Obtención de microorganismos probióticos en un medio no láctico

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(1)OBTENCION DE MICROORGANISMOS PROBIOTICOS EN UN MEDIO NO LACTICO. CLARA JULIANA GOMEZ MOLINA. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERIA DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA BOGOTA, ENERO 2004.

(2) OBTENCION DE MICROORGANISMOS PROBIOTICOS EN UN MEDIO NO LACTICO. CLARA JULIANA GOMEZ MOLINA, Autor. EDGAR MAURICIO VARGAS SOLANO (MSc.), Asesor. Trabajo presentado como requisito parcial para optar al título de Ingeniero Químico. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERIA DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA BOGOTA, ENERO 2004.

(3) IQ-2003-2-09. Nota de Aceptación. _____________________________________________________. _____________________________________________________. _____________________________________________________. Asesor. ____________________________________________. Jurado ____________________________________________. Jurado. ____________________________________________. Bogotá, Enero 30 de 2004.. iii.

(4) A mis padres y mi hermano por su apoyo incondicional y por ser la luz que guía mi vida..

(5) IQ-2003-2-09. AGRADECIMIENTOS. El autor expresa sus agradecimientos a:. Edgar Mauricio Vargas S., Ingeniero Químico y asesor de este proyecto por la confianza depositada, por la orientación y la constante motivación. A los profesores del Departamento de Ingeniera Química de la Universidad de los Andes por la formación académica y su apoyo. Al Centro de Investigación de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad de los Andes por haber creído en este proyecto. A Mónica Parra y María Alexandra Romero, por su colaboración y apoyo para este proyecto. A la directora del Centro Investigación en Microbiología de la Universidad de los Andes y a su equipo de trabajo, por su colaboración. A Julián Zamora por su colaboración y dedicación. A Cristina Gómez por su amplia colaboración y apoyo. A José María Robles y al personal del Centro de Investigación y Tecnología de la Universidad de los Andes por su valiosa colaboración en todo momento.. IV.

(6) IQ-2003-2-09. TABLA DE CONTENIDO. Pág.. 1 JUSTIFICACION. 1. 2 ANTECEDENTES. 3. 3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. 4. 4 OBJETIVOS. 6. 4.1 OBJETIVO GENERAL. 6. 4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS. 6. 5 IMPORTANCIA DEL PROYECTO. 7. 6 REVISION BIBLIOGRAFICA. 8. 6.1 PROBIOTICOS. 8. 6.1.1 Reseña Histórica de los Probióticos. 8. 6.1.2 Descripción de la Flora Intestinal. 11. 6.1.3 Efecto de los Probióticos en la Salud Humana. 12. 6.1.4 Uso de Probióticos en Animales. 13. 6.1.5 Descripción de las Bacterias Probióticas. 18. 6.2 FERMENTACIONES. 22. 6.2.1 Generalidades. 22. v.

(7) IQ-2003-2-09. 6.2.2 Fermentación Acidoláctica. 22. 6.3 MODELO CINETICO DE CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS. 25. 6.3.1 Crecimiento Celular. 25. 6.3.2 Patrones de Crecimiento y Ecuaciones de Crecimiento. 26. 6.3.3 Modelos Cinéticos. 32. 7 MATERIALES Y METODOS. 35. 7.1 AISLAMIENTO DE LAS BACTERIAS. 35. 7.2 IDENTIFICACION, CARACTERIZACION Y CONSERVACION DE LAS CEPAS. 37. 7.3 FORMULACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. 39. 7.3.1 Discusión Preliminar. 39. 7.3.2 Análisis de Laboratorio Preliminares. 40. 7.3.3 Composición de los Medios de Cultivo. 40. 7.4 FERMENTACIONES BATCH. 42. 7.4.1 Inóculo y Condiciones de la Fermentación. 43. 7.4.2 Medición de Parámetros. 44. 8 CALCULOS DE CINETICA DE CRECIMIENTO Y RESULTADOS. 46. 8.1 FERMENTACION DE LACTOBACILLUS EN EL MEDIO DE CULTIVO 1. 46. 8.2 FERMENTACION DE LACTOBACILLUS EN EL MEDIO DE CULTIVO 2. 52. 8.3 FERMENTACION DE LACTOBACILLUS EN EL MEDIO DE CULTIVO 3. 55. vi.

(8) IQ-2003-2-09. 8.4 FERMENTACION DE BIFIDOBACTERIUM EL MEDIO DE CULTIVO 2. 59. 8.5 FERMENTACION DE BIFIDOBACTERIMEN EL MEDIO DE CULTIVO 3. 62. 8.6 DETERMINACION DEL MEJOR MEDIO DE CULTIVO. 67. 8.7 DETERMINACION DE LA CINETICA DE CRECIMIENTO. 71. 8.7.1 Determinación del Modelo de Crecimiento. 71. 8.7.2 Cálculo de los Parámetros Cinéticos. 82. 8.7.3 Ecuaciones Cinéticas y Curvas de Crecimiento. 83. 9 COSTOS ASOCIADOS AL EXPERIMENTO. 85. 10 ANALISIS DE RESULTADOS Y DISCUSION. 86. 11 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. 93. BIBLIOGRAFIA. 96. ANEXOS. 101. vii.

(9) IQ-2003-2-09. LISTA DE ANEXOS. Pág. Anexo A. Composición de Medios y Caldos de Cultivo. 102. Anexo B. Procedimiento Tinción de Gram. 105. Anexo C. Preparación de Medios de Cultivo. 107. Anexo D. Procediemiento para Medición de Parámetros. 109. Anexo E. Datos y Resultados Cinéticos para las Fermentaciones.. 114. viii.

(10) IQ-2003-2-09. LISTA DE TABLAS. Pág. Tabla 1. Subespecies de microorganismos probióticos Tabla 2. Datos bibliográficos sobre crecimiento celular de lactobacillus acidophilus Tabla 3. Resultados de caracterización de las cepas. Tabla 4. Composición del medio de cultivo 1 Tabla 5. Composición del medio de cultivo 2 Tabla 6. Composición del medio de cultivo 3 Tabla 7. Número de Fermentaciones Tabla 8. Métodos utilizados para la medición de parámetros de crecimiento Tabla 9. Datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación 3, medio 1 Tabla 10. Continuación Datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación 3, medio 1 Tabla 11. Datos obtenidos de velocidad de crecimiento de lactobacillus, fermentación 3, medio 1. Tabla 12. Datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación 2, medio 2. Tabla 13. Datos obtenidos de velocidad de crecimiento para lactobacillus, fermentación 2, medio 2. Tabla 14. Datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación 5, medio 3 Tabla 15. Continuación datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación 5, medio 3 Tabla 16. Datos de velocidad de crecimiento para lactobacillus, fermentación 5, medio3 Tabla 17. Datos de parámetros de crecimiento para bifidobacterium, fermentación 4, medio 2 Tabla 18. Continuación datos de parámetros de crecimiento para bifidobacterium, fermentación 4, medio 2. Tabla 19. Datos de parámetros de crecimiento para bifidobacterium,. ix. 18 24 38 41 41 42 43 44 47 48 50 52 53 55 56 58 60 61 63.

(11) IQ-2003-2-09. fermentación 4, medio 3 Tabla 20. Continuación datos de parámetros de crecimiento para bifidobacterium, fermentación 4, medio 3 Tabla 21. Datos de velocidad de crecimiento para bifidobacterium, fermentación 4, medio 3. Tabla 22. Resumen de parámetros cinéticos hallados Tabla 23. Valores de constantes de velocidad media lactobacillus Tabla 24. Valores de velocidad de crecimiento celular y viabilidad de células obtenidos de los modelos planteados para lactobacillus Tabla 25. Valores de constantes de velocidad media bifidobacterium Tabla 26. Valores de velocidad de crecimiento celular y viabilidad de células obtenidos de los modelos planteados para bifidobacterium Tabla 27. Parámetros cinéticos obtenidos del modelo de crecimiento Tabla 28. Ecuaciones cinéticas, balance de sustrato y tiempos de la curva de crecimiento Tabla 29. Comparación de costos de medios de cultivo Tabla 30. Composición de medio de cultivo MRS Tabla 31. Composición caldo de cultivo MRS Tabla 32. Composición de medio de cultivo Rogosa Tabla 33. Composición de medio de cultivo TPY Tabla 34. Composición de caldo de cultivo TPY Tabla 35. Datos de calibración Curva de DNS Tabla 36. Datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación1, medio 1 Tabla 37. Datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación 2, medio 1 Tabla 38. Datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación 4, medio 1. Tabla 39. Datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación 5, medio 1. Tabla 40. Datos de crecimiento para Fermentación de lactobacillus en medio 1 Tabla 41. Datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación1, medio 2 Tabla 42. Datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación3, medio 2. Tabla 43. Datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación 4, medio 2. Tabla 44. Datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación 5, medio 2 Tabla 45. Datos de crecimiento para Fermentación de lactobacillus en medio 2. x. 64 65 70 73 74 78 79 82 84 85 101 102 102 103 103 111 113 115 117 119 121 122 123 125 126 128.

(12) IQ-2003-2-09. Tabla 46. Datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación1, medio 3 Tabla 47. Datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación2, medio 3 Tabla 48. Datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación3, medio 3. Tabla 49. Datos de parámetros de crecimiento para lactobacillus, fermentación4, medio 3 Tabla 50. Constantes cinéticas para fermentaciones de Lactobacillus en medio 3 Tabla 51. Datos de parámetros de crecimiento para bifidobacterium, fermentación1, medio 2. Tabla 52. Datos de parámetros de crecimiento para bifidobacterium, fermentación 2, medio 2 Tabla 53. Datos de parámetros de crecimiento para bifidobacterium, fermentación 3, medio 2 Tabla 54. Datos de parámetros de crecimiento para bifidobacterium, fermentación 5, medio 2 Tabla 55. Datos de crecimiento para Fermentación de bifidobacterium en medio 2 Tabla 56. Datos de parámetros de crecimiento para Bifidobacterium, fermentación1, medio 3. Tabla 57. Datos de parámetros de crecimiento para Bifidobacterium, fermentación 2, medio 3. Tabla 58. Datos de parámetros de crecimiento para Bifidobacterium, fermentación 3, medio 3. Tabla 59. Datos de parámetros de crecimiento para Bifidobacterium, fermentación5, medio 3. Tabla 60. Constantes cinéticas para fermentaciones de Bifidobacterium en medio 3.. xi. 128 130 132 133 136 137 138 140 142 143 144 145 147 149 151.

(13) IQ-2003-2-09. LISTA DE FIGURAS. Pág. Figura 1. Patrón de curva de crecimiento típica en fermentaciones de bacterias y hongos. Figura 2. Muestra de cultivo por aislamiento en Agar Rogosa Figura 3. Fotografía Microscópica de Lactobacillus aislado (100X) Figura 4. Fotografía Microscópica de Bifidobacterium aislado (100X) Figura 5 .Crecimiento celular, consumo de sustrato y producción de ácido láctico para fermentación 3 de lactobacillus en medio de cultivo 1. Figura 6 .Gráfica de Crecimiento celular, fermentación 2 de lactobacillus en medio de cultivo 2 Figura 7 .Crecimiento celular, consumo de sustrato y producción de ácido láctico para fermentación 5 de lactobacillus en medio de cultivo 3 Figura 8 .Crecimiento celular, fermentación 4 de Bifidobacterium en medio de cultivo 2 Figura 9. Gráfica de crecimiento celular, consumo de sustrato y producción de ácido láctico para fermentación 4 de Bifidobacterium en medio de cultivo 3. Figura 10. Gráfica de concentración celular contra tiempo para fermentación de Lactobacillus en medio 1, 2 y 3. Figura11. Curva de crecimiento para fermentación de lactobacillus en medios 1, 2 y 3 Figura 12. Gráfico de concentración celular contra tiempo para fermentación de Bifidobacterium en medios 2 y 3. Figura 13. Curva de crecimiento para fermentación de bifidobacterium en medios 2 y 3 Figura 14. Gráfico de velocidad de crecimiento contra concentración de sustrato para lactobacillus, medio 3 Figura 15. Gráfica de velocidad de crecimiento contra concentración de ácido láctico para lactobacillus, medio 3. Figura 16. Gráfica de la velocidad específica contra el tiempo, calculados por los diferentes modelos para lactobacillus Figura 17. Gráfica de viabilidad de células contra tiempo obtenidas por el modelo planteado para lactobacillus Figura 18. Gráfica de velocidad de crecimiento contra concentración de. xii. 27 35 37 37 50 54 59 62 66 67 68 69 69 72 73 75 76 77.

(14) IQ-2003-2-09. sustrato para bifidobacterium, medio 3. Figura 19. Gráfica de velocidad de crecimiento contra concentración de ácido láctico para bifidobacterium, medio 3. Figura 20. Gráfica de la velocidad específica contra el tiempo, calculados por los diferentes modelos para bifidobacterium. Figura 21. Gráfica de viabilidad de células contra tiempo obtenidas por el modelo planteado para bifidobacterium. Figura22. Curva decrecimiento para lactobacillus en medio de cultivo de melaza de caña – peptona. Figura 23. Curva decrecimiento para Bifidobacterium en medio de cultivo de melaza de caña – peptona. Figura 24. Datos de crecimiento celular contra tiempo para los medios de cultivo formulados comparándolos con datos bibliográficos. Figura 25. Muestras del método de DNS para realizar la espectrofotometría Figura 26. Curva de calibración para DNS Figura 27. Crecimiento celular, consumo de sustrato y producción de ácido láctico para fermentación 1 de lactobacillus en medio de cultivo 1. Figura 28. Crecimiento celular, consumo de sustrato y producción de ácido láctico para fermentación 2 de lactobacillus en medio de cultivo 1. Figura 29. Crecimiento celular, consumo de sustrato y producción de ácido láctico para fermentación 4 de lactobacillus en medio de cultivo 1. Figura 30. Crecimiento celular, consumo de sustrato y producción de ácido láctico para fermentación 5 de lactobacillus en medio de cultivo 1. Figura 31. Crecimiento para fermentación 1 de lactobacillus en medio de cultivo 2 Figura 32. Crecimiento para fermentación 2 de lactobacillus en medio de cultivo 2 Figura 33. Crecimiento para fermentación 4 de lactobacillus en medio de cultivo 2 Figura 34. Crecimiento para fermentación 5 de lactobacillus en medio de cultivo 2 Figura 35. Crecimiento celular, consumo de sustrato y producción de ácido láctico para fermentación 1 de lactobacillus en medio de cultivo 3 Figura 36. Crecimiento celular, consumo de sustrato y producción de ácido láctico para fermentación 2 de lactobacillus en medio de cultivo 3. Figura 37. Crecimiento celular, consumo de sustrato y producción de ácido láctico para fermentación 3 de lactobacillus en medio de cultivo 3. Figura 38. Crecimiento celular, consumo de sustrato y producción de ácido láctico para fermentación 4 de lactobacillus en medio de cultivo 3. Figura 39. Crecimiento para fermentación 1 de bifidobacterium en medio de. xiii. 78 80 81 83 84 88 110 111 115 117 119 121 123 124 126 127 130 132 134 136 138.

(15) IQ-2003-2-09. cultivo 2 Figura 40. Crecimiento para fermentación 2 de bifidobacterium en medio de cultivo 2. Figura 41. Crecimiento para fermentación 3 de bifidobacterium en medio de cultivo 2 Figura 42. Crecimiento para fermentación 5 de bifidobacterium en medio de cultivo 2 Figura 44. Crecimiento celular, consumo de sustrato y producción de ácido láctico para fermentación 1 de Bifidobacterium en medio de cultivo 3 Figura 45. Crecimiento celular, consumo de sustrato y producción de ácido láctico para fermentación 2 de Bifidobacterium en medio de cultivo 3. Figura 46. Crecimiento celular, consumo de sustrato y producción de ácido láctico para fermentación 3 de Bifidobacterium en medio de cultivo 3. Figura 47. Crecimiento celular, consumo de sustrato y producción de ácido láctico para fermentación 5 de Bifidobacterium en medio de cultivo 3. xiv. 140 141 143 145 147 149 151.

(16) IQ-2003-2-09. RESUMEN. La producción actual de carne en Colombia se encuentra limitada, debido a la mala alimentación a la que está sometida el ganado por la ingestión de pastos de forraje y agua de mala calidad, que causan en los animales el padecimiento de enfermedades del gastro intestinal, impidiendo el buen desarrollo físico del animal, aumento en la tasa de mortalidad y disminución de la producción de becerros. Actualmente en Europa y Estados Unidos existen normas que prohíben la importación de alimentos que durante su producción involucren el uso de antibióticos, debido a las trazas de estos que se pueden trasmitir al cuerpo humano; es por esto que países como Colombia deben fomentar la búsqueda de nuevos productos que alivien la deficiencia en producción de carne. La solución que se plantea es la producción de microorganismos probióticos para ser incluidos en alimentación animal, debido al efecto benéfico que se ha comprobado por años estos tienen sobre la salud. Los microorganismos se. producen. mediante el. aprovechamiento de un recurso agrícola nacional que no involucre medios de cultivo lácticos como los usuales para optimizar de esta manera los costos y la eficiencia de la producción y comparar el crecimiento con un medio láctico que proviene de residuos de la industria lechera.. xv.

(17) IQ-2003-2-09. En este proyecto se obtuvieron. cepas de microorganismos probióticos a partir de. productos lácteos comerciales y se formuló un medio de cultivo que contiene melaza de caña como fuente de carbono.. Los resultados que se obtuvieron arrojaron un crecimiento máximo celular da bacterias probióticas, tanto Lactobacillus como Bifidobacteria de 5,0 g/L y 3,5 g/L, lo cual comparado con crecimientos reportados por institutos de investigación se encuentra en un rango del 10% menor que el mayor crecimiento reportado y de 40% mayor que el menor reportado.. Las fermentaciones que se realizaron en el medio de cultivo de melaza de caña para la especie de Lactobacillus, tomaron un tiempo total de 29 horas para arrojar el mayor crecimiento, lo cual frente al promedio de 36 horas hallado en otros experimentos representa una optimización de recursos y costos.. La cinética de las fermentaciones realizadas se ajusto al modelo de Monod simple, el cual arrojo parámetros cinéticos d e velocidad de crecimiento, que representan la pendiente alta en fermentaciones de lactobacillus, disminuyendo el tiempo de la fermentación, y un crecimiento sostenido en las fermentaciones de bifidobacterium.. xvi.

(18) IQ-2003-2-09. 1. JUSTIFICACIÓN. El desarrollo de los alimentos saludable ha ascendido rápidamente en las últimas décadas a nivel mundial, debido a los beneficios que estos brindan a los seres humanos y a los animales. En Europa y Asia, el crecimiento de ésta industria ha sido del 20% entre 1992 y 1997. Dentro del mercado de estos alimentos saludables se encuentran con una participación de los 65%, aquellos que tienen como valor agregado cultivos probióticos. 1. Los componentes activos de los probióticos son una mezcla de bacterias ácidolácticas, entre las que se encuentran Lactobacili, Bifidobacteria y Enterococci entre otras, las cuales componen la flora intestinal de humanos y animales. Estos microorganismos necesitan básicamente de una fuente de carbono junto con otros micronutrientes para su crecimiento adecuado.. Varios estudios han demostrado la influencia positiva que tienen los cultivos probióticos en la salud humana actuando benéficamente en la flora intestinal del individuo.2 Entre 1 2. Pardio, Violeta , Los probióticos y su futuro, Archivos Latinoamericanos de nutrición, Volumen 46, 1998. Holzapfel, Wilhelm et al “ Introduction to pre- and probiotics”, Food Research International, Mayo 15 de 2001.. 1.

(19) IQ-2003-2-09. los numerosos beneficios en la salud humana se incluye el sostenimiento de una flora intestinal saludable, protección contra las infecciones, disminución de la intolerancia a la lactosa y estimulación del sistema inmune.3. En los animales, se han realizado varios estudios en vacunos y se ha descubierto. que. evitan enfermedades tales como: mastitis, descalcificación e infecciones en el tracto reproductivo.4 Además los probióticos disminuyen las alteraciones digestivas e inducen el aumento del peso del animal en un 20%, lo cual lleva a reducir los costos por unidad producida de carne.5. 3 Marteau, P., De Vrese, M. et al “ Protection from gastrointestinal diseases with the use of probiotics”, American Journal of Clinical Nutrition, Volumen 73, 2001. 4 Wiiliams, P.C.V. “ La acción de los cultivos de levadura en el rumen”, en Biotecnología en la industria de alimentación animal, Editorial Setosa, Volumen 1, México 1999. 5 Hobsobson, P. “Crianza de un ternero para carne”, Editorial CECSA, 1985.. 2.

(20) IQ-2003-2-09. 2. ANTECEDENTES. Europa, Estados Unidos y Japón, ha desarrollado alimentos de varias clases con cultivos probióticos entre los cuales los más desarrollados han sido los derivados de la leche y los cereales. En Latinoamérica el mercado de los probióticos se ha desarrollado básicamente en los productos lácteos, en países como Chile, Brasil y Argentina.. Actualmente en Colombia, la producción de alimentos con probióticos es incipiente, siendo la industria de lácteos la única que ha desarrollado productos con estas condiciones debido a la facilidad para obtener crecimiento de los microorganismos en un medio láctico6. Los probióticos utilizados actualmente en alimentos diferentes a los derivados de la leche, son importados de países como Japón lo cual implica costos de adquisición y transporte elevados.. 6 Krasaekoopt, W., Bhandari, B., Deeth, H. “Evaluation of encapsulation techniques of probiotics foyoghurt”,International Dairy Journal, Junio 19 de 2001.. 3.

(21) IQ-2003-2-09. 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. Colombia ocupa el tercer puesto en volumen de producción de carne en América Latina, después de países como Argentina y Chile, sin embargo se esta alejando de los índices productivos de carne de los países industrializados tanto en volumen como en calidad debido al manejo primario que se le ha dado a la parte nutricional de la ganadería en Colombia, que hace que la producción de leche y carne sea ineficiente. Estudios de Fedegan indican que la mala calidad de los pastos de forraje y la contaminación de las aguas, hacen que disminuyan las colonias de bacterias benéficas presentes en el intestino del animal, que permiten desdoblar los alimentos y mantenerlo saludable.. El mal funcionamiento del sistema digestivo produce deficiencias de minerales en los huesos y en los tejidos desarrollando mastititis, descalcificación, infertilidad posparto, retención de líquidos y tejidos de la placenta que producen endometritis, lo cual lleva a un alto índice de mortandad de cabezas de ganado al año, disminuyendo la producción de carne de buena calidad.. Para evitar todas las enfermedades anteriores existen tratamientos costosos a base de antibióticas que afectan el útero de las vacas alterando la gestación y reduciendo la producción de leche. Así también la carne producida tiene trazas del antibiótico, o que va. 4.

(22) IQ-2003-2-09. en contra de las legislaciones europeas y americanas de no permitir la importación de carne que involucre antibióticos en cualquiera de sus pasos de producción, sacando a Colombia de la competencia internacional.. Es así como se hace necesario el desarrollo de un producto alimenticio para ganado vacuno que contenga microorganismos probióticos, el cual mejore el funcionamiento intestinal del animal, mejorando la producción de carne.. 5.

(23) IQ-2003-2-09. 4. OBJETIVOS. 4.1 OBJETIVO GENERAL. Obtener un cultivo de microorganismo probióticos a partir de un medio no láctico, utilizando como fuente de carbono productos agrícolas del país y determinar las condiciones óptimas para su crecimiento.. 4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS. •. Aislar los microorganismos probióticos de un medio no láctico y caracterizar las cepas.. •. Encontrar la fuente de carbono proveniente de un medio agrícola más adecuada para el crecimiento de los microorganismos.. •. Determinar la composición del medio de cultivo óptimo para una buena velocidad de crecimiento.. •. Evaluar la cinética de crecimiento de la reacción biológica y encontrar las condiciones para optimizar el crecimiento.. 6.

(24) IQ-2003-2-09. 5. IMPORTANCIA DEL PROYECTO. Colombia es un país con un gran potencial en la industria biotecnológica, debido a los recursos naturales que se tienen para la explotación, los cuales pueden ser utilizados en beneficio de la salud humana y de los animales, obteniendo beneficios económicos en varias áreas.. La importancia de obtener cultivos probióticos desarrollados en un medio diferente al lácteo, indica que varios alimentos diferentes a los de. la industria láctea podrán. contener dicho ingrediente, presentando como valor agregado la influencia positiva sobre la flora intestinal del individuo y así generar nuevos mercados.. Al producir los probióticos en medios diferentes al lácteo, se puede implementar en alimentos para animales, aprovechando los efectos que este tiene sobre bovinos, equinos, porcinos y aves.. Así, Colombia que es un país ganadero tendrá más. oportunidades de entrar en los mercados extranjeros con carne de la mejor calidad que cumpla con las nuevas tendencias internacionales de consumir productos que no contengan antibióticos en su producción.. 7.

(25) IQ-2003-2-09. 6. REVISION BIBLIOGRAFICA. 6.1 PROBIOTICOS. 6.1.1 Reseña Histórica de los Probióticos. El descubrimiento incipiente de los probióticos se remonta a miles de años, cuando los sumerios describieron en sus tablas 6000 años atrás la fabricación del queso como un producto de mayor atractivo dietético transformado por las bacterias.. Durante varios siglos se conocía el papel benéfico. de la ingestión de leches. fermentadas, pero hasta 1908 el científico ruso Ilya Metchnikoff observo que una gran proporción de los habitantes de Bulgaria tenían un período de vida superior a los 100 años y debido a que Bulgaria no era un país muy avanzado, inquirió que la longevidad de sus habitantes no se debía a la medicina moderna, encontrando así que los habitantes de este país consumían gran cantidad de yogurt y verduras cultivadas artesanalmente, así. 8.

(26) IQ-2003-2-09. Metchnikoff enfatizó en los beneficios que proporcionaba el consumo de yogurt, debido a que las verduras no eran un factor determinante de la longevidad, por lo cual recibió el Premio Novel de Medicina ese año.7. En 1940 en Francia se creo la leche “Bifidus”, la cual contenía un alto porcentaje de bifidobacterias y se suministraba a niños con deficiencias nutritivas. En 1950 la empresa Degussa H&N de los Estados Unidos sacó al mercado BIOghurt y BIOgarde yogurt y leche con contenido de bifidobacterias.. Lilly y Stilwell en 1965 utilizaron el término Probiótico para nombrar los productos de la fermentación gástrica, esta palabra se derivaba del latín pro – a favor de y del griego bios – vida. A través de los años la definición fue modificada a microorganismos y compuestos participantes en el balance y desarrollo microbiano intestinal.. En 1986 en Suiza promocionó la primera leche (BIO) con contenido de bacterias prebióticas. La definición de probióticos que se utiliza actualmente es la dada por R. Fuller en 1989 que dice: “ Son aquellos microorganismos vivos, principalmente. 7. Gómez, Pablo. Importancia Terapéutica de las Bifidobacterias, Documento del simposio nacional sobre probióticos, en www.probiotic.es, Madrid- España, Marzo 200, p.30.. 9.

(27) IQ-2003-2-09. bacterias y levaduras, que son agregados como suplemento en la dieta y que afectan en forma beneficiosa al desarrollo de la flora microbiana en el intestino”.8. En 1990 comenzó el auge de los alimentos con contenido probiótico, en países como Estados Unidos, Canadá, Francia, Alemania y Japón, los primeros productos presentes en el mercado que tenían probiótico en su formulación eran derivados de la leche debido a la facilidad de cultivar las bacterias en ese medio, poco a poco los probióticos se fueron incluyendo en productos utilizados como suplementos que además de contener probióticos contienen vitaminas, enzimas, cereales y levaduras. En los últimos años de la década del 90, Japón ha incrementado la investigación para obtener bacterias probióticas en un medio de cultivo no láctico como por ejemplo la leche de soya, optimizando así costos de producción y diversificando el mercado.. Así mismo, Estados Unidos se ha encargado de producir cereales para consumo humano y animal con probióticos. En Europa, entre los años 1998 y 2002 se ha aumentado la producción de alimentos con contenido probiótico en un 20%.9. 8 9. Ibid, p.28 Pardio, Violeta , Los probióticos y su futuro, Archivos Latinoamericanos de nutrición, Volumen 46, 1998.. 10.

(28) IQ-2003-2-09. 6.1.2 Descripción de la Flora Intestinal10. A partir de nuevas técnicas de la ciencia se ha descubierto que la composición que se conocía de la flora intestinal era errada. Hoy en día se sabe que la proporción de coniformes está entre 1-4 % del total y son las responsables de la síntesis de la Vitamina K. El grupo que predomina son los Bifidus o bifidobacterias y los bacteroides, y en menor proporción se encuentran los Lactobacillus aeróbicos y el grupo Acidophilus. El intestino delgado medio (pasaje del Yeyuno Ileum) esta compuesta por 33% de lactobacillus, 33% de Bifidobacterias ,33% de Estreptococos y 1% de otras bacterias. El intestino grueso se compone de 33% Lactobacillus y Eubacterias, 33% Bacteroides, 20% Bifidobacterias, 11% Peptococos y 3% otros microorganismos. En el intestino delgado también hay una población menor de micrococos, levaduras, bacilos, clostridium, hongos y levonellas. Estudios realizados durante varios años han demostrado que la flora intestinal tiene efectos tanto negativos como positivos en su hospedante determinando la longevidad de su vida y además afectan el sistema inmune del individuo evitando la invasión de gérmenes patógenos y activando la inmunidad loca. La estabilidad de las defensas depende de la estabilidad del equilibrio de la flora intestinal, donde hay competencia constante entre las diferentes poblaciones de individuos. En este punto juegan un papel muy importante los Lactobacillus y la Bifidobacterium ya que estas, mantienen el equilibrio dentro del grupo de las bacterias patógenas (E. Coli y Proteus), 10. Ayala, Javier, Utilización de Microorganismos probióticos, Documento del simposio nacional sobre probióticos, en www.probiotic.es, Madrid- España, Marzo 200, p.56.. 11.

(29) IQ-2003-2-09. además que son las únicas que sobreviven al pasar el tracto gastrointestinal, por lo cual se deben incluir constantemente en la dieta de los mamíferos.. 6.1.3. Efecto de los Probióticos en la Salud Humana11. Las bacterias probióticas tienen gran cantidad de efectos benéficos en la salud, entre los cuales se encuentran: • Acción antagonista de hacia Salmonella y Listenia • Inhibición de la invasión y crecimiento de bacterias Prevención de la diarrea y de la colonización de uropatógenos • Buena digestión de la lactosa • Evitan la pérdida de la densidad ósea por descalcificación • Desconjugan el colesterol • Estimulación del sistema inmune • Prevención de tumores cancerígenos en el colon • Efecto Antihipertensivo • Previenen las enfermedades inflamatorias intestinales. 12.

(30) IQ-2003-2-09. 6.1.4 Uso de probióticos en Animales. •. Generalidades. En los últimos años se ha desarrollado en Japón y Estados Unidos algunos alimentos que tienen una mezcla simbiótica de elementos que ayudan a mejorar el funcionamiento del sistema digestivo de algunos “pets” o animales domésticos, esta mezcla consiste en la combinación de probióticos, prebióticos (oligasacáridos digestibles parcialmente en el intestino grueso) y cofactores (sustancias que ayudan al desarrollo de los probióticos)12. Estas mezclas simbióticas presentan elevados costos de producción debido esencialmente a la necesidad de crecer los probióticos en medios de cultivo que arrojen un buen rendimiento de producción celular, lo que desembocan en elevados costos para el consumidor haciendo que esta clase de alimentos sean utilizados solo para animales domésticos y para casos de alimentación muy especializados. Actualmente en Estados Unidos existen diversidad de productos (cereales y suplementos) para animales domésticos (perros, gatos y caballos) que tienen un contenido probiótico y se adquieren a costos elevados. Japón por su parte desarrolló una mezcla probiótica que se importa en algunas países productores de Carne para ser mezclada con el concentrado que se. 11 12. Ibíd, p. 67 Pardio, Violeta , Los probióticos y su futuro, Archivos Latinoamericanos de nutrición, Volumen 46, 1998.. 13.

(31) IQ-2003-2-09. suministra al ganado, la cual eleva casi en un 50% los costos de producción de carne de buena calidad.. •. Producción de carne13. Actualmente en el mundo existen dos factores preponderantes que están marcando la pauta en la producción de carne, estos son el rendimiento de la producción animal y la calidad de la carne la cual no debe contener residuos de antibióticos que hayan suministrados al animal. Para obtener un buen rendimiento en la producción animal intensiva es necesario el uso de antibióticos para prevenir infecciones del animal y que al mismo tiempo sirven de precursores del crecimiento mediante la eliminación de algunos microorganismos no deseados que se encuentran en el tracto digestivo. El problema del uso de estos antibióticos radica en que trazas o residuos de los mismos quedan en la carne y que al ser consumida por el hombre creen resistencia de microorganismos patógenos a la acción de algunos antibióticos dejando al humano en condiciones precarias de defensas ante el ataque de algunas bacterias. Es así como en Asia y Europa se ha fomentado el consumo de alimentos que no involucren antibióticos en su producción, creando leyes que benefician la importación de alimentos proteínicos que cumplan con este requisito.. 13. Estrada, Ricardo, Desarrollo de Probióticos, Cofactores y Prebióticos, Séptimo Concurso Nacional de Proyectos de I&D, Universidad de Madrid, España, Agosto de 2002.. 14.

(32) IQ-2003-2-09. Es así como el uso de los antibióticos como estimulantes del crecimiento y preventores de enfermedades serán eliminados a nivel mundial y una alternativa para su sustitución es la utilización de cultivos probióticos.. •. Ventajas del uso de probióticos. Las bacterias ácido lácticas que conforman los probióticos, si son ingeridas por el animal en concentraciones adecuadas de 107 UFC/gr de alimento,14 colonizan el intestino, haciendo que la flora intestinal sea homogénea y útil dando los siguientes resultados: • Garantizan un pH suficientemente bajo en el intestino para que no se desarrollen microorganismos patógenos (coliformes, salmonellas, estáfilos y bacterias Gramnegativas en general). • Prevención de las diarreas por inhibición de la flora causante y disminución de la mortalidad que las misma causan en animales de edad corta. • Disminución de las enfermedades pulmonares ligadas al sistema gastrointestinal. • Mejor Absorción de los nutrientes y por lo tanto ganancia de peso. • Mejoramiento de las condiciones fisiológicas de los residuos orgánicos de los animales haciendo que sirvan con abono y fertilizantes.. 15.

(33) IQ-2003-2-09. • Mejoramiento del funcionamiento del sistema inmune.. •. Situación Actual en Colombia. Un gran limitante en la producción de carne y leche en Colombia, es el alto costo de la implantación de nuevas tecnologías que mejoren la calidad y el volumen del producto, así como también el manejo primario que se le ha dado a la parte nutricional de la ganadería, factores que han alejado los índices productivos del país a los de países industrializados y que han hecho que Colombia este perdiendo el tercer lugar que ocupa en la producción y exportación de carne magra. Investigaciones y estudios en diferentes rebaños que han realizado las diferentes entidades que controlan la actividad ganadera en Colombia, dieron como resultado las deficiencias nutricionales que afectan tanto la producción de leche como de carne y que se deben a la baja calidad del agua y pastos de forraje que sirven de alimento al ganado y que hacen que las colonias de bacterias buenas que se encuentran en el intestino no cumplan a cabalidad su función de desdoblar los alimentos y proteger el organismo del animal, creando una deficiencia de minerales en los huesos y tejidos, mastitis, descalcificación o síndrome de la vaca caída, aumento en los índices de infertilidad posparto, infecciones en el tracto reproductivo, endometritis e infecciones del tracto. 14. Shimakawa, Y, Matsubara, S et al, Evaluation breve strain Yakult-Fermented soy milk as a probiotic food, en International Journal of Food Microbiology, Tokyo, Mayo 2002, p.1. 16.

(34) IQ-2003-2-09. gastro intestinal. El suministro de antibióticos para combatir las anteriores enfermedades en algunos casos provocan anestro permanente, es decir la vaca no entra en celo, lo que ha disminuido la producción de becerros en un 40 % a nivel nacional.15 En los últimos años países como Japón, estados Unidos y la comunidad europea en general han enviado representantes a Colombia en busca de empresas dispuestas a exportar carne magra con alta calidad, rendimiento y manejo de la misma, por lo cual se hace necesario implementar una nueva alimentación que suprima los antibióticos y aumente la producción, siendo una buena opción los probióticos. También es indispensable producir alimentos que aumenten la producción de carne, a bajo costo para una mayor penetración en el mercado y que involucren en su producción materia prima nacional, como por ejemplo la caña de azúcar la cual es un residuo del proceso de producción del azúcar. La melaza es un residuo que actualmente se utiliza en menor proporción para alimento de ganado vacuno, bovino y porcino y para la producción de algunos dulces. Según el informe estadístico de Asocaña en el año 2002, la producción de melaza fue de 572.487 toneladas, de las cuales se vendieron el 60% a razón de 56.5 dólares la tonelada, observando así el bajo costo de esta posible materia prima para la producción de probióticos y el posible aprovechamiento de sobredemanda existente en el país.. 15. Fedegan, Informe estadistico anual año 1998, Documentos públicos de la Federación Nacional de Ganaderos, Bogotá- Colombia, Abril 1999.. 17. la.

(35) IQ-2003-2-09. 6.1.5 Descripción de las Bacterias Probióticas. A continuación se muestra una tabla donde se mencionan las subespecies de bacterias que deben contener un alimento prebiótico, resaltado en negrilla son las subespecies de obligatoriedad.16. Tabla 1. Subespecies de microorganismos probióticos Microorganismos usados en productos probióticos Productos para humanos Productos para animales Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus Lactobacillus casei Lactobacillus casei Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus delbrueckii Lactobacilus johnsonii Lactobacillus plantarum Lactobacillus reuteri Lactobacillus reuteri Lactobacillus rhamnosus Bifidobacterium bifidum BIfidobacterium adolescentis Bacillus subtilus Streptococcus thermophilus Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium breve Pediococcus pentosaceus Bifidobacterium longum Enterococcus faecium Bifidobacterium Infantis Saccharomyces cerevisiae Streptococcus thermophilus Aspergillus oryzae Saccharomyces boulardi Torulopsis spp.. •. Especie Lactobacillus. La especie lactobacillus fue descubierta en 1907 por Ilya Metchnikoff en el instituto Pasteur en Francia, debido a las investigaciones en fermentación de leche. En años 16. Gómez, Pablo. Importancia Terapéutica de las Bifidobacterias, Documento del simposio nacional sobre probióticos, en www.probiotic.es, Madrid- España, Marzo 2002.. 18.

(36) IQ-2003-2-09. posteriores se descubrió que lactobacillus ocupa el octavo lugar en densidad de población en la flora intestinal de humanos y mamíferos, y están presentes en gran cantidad en la mucosa vaginal creando un ambiente ácido para evitar las infecciones urogenitales. La especie más importante de lactobacillus es Lactobacillus reuteri, la cual utiliza un proceso de fermentación para convertir azúcares de los alimentos en CO, nutrientes y ácido láctico.. En 1985, en la Universidad de ciencias de Uppsala, Suiza, los profesores Lindaren y Dobrogosz descubrieron las propiedades antimicrobianas de lactobacillus, con lo cual surgió la investigación a cerca de los organismos probióticos.17. •. Morfología18. Lactobacillus son bacterias Gram-positivas, lo que significa que tienen una membrana celular interna rodeada por una pared celular gruesa de peptidoglicano, cuya función es dar rigidez al cuerpo celular y permitir el paso de nutrientes, enzimas y sustancias de desecho producto del metabolismo celular. Miden 0.5 – 1.2 x 1.0 – 10 µm. Usualmente tiene forma de varas largas pero también pueden presentarse en forma de cocoides en cadenas cortas. No esporulan y no presentan movilidad frecuente, son anaeróbicas facultativas en algunas ocasiones y normalmente son organismos microaerofílicos y su. 17. Ramírez, Miguel Angel, Utilización de Microorganismos Probióticos en la Industria Alimentaria, Ponencia en el VII Congreso sobre Calidad en la Industria Alimentaria, Vittoria-Garleiz, Mayo 2003, p.32.. 19.

(37) IQ-2003-2-09. crecimiento es mejor en condiciones reducidas de oxigeno. Las colonias en agar son usualmente de 2-5 mm y redondas, convexas y sin pigmento. Su metabolismo es fermentativo y sacarolástico, cerca de la mitad de su producto final es ácido láctico. Su temperatura óptima de crecimiento es entre 30-40°C, en un rango aceptable entre 26 y 46°C, a un pH de 4.5- 7.2. Es un microorganismo no patógeno.. •. Especie Bifidobacteria. La especie Bifidobacterium fue descubierta en 1900 por el doctor Tissier del Instituto de Investigación Louis Pasteur en Francia, a partir de muestras de materia fecal de bebés alimentados con leche materna. Alexander (1948) y Robinson (1951) realizaron estudios clínicos de bebés alimentados con leche materna y con elche en polvo concluyendo que las Bifidobacterias. predominaban únicamente en los bebes del primer grupo y. encontraron que esta especie de bacteria suprime los microorganismos patógenos del intestino a través de un sistema de autolimpieza. Al principio esta bacteria se considero como una especie de Lactobacillus por producir ácido acético y ácido láctico a partir del metabolismo de azúcares simples ( Weiss y Rettger, 1934), sin embargo años después se descubrió que este tipo de bacterias se reproducía en un medio anaerobio recibiendo el nombre de Bifidobacterium compuesto por onces subespecies.. 18. Halt, J, Bergey´s Manual of Determinate bacteriology, Novena edición, Sneath p, Staley J, Williams,S. Baltimore, USA, 1994, p.568.. 20.

(38) IQ-2003-2-09. •. Morfología19. El género Bifidobacterium ocupa el tercer puesto en población bacterial en el intestino humano y animal después de los géneros Bacteroides y Eubacterium. Bifidobacteria son bacterias Gram – positivas, presentan la forma de varas o cilindros usualmente de forma curva y ramificada. Mide ente 0.5 – 1.3 x 1,5 – 8 µm, se presenta en arreglos simples, forma de V, cadenas o rosetones. Ocasionalmente exhibe forma de cocoide. Son inmóviles, no esporulan y no son ácidotolerantes. Son anaeróbicas y unas pocas subespecies pueden crecer en un ambiente enriquecido con 10% de CO2. No presentan crecimiento en un pH por debajo de 4,5 y por encima de 8,5. Su metabolismo se dirige principalmente hacia la fermentación de carbohidratos produciendo ácido acético y acético láctico en una proporción de 3:2. La temperatura óptima de crecimiento se encuentra entre 37 – 41 °C, sin embargo su rango de crecimiento se da entre los 3444°C, se considera microorganismo no patógeno.. 19. Ibíd, p.345.. 21.

(39) IQ-2003-2-09. 6. 2 FERMENTACION. 6.2.1 Generalidades. Pasteur demostró que las fermentaciones son procesos catabólicos. realizados por. microorganismos donde un compuesto orgánico actúa como dador de electrones y el producto es el receptor de los mismos. Los productos derivados de la fermentación son muy variados, es frecuente que algunas fermentaciones desprendan gases o ácidos, lo que favorece la identificación de bacterias. El crecimiento de las bacterias en experimentación primaria como en el caso de este estudio se realiza en una fermentación de tipo batch donde las células se cultivan en un recipiente con una carga inicial de medio de cultivo celular que no es alterado durante el tiempo de la fermentación por adición o remoción de nutrientes o de medio fresco, solamente se adiciones los componentes necesarios para las condiciones de crecimiento del microorganismos como aire, oxígeno u otro gas y basé o ácido para el mantenimiento del pH.. 6.2.2 Fermentación acidoláctica Las bacterias probióticas acido lácticas, realizan sobre los substratos donde crecen un proceso metabolico de crecimiento celular no esporulado y un proceso catabolico. 22.

(40) IQ-2003-2-09. fermentativo denominado fermentación acidoláctica que puede ser de tipo homoláctica como en el caso de Lactobacillus donde el producto final es lactato o ácido láctico, mientras que en las de tipo heteroláctico como en Bifidobacterias donde se puede producir etanol y/o otros ácidos además del ácido láctico. La reacción general para una fermentación de tipo acidoláctico es: Glucosa + ADP +Piruvato → Ácido láctico + ATP CO2 + Etanol + Ácido X . Como se observa en la reacción anterior, la fermentación ácido láctica utiliza como fuente directa de substrato la Glucosa, la cual es la fermentación de productos lácteos proviene de la descomposición de la Lactosa, azúcar compuesta. Es así como investigaciones en la búsqueda de nuevos productos han llevado a probar nuevas fuentes de carbono diferentes a un medio láctico para la fermentación que realizan las bacterias acidolácticas entre ellas las probióticas, a continuación se muestra una tabla donde se muestran datos reportados en la bibliografía acerca de crecimiento celular de lactobacillus acidophilus (principal subespecie de lactobacillus) en leche comparado con fuentes de azúcar no lácticas.. 23.

(41) IQ-2003-2-09. Tabla 2. Datos bibliográficos sobre crecimiento celular de lactobacillus acidophilus. Substrato (fuente de Carbono) Leche Leche de Soya Repollo Chino Rábano Repollo Cebolla Verde Tomate Zanahoria Espinaca Papa Puerro Alga Tangle Mugwort Maíz Harina Buck Wheat Batata Cebada Malta. Crecimiento celular (g/ml) 0.0060 0.0038 0.0033 0.0025 0.0037. Viabilidad de Células Log (UFC/ml) 9.7 5.8 8.3 6.9 7.8 7.2 5.8 8.1 7.8 5.0 6.6 6.9 7.1 7.6 6.8 6.1 7.8 6.6 6.6 8.5. (-) No hay información disponible. Fuentes: (Y, Shimakawa, 2002, p.3; Kim, Hye 2000,p.323; Charalampopoulos,D, 2002, p,135; Ostlie, H, 2002, p.3). 24.

(42) IQ-2003-2-09. 6.3 MODELO CINÉTICO DE CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS. 6.3.1 Crecimiento Celular. En fermentaciones es necesario conocer la cinética de crecimiento de los cultivos para poder predecir la evolución de los mismos, es decir, como se irá consumiendo el substrato y como se acumula el producto de la fermentación, sin estos factores es casi irresponsable iniciar el diseño a gran escala de un bioreactor industrial. Las células que se aislan y se cultivan en un volumen finito de medio de cultivo, utilizan los nutrientes a sus disposición con mayor eficiencia y rapidez que pueden, sintetizando los componentes celulares y duplicando su masa y material genético. El tiempo en el cual las células tardan en hacer este proceso de denomina tiempo de generación y según la clase de bacteria y el substrato puede variar entre 20 minutos en condiciones óptimas de crecimiento y varios meses en condiciones del suelo. Cada vez que transcurre el tiempo de generación el número de células se duplica en un incremento exponencial, como se muestra en la siguiente ecuación:. N = N0 2g. (1). Donde, No = Número de células inicial. 25.

(43) IQ-2003-2-09. g = Número de generaciones transcurridas N = Número de células al final Si se toma τd al tiempo de generación y t al tiempo del cultivo trascurrido la ecuación anterior queda:. t. N = N 2 τd 0. (2). Aplicando logaritmo natural a la ecuación anterior se obtiene: Ln( N ) = Ln( N 0 ) +. t Ln(2) τd. (3). Se observa de la ecuación anterior que el logaritmo del número de células crece linealmente con el tiempo a razón de una constante igual a ln2/τd , por lo tanto si τd es muy grande el crecimiento será lento (poca pendiente) y viceversa.. 6.3.2 Patrón de Crecimiento y Ecuaciones de Crecimiento. El desarrollo de un cultivo discontinuo sigue un patrón de crecimiento típico representado por la siguiente figura:. 26.

(44) IQ-2003-2-09. Figura 1. Patrón de curva de crecimiento típica en fermentaciones de bacterias y hongos. (Fuente: Cayré, María E, Validación y comparación de Modelos de Crecimiento Microbiano, Facultad de Ingeniería Química UNNE, Chaco Argentina, 2002, p.23.). Como se observa en la figura anterior una curva de un cultivo batch típico incluye cuatro fases: fase de latencia, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte. Sin embargo en algunas fermentaciones se tienen dos fases más que son la fase de aceleración que se encuentra al final de la fase de latencia y al principio de la fase exponencial y la fase de desaceleración que se encuentra al final de fase exponencial y al principio de la fase estacionaria, sin embargo, en cultivos típicos de bacterias estas dos fases tienden a desaparecer de la curva decrecimiento debido al tiempo reducido en el que se llevan a cabo.. La fase de latencia ocurre después de agregar el inoculo al medio de cultivo fresco, donde las células se adaptan a las nuevas condiciones del ambiente (temperatura, composición del medio, condiciones de aireación y pH). Durante esta fase la masa. 27.

(45) IQ-2003-2-09. celular puede incrementarse un poco pero sin incrementar la densidad del número de células. La duración de esta fase es variable y en general es mayor a medida que el cambio en las condiciones del cultivo es más grande y a medida que la edad del inoculo es mayor, por lo tanto se deben tener las condiciones óptimas en composición, volumen y edad del inóculo para obtener una fase de latencia pequeña.. La fase exponencial, también conocida como la fase de crecimiento logarítmico las células ya se han ajustado a su nuevo ambiente y se multiplican rápidamente tanto en masa celular como en densidad de número de células.. En esta fase de un crecimiento equilibrado donde en incremento en el número de células, en la biomasa del cultivo y en el proceso catabólico es paralelo y el cambio en concentración celular X (g/L), en un intervalo corto de tiempo se puede expresar como: dX = µX dt. (4). y la constante de proporcionalidad µ (h-1) se denomina velocidad de crecimiento específica. Integrando la ecuación 4 y aplicando logaritmo natural se tiene:. Ln( X ) = Ln( X 0 ) + µt. (5). Así comparando esta ecuación con la ecuación 3, se puede deducir que:. 28.

(46) IQ-2003-2-09. τd =. Ln(2 ). (6). µ max. Es decir que hay una correlación entre el valor de la velocidad de crecimiento y el tiempo de generación. La velocidad de crecimiento específica se puede calcular a partir de medidas experimentales.. Para describir mejor la cinética de crecimiento es necesario definir relaciones estequiométricas respecto al consumo de substrato que decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa, esta relación se expresa como:. YX = − S. ∆X ∆S. (7). YX/S se denomina coeficiente de rendimiento de utilización del substrato para crecimiento celular y mide la cantidad de biomasa que puede producirse por unidad de. substrato consumido.. Así mismo, la cantidad de producto de la reacción biológica se relaciona con la cantidad de sustrato consumido, dando el coeficiente YP/S denominado coeficiente de rendimiento de utilización del substrato para producción, en este caso para la. producción de ácido láctico y sigue la siguiente ecuación:. 29.

(47) IQ-2003-2-09. YP = − S. ∆P ∆S. (8). Relacionando la variación de la biomasa con la del substrato, se obtiene un coeficiente qs (h-1) denominado velocidad específica de consumo de substrato por el organismo y relaciona la velocidad específica de crecimiento con el rendimiento del substrato.. µ = YX q s. (9). S. Por último se puede definir el coeficiente de mantenimiento, m (g sustrato /g células* h), el cual describe la velocidad a la cual el substrato realiza el mantenimiento celular el cual representa la energía gastada para reparar daños en la composición celular, para movilidad de las células, para transferir nutriente y productos dentro y fuera de las células, su valor se encuentra dentro de 0 a 1.. m es el intersecto en el eje Y de una gráfica de concentración de sustrato sobre la. concentración celular en un tiempo dado contra la velocidad específica de crecimiento, así la ecuación para m es la siguiente: ⎛ ⎛ 1 ⎞ dS ⎜ 1 =⎜ ⎜ ⎟ ⎝ X ⎠ dt ⎜ YX ⎝ S. ⎞ ⎟ ⎟⎟ µ + m ⎠. 30. (10).

(48) IQ-2003-2-09. En la fase estacionaria la velocidad de crecimiento neta es cero lo que no significa que no haya producción de nuevos microorganismos sino que la aparición de nuevos individuos. se compensa por la muerte de otros, por lo tanto es una fase. metabolicamente activa. dX =0 dt. (11). En esta fase se produce la esporulación y la biosíntesis de metabolitos secundarios y la composición macromolecular de la célula cambia ya que sus demandas metabólicas son distintas.. En la fase de muerte el número de microorganismos vivos disminuye exponencialmente, es decir los microorganismos presentes se duplican en menor proporción. La fase de muerte se da por acumulación tóxica de de producto o por decaimiento de la cantidad de substrato presente.. La velocidad de muerte usualmente sigue una ecuación cinética de primer orden:. X = XSe. − kdt. (12). Donde, Xs = concentración de células al final de la fase estacionaria (g/L). 31.

(49) IQ-2003-2-09. kd = constante de velocidad de muerte (h-1). 6.3.3 Modelos Cinéticos. Existen modelos cinéticos de primer orden que describen el comportamiento de las células en la fase exponencial y estacionaria, que son suficientes para describir las fermentaciones para propósitos de diseño y control. Los modelos se clasifican por la estructuración y la segregación. Los modelos mas simples son los modelos no estructurados de crecimiento, es decir, la biomasa se describe por una sola variable, también los modelos no presentan segregación de la población celular lo que indica que todas las células son iguale sen el modelo.. El modelo más simple y el que siguen casi todos los cultivos de bacterias y hongos es la ecuación de Monod, que relaciona la velocidad de crecimiento específica y la. concentración del substrato, cuando solo hay un sustrato limitante como en el caso de la fermentación ácidoláctica.. µ = µ max. S KS + S. 32. (13).

(50) IQ-2003-2-09. Esta ecuación depende de la máxima velocidad de crecimiento que puede alcanzar el microorganismo µmáx (h-1), de la concentración de substrato y de un valor Ks que representa la concentración de substrato a la que se alcanza una velocidad de crecimiento igual a la mitad de la máxima.. Para el caso de las fermentaciones con productos de alta concentración, en este caso si se producen más de 35 g/L de ácido láctico, se tiene el modelo de Monod por inhibición por producto no competitiva, en el cual la velocidad de crecimiento depende de las. concentraciones de producto y de sustrato y de la constantes de velocidad media Ks y. Kp; esta última corresponde a la concentración de sustrato cuando la velocidad decrecimiento es la mitad de la máxima. A continuación se muestra la ecuación de Monod para el modelo mencionado.. µ=. µ max P ⎞ ⎛ K S ⎞⎛ ⎟ ⎜1 + ⎟⎜⎜1 + S ⎠⎝ K P ⎟⎠ ⎝. (14).. Existen otros modelos que podrían utilizarse para la descripción de la cinética de la fermentación de interés, como la ecuación logística (Ricker, 1979), sin embargo requieren de una experimentación más especializada y el uso de herramientas computacionales avanzadas.. 33.

(51) IQ-2003-2-09. Para completar el modelo cinético es necesario realizar un balance de sustrato en un tiempo dado de la fermentación.. ⎛ dS ⎜ 1 = dt ⎜⎜ Y X ⎝ S. ⎞ ⎛ ⎟ dX ⎜ 1 ⎟⎟ dt + ⎜⎜ Y ⎠ ⎝ PS. ⎞ ⎟ dP ⎟⎟ dt + mX ⎠. (15). También existe un modelo que describe el comportamiento en fermentaciones de bacterias y depende de la cantidad de células viables en un momento dado, es la ecuación modificada de Gompertz, de primer orden20.. Log (N ) = A + ce−e. − B (t − M ). (16). Donde, N = Número de células viables al tiempo t A = Logaritmo decimal del número inicial de microorganismos C = Número de ciclo de crecimiento B = Es la velocidad de crecimiento máxima relativa al tiempo M M = Tiempo requerido para alcanzar la velocidad máxima de crecimiento.. 20. Merchuk, José, Monografía de cultivo microbiano, Programa Regional del Desarrollo Científico y Tecnológico, Universidad de Ru Hurí, BeerShera- Israel, 2002, Cap5, p.43-53.. 34.

(52) IQ-2003-2-09. 7. MATERIALES Y MÉTODOS. 7.1 AISLAMIENTO DE LAS BACTERIAS. Para el aislamiento de la cepa de Lactobacillus, se utilizaron medios sólidos de cultivo de. agar Rogosa (Merck). y agar MRS (DeMann, Rogosa, Sharpe; Merck) cuyas. composiciones y método de preparación se muestra en el anexo A. Se tomaron muestras de yogurt y kumis comercial y se realizaron cultivos en diferentes cajas por el método de cultivo por aislamiento.. Figura 2. Muestra de cultivo por aislamiento en Agar Rogosa.. 35.

(53) IQ-2003-2-09. Debido a que tanto en el yogurt como en el kumis existe la presencia de levaduras y estas presentan crecimiento en los medios de cultivo sólidos utilizados, a pesar de ser específicos, se hizo necesario realizar la incubación no a su temperatura óptima de crecimiento de 37°C sino a una temperatura de 44°C, a la cual no crecen las levaduras presentes en los medios lácticos y además esta en el rango permisible de crecimiento de la bacteria. La incubación de lactobacillus se realizó por 48 horas en un medio microaerofílico que se logro mediante la colocación de las cajas de petri en un recipiente cerrado con una vela dentro, que se prendía y absorbía el oxígeno presente en el recipiente. Después de 48 horas de crecimiento se observaron las colonias y de colonias aisladas se realizo de nuevo una siembra en el mismo medio y a las mismas condiciones hasta obtener cepas completamente puras de la especie.. Para la especie de Bifidobacterium se realizó el procedimiento anterior utilizando Agar TPY (Tryptone, Peptone, Yeast) que fue preparado en el laboratorio (Anexo A), y se le adicionó L- cysteina- HCL. La incubación en este caso se realizó también a 42°C, para evitar el crecimiento de levaduras y se creo un ambiente anaerobio mediante la utilización de sobre de Anaerobiosis- Anaerogen (Biomerieux), en una jarra de Anaerobiosis de 2,5 L (Biomerieux).. 36.

(54) IQ-2003-2-09. 7.2 IDENTIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LAS CEPAS. Después de obtener las cepas aisladas se realizó la identificación en una lámina mediante tinción de Gram (Anexo B), para luego ser observada al microscopio. Mediante ayuda de la teoría acerca de la morfología de las bacterias se realizó la identificación de las especie Lactobacillus y Bifidobacterium. A continuación se muestran fotografías macroscópicas de las cepas aisladas y una tabla acerca de la caracterización de las bacterias.. Figura 3. Fotografía Microscópica de Lactobacillus aislado (100X). Figura 4. Fotografía Microscópica de Bifidobacterium aislado (100X). 37.

(55) IQ-2003-2-09. Tabla 3. Resultados de caracterización de las cepas. Característica. Forma Estructura Coloración Esporulación Condiciones Aeróbicas Colonias Temperatura óptima de aislamiento pH óptimo de crecimiento Medio de cultivo óptimo de aislamiento Medio líquido de cultivo para conservación. Lactobacillus Cilindros, varitas largas, cocoides Cadenas Gram positivas NO Microaerófilos Sin pigmentación, redondas 44°C 5.5 Agar Rogosa Caldo MRS. Bifidobacterium Cilindros pequeños. Cadenas Gram positivas NO Anaerobiosis Sin pigmentación, ovaladas 42°C 6.2 Agar TPY Caldo TPY. Para la conservación de las cepas se tomaron colonias aisladas de las cajas de Petri y se realizaron siembras en caldos de cultivos específicos para cada cepa, Caldo MRS (Difco) para Lactobacillus y Caldo TPY (anexo A) Preparado en el laboratorio para Bifidobacterium, se incubaron a 37°C durante 48 h, y se mantuvieron a 4°C, haciendo repiques en caldo cada 8 días para mantener las cepas activas.. La determinación de las cepas también se realizó mediante la utilización del Kit API 50 ChL (Biomerieux) para lactobacillus y para bifidobacterium.. 38.

(56) IQ-2003-2-09. 7.3 FORMULACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. 7.3.1 Discusión Preliminar. Uno de los objetivos de este proyecto es la búsqueda de un medio de cultivo óptimo para el crecimiento de las bacterias probióticas, cuya fuente de carbono provenga de un recurso agrícola del país y comparar el crecimiento con un medio láctico formulado que contiene agua residual del proceso de pasteurización UHT (Ultra High Temperature), realizado en la sede de Funza- Cundinamarca de la empresa productora de lácteos COLANTA. Para el medio proveniente de una fuente agrícola se contemplo la posibilidad de utilizar Caña de Azúcar debido a que es un residuo y su costo es bajo, además de ser una fuente. de azúcar directa para las bacterias y la disponibilidad que existe, la papá compuesta de almidón es una buena opción, sin embargo se tienen datos de crecimientos celulares bajos , obtenidos en experimentaciones realizadas en otros países, que se deben a la gran cantidad de energía que necesitan las células para descomponer el almidón. La yuca por su costo fue descartada de entre las posibilidades, escogiendo así la melaza de caña como fuente de carbono por las ventajas mencionadas.. 39.

(57) IQ-2003-2-09. 7.3.2 Análisis de Laboratorio Preliminares. Para la utilización de la melaza de caña y del agua residual de UHT, se hizo necesario realizar análisis de composición de azúcares, y debido a que el agua residual no se podría autoclavar porque perdía sus características nutritivas, se realizaron análisis de microorganismos en el medio. Estos análisis se realizaron en el Laboratorio Ivonne Bernier Ltda., en la ciudad de Bogotá.. Como resultado arrojaron que la melaza tiene una composición de azucares reductores de 60% glucosa, 40% sacarosa y no se detecto la presencia de microorganismos termófilos. Para el agua residual UHT se determinó un contenido de 12% de lactosa y una población de 10 UFC/g de coliformes totales que según la norma NTC 611 del ICONTEC21 para alimentos es un contenido muy bajo de los mismos, sin embargo estos microorganismos se eliminaron por medio de una membrana de microfiltración. Millipore de 10 µm. 7.3.3 Composición de los Medios de Cultivo. La formulación del medio se realizo basado en medios típicos del crecimiento de bacterias, donde se suministra un medio de sales mínimo que proporciones sales de nitrógeno y fósforo, proteína proveniente de la levadura y la fuente de carbono, así se. 21. Instituto Colombiano de Normatividad Técnica, Contenido de Microorganismos en Alimentos, NTC 611, Bogotá – Colombia, 1997.. 40.

(58) IQ-2003-2-09. realizó la formulación mediante la utilización de un medio mínimo de sales obtenido de la bibliografía22 y las fuentes de carbono correspondientes.. Tabla 4. Composición del medio de cultivo 1 Medio 1 Componente Melaza de Caña Extracto de Levadura Medio Mínimo de Sales Fosfato de Potasio (KH2PO4) Cloruro de Amonio (NH4Cl) Sulfato de Sodio (Na2SO4) Cloruro de Calcio Hexahidratado (CaCl2*6H2O) Sulfato de Hierro (FeSO4) Cloruro de Magnesio (MgCl2). Cantidad 32 g/L 5,0 g/L. 0.5 g/L 1.0 g/L 2,0 g/L 0.001 g/L 0.0003 g/L 5 ppm. Tabla 5. Composición del medio de cultivo 2 Medio 2 Componente Agua Residual UHT Extracto de Levadura Medio Mínimo de Sales. Cantidad 45 g/L 5,0 g/L 3.3 g/L. Según Luedeking23, las fermentaciones ácido lácticos aumentan su eficiencia utilizando. peptona caseína, como fuente de proteína además de la levadura, sin embargo no es 22. Schiraldi C, Aducci V, Valli V, Maresca C, Giuiliano M et al., High cell density cultivation of. 41.

(59) IQ-2003-2-09. utilizado frecuentemente por su costo. Sin embargo se pensó que el costo que se evita utilizando glucosa como sustrato podría compensar la utilización de peptona caseína, por lo cual se procedió a formular un tercer medio de cultivo que presenta la siguiente composición:. Tabla 6. Composición del medio de cultivo 3 Medio 3 Componente Melaza de Caña Extracto de Levadura Peptona Caseína Medio Mínimo de Sales. Cantidad 32 g/L 5,0 g/L 10,0 g/L 3,3 g/L. 7.4 FERMENTACIONES BATCH. Para realizar la experimentación de las fermentaciones se requiere determinar un número adecuado de repeticiones de cada combinación para obtener datos estadísticamente viables. Sin embargo existía el inconveniente de no contar con la cantidad adecuada de L-cysteina- HCl para preparación de Medio TPY para Bífidobacterias, por los cual se realizo primero el ensayo con Lactobacillus para encontrar un patrón de comportamiento. probiotics and lactic acid production, Wiley Periodicals, Feb 2003, p.213-222. 23 Luedeking R, et al “ A Kinetic Study of the lactic Acid Fermentation”, Journal of Biochemical and Microbiological Technology and engineering, vol1, No. 4.. 42.

(60) IQ-2003-2-09. y aplicarlo a las primeras. Así se realizaron las siguientes fermentaciones por combinación.. Tabla 7. Número de Fermentaciones Especie. Medio. Lactobacillus spp Lactobacillus spp Lactobacillus spp Bifidobacterium spp Bifidobacterium spp. 1 2 3 2 3. No. Fermentaciones 5 5 5 5 5. 7.4.1 Inoculo y condiciones de la fermentación. Para la fermentación se preparo un inóculo de 4 ml en un tubo de ensayo que contenía la misma composición del medio de cultivo de la respectiva fermentación. El inoculo se incubó por 8 horas antes de la fermentación a 37°C.. Cada medio de cultivo se preparo en un medio estéril (Anexo C), en erlenmeyers de 250 ml, con un volumen 125 ml para que en el caso de lactobacillus la columna de aire restante garantizara una concentración de 5-10% e oxigeno creando un ambiente microaerofílico y en las fermentaciones de las Bifidobacterias, la columna de aire sirve. 43.

(61) IQ-2003-2-09. para que el Anaerogen absorba el volumen de aire encima del medio de cultivo y crea un ambiente anaerobio. Después de 8 horas de incubación del inóculo, se agrego al medio de cultivo en ambiente estéril, y se coloco el erlenmeyer en un shaker a (100 osc/min) a 37°C por 48 h.. 7.4.2 Medición de Parámetros. Para la medición de los parámetros cinéticos se tomaron muestras en intervalos de 2 horas en un tiempo aproximado de 8 horas durante algunas etapas de la fermentación de 48 horas. A continuación se presenta una tabla donde se nombran los parámetros de la fermentación que se midieron y el método por el cual se midieron, la descripción de los métodos se encuentra en el Anexo D.. Tabla 8. Métodos utilizados para la medición de parámetros de crecimiento Parámetro Concentración de masa celular o Biomasa (g/ml) Numero de células viables (UFC/ml) Concentración de Sustrato (g/ml) Concentración de ácido láctico (g/ml). 44. Método Peso Seco Conteo en placa o en agar Método colorimétrico de DNS Titulación con carbonato de sodio.

(62) IQ-2003-2-09. La concentración de sustrato solo se midió para las fermentaciones de melaza debido a que los métodos para medición de lactosa del agua residual son muy especializados. La concentración de producto no es significante sin la concentración de sustrato para medir la cinética, la concentración de ácido láctico se midió también solo para las fermentaciones que contenían melaza.. 45.

(63) IQ-2003-2-09. 8. CÁLCULOS DE CINÉTICA DE CRECIMIENTO Y RESULTADOS. En esta sección se presentan una muestra de datos y de cálculos para cada una de las combinaciones de fermentación. La muestra que se presenta es la fermentación cuyos datos más se aproximan al promedio estadístico, los datos y cálculos para las 4 fermentaciones restantes de cada combinación se muestran en el anexo E.. 8.1 FERMENTACIÓN DE LACTOBACILLUS EN EL MEDIO DE CULTIVO 1. A continuación se muestran las tablas con los resultados de medición de parámetros para la fermentación 3.. 46.