IDENTIFICACION Y SEROTIPIFICACION DE Salmonella EN CARNE CRUDA MOLIDA DE RES Y CERDO EN COLIMA

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Instituto Tecnológico de Colima

LABORATORIO ESTATAL DE SALUD PÚBLICA.

“IDENTIFICACION Y SEROTIPIFICACION DE

Salmonella

EN CARNE

CRUDA MOLIDA DE RES Y CERDO EN COLIMA.”

OPCIÓN I

TESIS PROFESIONAL

Que para obtener el título de:

INGENIERO BIOQUÍMICO

Presenta

HECTOR LEONEL MENDOZA CHAVEZ.

LAMAR ORTIZ PIMENTEL.

Asesora:

DRA. ARGELIA JUÁREZ ALCARÁZ

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AGRADECIMIENTOS

Agradezco a mi padre Roberto Mendoza Cardenas, y madre Ma. Natividad Chavez Aldana, por todo el apoyo que me brindaron durante este tiempo de estudiante, a la sabiduría que me brindaron y paciencia. GRACIAS¡¡¡

A mis hermanos Oswaldo, Jeovana y Jacqueline por estar conmigo siempre apoyándome y levantándome en todo momento.

A toda mi familia por su apoyo incondicional, por no dejarme caer a medio

camino de la carrera.

A mi generación Fernando, Lamar, Raúl, Roció, Mally,Ismael, Juan Ramón, Edith

y Santana amigos que estuvimos cinco años juntos apoyándonos mutuamente para lograr salir adelante con la carrera y nuestras vidas. Gracias Brothers¡.

A la Dra. Argelia Juárez ,por su disponibilidad, paciencia y su gran apoyo

incondicional en todo momento y por estar siempre al pendiente de nosotros, así como a su sabiduría que nos compartió y gracias ella logramos esta meta.

Al Laboratorio Estatal de Salud Pública, que nos apoyaron en el tiempo en que

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AGRADECIMIENTOS

Agradezco primeramente a mi mama Araceli Pimentel Torres por todo su apoyo incondicional, sus consejos, su tiempo, paciencia, por estar conmigo en momentos difíciles y enseñarme a levantarme siempre, mama sin ti no hubiera podido llegar a donde estoy y lo que falta. Gracias¡¡¡

A mi hermana Araceli (Mito) por siempre estar conmigo apoyándome, y hechandome porras siempre T.Q.M hermanita.

Y a una de las personas más importantes en mi vida mi papa Nicolás Ortiz Ferrara que siempre está conmigo desde allá arriba iluminándome y cuidándome en todo momento. Gracias por tus buenas enseñanzas y por formar la persona que soy. Se que estas orgulloso de mi¡¡¡¡

A mi familia por todo su apoyo en todo momento y en especial a mi Tías:

Rafaela, Susana, Enedina, Evangelina y a mi Tíos: Pepe y Chuy, que siempre estuvieron conmigo a lo largo de la carrera.

A mi generación Fernando, Leonel, Raúl, Roció, Mally ,Ismael, Juan Ramón,

Edith amigos que estuvimos cinco años juntos apoyándonos mutuamente para lograr salir adelante con la carrera y nuestras vidas. Y también a mi amiga Susana por siempre estas hay en las buenas y en las malas brindándome todo su cariño.

A la Dra. Argelia Juárez ,por su disponibilidad, paciencia y su gran apoyo

incondicional en todo momento y por estar siempre al pendiente de nosotros, así como a su sabiduría que nos compartió y gracias ella logramos esta meta.

Al Laboratorio Estatal de Salud Pública, que nos apoyaron en el tiempo en que

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INDICE

PAGINA

1.- RESUMEN………..1

2.-INTRODUCCION………3

3.- JUSTIFICACION………...6

4.- OBJETIVOS………...8

4.1.- OBJETIVO GENERAL……….……...8

4.2.- OBJETIVOS ESPECIFICOS………..8

5.- PROBLEMAS A RESOLVER………..……....8

6.- ALCANCES……….…8

7.- LIMITACIONES………..9

8.- FUNDAMENTO TEORICO……….10

8.1.- MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS………...14

8.2.- IMPORTANCIA DE LA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS………... 14

8.3.- PRINCIPALES MICRORGANISMOS DE INTERES DE LA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS……….15

8.4.- PRINCIPALES BACTERIAS PATOGENAS INVOLUCRADAS EN LOS ALIMENTOS……….………..15

8.5.- SALMONELLA SPP……….………15

9.-MATERIALES Y METODOS………...…..………....18

9.1-INCIDENCIA DE SALMONELLA………..….……….…………..18

9.2- IDENTIFICACION DE CEPAS DE SALMONELLA ……...…..………22

9.3-AGLUTINACION EN GRUPOS POSITIVOS A LA IDENTIFICACION………...22

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10.- RESULTADOS Y DISCUCION………..………...26

11.- CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES……….…….42

12.-ANEXOS………..………..44

13.- REFERENCIA BIBLIOGRAFICA………...………...54

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1.-RESUMEN

El presente trabajo se realizó en colaboración con el Laboratorio Estatal de Salud Publica el cual se refiere a la identificación y serotipificación de Salmonella en carne cruda molida de res y cerdo en las tres jurisdicciones de Colima.

Debido a la trascendencia que tiene la presencia del microorganismo en este tipo de alimentos, se llevó a cabo un estudio, durante los meses de enero a junio del 2008. Dicho estudio, se realizó en los establecimientos públicos (carnicerías), de las jurisdicciones del estado de Colima.

Salmonella, es una bacteria que se manifiesta en los alimentos por falta de

higiene, lo cual es causante de enfermedades intestinales, por eso la importancia del sector público en tener control sobre esta bacteria en carnes crudas y sobre todo molidas.

Este proyecto fue realizado de acuerdo a la norma: NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS.

Por otro lado, de acuerdo a los datos obtenidos por el la Dirección de Planeación de la SSA, en el año 2006 se reportaron 41 casos de fiebre tifoidea y 110 casos de salmonelosis y en el 2007 se reportó 6 casos de fiebre tifoidea y 188 de salmonelosis, En este mismo año fueron reportadas 2 defunciones por Salmonella un paciente de 85 y otro de 59 años.

Por lo que el índice de morbilidad en el 2006 fue de151 casos y en el 2007, 194 casos y dos casos de mortalidad (Sistema Único Automatizado Para la Vigilancia Epidemiológica).

Por tal motivo la importancia de conocer la Salmonella en los alimentos, ya que es importante para evitar posibles enfermedades gastrointestinales en la población. También, para planear estrategias preventivas que conlleven medidas higiénicas, en especial en alimentos así como en su manipulación.

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Las condiciones de trabajo en el laboratorio, el equipamiento e instalaciones facilitaron la culminación de este proyecto.

La importancia de conocer la incidencia de Salmonella en un alimento, es importante para evitar posibles enfermedades gastrointestinales en la población. También, para planear estrategias preventivas que conlleven medidas higiénicas, en especial en alimentos así como en su manipulación.

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2.-INTRODUCCION

El presente trabajo se refiere a la identificación y serotipificación de

Salmonella en carne cruda molida de res y cerdo en las tres jurisdicciones de

Colima.

Uno de los enteropatógenos más importantes es la Salmonella, porque es una de las contaminantes más abundante en los alimentos. Son parte de un grupo de microorganismos que se encuentran distribuidos ampliamente en la naturaleza. Se localizan, en el tracto gastrointestinal de los mamíferos domésticos y salvajes, reptiles, aves, insectos y humanos, produciendo en estos una gran variedad de patologías.

Salmonella, es una bacteria que se manifiesta en los alimentos por falta de

higiene, lo cual es causante de enfermedades intestinales, por eso la importancia del sector público en tener control sobre esta bacteria en carnes crudas y sobre todo molidas.

Debido a la trascendencia que tiene la presencia del microorganismo en este tipo de alimentos, se llevó a cabo un estudio, durante los meses de enero a junio del 2008. Dicho estudio, se realizó en los establecimientos públicos (carnicerías), de las jurisdicciones del estado de Colima. Enseguida se menciona, los municipios y y las jurisdicciones a las que pertenece:

JURISDICCION SANITARIA No. 1

Con sede en el municipio de Colima y cubriendo los municipios de Colima, Villa de Álvarez, Coquimatlan , Cómala y Cuauhtémoc con un total de 49 unidades

básicas de primer nivel

JURISDICCION SANITARIA NO. 2

Con sede en el municipio de Tecomán y cubriendo los municipios de Tecomán, Armería e Ixtlahuacán con un total de 31 unidades de primer nivel.

JURISDICCION SANITARIA No. 3

Con sede en Manzanillo y cubriendo los municipios de Manzanillo y Minatitlán con un total de 36 unidades de primer nivel.

Salmonella, es un género de bacterias que pertenece a la familia

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con flagelos perítricos que rodean al microorganismo y no desarrolla cápsula ni espora. Son bacterias móviles que producen sulfuro de hidrógeno (H2S).

Fermentan glucosa pero no lactosa, y no producen ureasa. Se encuentran fundamentalmente asociados a la flora intestinal y, por ello, en aguas y alimentos que hayan tenido contacto con material fecal. Producen grandes cantidades de gas durante la fermentación de azúcares, y llevan a cabo una fermentación ácido mixta, produciendo gran cantidad de ácidos orgánicos y gases (NOM-114-SSA1-1994).

Se transmite por contacto directo o contaminación cruzada durante la manipulación, del proceso de alimentos o en el hogar y también por vía sexual.

Se pueden agrupar en tres divisiones ecológicas (Spp. son subespecies). las más de 2000 serovariedades de Salmonella.(Salmonella 2008. http://es.wikipedia.org/wiki/Salmonella).

1. Salmonella spp. adaptadas a vivir en el ser humano, entre ellas, S. Typhi.

S. paratyphi A, B y C;

2. Salmonella Spp. adaptadas a hospederos no humanos, que

circunstancialmente pueden producir infección en el hombre, entre ellas, S.

Dublin y S. Cholerae-suis;

3. Salmonella Spp. sin adaptación específica de hospedero, que incluye a unas 1800 serovariedades de amplia distribución en la naturaleza, las cuales causan la mayoría de las salmonelosis en el mundo.

Los miembros del género Salmonella, han sido muy estudiados como patógenos cuando se encuentran presentes en los alimentos. El control de este microorganismo, tanto por parte de las autoridades sanitarias, como de las plantas procesadoras de alimentos, depende en cierta medida del método analítico utilizado para su detección.

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bacterianas presentes en un alimento, debido al proceso a que está sujeto (por ejemplo: tratamiento térmico, secado) y el segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio. (www.es.wikipedia.org/wiki/Salmonella).

Para diversos alimentos existen diferentes protocolos para el aislamiento de

Salmonella. Todos ellos son esencialmente similares en principio y emplean las

etapas de pre enriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivo selectivos y diferenciales. La identificación bioquímica y confirmación serológica de los microorganismos, se emplea para un protocolo de investigación y obtener no solo su caracterización sino hasta la identificación de su especie respectiva.

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3. JUSTIFICACION

El investigación realizada en este trabajo, se enfocó principalmente a estudiar la identificación y serotipificación de Salmonella en carne cruda molida. Debido, a que este alimento es una fuente rica en nutrientes, que provoca el albergue de ciertas bacterias entero patógenas. La carne es una fuente de infección, debido a la falta de higiene en la manipulación. Cuando ha sido contaminada, puede propiciar lo que se denomina contaminación cruzada. Como consecuencia tenemos como resultado algunas enfermedades provocadas por las poblaciones microbianas y entre ellas a Salmonella.

Las infecciones por Salmonella son de tipo diarreicas que se manifiesta tanto en animales como en humanos. Esta bacteria, normalmente se transmite a humanos al comer alimentos contaminados con las heces de animales. Los alimentos contaminados son a menudo de origen animal, como por ejemplo carne de vaca y cerdo.

Una de las principales enfermedades es la salmonelosis producida por el género microbiano Salmonella. No todas las especies, cepas o serotipos reconocidos tienen igual potencial patogénico. Los principales agentes etiológicos corresponden a Salmonella typhi, Salmonella paratiphi, Salmonella typhimurium y

Salmonellaenteritidis.(EnfermedadesInfecciosas2007,www.healthsystem.virginia.ed u/uvahealth/adult_infectious_sp/salmonel.cfm).

De acuerdo a las características higiénicas de los establecimientos públicos con la que se manipula la carne a través de sus equipos, podría estar contaminada por una carga microbiana con posibilidades de hallar Salmonella.

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Por lo que el índice de morbilidad en el 2006 fue de151 casos y en el 2007, 194 casos y dos casos de mortalidad (Sistema Único Automatizado Para la Vigilancia Epidemiológica).

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4.OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GENERAL

Identificar y Serotipificar las cepas sospechosas encontradas en las muestras de carne molida de res y cerdo.

4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Realizar la identificación a través de pruebas bioquímicas de las cepas en las muestras de carne molida de res y cerdo para su biotipificación.

• Identificar la aglutinación de cada una de las cepas para conocer el tipo de

Salmonella.

• Determinar los serotipos de cada una de las cepas por medio del equipo Micro Scan,Walk Away.

5. PROBLEMAS A RESOLVER

A través de los resultados obtenidos en esta investigación, se pretendió realizar estrategias de prevención y control higiénico oportuno sobre la manipulación de los productos cárnicos, en especial la carne cruda molida.

6. ALCANCES

• El conocimiento en el área de trabajo que abarcó las actividades realizadas en el departamento de control ambiental a través de su área de microbiología de alimentos.

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de Salmonella bajo la norma oficial mexicana Nom-114-SSA-1-1994, Bienes y Servicios. Método para la determinación de salmonella en alimentos.

• Habilidad para el manejo del equipo requerido para la ejecución de la técnica mencionada, en laboratorio estatal.

7. LIMITACIONES

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8. FUNDAMENTO TEORICO

La secretaria de salud es la dependencia del ejecutivo federal que tiene como objetivo fundamental proteger la salud de la población.

En el siglo pasado, los servicios de salud en el estado de Colima, se organizaron como “las juntas de salud”, constituyéndose la primera de ellas en 1821, por el cabildo de la Villa de Coima. ( manual organizacional del LESP).

La función principal de estas, era vigilar los hospitales, Hospicios y casas de cuna, cuya operación era eminentemente de beneficencia, otorgada por las órdenes religiosas y ayudadas por personas altruistas, continuando así hasta los inicios de este siglo.

El 26 de agosto de 1914 se crea “ El Consejo de Salubridad del estado de Colima”, un avance significativo en materia de salud, al asentar las bases para la regulación del ejercicio de las profesiones, proponiendo al gobierno las medidas generales para mejorar la salubridad pública, precursora de la epidemiología y de la salud pública, posteriormente se reorganiza el consejo de salubridad, por decreto presidencial el 17 de enero, con la intención de actualizarlo y brindar una mejor atención medico-preventiva a la población.

En el año de 1926, se crea en Colima “La Delegación Sanitaria Federal” para descentralizar funciones. Sin embargo, poco a poco el nivel central retoma el control, limitándose las funciones y atribuciones a la esfera operativa exclusivamente.

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IMSS-11

COPLAMAR y los servicios estatales, evitando duplicidad de funciones, reservando a la secretaria de salubridad y asistencia, la responsabilidad de fungir como instancia de programación, presupuestación, fijación de normas técnicas, supervisión y evaluación general de los servicios.

En el año de 1985, concluye el proceso de descentralización de los servicios de salud, procediéndose a la integración de los Servicios Coordinados de Salud Publica (SSA) y el programa IMSS-COPLAMAR.

El 7 de marzo de 1986 se crea la “Secretaria de Salud y Bienestar Social del Gobierno del Estado de Colima”, hasta el año de 1985 funcionaron los Servicios Coordinados de Salud con una unidad de programación y 5 departamentos.

En mayo de 1986 por decisión política del Gobierno del Estado se constituye e inicia sus actividades “El Laboratorio Estatal de Salud Publica” a partir de Agosto de este año con una superficie de 80 metros cuadrados, y se ubica en la planta alta del Centro de Salud ubicado en Av. 20 de Noviembre y Juárez en la Ciudad de Colima, Col.; con el siguiente personal: un Jefe de Laboratorio Estatal de Salud Pública, una Química Analista, un Técnico, un intendente (provisional) y dos secretarias.

En 1987 se le otorga su propio presupuesto Federal para gastos de operación, el cual es administrado por el Jefe del Laboratorio con apoyo del Centro de Salud. A fin de año se reciben 23 aparatos procedentes del almacén Central de la Ciudad de México, con apoyo del Dr. Jesús Kumate Rodríguez, Secretario de Salud Federal a nivel Nacional en ese tiempo.

Normativamente depende de:

• Laboratorio Nacional de Salud Pública (L.N.S.P.) Hoy (CCAYAC )

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1.- Departamento Administrativo 2.- Departamento de Control Ambiental 3.- Departamento de Control Microbiológico 4.- Departamento de Control de Calidad.

En junio del mismo año se obtiene una ampliación del área física de 18 metros cuadrados que se destinan para jefatura y administración. Se inicia la construcción de 115 metros cuadrados para la ubicación y utilización de equipo nuevo y poder atender la creciente demanda.

De 1989 a 1991 se consolidan las actividades por Departamento, en apoyo a la Dirección de Regulación Sanitaria y a la Vigilancia Epidemiológica, se realiza control y Supervisión de la Red Estatal de Laboratorios de la Secretaria de Salud.

En 1992 se fortalecen los programas de Vigilancia de Diarreas incluyendo cólera y Programa de la Vigilancia de la Calidad del Agua, con mas presupuesto y recursos Humanos que fueron contratados por gobierno federal (dos Químicos y un capturista, cancelados al terminar el apoyo para el programa de cólera) y por gobierno Estatal (dos Químicos analistas, tres Laboratoristas y dos Técnicos, que actualmente están de Base por el Gobierno Estatal).

En noviembre de 1995 por decisión del Secretario de Salud y Bienestar Social se transfiere la Jefatura de Departamento Administrativa a la Dirección de Regulación Sanitaria para dar origen al Departamento de Regulación de los Servicios de Salud.

En el año de 1998 se adecua un área para los Desechos Biológicos Infecciosos que genera el LESP.

El 23 de febrero de 1999, el Departamento de Control de Calidad cambia su nombre a Departamento de Serología Diagnostica con el fin de adecuarlo a las actividades que realiza.

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En Noviembre de 1999, por decisión política del Secretario de Salud y Presidente Ejecutivo del Organismo Publico Descentralizado, se fusionan los Laboratorios Clínicos Jurisdiccionales y Hospitales de la Secretaria de Salud creando así el “Laboratorio Central de Análisis Clínicos” con dependencia operativa y funcional del Laboratorio Estatal de Salud Publica.

En agosto del 2001 inicia nueva administración en el Laboratorio Estatal de Salud Publica cuya visión es promover al Laboratorio como una institución autónoma es decir que crea sus propios recursos para su mantenimiento y desarrollo, que ofrezca resultados de análisis a bajo costo con equipo y métodos sustentados en un sistema de calidad.

En enero del 2002 se inician las gestiones ante el Secretario de Salud para lograr que el Laboratorio sea considerado como una unidad desconcentrada para poder administrar los ingresos por los estudios que realiza, ya que hasta la fecha estos eran captados por el Centro de Salud de Colima.

En abril del 2002 se obtiene los recursos para modificar los espacios con la finalidad de reacomodar las áreas y obtener una mayor funcionalidad, por lo que en el área de Análisis Fisicoquímicos se acondiciono un espacio para ser utilizado por el área de Preparación de Medios de Cultivo y un Almacén de Reactivos Peligrosos; así mismo se creo un área especial para los refrigeradores y el área administrativa se crece en espacio para albergar a las Jefaturas de los Departamento que integran el LESP.

Es en este año cuando se implementa el proceso de bacteriología de manera automatizada logrando un importante avance en la emisión de resultados, siendo el único equipo en su género actualmente en el estado a nivel institucional y privado.

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analíticos de cada una de las áreas del LESP, con la finalidad de obtener resultados confiables y oportunos.(Manual de Organización del Laboratorio estatal de salud publica).

8.1. MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS.

Los alimentos, los microorganismos y los seres humanos, tienen interesante y duraderas asociaciones que se desarrollaron mucho antes del inicio de la historia escrita. Los alimentos no sólo tienen un valor nutricional para quienes los consumen; a menudo constituyen además un medio de cultivo ideal para la multiplicación microbiana.

Los microorganismos pueden utilizarse para transformar alimentos crudos en delicias gastronómicas, como los quesos, los pepinillos, las salchichas y la salsa de soya. Los vinos, las cervezas y otros productos alcohólicos también se generan mediante la actividad microbiana. Por otra parte, los alimentos también pueden actuar como vehículos de transmisión de enfermedades, y la detección y el control de los patógenos y de los microorganismos responsables de la descomposición de los alimentos constituyen partes importantes de la microbiología de los alimentos. Durante la secuencia completa de la manipulación de los alimentos, desde el productor hasta el consumidor final, los microorganismos pueden afectar a la calidad de los alimentos y a la salud humana.

8.2. IMPORTANCIA DE LA MICROBIOLOGÍA EN LOS ALIMENTOS

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o procesado, forma parte de los intereses de cualquier comunidad. (Fernández Escartin, 2000).

8.3. PRINCIPALES MICROORGANISMOS DE INTERÉS DE LA

MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS.

Los microorganismos, y en concreto las bacterias, son la principal causa de enfermedades producidas por el consumo de alimentos contaminados. Se habla de cómo evitar su presencia, de sus consecuencias sanitarias y socioeconómicas, pero a menudo no se conocen lo suficiente.

8.4. PRINCIPALES BACTERIAS PATÓGENAS INVOLUCRADAS EN LOS ALIMENTOS

Los microorganismos, y en concreto las bacterias, son la principal causa de enfermedades causadas por el consumo de alimentos contaminados. Se habla de cómo evitar su presencia, de sus consecuencias sanitarias y socioeconómicas, pero a menudo no se conocen lo suficiente. Cualquier alimento debería estar, en condiciones ideales, libre de la presencia de microorganismos patógenos. Pero conseguirlo no es fácil y, a pesar de las medidas que el sector productivo implementa, con un demostrado alto grado de eficacia para alguno de los microorganismos más virulentos, su completa erradicación es compleja. Un análisis de las principales bacterias patógenas responsables de enfermedades causadas por el consumo de alimentos contaminados obliga a tener en cuenta

Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Escherichia coli enteropatógeno,

Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae y Salmonella. (Fernández Escartin, 2000).

8.5. SALMONELLA SPP

El género Salmonella es uno de los más extensamente estudiado entre los patógenos que pueden ser aislados de los alimentos. La descripción del género

Salmonella corresponde al típico bacilo gram negativo de la familia

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anaerobios con una rica composición antigénica que se emplea como base para la identificación de sus miembros en serotipos, más recientemente designados como serovares.

La Salmonella es una bacteria primariamente parásita intestinal de los animales, incluido el hombre. Tal es su hábitat natural. Se libera al medio ambiente cuando se le expulsa por las heces. Entonces muestra cierta capacidad de supervivencia en los materiales que contacta, y bajo condiciones favorables también para multiplicarse en ellos; los alimentos no son un excepción. Las fuentes de aislamiento de la Salmonella son el medio ambiente del agua, tierra, suelo; los vegetales y animales acuáticos, domésticos, silvestres, de explotación y fauna nociva; utensilios y en humanos sintomáticos, enfermos y convalecientes.

De acuerdo con la información sobre la prevalecía y sobrevivencia de la

Salmonella en el medio ambiente, no es de extrañar que los alimentos crudos o

naturales, muestren índices de contaminación cualitativamente, muy variados, y elevados en muchos de ellos. (Fernández Escartin, 2000).

La prevención de Salmonella como contaminante de alimentos involucra el sanatizar eficazmente las superficies de contacto con los alimentos. El alcohol ha sido efectivo como agente desinfectante tópico en contra de la Salmonella, así como el cloro. La comida que contenga huevos crudos debe ser cocinada adecuadamente o congelada antes de consumirla. Cualquier alimento cocinado de manera imperfecta o no cocinado, especialmente en carne, aves, huevos (porque este sale por el mismo conducto de las heces y como Salmonella es una enterobacteria se contamina el huevo por eso es importante tener practicas de higiene en la manipulación de estos) y leche, es un buen vehículo de transmisión de Salmonella.

Su tiempo de supervivencia en alimentos a temperatura ambiente es de varios días llegando incluso a los límites siguientes:

- mantequilla: hasta 10 semanas - leche: hasta 6 meses

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Existen unos métodos destinados a evitar la proliferación de este género en los alimentos, por ejemplo, destruir la bacteria en los alimentos mediante el cocinado, evitar la contaminación cruzada durante la manipulación de los mismos y almacenar los alimentos a bajas o altas temperaturas para evitar su crecimiento.

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9. MATERIALES Y MÉTODOS

A través del departamento de Calidad Sanitaria de Bienes y Servicios, se obtuvieron las muestras de carne y quienes se responsabilizaron de realizar las verificaciones sanitarias a los establecimientos públicos (carnicerías). El análisis microbiológico de las muestras de acuerdo la NOM-114-SSA1-1994, se llevó a cabo en el laboratorio del departamento de control ambiental, área de microbiología de alimentos de la Secretaria de Salud.

9.1 INCIDENCIA DE SALMONELLA

Con el fin de obtener alícuotas representativas de las muestras obtenidas se les aplicó el proceso de homogenización (Fig. 1). Enseguida se pesó 20 grs del total de la muestra y se pasaron a frascos de 250mL conteniendo 180mL de Caldo Nutritivo (Fig. 2). Este funcionó como un caldo de preenriquecimiento y se dejó reposar durante 60 min para ajustar enseguida el pH a 7 (se ajustó el pH con NaOH 0.1N y HCl 0.1N). Posteriormente, se incubó a 37°C de 18 a 24 hrs (Fig. 3). Una vez transcurrido el periodo de incubación, se retiraron de la incubadora y se agitaron para homogenizarlas nuevamente y tomar 1 mL de la muestra. Luego pasó a medios de enriquecimiento selectivo, tales como Caldo Selenito y Caldo tetrationato (Fig 4 y 5). Una vez que el tetrationato se encontró a temperatura ambiente, se realizó la inoculación de la alícuota de la muestra. Después se adicionó a los medios de enriquecimiento selectivo los cuales contenían un volumen 10 mL de cada medio en tubos de ensayo con tapón de baquelita. Posteriormente se agitaron los tubos con un agitador Vortex aprox. 15 rpm (Fig.6). Se incubaron a 37°C de 18 a 24hrs. La siguiente etapa del proceso fue pasar de los medios selectivos a medios sólidos selectivos (Fig. 7).

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cajas con SB y VB fueron incubadas a 37 C por 24 hrs. Y las que contenían SB a la misma temperatura pero diferente hora de incubación (48 hrs). Después, se hicieron las lecturas de las placas de SS y VB a las 24 hr de incubadas, para identificar las colonias sospechosas, en las siguientes características.

Agar S.S: las colonias típicas de Salmonella son colonias traslucidas opacas algunas colonias dan de color negro en el centro.

Agar V.B: las colonias típicas de Salmonella son colonias rosas o rojas.

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Fig 1. Muestra el proceso de la Fig 2. 20gr del total de la muestra fue . homogenización de la muestra pesado para pasar a frascos de

250ml. .

Fig.3 ajuste de pH y etiquetado de Fig.4 Tubo de enriquecimiento . muestras para su incubación Testigos (CS Y CT).

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Fig. 5 caldos de enriquecimiento Fig. 6 homogenización en Vortex. . . . Incubados.

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9.2 IDENTIFICACION DE CEPAS DE SALMONELLA

Para su identificación bioquímica se tomó 2 colonias típicas de Salmonella sospechosas de cada medio selectivo que se encontró debidamente aislada. Para la toma de las muestras se tocó ligeramente el centro de cada colonia. Se sembró por estría en tubos conteniendo Agar TSI (Agar triple azúcar hierro) y en tubos con Agar LIA ((Agar hierro lisina), y por picadura en Agar MIO (Movilidad, Ornitina e Indol) (Fig.9)).

Para detectar las colonias sospechosas de Salmonella, se observó su morfología y se reportó por medio de una cruz en la bitácora de LESP. Este reporte se basó de acuerdo a la taxonomía que rige el Laboratorio Estatal, el cual una cruz significa: que son menos de 50, dos cruces más de 50 y 3 cruces: más de 100 colonias (Fig.10). Las sospechosas fueron identificadas por las siguientes características, de acuerdo a (Fernández Escartín, 2000).

Para el Agar TSI se lee lactosa en la punta del tubo si es amarilla es positivo (+) y si es roja negativo (-), glucosa si es amarilla positiva (+) y roja negativo (–) en la parte de abajo del tubo y acido sulfhídrico si da coloración negra positiva (+), en el Agar LIA se le la descarboxilación de la lisina y acido sulfhídrico (LDC: si da coloración morada es positiva (+), si es amarillo negativo (-), H2S: negro positivo (+)).En el Agar MIO se lee Movilidad, Indol y Ornitina. (Movilidad: turbidez en el Agar positivo (+), Indol: anillo rojo es positivo (+) y anillo café o amarillo negativo (-), Ornitina: coloración morada positiva (+) amarillo negativo (-))(Fig.11).

9.3 AGLUTINACION EN GRUPOS DE CEPAS POSITIVAS A LA IDENTIFICACION.

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Fig.9 Tubos sembrados con Agar TSI.LIA y MIO . Fig.10 Colonias sospechosas de . Salmonella

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24 9.4 SEROTIPIFICACION

Para la técnica de serotipificacion esta se realizo en el departamento de serología con el equipo micro Scan Walk Away 96.

La técnica consiste en determinar el género y la especie de las salmonellas detectadas la cual lleva una serie de pasos:

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Fig.13 resiembra en agar Mckonkey. Fig.14 solución PROM.

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26 10. RESULTADOS Y DISCUSION

En el Cuadro 1 se observa el número asignado a cada una de las ochenta muestras tomadas por el departamento de Calidad Sanitaria de Bienes y Servicios,, También se observó el tipo de carne y su pH inicial y final respectivo, solamente se ajustó el pH, a las muestras que dieron pH inicial menor de 7.

.

Número de muestra

Tipo de carne

1467* Res

1468 Cerdo

1469 Res

1470 Cerdo

1471 Res

1472 Cerdo 1473 Cerdo

1474 Res

1475 Res

1476 Cerdo 1477 Cerdo

1478 Res

1479 Cerdo

1480* Res

1481 Cerdo 1482 Cerdo

1497 Res

1498 Cerdo 1499 Cerdo 1500* Cerdo

1501 Res

1539 Mixta

1540 Res

1541 Cerdo

1542 Res

1543 Cerdo 1544 Mixta

1695 Res

1696 Cerdo 1697 Mixta

1698 Res

1699* Res

1700* Cerdo

1741 Res

1742* Cerdo

1823 Res

1820 Res

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27 # de muestra Tipo de carne

1824 Res

1838 Res

1839 Cerdo

1840* Res

1841* Cerdo

1842 Res

1843 Cerdo

1844 Res

1845 Cerdo

1877* Res

1878 Cerdo

1879 Res

1880 Cerdo

1881* Res

1882* Cerdo 1883 Cerdo

1884 Res

1885 Res

1887* Cerdo

1888 Res

1889 Cerdo

1890* Res

1893 Res

1894* Cerdo 1909* Cerdo 1910 Cerdo

1962 Res

1963 Cerdo

2032 Res

2033 Cerdo

2034 Res

2035* Cerdo

2051 Res

2052* Cerdo

2053 Res

2054 Cerdo

2073* Res

2074 Cerdo 2075* Cerdo

2076 Res

2077 Res

Taxonomía del LESP(Laboratorio Estatal de Salud Publica)

*: muestras que se les ajusto el pH de 6 a 7.

(33)

28

En el Cuadro 2 se observa el reporte de la respuesta del crecimiento microbiano de cada muestra que se inoculó en el caldo Selenito como al caldo Tetrationato y la respuesta también que se obtuvo de las siembras por estria a las cajas que contenían los Agares Selectivos(SS,VB y SB).

CS CT

No. de

muestra SS VB SB SS VB SB

(34)

29

CS CT

No. de

muestra SS VB SB SS VB SB

1500 +++ - +++ - ++ 1,2 +++ - +++ - + -

1501 +++ - +++ - +++ - +++ - +++ - ++ 1

1539 ++ - +++ - ++ - ++ - ++ - +++ -

1540 ++ - +++ - ++ - ++ - +++ - ++ 1

1541 +S/D - + - +S/D - ++ - ++ - ++ -

1542 ++ - +++ - ++ - ++ - +++ - +++ 1

1543 + - ++ - +S/D - ++ - +++ - ++ -

1544 ++ - +++ - +++ - +++ - +++ - +++ -

1695 + - ++ - ++ - ++ - ++ - ++ -

1696 ++ - +++ 1 ++ - +++ - +++ - +++ -

1697 ++ 1 ++ - ++ 1,2 +++ - ++ - ++ -

1698 + - +++ - ++ 1 ++ - ++ 1 ++ 1

1699 ++ 1,2 +++ - +++ 1 ++ - +++ - +++ -

1700 +S/D - ++ - +S/D - ++ 1 +++ 1 ++ 1

1820 + - + - + - +++ - +++ - ++ -

1821 + - ++ 1,2 ++ - ++ - ++ - ++ -

1822 +++ - +++ - + - ++ - ++ - ++ -

1823 + - +++ 1 +++ - + - +++ - ++ -

1824 + 1 +++ - ++ - +++ - +++ - +++ -

1838 + - ++ - + - +++ - +++ - +++ -

1839 ++ - +++ 1,2 ++ - ++ - +++ - ++ -

1840 + - ++ - + - +++ - +++ - +++ -

(35)

30

CS CT

No. de

muestra SS VB SB SS VB SB

1842 + - +++ - ++ - +++ - +++ - ++ -

1843 + - +++ - + - ++ - +++ - +++ -

1844 + - ++ - + - ++ + - +++ - ++ -

1845 ++ - +++ - ++ - + - +++ - ++ -

1877 + - ++ - +S/D - ++ - +++ - ++ -

1878 +S/D - ++ - + - +++ - +++ - +++ -

1879 + S/D - +S/D - + - +++ 1 ++ - +++ -

1880 +S/D - ++ - ++ 1,2 ++ - +++ - ++ -

1881 +S/D - ++ - ++ - ++ - +++ - +++ -

1882 +S/D - ++ - + - ++ - +++ - ++ -

1883 ++ - +++ - ++ - +++ - +++ - +++ -

1884 ++ - +++ - ++ 1 +++ 1 +++ - +++ -

1885 ++ - ++ - ++ - +++ - +++ - ++ -

1887 +S/D - ++ - ++ - ++ 1 +++ - +++ -

1888 ++ - ++ - ++ 1 ++ - +++ - +++ -

1889 +S/D - ++ - + 1 ++ + - +S/D - +++ -

1890 +S/D - ++ - +S/D - ++ - +++ - +++ 1

1893 ++ 1 +++ - +++ - +++ - +++ - +++ -

1894 ++ - + - +++ - ++ - +++ - +++ -

1909 ++ 1 +S/D - + - +++ 1,2 +++ - ++ -

1910 +S/D - +S/D - +++ - +++ - +++ - +S/D -

(36)

31

CS CT

No. de

muestra SS VB SB SS VB SB

1923 +S/D - ++ - ++ - ++ - ++ - +++ -

2032 +S/D - ++ - +S/D - ++ - +++ - ++ -

2033 +S/D - ++ - +S/D - ++ - ++ 1 +++ -

2034 ++ - ++ - ++ - ++ - +++ - +++ -

2035 ++ 1 +++ - ++ - +++ 1,2 +++ - +++ -

2051 ++ 1,2 +++ - +++ - ++ 1,2 +++ - +++ -

2052 ++ 1,2,3 +++ - +++ - ++ - +++ - ++ -

2053 ++ - +++ - ++ - ++ - ++ - +++ -

2054 +++ - ++ - ++ - +S/D - + - + -

2073 +S/D - + - ++ - +S/D - ++ - +S/D -

2074 +S/D - ++ 1 ++ - +++ - +++ 1,2 +++ -

2075 +S/D - +++ - ++ - +++ - +++ - ++ -

2076 ++ - + - +S/D - +++ - ++ - +++ -

2077 ++ - +++ 1 ++ - + - +++ 1 +++ -

Cuadro 2. Número de muestra y crecimiento microbiano, dependiendo del caldo y Medios Solido.

(37)

32

De acuerdo a la técnica convencional que nos rige la norma para que se propicien las condiciones ideales para el crecimiento de la Salmonella, se mantuvieron en dos medios adecuados para su desarrollo óptimo (Cuadro 3). Como se lo indicó en la taxonomía descrita al final de Cuadro.Las colonias desarrolladas como sospechosas, están indicadas con los números 1 y 2 después del número que le correspondió a la muestra.

No. DE MUESTRA TIPO DE CALDO SELECTIVO

MEDIO SOLIDO SELECTIVO (SS y SB)

1698-2 Caldo Tetrationato Sulfito de Bismuto 1697-1 Caldo Selenito Sulfito de Bismuto 1909-1 Caldo Selenito Salmonella Shigella 1909-1 Caldo Tetrationato Salmonella Shigella 1909-2 Caldo Tetrationato Salmonella Shigella 2035 Caldo Selenito Salmonella Shigella 2035-1 Caldo Tetrationato Salmonella Shigella 2035-2 Caldo Tetrationato Salmonella Shigella

Cuadro 3. Colonias sospechosas de Salmonella según morfología.

(38)

33

(39)

34

(40)

35

Fig 21. Los porcentajes mostrados de las muestras, fueron obtenidos de las tres jurisdicciones del estado

.

Fig 22. Del total de muestras analizada, solamente el 10 % fueron las que se consideraron como sospechosas de Salmonella .

Porcentaje Total de Muestras de Carne Molida

48%

48%

4% Carne Molida de Res

Carne Molida Mixta

Carne Molida de Cerdo

Porcentaje Total de Colonias Sospechosas de Salmonella

90% 10%

(41)

36

Porcentaje de Muestras Segun su Procedencia

42%

34% 24%

1

2

3 JURISDICCION 1

JURISDICCION 2

JURISDICCION 3

(42)

37

Cuadro 4. En este cuadro se muestran las las bioquímicas realizadas

a las colonias sospechosas de Salmonella.

Número de muestra. TSI LIA MIO

L G H2S L H2S M I O

1468-1 CS/SB + +GAS - + - - + -

1468-2CS/SB + +GAS - - - + - -

1477-1CS/SB - +GAS + - - - - -

1477-2CS/SB - + + - + + - -

1480-1CS/SB - + + - - + - -

1480-2CS/SB + +GAS - + - - - -

1497-1CT/SB + +GAS + - + + + -

1497-2CT/SB + +GAS + - + + + -

1499-1CS/SB + + - - - + + -

1499-2CS/SB + + - - - + + +

1500-1CS/SB + +GAS - - - + - +

1500-2CS/SB + +GAS - - - + + +

1501CT/SB + +GAS - - - + + +

1540CT/SB + +GAS - - + + + +

1542CT/SB + + - - - + + +

1696CS/VB - +GAS + - - - - +

1697CS/SS - + + - - + - +

1697-1CS/SB - +GAS + + + + - +

1697-2CS/SB - +GAS + + - + - +

1698-1CS/SB - +GAS + + + + - +

1698-2CT/SB - + + - - + - +

(43)

38

1699-2CS/SS + +GAS - - - + - +

1699CS/SB + + - - - - + -

1700CT/VB - +GAS + + + + + +

1700CT/SS + +GAS - + - + - +

1700CT/SB + +GAS + + + + + +

1741CS/SS - +GAS - + - - - +

1741CT/VB - + - - - -

1742CT/VB - + + - - - - -

1742CS/CT - +GAS + - - - - -

1821-1CS/VB - +GAS - - - + - -

1821-2CS/VB - +GAS + - - + - -

1823CS/VB - - - + - - - +

1824CS/SS - + + + - + - +

1839-1CS/VB - + + + - + - -

1839-2CS/VB - + + - - + - -

1841CT/VB - + - - - + - -

1879CT/SS - + - + - + - +

1880-1CS/SB - + - - - +

1880-2CS/SB - +GAS - - - +

1884CS/SB - +GAS - - - +

1884CT/SS + + - + - + + -

1887CT/SS - + + - - + - -

1888CS/SB - + - - - +

1889CS/SB - +GAS + - - - - +

1890CT/SB - + - - - + - +

(44)

39

1909-1CT/SS - +GAS + + + + - +

1909-2CT/SS - +GAS + + + + - +

1909CS/SS - +GAS + + + + - +

2033CT/VB - +GAS + - + + - -

2035CS/SS - +GAS + + + + - +

2035-1CT/SS - +GAS + + + + - +

2035-2CT/SS - +GAS + + + + - +

2051-1CS/SS - +GAS - - - + - +

2051-2CS/SS + +GAS - + - - - -

2051-1CT/SS + +GAS - + - - - -

2051-2CT/SS - + + + + - + -

2052-1CS/SS - +GAS - + - + - +

2052-2CS/SS - +GAS - - - + + +

2052-3CS/SS - + - + - - + +

2073CT/VB - +GAS + + - + - +

2074-1CT/VB - +GAS - + - + - -

2074-2CT/VB - +GAS + + + + - +

2074-1CS/VB - +GAS - + - + - +

2077CS/VB + +GAS - + - - - -

Taxonomia en rojo: Salmonellas detectadas según las características de una Salmonella positiva de acuerdo a su bioquímica típica.

A continuación se muestra como se leen las bioquímicas y como se reportan tomando en cuenta la taxonomía del LESP.

AGAR TSI=

Lactosa= amarillo positivo (+) rojo negativo(-) se detecta en el pico. Glucosa= amarillo positivo (+) rojo negativo(-) se detecta en el fondo. H2S= Negro positivo (+).

AGAR LIA=

LDC (descarboxilacion de la lisina)= morado positivo(+), amarillo negativo (-), rojo negativo(-). H2S=negro positivo (+).

AGAR MIO= Movilidad, Indol y Ornitina.

(45)

40

L

G

H2S

LDC

H2S

M

I

O

-

+GAS

+

+

+

+

-

+

Cuadro. 5 Se describe las respuestas de la bioquímica típica de Salmonella

TSI

LIA

MIO

# MUESTRAS

L

G

H2S

L

H2S

M

I

O

1697-1CS/SB

-

+GAS

+

+

+

+

-

+

1698-1CS/SB

-

+GAS

+

+

+

+

-

+

1909-1CT/SS

-

+GAS

+

+

+

+

-

+

1909-2CT/SS

-

+GAS

+

+

+

+

-

+

1909CS/SS

-

+GAS

+

+

+

+

-

+

2035CS/SS

-

+GAS

+

+

+

+

-

+

2035-1CT/SS

-

+GAS

+

+

+

+

-

+

2035-2CT/SS

-

+GAS

+

+

+

+

-

+

2074-2CT/VB

-

+GAS

+

+

+

+

-

+

(46)

41

Cuadro. 7 Resultados de la identificación de las 6 cepas de Salmonella obtenidas de la carne molida de res y cerdo. Las cuales fueron enviadas al

Laboratorio INDRE (Instituto De Diagnostico Y Referencia Epidemiológicos).en el Estado de México.

Número de muestra

Género Especie Aglutinación en grupos.

1697 Salmonella Anatum Grupo E

1698 Salmonella Infantis Grupo C

1909 Salmonella Agona Grupo B

2035 Salmonella Agona Grupo B

2074 Salmonella Agona Grupo B

2098 Salmonella B Grupo B

Cepas identificadas con el equipo micro Scan Walk Away 96.

(47)

42

11. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.

El trabajo realizado en esta investigación, cumplió los objetivos que se plantearon al 100 %. De los resultados obtenidos de acuerdo al número de muestras procesadas (80), se aisló el 10% , resultó ser sospechas de Salmonella. Las condiciones de trabajo en el laboratorio, el equipamiento e instalaciones facilitaron la culminación de este proyecto.

La importancia de conocer la incidencia de Salmonella en un alimento, es importante para evitar posibles enfermedades gastrointestinales en la población. También, para planear estrategias preventivas que conlleven medidas higiénicas, en especial en alimentos así como en su manipulación.

De acuerdo a lo estudiado, las condiciones higiénicas con las que se trabajan los cárnicos, no son las adecuadas. A pesar de tener como resultado un 10 % de incidencia de Salmonella, se deberían obtener la nula presencia de ella.

(48)

43

La serotipificacion es un proceso obligatorio después de la biotipificación de la Salmonella. Esto es debido a que se requiere confirmar su presencia, ya que el sinergismo de otras bacterias como Proteus, puede confundir o dejar dudoso un diagnóstico. La severidad de sus efectos en el organismo obliga la confirmación precisa de su presencia, para asignar confiablemente el medicamento de acuerdo a los pacientes que se presentan patologías de Salmonella.

Por otro lado, sería conveniente llegar a una identificación molecular por medio de PCR (Reacción en Cadena de las Polimerasas) e identificar también los genes resistentes a los antibióticos usados para su eliminación tales como aquellos antibióticos derivados del acido-z-cefalosporánico como las cefalosporinas y de aquellas penicilinas que tienen un anillo beta lactámico.

La cooperación incondicional y apoyo de los Químicos Analistas, fue parte de este logro. El trabajo concluido en tiempo y forma, fue de acuerdo a lo planeado inicialmente y de acuerdo al cronograma de actividades.

(49)

44

12. ANEXOS

MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS

AGAR SULFITO BISMUTO

Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de Salmonella y otros bacilos entéricos.

Composición:

Extracto de carne 5.0g Sulfato ferroso 300mg Digerido pancreático de caseína

5.0g

Agar 20.0g

Digerido péptico de tejido animal 5.0g

Indicador de sulfito de bismuto 8.0g

Dextrosa 5.0g Verde brillante 25.0g Fosfato de sodio 4.0g Agua destilada 1000mL Con un pH final de 7.6± 0,2

Preparación:

Suspender los ingredientes en el agua destilada. Calentar agitando

Frecuentemente y dejar hervir no más de 1 a 2 minutos. Evitar el sobrecalentamiento.

Enfriar entre 50ºC y 55ºC, mezclar suavemente para

Que se disperse el precipitado, colocar 20 mL de medio por cada placa Y dejar solidificar.

(50)

45 BASE DE CALDO TETRATIONATO

La Base de Caldo Tetrationato es utilizada como un medio de

enriquecimiento selectivo para especies de Salmonella que pueden estar

presentes en pequeñas cantidades y que compiten con otras bacterias de la flora

intestinal. Las salmonellas pueden ser dañadas durante el procesamiento de los

alimentos,

Sometiéndose a bajas temperaturas, calor, desecación, radiación y adición

de preservativos. Aún cuando las células dañadas no desarrollen en medios de

cultivo selectivos, al estar presentes, éstas pueden causar daño al ser ingeridas

con los alimentos.

Mueller demostró la efectividad del Caldo Tetrationato para el

enriquecimiento de bacilos tifoídicos y paratifoídicos y la inhibición de coliformes.

En una modificación del medio de Mueller, Kauffman incrementó el número de

aislamientos positivos de Salmonella. La base de Caldo Tetrationato está

especificada en los Métodos Estándar para las pruebas de Salmonella.

En este medio la peptona provee la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas

y aminoácidos. La selectividad del medio está dada por la combinación del

tiosulfato de sodio y tetrationato (el tetrationato es formado en el medio con la

adición de yodo y yoduro de potasio en solución). Los organismos que tienen la

enzima tetrationato reductasa proliferan en el medio. Las sales biliares suprimen el

desarrollo de coliformes e inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas. El

carbonato de calcio neutraliza y absorbe los metabolitos tóxicos.

Mezcla de Peptonas 5.0 Carbonato de Calcio 10.0 Sales biliares 1.0

Tiosulfato de Sodio 30.0 pH 8.4 ± 0.2.

Procedimiento:

Referirse a los procedimientos y Métodos Estándar para el aislamiento e identificación de Salmonella.

(51)

46 AGAR VERDE BRILLANTE

Medio de enriquecimiento altamente selectivo para el aislamiento de

Salmonella spp., excepto S. typhi y S. paratyphi, a partir de muestras clínicas,

alimentos, y otros materiales de importancia sanitaria. No se recomienda para el

aislamiento de Shigella spp.

Es de un valor excepcional cuando se investiga un gran número de muestras de heces o alimentos, por su alta capacidad de diferenciación de las colonias sospechosas.

Fundamento

En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo fenol es el indicador de pH, que vira al amarillo cuando hay producción de ácido a partir de la fermentación de azúcares, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el verde brillante actúa como agente selectivo.

Fórmula (en gramos por litro):

Pluripeptona 10.0 Sacarosa 10.0 Extracto de levadura 3.0 Rojo de fenol 0.08 Cloruro de sodio 5.0 Verde brillante 0.0125 Lactosa 10.0 Agar 20.0

Instrucciones:

Suspender 58 g de polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 2 o 3 minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos. Secar la superficie del medio por unos minutos en la estufa pH final: 6.9 ± 0.2.

Siembra:

(52)

47

medios menos selectivos, como Salmonella Shigella agar (B02-138-05), o Mac Conkey agar (B02-114-05).

Incubación:

Incubar 24 horas a 35-37°C..

Resultados:

Microorganismos:

• Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis ATCC 13076,

Salmonella typhi, Salmonella typhimurium ATCC 14028 y Shigella flexneri. ATCC 12022.

(http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/verdebriagar.htm).

SALMONELLA SHIGELLA AGAR.

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia.

Fundamento:

Es un medio de cultivo selectivo y diferencial.

La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp.

Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio.

Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.

Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes.

(53)

48

Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra en Selenito caldo (B02-120-05).

Fórmula (en gramos por litro)

Pluripeptona 5.0 Tiosulfato de sodio 8.5 Extracto de carne 5.0 Citrato ferrico 1.0 Lactosa 10.0 Agar 13.5

Mezcla de sales biliares 8.5 Verde brillante 0.00033 Citrato de sodio 8.5 Rojo nuetro 0.025

Instrucciones:

Suspender 60 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar. Calentar a ebullición durante 2 o 3 minutos. NO

ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50°C y distr ibuir unos 20 ml por placa. Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa y con un pH final: 7.0 ± 0.2.

Siembra:

Sembrar por estriado la superficie del medio de cultivo.

Recomendaciones, se aconseja sembrar en forma conjunta una placa de agar E.M.B. (B02-101-05) o de agar Mac Conkey (B02-114-05).

Incubación

Durante24-48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.

(54)

49 PRUEBA TSI (TRIPLE SUGAR IRON Ó TRIPLE AZÚCAR HIERRO)

El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la identificación de la producción de SH2.

Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:

• bacterias fermentadoras de la glucosa • bacterias fermentadoras de la lactosa • bacterias fermentadoras de sacarosa • bacterias aerogénicas

• bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre.

Procedimiento:

Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35° durante 24 horas.

Resultados:

• Pico alcalino/fondo negro: Glucosa fermentada, pero no fermenta la lactosa , producción de ácido sulfhídrico. Salmonella spp.

PRUEBA LIA (LYSINE IRON AGAR Ó AGAR LISINA HIERRO)

(55)

50 Procedimiento:

Inocular en forma de estría las cepas de micro organismo en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37°.

PRUEBA MIO (MOTILITY-INDOLE-ORNITINE Ó MOTILIDAD-INDOL-ORNITINA)

Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de Indol a la descarboxilación de la ornitina.

Procedimiento:

Inocular en picada las cepas de microorganismo en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37°.

Interpretación y Resultados:

Reacción Interpretación

Enturbiamiento del Agar.

Hay movilidad

Agar transparente de- sarrollo solo en picada

No hay movilidad

Azul (alcalino) Descarboxila ornitina

Coloración Amarilla (ácido) No descarboxila

Rojo (anillos) Indol (+)

Amarillo (anillos) Indol ( - )

(56)

51 CALDO NUTRITIVO

Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el desarrollo de microorganismos con escasos requerimientos nutricionales. Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

Fundamento

Medio no selectivo, contiene pluripeptona y extracto de carne que constituyen la fuente de carbono y nitrógeno necesarias para el adecuado desarrollo bacteriano. Puede ser utilizado además, como preenriquecimiento en la búsqueda de Salmonella spp. a partir de alimentos, ya que permite recuperar células dañadas, diluir metabolitos tóxicos y sustancias inhibitorias.

Formula en gramos por litro:

Pluripeptona 5.0 y extracto de carne 3.0. pH final: 6.9 ± 0.2.

Instrucciones: Emplear 8 g de polvo por litro de agua destilada. Si es necesario, calentar hasta disolver. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos.

Siembra

Por inoculación directa de la muestra o del microorganismo en estudio.

Incubación

En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24 horas.

Microorganismos Crecimiento

S. aureus ATCC 25923 Bueno S. epidermidis ATCC 14990 Bueno S. typhimurium ATCC 14028 Bueno

Características del medio

Medio preparado: ámbar claro.

Almacenamiento

(57)

52

Medio preparado: a 2-8 ºC.

(http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/nutritivocaldo.htm.).

SELENITO CISTINA CALDO.

Medio utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella spp. a partir de muestras de alimentos, productos lácteos y otros materiales de importancia sanitaria.

Fundamento

En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable, el selenito de sodio inhibe flora Gram positiva y la mayoría de la flora entérica excepto Salmonella spp.. La l-cistina es el agente reductor y fue propuesta por la FDA para el aislamiento de Salmonella en productos alimenticios incrementando la recuperación por reducción de la toxicidad del selenito.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona 5.0 Lactosa 4.0 Fosfato de sodio 10.0 Selenito de sodio 4.0

L-Cistina 0.01

Suspender 23 g del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar ligeramente hasta disolución completa. Evite el calentamiento excesivo y no esterilice en autoclave. pH final: 7.0 ± 0.2

Siembra

Puede realizarse la siembra partiendo de un caldo de preenriquecimiento o en forma directa conservando la proporción 1:10.

Incubación

(58)

53 Resultado.

Microorganismos Crecimiento

Salmonella enteritidis ATCC 13076 Bueno

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Bueno

Escherichia coli ATCC 25922 Regular-escaso

Proteus mirabilis ATCC 43071 Regular-escaso

Características del medio

Medio preparado: ámbar muy claro de transparente a ligeramente opalescente.

Almacenamiento:

Medio deshidratado: a 10-35 ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC.

(59)

54 13.REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

• Norma Oficial Mexicana Nom-114-SSA-1-1994, Bienes y Servicios. Método para la determinación de Salmonella en alimentos.

• Fernández Escartín. (2000), Microbiología e inocuidad de los alimentos,1ra edición.

• Fernández Escartin. (2000), Microbiología Sanitaria Agua y Alimentos, Volumen I, editorial Universidad de Guadalajara.

• Frazier W.C.(1993) Microbiología de los Alimentos, 4ta edición. Acriba. España.

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