formac¸ão aumenta drasticamente em modelos animais de dano oxidativo44.
Como MDA, ele é, também, considerado um candidato potencialparaserescolhidocomoumbiomarcadorgeralde danooxidativonoplasma.
Entre as técnicas empregadas para detecc¸ão de isoprostanos destacam-se os radioimunoensaios (radioim-munoeassays--- RIA),osimunoensaiosenzimáticos(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay --- ELISA) e as técnicas cromatográficas (separac¸ão) associadas à espectrometria de massa (detecc¸ão) (GC-MS). A aplicac¸ão de técnicas imunológicas,naaferic¸ãode8-iso-PGF2␣temlimitada espe-cificidade,decorrente daspossíveisreac¸õescruzadascom outrosprostanoides. A GC-MS tem boa especificidade, no entanto,consisteemumatécnicaonerosae, consequente-mente,dedifícilexecuc¸ãoemestudospopulacionais20,33,47.
Assim,os métodos radiométricose imunológicos são mais utilizados37,50.
Aaferic¸ãodeisoprostanospodeserrealizadaemfluidos biológicos,soro e plasma sanguíneo e urina, sendoque a utilizac¸ãodeurinatemmaioraplicabilidade.
Hidrocarbonetos:etanoepentano
A quantificac¸ão de compostos voláteis constitui em outra técnica de aferic¸ão da oxidac¸ão lipídica. Entre tais com-postos destacam-se, alémdos isoprostanos e aldeídos, os hidrocarbonetos:etanoepentano.Estes2últimossão for-mados mediante peroxidac¸ão lipídica dos ácidos graxos polinsaturadosdasérieômega3e 6,respectivamente.Os hidrocarbonetossãoosmaisvoláteise dessaformasãoos maisfrequentementeutilizados35,51---53.
Aaferic¸ãobaseia-sena concentrac¸ão de hidrocarbone-tosexaladosnoar expirado.Existe umagrande variedade de técnicas para tal propósito, estas variam em relac¸ão à forma de coleta, armazenamento e processamento das amostras.Comodecorrência desta falta depadronizac¸ão, ocorrerelevantevariac¸ãoentreosresultadosprovenientes dediferentesestudos.Aanálisedasamostras,usualmente, sedápormeiodeGC.Apesardagrandevariedadede téc-nicas, aslimitac¸ões sãocomuns e convergem para o fato dacontaminac¸ãodasamostrascomapresenc¸adeetanoe pentanonoambiente52.
Sugere-se quea aferic¸ão doetano tenha maior viabili-dade em predizer a peroxidac¸ão lipídica, entre ascausas destaca-se o fato do etano ser metabolizado em menor extensãoqueopentano,sermenossolúvelemtecidos, exi-bir menor coeficiente de variac¸ão diária na sua taxa de exalac¸ãoe,ainda,sofrermenorinfluênciadefatores inter-venientesnasuataxadeexalac¸ão53.
Testedoalaranjadodexilenol(xilenol-orange)
Oshidroperóxidos são produtos primários da peroxidac¸ão dos AGPI55, daí a importância da sua medida, uma vez
que a maioria dos métodos avalia seus produtos de degradac¸ão.Umdosmétodosutilizadosparasedeterminar a concentrac¸ão dehidroperóxidos em amostrasbiológicas éaquelequeutilizaoxilenol-orange.Estemétodo baseia-se no princípio de que os hidroperóxidos oxidam ferro II a ferroIII, o qualreage como xilenol orange, produzindo umcromóforoque temabsorc¸ãomáximaem 560nm55.Os
resultadossãorelativamentereprodutíveiseométodopode serusadoparaa determinac¸ão dehidroperóxidosem fase aquosa e lipídica56. É um método simples,que não exige
equipamentossofisticados,poréméinespecífico,poispode sofrer interferências de diversas substâncias presentes no plasmasanguíneo.
Cromatografialíquidadealtaeficiência comdetecc¸ãoporquimiluminescência
O método de CLAE com detecc¸ão por quimiluminescên-cia tem sido bastante utilizado na mensurac¸ão específica de hidroperóxidos lipídicos54,56,57,45,58,59. Utilizando este
método é possível a quantificac¸ão de hidroperóxidos pre-sentesemamostrasbiológicas,seminterferênciasdeoutras biomoléculas.
Esse método tem demostrado alta sensibilidade, podendo-se detectar níveis abaixo de 10nmol/L, dependendodaqualidadedodetector.
Cromatografialíquidadealtaeficiênciaacoplada àespectrometriademassas
Ousodatécnicadecromatografialíquidaacopladaà espec-trometriademassas(CLAE-EM)paraaanálisedeamostras biológicas é recente, tendohavido importante avanc¸o na últimadécada.
Umadasvantagensmaisimportantesdestatécnicaé per-mitiraseparac¸ão,quantificac¸ãoeelucidac¸ãoestruturaldas substânciaspresentesnaamostra,demaneiracontínua,sem anecessidadedepurificac¸ãoouderivatizac¸ãoprévias, per-mitindoanálisemuitomaisrápidaeeficiente.Outroponto importanteéapossibilidadedeseanalisarsubstânciasnão voláteisoutermolábeis,oqueseriadifícilemoutras técni-cascomoacromatografiagasosaacopladaàespectrometria demassas60.
AtécnicadeCLAE-EMtemsidoutilizadaemdiversos tra-balhosnaanálisedederivadoslipídicoseseusprodutosde oxidac¸ão60---65 erepresentao quehá demaisavanc¸adoem
técnicasdedetecc¸ãoecaracterizac¸ãoqualitativae quanti-tativadebiomoléculasemmatrizesbiológicas.Alémdisso, osresultadosobtidosporestatécnicaapresentamelevadas especificidadeesensibilidade.
Dosagemdeácidoshidroxieicosatetranóicos
Os ácidos hidroxieicosatetranóicos são derivados da oxidac¸ão do ácido aracdônico e os ácidos hidroxiocta-decanóicos (HODE), resultantes da oxidac¸ão do ácido linoléico66.
Estescompostosjáforamencontradosaderidosàplaca ateroscleróticaecogita-sequesuapresenc¸aestáassociada aplacasinstáveisesujeitasàruptura67.
Apresenc¸adestescompostospodeserdeterminada,após aextrac¸ãodafrac¸ãolipídicadomaterialaseranalisado,por técnicasdecromatografialíquidadealtaeficiência(CLAE).
Conclusão
Aobesidadetemprevalênciamundialcrescenteeaanálise defatoresqueparticipamnafisiopatologiadas comorbida-des temelevada importância. Nesse sentido,o estudo do estresseoxidativo nos obesostem papel fundamental.Tal atitudepodebalizarmedidasfuturasparapreveniro surgi-mentodessasdoenc¸as,bemcomocolaborarnotratamento.
Conflito
de
interesses
Osautoresdeclaramnãohaverconflitodeinteresses.
Agradecimentos
Agradecemos ao Instituto de Tecnologia e Pesquisa (ITP) daUniversidade Tiradentes (UNIT)e ao Departamento de Nutric¸ãodaUniversidadeFederaldeSergipepeloapoiopara desenvolvimentodessalinhadepesquisaacercadaaferic¸ão ecomprovac¸ãodoselevadosníveisdeestresseoxidativona obesidade.
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