• No se han encontrado resultados

El papel de la microscopía electrónica en el diagnóstico virológico 1. Virus del grupo Herpes

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2020

Share "El papel de la microscopía electrónica en el diagnóstico virológico 1. Virus del grupo Herpes"

Copied!
8
0
0

Texto completo

(1)

Vol. 2, No. 1

-

1982

REVISIONES

EL PAPEL DE LA MlCROSCOPlA ELECTRONICA

EN

EL

DIAGNOSTICO VIROLOGICO

1 . VIRUS

DEL

GRUPO HERPES.

HENRY HANSSEN,* GONZALO URBE,** GENARINA ESCOVAR.**'

INTRODUCCION

La aplicación rutinaria de l a microscopía electrónica e n los laboratorios de virologia y patología clínica s e h a convertido e n un método de primera línea p a r a el diagnóstico de enfermedades ocasionadas por virus. Cada vez s e siente más la necesidad de utilizar esta elaborada pieza de equipo costoso e n el diagnóstico virológico. Es nuestra intención e n este artículo, t r a t a r de definir el papel del microscopio electrónico como a r m a eficiente e n el diagnóstico de importantes infecciones virales humanas. Para alcanzar este propósito s e r á sustentado fundamentalmente por la experiencia de los autores y por una cuidadosa revisión de los avances más recientes e n este tema.

TIPOS DE MICROSCOPIOS

El microscopio electrónico de transmisión, con frecuencia descrito como "Microscopio Invertido'' por lo que h a c e referencia con la posición de sus lentes y por contraposición a l microscopio de luz d e tipo corriente. Consiste

esencialmente e n u n filamento d e tungsteno e n forma d e "V" que a l recibir alto voltaje emite electrones a través d e u n a columna metálica aislada y a l vacío; l a fuente de electrones e s orientada a lo largo d e la columna, por u n a serie d e lentes electromag- néticos, p a r a que incida directamente sobre el espécimen que s e examina, permitiendo l a formación de s u imagen, l a c u a l s e proyecta sobre una pantalla fluorescente. El equipo requiere que el alto voltaje y la corriente eléctrica s e a n muy estables: el perfecciona- miento del sistema aumenta en forma direc- tamente proporcional el costo del a p a r a t o .

El microscopio electrónico de r a s t r e o [Scanning) tiene e n s u funcionamiento un parecido con u n televisor. Esencialmente requiere e l mismo tipo de fuente de electro- nes del microscopio de transmisión, l a cual, una vez enfocada sobre determinada á r e a del espécimen, s e permite que r e c o r r a , rastree o b a r r a dicha á r e a e n l a p r e p a r a - ción. El barrido se logra mediante la interac- ción d e u n a serie de alambres electromagné- ticos. El resultado e s una imagen aumentada

* P r o f e s o r A s o c i a d o , D e p a r t a m e n t o d e M i c r o b i o l o g í a y P a r a i t o l o g i a , S e c c i ó n V i r o l o g í a , F a c u l t a d d e M e d i c i n a , U n i v e r s i d a d d e A n t i o q u i a . M e d e l l i n , C o l o m b i a .

A c t u a l m e n t e e n e n t r e n a m i e n t o : D e p a r t m e n t o f V i r o l o g y , B a y l o r C o l l e g e o f M e d i c i n e , T e x a s M e d i c a l C e n t e r , H o u s t o n T e n a s , 7 7 0 3 0 , U . S . A .

* ' P r o f e s o r A s i s t e n t e . O e p a r t m e n t o f P a t h o l o g y , B a y l o r C o l l e g e o f M e d i c i n e , T e n a s M e d i f a l C e n t e r a n d

S t a f f P a t h o l o g i s f V e t e r a n s A d m i n i s t r a t i o n H o s p i t a l , M e d i c a l C e n t e r , H o u s t o n T e x a s , 7 7 2 1 1 , U . S . A . - * * P r o f e s o r a A s i s t e n t e , D e p a r t a m e n t o d e M o r f o l o g i a , F a c u l t a d d e M e d i c i n a . U n i v e r s i d a d d e A n t i o q u i a ,

M e d e l l í n , C o l o m b i a .

A c t u a l m e n t e e n e n t r e n a m i e n t o : D e p a r t a m e n t o f P n t h o l o g y , M . D . A n d e r r o n H o s p i t a l a n d T u m o r K e - s e a r i h I n s t i t u t e , T e x a s M e d i c a l C e n t e r , H o u i t o n T e x a s , 7 7 0 3 0 , U . S . A .

(2)

HENRY HANSSEN. GONZALO URIBE. GENARINA ESCOVAR

del objeto o á r e a r a s t r e a d a . proyectada electrónico. El procedimiento del examen también sobre u n a pantalla. directo d e especímenes fluídos puede s e r

rece di do Dor la centrifueación lenta d e l a

EXAMEN DIRECTO DE ESPECIMENES muestra, con el fin d e eliminar el material pesado contaminante. como bacterias y Una d e l a s m á s i m ~ o r t a n t e s v 2 rimer ras - - - detritos celulares.

aplicaciones diagnósticas del microscopio electrónico e n cuanto a l a visualización d e partículas virales h a sido l a detección d e viriones e n fluído vesicular o material pustuloso obtenido de pacientes con viruela o con varicela-zoster. (1

-

8). En años recientes el microscopio electrónico h a sido usado con frecuencia e n la búsqueda de rotavirus e n preparaciones de materias fecales de pacientes con gastroenteritis vira1 (9

-

12). También h a sido posible demostrar partículas virales de tipo Herpes e n el líquido cefalo-raquídeo de pacientes con encefalitis herpética y de pacientes con herpes zoster (13). Adicionalmente s e h a utilizado p a r a visualizar virus de las paperas en casos de encefalitis (14) y virus respira- torios en secreciones nasofaríngeas. Final- mente no se debe dejar d e mencionar la g r a n utilidad que h a prestado esta poderosa arma diagnóstica en el hallazgo oportuno de citomegalovirus e n la orina de infantes con

Mediante este procedimiento e s relativa- mente simple detectar e n heces d e pacientes con diarrea: Rotavirus, Enterovirus, Astrovi- rus, Calicivirus y Coronavirus. La técnica h a sido particularmente útil p a r a realizar un diagnóstico rápido e n fluído vesicular d e un gran número d e pacientes inmunosuprimi- dos, bien s e a por problemas patológicos directos, como leucemias o linfomas, por situaciones iatrogénicas como transplantes de órganos o por situaciones d e terapia anti- cancerosa intensiva. Usualmente l a s lesiones vesiculares son c a u s a d a s por virus Herpes simplex y virus d e Varicela-Zoster (Figura 1). El diagnóstico oportuno de la c a u s a d e estas lesiones permite u n a pronta terapia específica mediante compuestos antivirales o la iniciación d e un tratamiento con gamaglobulina hiperinmune p a r a virus d e Herpes-Zoster e n los pacientes afectados O

e n contactos inmunodeficientes.

infección congénita y e n pacientes inmuno- Cuando se estudian tejidos, de biopsias o suprimidos. (15 - 17). de autopsias, usualmente los especímenes s e

El procedimiento de tinción directa de especímenes fluídos p a r a l a microscopía electrónica, consiste esencialmente en depo- sitar una gota d e la muestra que s e va a examinar sobre u n a superficie de cera previamente p r e p a r a d a e n una caja de Petri; sobre este espécimen s e coloca una rejilla de cobre p a r a microscopía cubierta previamen- te con una fina película de colodión a la cual se le h a evaporado carbón e n s u superficie. La rejilla e n t r a e n contacto directo con el espécimen; después d e 1 5 minutos d e incu- hación a temperatura ambiente y previnien- do la hidratación de la preparación con hidróxido de sodio sólido como agente adsorbente, s e remueve la rejilla y se sumerge cuidadosamente en agua destilada estéril. A continuación s e coloca la rejilla sobre una gota de ácido fosfotúngstico a l 2% d u r a n t e 15 minutos y s e lava nuevamente en agua destilada p a r a remover el exceso de ácido fostotúngstico. Queda así p r e p a r a d a la muestra p a r a s u estudio en el microscopio

cortan e n forma d e cubos de 1 milímetro d e lado y s e colocan sobre una placa metálica p a r a facilitar el procedimien- to que sigue, de congelación y descongela- ción y microtomía. Los cortes se montan sobre una rejilla p a r a microscopía electró- nica y se colorean con u n a gota de fosfo- tungstato d e sodio a l 2%: el exceso de colorante se remueve con papel d e filtro. Usando e s t e procedimiento h a sido posible detectar virus d e Herpes simplex e n hiopsias de tejido cerebral de pacientes con encefali- tis herpética, permitiendo un tratamiento oportuno. El diagnóstico puede h a c e r s e e n cuestión de minutos después d e haberse recibido el material de tejido cerebral.

PROCEDIMIENTOS PARA INCREMENTAR LA CAPACIDAD DE VISUALIZACION DE VIRUS POR MICROSCOPIA ELECTRONICA

El examen fructífero de especímenes clínicos mediante microscopía electrónica está limitado por la concentración de p a r -

(3)

tículas virales en l a preparación. Se estima que se requieren alrededor de

l o h

a 109 partículas virales por mililitro de muestra (18) p a r a que una persona con experiencia en microscopía electrónica pueda visualizar las partículas virales e n una preparación.

El hecho de necesitarse altas couceutra- ciones d e partículas virales, no obstante s e r limitante, h a contribuido a l desarrollo de varios procedimientos de concentración: la pseudo-réplica y la ultraceutrifugación.

Esta técnica fue creada por Sbarp (19) e n 1958 y modificada por Smith y Melnick (20). El procedimiento h a sido ampliamente usado para concentrar Rotavirus e n muestras de heces (21, 22). La ilustración esquemática de este procedimiento a p a r e c e e n la figura 2. El espécimen que se va a examinar s e coloca e n la p a r t e superior de un bloque de agarosa a l 2% y s e deja difundir la fase fluida a través del gel hasta permitir la concentración de las partículas virales e n la superficie. En seguida se vierte sobre la superficie una gota de colodion a l 0,5% y, una vez formada la película, se sumerge el bloque e n una solución acuosa al 0,5% de acetato de uranilo; la película se desprende entonces del bloque y s e recoge e n una rejilla p a r a microscopía electrónica. la cual s e fija sobre un pequeño soporte d e fibra de vidrio. Finalmente se colorea el espécimen con ácido fosfotúngstico a l 2%.

Ultrocentrifugación

Existen dos procedimientos de ultracentri- fugación los cuales son aplicables e n el diagnóstico virológico por microscopía elec- trónica. El primero de estos procedimientos se basa en la propiedad que tienen las particulas virales de flotar e n sales de cesio. La técnica consiste en someter la muestra que s e va a examinar a un gradiente d e flotación por ultracentrifugación en sales de sulfato de cesio. Antes d e la preparación del gradiente s e requiere homogeneizar la muestra y centrifugarla a baja velocidad utlizando una centrífuga de tipo corriente; 2.000 revoluciones por minuto durante 10 minutos son generalmente suficientes p a r a

obtener u n sobrenadante libre de bacterias y detritos. Después d e e s t a centrifugación s e ajusta el índice d e refracción del sobrena- dante mediante la adición d e s a l sólida d e cesio y s e procede a la ultracentrifugación. El índice de refracción deseado y por consiguiente el tipo de gradiente requerido depende de la densidad de l a s partículas virales que s e desean detectar. En el caso de virus con envoltura de lípidos s e prefiere p r e p a r a r un gradiente de sucrosa p a r a concentrarlos según s u tamaño y s u coefi- ciente de sedimentación. Lógicamente l a s particulas s e sedimentarán d e acuerdo con l a s concentraciones d e sucrosa y el tiempo de ceutrifugación utilizados. P a r a el caso de virus desnudos (sin envoltura lipídica), son suficientes 35.000 r.p.m. d u r a n t e 1 8 h o r a s p a r a alcanzar el equilibrio por flotación. Cuando se utilizan los gradientes d e sucrosa, el tiempo de centrifugación depende de la concentración de sucrosa e n el gradiente.

En este procedimiento d e ultracentrifuga- ción se utilizan generalmente tubos d e nitrocelulosa, de 2 pulgadas d e largo por media pulgada de diámetro, adaptables a un rotor de titanio tipo SW (50.1).

Los virus quedan contenidos e n l a s b a n d a s que origina el gradiente las cuales s e observan mediante trans-iluminación del tubo de centrífuga sobre un fondo dscuro o negro. Una vez localizada las posiciones d e las bandas s e obtiene el material p a r a estudio mediante perforación l a t e r a l del tubo y aspiración con una jeringa d e tipo tuberculina con aguja calibre 26. El material así obtenido se deposita sobre una rejilla p a r a microscopía previamente cubierta con película de colodión y contrastada con carbón evaporado y se tiñe con alguno de los colorantes utilizados en microscopia elec- trónica, generalmente ácido fosfotúngstico al Z0Io. Un aumento de 12.000 diámetros e s apropiado p a r a realizar el estudio de locali- zación de l a s partículas virales.

Recientemente se describió el procedi- miento de centrifugación mediante fuerza ultracentrifuga producida por a i r e a presión, que requiere una centrífuga llamada "air- fuge" (fuga de aire), cuyo principio e s similar a l de los motores de los aviones de

(4)
(5)

e

FIGURA

7

A

Partículas de virus de H e r p e s s i m p l e x en una célula epitelial de una biopsia del labio inferior de la boca de u n paciente con leucemia. Obsérvese el acumulo de

partículas virales redondeadas, con u n centro o nucleoide electrodenso ( 4).

Se aprecia también en las partículas la presencia de doble envoltura característica de las partículas virales maduras del virus del grupo Herpes. (

>

1. 3 7 5 0 0 X.

B

Partículas inmaduras de virus de H e r p e s s i m p l e x en una célula de cultivo de tejidos (células VERO). Nótese la presencia de u n nucleoide electrodenso (-t ) rodea- d o de una sola capa o envoltura de Iípidos (

>

). A diferencia de las partículas maduras se observa u n espacio electro-lúcido prominente separando al nucleoide de la envoltura. Nótese que hay numerosas partículas sin nucleoide. 37.500 X.

C

Partículas de virus de H e r p e s s i m p l e x parcialmente purificadas mediante u n gra- diente homogéneo de sucrosa al 1 0 010. E n esta figura se observan los capsómeros característicos de la cápside de este virus. Nótese la presencia de capsómeros

huecos, (

-

b ). L a apariencia moriológica de las partículas es exagonal de- l i n e a n d o la estructura icosahédrica de este virus. Tinción negativa con áci- do fosfotúngstico al 2 010, 142.000 X.

D

Partículas de virus H e r p e s s i m p l e x detectadas en l í q u i d o vesicular, de una lesión bucal de u n paciente con Herpes recidivante. Nótese la presencia de partículas completas con envoltura de Iípidos (

+

). Se ven también los capsómeros huecos y una partícula viral desnuda, la cual presenta una estructura icosahédrica característica. í t 1. Hay fragmentos de partículas virales. ( D 1. T i n - ción negativa con ácido fosfotúngstico al 2 010, 132.000 X.

(6)

H E N R Y ;+AWSSEN. GONZALO URIBE. G E N A R l N A ESCGVAR

E S P E C I Y E N C O L O D I O N

C O L O D I O N

V I R U S

- A G A R

-

A G A R

S O L U C I O N C O L O R A N T E A C E T A T O D E U R A N I L O

P I N Z A S A C I D O

SOPORTE-^^^,

F O S F O - m

i l ? '

-

.- - - J ,

R E J I L L A

-

P R O C E O I Y I E N T O D E P S E U D O R E P L I C A P A R A L A C O N C E N T R A C I O N Y C O L O R A C I O N

D E E S P E C I Y E N S P A R A Y l C R O S C O P l A E L E C T R O N I C A

turbo-reacción. Los elementos fundamenta- les de este novedoso procedimiento (Figura 3), están constituidos por el rotor, los sellos o tapas de éste y los tubos de nitrocelulosa. especialmente adaptables a l rotor. Los tubos tienen por lo general u n a capacidad p a r a alojar como máximo 240 microlitros. La velocidad que desarrolla el rotor puede llegar hasta 178.000 g ó 95.000 r.p.m. Esta ventaja tecnológica h a resultado muy útil para detectar en muestras clínicas cualquier tipo de virus, especialmente los virus desnu- dos, sin que s e altere sustancialmente s u morfología. El procedimiento incrementa, entre 1,000 y 10.000 veces, sobre el método directo, la posibilidad d e detectar virus e n las muestras. Se h a n podido detectar partí- culas virales en concentraciones t a n bajas como 104/mililitro. Conviene anotar que, antes de proceder con la ultracentrifuga- ción, s e debe someter el espécimen a una centrifugación a baja velocidad, como se indicó antes.

VIRUS DEL GRUPO HERPES. FAMILIA NERPETOVIRIDAE

Los virus herpes son un grupo heterogéneo (23). que se identifican por s u e s t r u c t u r a , la cual consiste esencialmente e n una p a r t e central densa, o nucleoide, rodeada por una cápside icosahédrica compuesta por 162 capsómeros huecos, organizados e n u n a simetría axial de 5:3:2. La cápside está rodeada por una membrana o envoltura lipídica que contiene proteínas virales espe- cíficas. El DNA d e estos virus e s de doble hélice. Los varios tipos d e este grupo se diferencian considerablemente, por s u tamaño (50 a 135 X 106 daltones de peso molecular), por s u contenido de citosina y guanina (44 a 74010) y por s u complejidad estructural. El DNA de los virus herpes e s suficiente p a r a codificar de 80 a 100 proteínas; de las cuales h a n sido aisladas 50. Por lo menos 30 de estas pueden s e r estructurales de la partícula viral, mientras

(7)

que otras pueden s e r enzimas inducidas por los virus, como la timidinakinasa (TK), la DNA polimerasa y algunas DNA-asas.

Los virus herpes son notables por s u habilidad p a r a establecer infecciones laten- tes y persistentes. Las infecciones latentes pueden permanecer durante toda la vida de los huéspedes, a ú n e n presencia de anti- cuerpos circulantes. Especial interés s e h a

generado e n el estudio de este grupo de virus por l a asociación del virus d e Epstein-Barr con el Linfoma d e Burkitt y el Carcinoma Nasofaringeo y por el papel d e los virus herpes genitales [Herpes simplex tipo 2) e n el cáncer del cuello uterino. Varios virus herpes de simios h a n mostrado s e r oncogé- nicos en infecciones experimentales de algunas especies animales. Las infecciones por especies heterólogas de virus herpes son, en la mayoría de los casos, muy serias; ejemplos de este fenómeno son: La infección fatal del hombre por uno de los h e r p e s virus simianos, el llamado virus B y la infección del ganado por el virus d e la pseudorrabia de los cerdos.

Las enfermedades humanas incluyen el herpes oral y el genital. l a Varicela-Zoster. la enfermedad d e inclusión citomegálica y la mononucleosis infecciosa. Son numerosos los miembros d e la familia herpetoviridae. Sin embargo, hasta la fecha solo s e h a recono- cido formalmente un género, Herpesvirus. del cual el virus Herpes simplexes la especie "Tipo". La clasificación de los Herpesvirus en subgrupos A y B, b a s a d a e n el hecho d e que los virus s e pudieran encontrar libres o asociados a la célula, solo tuvo validez y utilidad antes del advenimiento d e la virolo- gía molecular.

1 . A l m e i d a J D , e t a l . M o r p h o l o g y o1 v a r i c e l a I c h i c k e n D o x I v i r u s V i r ~ l o g y 1 9 6 2 ; l b : 353.

2 . c r u i c k r h a n k J G , e t a l . E l e c t r a n r n i c r o i c o p y i n t h e r a p i d d i d ~ n o s i s o f s m a l I p 0 X . L a n c e ! 1 9 6 6 . 2 1 2 7 .

3. E v a n i A S , M e l n i c k J L . E l e c t r o n m i c r o i c o p e i t u d i e s o1

f r e v e r i c l e a n d s p i n a l f u i d s f r o m a r a s e of h e r p e s z o s t e r . P r o c . S O C . E X P . B i o l M e d 1 9 4 9 ; 7 1 ' 2 8 3 .

4 . ~ l e w e f f T H . s o m e r e c e n t c o n t r i b u t i o n s i o i r n e e c t r a n r n i c r ~ s c o p e i a b ~ r a t ~ r i e s . B r i t . M e d . J . 1 9 7 2 . 1 : 6 6 7 . 5 . ~ a g i n g t o n J . ~ t e c t r o n ~ i c r o c a p y in d f f e r e n t i a l d i a g n o s i s

O' pOXYirUS i n f e ' t i o n i . B l i t . M e d . J . , 9 6 4 , Z 1497. 6 . ~ a g l e r F P O , ~ a k e G . he u s e a i t h e e l e c t r o " r n i c r o r c o p e

in d i a g n o s i s o f v a r i o l a . v a c c i n i a ñ n d v a r i c e l l a . J . B a c t . 1948; 55: 45.

Figura 3. A. ~ttracentrifuga tipo "fuga de aire"

,

s m i t h

K O , M e l n i c k

,

R e c o g n i t i o n q v a n t i t a f i o n o +

(air fuge), ( A ) ; con sus rotores y el tubo de nitro- h e r p e r v i r u s p a r t i c l e s i n h u m a n v a s i c u i a r ~ e s i o n i . s c i e n c e

(8)

HENRY HANSSEN. GONZALO URIBE. GENARINA ESCOVAR

8. Van Rooyen C E. Scott G D. Smallpox diagnosis w i t n especial referente ta e l e c t r o n m i c r a r c o p y . c a n . J . ~ u b l i c H e a l t h . 19d8; 39:467.

9. Bishop R F. et a l . Oefecfion o t a new v i r u r by e l e c t r o n

m i c r o s c o p y a l taecal e x t r a c t r t r o m c h i l d r e n w i t h acute g a r t r o e n t e i i t i r . ~ a n c e t 7974; 1:ir9,

10. F l e w e f t T H, et al. v i r u s p a r t i c l e s in g a r t r o e n t e i i t i r .

L a n c e t 1973; 2: , 4 9 7 .

1 1 . K a p i k i a n A z et al. ~ e o v i r u r ~ l i k e agenf i n 11001s: A r r o c i a t i o n w i t n i n f a n f i l e d i a r r h e a and d e v e ~ p m e n t of

s e r o l o g i c t e s t . science 1974; 1 8 5 : 10dP.

12. Midaleton, P J . et a l . O r b i v i r u r a c u t e g a s t r o e n t e r i t i r o, i n f a n c y . L a n c e f 1974; 1: 1241.

13. D D a n e F W . l d e n f i f i c a t i o n o1 v i r u r by irnmunoelectron

m i c r o ~ c ~ p y . l n : v i r a 1 I m m u n o d i a g n o r i r . 1974; 237. Academic P r e r s , ~ e ~ o r k . w

1 4 . D D a n e F W , et a l . R a p i d l a b o i a t o r y diagnosis a l

p a r a m y x o v i r u s i n f e c t i o n r by e l e c t r a n m i c r o r c o p y ~ a n r e f

1 9 6 7 ; 2: 751.

15. H e n i y C. e f a l . O e f e c t i o n of v i r u r i a i n c y t o r n e g a l o v i r u r - infected i n f a n t r b y e i e c t r a n m i c r o r c o p y . A m J . Cli".

P a t h O l . 1978; 69: 435.

16. ~ e e F K , e f a l . ~ a p i d diagnosis o t c y f o m e r a l o v i r u r infection in i n t a n t r by electron m i c r o s c a p y . N . ~ o g l . J .

M e d . 1978; 299: 1266.

1 7 . ~ o n t p l a i ~ i s s. et al. ~ l e c t r o n m i c r o s c o p y i n f h e r a p i d diagnOIiLOf c y f o m e g a l o v i r u r : U l t r a r t r u r t u r a l o b r e i v a t i o n and c o m p a r i s o n of m e t h o d r of diagnosis. J . l n f e c t . D i r .

1972; 125: 533.

1 8 . ~ o a n e F W . e f al. n p p l i c a t i o n o f electron m i c r o r c o p y t o

the diagnosis o f v i r u r i n f e c t i o n i . c a n ~ e d . A r r a c . J . 1969; 100: 1043.

1 9 . s m i f h K O, ~ e l n i c k J L . A m e t h o d f o r r t a i n i n g v i r u s

p a r t i c l e s and i n d e n t i t y i n g t h e i i nucleic acid t y p e i n the electron m i c r o r c o p e . V i r o l o g y 1 9 6 2 ; 1 7 : 480.

20. ~ a r t i n M L. et a l . u l t r a s t r u c t u r e o f i n f a n t i l e g a r t r o e n t e ~ r i t i P v i r u s . VirOlOgy 1 9 7 5 ; 68: 146.

2 1 . ~ i e w e t t T H . ~ o x a l l E. he h u n t for v i r u r e r in i n f e c t i o n r

O f f h . 2 a l i m e n t a r " r y r t e m : A " i m m u n o e l e c t r o n m i c r o r c o ~ pica1 approach. Clin. G a r f r o e n f e r o l . 1976; 5 : 359.

22. K a p i k i a n A L. et al. V i s u a l i z a t i o n by i m m u n e electro" m i ~ r o s ~ o p y of a 27-nm p a r t i c l e a r i o i i a t e d w i t h a c u t e

i n f e c t i o ~ ~ nonbacteria1 g a r f r o e n t e r i ~ i s . J . V i r o 1 1972; 10: 1075.

23. K a p l a n A S. ( e d l : The Herpesviruses. New Y o r k ,

Referencias

Documento similar

Cedulario se inicia a mediados del siglo XVIL, por sus propias cédulas puede advertirse que no estaba totalmente conquistada la Nueva Gali- cia, ya que a fines del siglo xvn y en

En estos últimos años, he tenido el privilegio, durante varias prolongadas visitas al extranjero, de hacer investigaciones sobre el teatro, y muchas veces he tenido la ocasión

que hasta que llegue el tiempo en que su regia planta ; | pise el hispano suelo... que hasta que el

En junio de 1980, el Departamento de Literatura Española de la Universi- dad de Sevilla, tras consultar con diversos estudiosos del poeta, decidió propo- ner al Claustro de la

E Clamades andaua sienpre sobre el caua- 11o de madera, y en poco tienpo fue tan lexos, que el no sabia en donde estaña; pero el tomo muy gran esfuergo en si, y pensó yendo assi

Sanz (Universidad Carlos III-IUNE): "El papel de las fuentes de datos en los ranking nacionales de universidades".. Reuniones científicas 75 Los días 12 y 13 de noviembre

La combinación, de acuerdo con el SEG, de ambos estudios, validez y fiabilidad (esto es, el estudio de los criterios de realidad en la declaración), verificada la

Así, antes de adoptar una medida de salvaguardia, la Comisión tenía una reunión con los representantes del Estado cuyas productos iban a ser sometidos a la medida y ofrecía