IDENTIFICACIÓN DE LOS VIRUS DENGUE Y ZIKA MEDIANTE RT-PCR EN PERSONAS ASINTOMÁTICAS DE SAN JOSÉ DE CÚCUTA, COLOMBIA, 2016.
ASTRID CAROLINA BELLO MEDINA JESSICA FERNANDA SERRANO PEREZ
UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
IDENTIFICACIÓN DE LOS VIRUS DENGUE Y ZIKA MEDIANTE RT-PCR EN PERSONAS ASINTOMÁTICAS DE SAN JOSÉ DE CÚCUTA, COLOMBIA, 2016.
ASTRID CAROLINA BELLO MEDINA JESSICA FERNANDA SERRANO PEREZ
Trabajo de grado para optar al titulo de: Bacteriólogo y Laboratorista Clínico
Director de Tesis
NÉSTOR FABIÁN GALVIS SERRANO Asesor Científico
DRA. NANCY GARCÍA Asesor Metodológico
M.Sc. JAEL CONTRERAS RANGEL
UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
ADVERTENCIA
Los autores, Astrid Carolina Bello Medina y Jessica Fernanda Serrano Pérez autorizamos a la UNIVERSIDAD DE SANTANDER (UDES) la reproducción total o parcial de este documento, con la debida cita de reconocimiento de la autoría y cedemos a la misma Universidad los derechos patrimoniales con fines de investigación, docencia e institucionales, consagrado en el artículo 72 de la Ley 23 de 1982 y las normas que lo instituyan o modifiquen.
DEDICATORIA
En primer lugar por darme la vida y tanta bendiciones recibidas como la de regalarme personas maravillosas como lo son mi Familia y Amigos.
A mis padres Miguel Eduardo Bello Duran y Nancy Medina Ibarra quienes me han dado amor, apoyo pero sobre todo han creído en mí.
A mi hermano Fabián Sneider Collantes Medina por todo su apoyo.
A nuestro director Fabián Galvis por su colaboración y por todo su conocimiento.
DEDICATORIA
A Dios, por darme la oportunidad de vivir y por estar conmigo en cada paso que doy, por fortalecer mi corazón e iluminar mi mente y por haber puesto en mi camino a aquellas personas que han sido mi soporte y compañía durante todo el periodo de estudio.
Mis padres Emiro Antonio Serrano Angarita y Mirian Pérez Pineda por darme la vida, por quererme mucho, por creer en mí y porque siempre me apoyaron desde la distancia. Mil gracias por darme una carrera para mi futuro, todo esto se los debo a ustedes.
Mi hermana Nasly Susana Serrano Pérez, por estar conmigo y apoyarme siempre, te quiero mucho Susan.
A nuestro director Fabián Galvis por su colaboración y apoyo en el transcurso de la realización de nuestro proyecto de grado.
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a:
A la Universidad de Santander UDES por prestarnos sus instalaciones donde se logró desarrollar pasó a paso nuestro proyecto de grado.
A la Dra. Claudia Sofía Montejo, Coordinadora del programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico, por estar siempre pendiente de nuestros avances académicos.
Al docente Jael Contreras por apoyarnos y guiarnos en la formación académica a lo largo de cada una de sus áreas.
A todas las personas que nos colaboraron en la toma de muestra para poder empezar con nuestro proyecto.
GLOSARIO
Aedes aegypti: “es el principal vector de los virus que causan el dengue. Los seres humanos se infectan por picaduras de hembras infectadas, que a su vez se infectan principalmente al succionar la sangre de personas infectadas1”.
Arn: “ácido ribonucleico; es un componente químico que ayuda a transmitir la información genética contenida en el adn a las fábricas de proteínas localizadas en el citoplasma de las células2”.
Artralgias: “engloba todo tipo de dolores a nivel de las articulaciones. El dolor puede ser de origen mecánico, después de repetidos esfuerzos o inflamatorio3”.
Agente etiológico: “entidad biológica, física o química capaz de causar enfermedad4”.
Dengue: “es una enfermedad vírica transmitida por mosquitos que se ha propagad o rápidamente en todas las regiones. Se conocen cuatro serotipos distintos, pero estrechamente emparentados, del virus: den-1, den-2, den-3 y den-45”.
Enfermedad reemergente: “son aquellas conocidas que aumentan después de una disminución significativa de la incidencia6”.
Epidemia: “manifestaciones de un número de casos de alguna enfermedad que excede claramente a la incidencia prevista en un periodo de tiempo determinado, en una colectividad o región7”.
Inmunidad: “estado de resistencia general asociado con la presencia de anticuerpos o células que poseen acción específica contra el organismo causante
1 MERCOSUR/GMC/RES. Nº 53/99. Glosario de terminología de vigilancia epidemiológica– Mercosur [Consulta: 29/08/2017] Disponible: http://www.bvs.org.ar/pdf/vigilancia.pdf
de una enfermedad infecciosa o contra su toxina8”.
Período de incubación: “es el intervalo de tiempo entre la exposición efectiva del huésped susceptible a un agente biológico o sus productos tóxicos y el inicio de los signos y síntomas clínicos de la enfermedad en ese huésped9”.
Portador: “persona o animal infectado que alberga un agente infeccioso especifico de una enfermedad, sin presenta síntomas clínicos de esta y constituye fuente potencial de infección”10.
Síndrome del guillain-barré: “en el síndrome de guillain-barré, el sistema inmunitario del organismo ataca parte del sistema nervioso periférico. El síndrome puede afectar a los nervios que controlan los movimientos musculares así como a los que transmiten sensaciones dolorosas, térmicas y táctiles. Esto puede producir debilidad muscular y pérdida de sensibilidad en las piernas o brazos”.
Transmisión autóctona: “significa que las poblaciones de mosquitos que residen en un área determinada están infectadas con el virus y comienzan a transmitirlo a las personas que estén en esa misma área”.
Vector: “ser viviente (insecto, roedor, etc.) Que asegura la transmisión de un agente infeccioso”.
Virus: “son pequeños pedazos de arn o adn, muchos están encapsulados en una envoltura echa a base de proteínas conocida como cápside, otros protegen su material genético con una membrana o envoltura derivada de la célula a la que infectan y algunos otro, además rodean su cápside con una membrana celular”.
8 Ibid., p. 19
IDENTIFICACIÓN DE LOS VIRUS DENGUE Y ZIKA MEDIANTE RT-PCR EN PERSONAS ASINTOMÁTICAS DE SAN JOSÉ DE CÚCUTA, COLOMBIA, 2016.
Autores Astrid Carolina Bello Medina, Jessica Fernanda Serrano Pérez
RESUMEN
Los virus Dengue y Zika (flavivirus) son virus trasmitidos por
artrópodos, arbovirus. Su importancia aumentó en las Américas en los últimos 20 años. Los vectores principales son Aedes aegypti y A. albopictus. El
dengue es una enfermedad vírica transmitida por mosquitos que se han propagado rápidamente en los últimos años. El virus del dengue se transmite por mosquitos hembra principalmente de la especie Aedes aegypti y, en menor
grado, de Aedes albopictus. Estos mosquitos también transmiten la fiebre
chikungunya, la fiebre amarilla y la infección por el virus de Zika. La fiebre por virus Zika (ZIKV) es una enfermedad febril, zoonótica, emergente de curso agudo, benigno y autolimitado; de origen selvático la cual es causada por el virus Zika. El virus de Zika es un flavivirus transmitido por mosquitos de la especie
Aedes aegypti. Su sintomatología es inespecífica por lo cual puede
confundirse con otros síndromes febriles y en varias ocasiones puede cursar de forma asintomática, o presentarse con un cuadro clínico moderado. Fue detectada en primates no humanos y en Aedes africanus en el año de 1947 en el bosque
Zika en Uganda y por primera vez en humanos en Nigeria en 1954. El objetivo de este estudio es Determinar la presencia o ausencia de los virus Dengue y Zika en ARN aislado de muestras de suero mediante la amplificación por RT-PCR. La metodología utilizada fue el Aislamiento de ARN de las 93 muestras, utilizando el método de Trisure siguiendo el protocolo propuesto por la casa comercial Bioline, PCR por duplicado y finalmente la electroforesis en gel de Agarosa. Según los resultados obtenidos del estudio de 93 muestras analizadas de personas asintomáticas para el virus Dengue y Zika solo 1 muestra se logró determinar la presencia del virus Zika, lo cual no se considera un resultado significativo para ser un foco de transmisión. Con este estudio aportamos a la investigación la presencia del Virus Zika en personas asintomáticas de San José de Cúcuta, puesto que esta ciudad es considerada una zona endémica donde prolifera el zancudo del genero Aedes aegypti que transmite no solo este virus sino también
el Dengue, la Fiebre Amarilla y el Chikungunya.
TITLE: IDENTIFICATION OF DENGUE AND ZIKA VIRUS THROUGH RT-PCR IN ASYMPTOMATIC PEOPLE OF SAN JOSÉ DE CÚCUTA, COLOMBIA, 2016.
Authors Astrid Carolina Bello Medina, Jessica Fernanda Serrano Pérez
SUMMARY
Dengue and Zika viruses (flavivirus) are viruses transmitted by arthropods,
arboviruses. Its importance has increased in the Americas in the last 20 years. The main vectors are Aedes aegypti and A. albopictus. Dengue fever is a viral disease
transmitted by mosquitoes that has spread rapidly in recent years. Dengue virus is transmitted by female mosquitoes mainly of the species Aedes aegypti and, to
a lesser extent, Aedes albopictus. These mosquitoes also transmit
chikungunya fever, yellow fever and Zika virus infection. Zika virus fever (ZIKV) is a febrile, zoonotic, emerging, acute, benign and self-limiting disease; of jungle origin which is caused by the Zika virus. Zika virus is a flavivirus transmitted by
mosquitoes of the species Aedes aegypti. Its symptomatology is nonspecific and
can be confused with other febrile syndromes and can occur on several occasions asymptomatically or present with a moderate clinical picture. It was detected in non-human primates and Aedes africanus in the year 1947 in the Zika forest in
Uganda and for the first time in humans in Nigeria in 1954. The objective of this study is to determine the presence or absence of Dengue and Zika viruses in RNA isolated from serum samples by amplification by RT-PCR. The methodology used was the Isolation of RNA of the 93 samples, using the Trisure method following the protocol proposed by the commercial house Bioline, duplicate PCR and finally the agar gel electrophoresis. According to the results obtained from the study of 93 samples analyzed from asymptomatic persons for the virus Dengue and Zika only 1 sample, it was possible to determine the presence of Zika virus, which is not considered a significant result to be a focus of transmission. With this study, the presence of the Zika Virus in asymptomatic people of San José de Cúcuta is investigated, since this city is considered an endemic zone where the mosquito of the genus Aedes aegypti proliferates, which transmits not only this virus but
also Dengue, Yellow Fever and Chikungunya.
Keywords: Arbovirus; Zika; Dengue; Arthropods; Exanthema; Microcephaly;
CONTENIDO
pág.
INTRODUCCIÓN 19
1. PROBLEMA 21
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 21
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 32
1.3 OBJETIVOS 32
1.3.1 Objetivo general 32
1.3.2 Objetivo específico 32
1.4 JUSTIFICACIÓN 32
2. MARCO REFERENCIAL 34
2.1 ANTECEDENTES DE INVESTIGACIÓN 34
2.2 MARCO TEÓRICO 43
2.2.1 Taxonomía del virus dengue 43
2.2.2 Estructura del virus 43
2.2.3 Genoma del virus 43
2.2.4 Serotipos del virus 44
2.2.5 En el ciclo de vida del mosquito Aedes aegypti ocurren tres etapas a
saber huevos, larvas y adultos 44
2.2.5 Células 46
2.2.6 Etapas clínicas de la enfermedad 46
2.2.7 Clasificación del dengue 50
2.2.8 Genoma del virus 52
2.2.9 Linajes del virus 52
2.2.10 Células Diana en la infección 52
2.2.11 Manifestaciones clínicas de la enfermedad 52
2.2.12 Diagnóstico diferencial 53
2.2.13 Prevención del dengue y Zika 54
2.3 MARCO CONCEPTUAL 54
2.4 MARCO LEGAL 56
2.5 MARCO CONTEXTUAL 56
2.6 SISTEMA DE HIPOTESIS 57
2.7 OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES 58
3. MARCO METODOLÓGICO 59
3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN 59
3.1.1 Nivel de Investigación 59
3.1.2 Diseño de Investigación 59
3.2 MÉTODOS O PROCEDIMIENTOS 59
3.2.1 Materiales y equipos 59
3.2.2 Métodos 60
3.2.2.1 Diligenciamiento del consentimiento informado y la encuesta para la
participación en el estudio. 61
3.2.2.2 Toma, transporte, adecuación y almacenamiento de muestras
sanguíneas. 61
3.2.2.3 Comprobación especifica de cebadores empleando herramientas de
bioinformática como el software en línea BLAST 61
protocolo propuesto por la casa comercial Bioline 61 3.2.2.5 RT-PC Múltiple para la identificación de Dengue y Zika 61
3.2.2.6 Electroforesis 65
3.2.2.7 Tabulación de las encuestas y análisis de los resultados
moleculares. 66
3.3 POBLACIÓN Y MUESTRA 66
3.3.1 Población 66
3.3.2 Muestra 67
3.3.3 Definición de sujetos de estudio 67
3.3.4 Criterios de inclusión 67
3.3.5 Criterios de exclusión 67
3.4 TÉCNICAS E INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS 67 3.5 TECNICAS DE PROCEDIMIENTOS Y ANALISIS DE DATOS 68
4. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 69
4.1 RESULTADOS 69
4.1.1 Presencia o ausencia de los virus dengue y Zika 69
4.2 DISCUSIÓN 72
5. CONCLUSIONES 75
6. RECOMENDACIONES 76
BIBLIOGRAFIA 77
ANEXOS 80
LISTA DE FIGURAS
pág.
Figura 1. Ciclo de vida del mosquito Aedes aegypti 46
Figura 2. Evolución de la enfermedad de dengue 50
Figura 3. Clasificación del dengue 51
Figura 4. Signos y síntomas asociados con dengue, Chikungunya y
Sarampión 53
LISTA DE CUADROS
pág.
Cuadro 1. Operacionalización de las variables 58
Cuadro 2. Retrotranscripció 62
Cuadro 3. Cebadores específicos utilizados en la RT-PCR Múltiple para la
identificación de Dengue 63
Cuadro 4. Mezcla de la PCR Múltiple 63
Cuadro 5. Programa de amplificación para el diagnóstico del virus Dengue
PCR Múltiple 64
Cuadro 6. Cebadores específicos utilizados en la PCR para la identificación
de ZIKA 64
Cuadro 7. Mezcla de PCR 65
Cuadro 8. Programa de amplificación para el diagnóstico de Zika por PCR
Múltiple 65
Cuadro 8. Determinación de Dengue 69
Cuadro 9. Determinación de Zika 71
LISTA DE GRÁFICAS
pág.
Gráfica 1. Determinación de Dengue 69
Gráfica 2. Determinación de Zika 71
LISTA DE ANEXOS
pág.
Anexo 1. Encuesta 81
Anexo 2. Tabulación de la encuesta 83
Anexo 3. Aislamiento de RNA 95
Anexo 4. Electroforesis 98
Anexo 5. RT-PCR 101
Anexo 6. Toma de muestra sanguinea 107
Anexo 7. Actas 111
INTRODUCCIÓN
El dengue es una enfermedad vírica transmitida por mosquitos que se han propagado rápidamente en los últimos años. El virus del dengue se transmite por mosquitos hembra principalmente de la especie Aedes aegypti y, en menor
grado, de Aedes albopictus. Estos mosquitos también transmiten la fiebre
chikungunya, la fiebre amarilla y la infección por el virus de Zika.
Se conocen cuatro serotipos distintos, pero estrechamente emparentados, del virus: DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4. Cuando una persona se recupera de la infección adquiere inmunidad de por vida contra el serotipo en particular. Sin embargo, la inmunidad cruzada a los otros serotipos es parcial y temporal. Las infecciones posteriores causadas por otros serotipos aumentan el riesgo de padecer el dengue grave.
Se conoce un gran número de manifestaciones de la enfermedad que van desde procesos asintomáticos hasta cuadros severos; es así como se definen diversas formas clínicas: dengue sin signos de alarma, dengue con signos de alarma, y el dengue grave donde se encuentran incluidos el síndrome de choque por dengue (SCD) y otras complicaciones del dengue como miocarditis, encefalitis, hepatitis las cuales se asocian con mayor mortalidad.
La fiebre por virus Zika (ZIKV) es una enfermedad febril, zoonótica, emergente de curso agudo, benigno y autolimitado; de origen selvático la cual es causada por el virus Zika. El virus de Zika es un flavivirus transmitido por mosquitos de la especie
Aedes aegypti. Su sintomatología es inespecífica por lo cual puede
confundirse con otros síndromes febriles y en varias ocasiones puede cursar de forma asintomática, o presentarse con un cuadro clínico moderado. Fue detectada en primates no humanos y en Aedes africanus en el año de 1947 en el bosque
Zika en Uganda y por primera vez en humanos en Nigeria en 1954.
El virus Zika es transmitido por la picadura de los mismos vectores del dengue y el Chikungunya, por lo que la región se constituye en una población de riesgo de contagio. En Colombia, el Instituto Nacional de Salud confirmó los primeros cuatro casos autóctonos del virus Zika en la semana epidemiológica número 40 de 2015 y dado que varias regiones presentan infestación de Aedes aegypti y/o Aedes albopictus, estas son condiciones que facilitan la transmisión de estas enfermedades. Solo 1 de cada 4 personas presenta sintomatología, usualmente leve. Sin embargo, desde finales del 2015 en Latinoamérica se empezó a sospechar la posible asociación de este virus con microcefalia en fetos de mujeres gestantes infectadas por el virus y en algunas pacientes
manifestaciones de síndromes neurológicos10" La OMS/OPS recomienden a los países que establezcan y mantengan la capacidad para detectar y confirmar casos de infección por el virus Zika, fue el incremento de anomalías congénitas, síndrome de Guillain Barre y otras manifestaciones autoinmunes en zonas donde circula el virus Zika, y su posible relación con este virus, fuertemente sospechosa pero que no ha sido probada científicamente. Pero los casos de microcefalia y otros desórdenes neurológicos por sí mismos, por su gravedad y por la carga socio-económica que conllevan para las familias constituyen una amenaza".
Los virus Dengue y Zika son un problema creciente para la Salud Pública mundial, debido a varios factores: el cambio climático, el aumento de la población mundial en áreas urbanas de ocurrencia rápida y desorganizada, la insuficiente provisión de agua potable que obliga a su almacenamiento en recipientes caseros habitualmente descubiertos, la inadecuada recolección de residuos y la gran producción de recipientes descartables que sirven como criaderos de mosquitos al igual que los neumáticos desechados. A esto se suman el aumento de viajes y migraciones, fallas en el control de los vectores y la falta de una vacuna eficaz para prevenir la enfermedad.
1. PROBLEMA
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El Dengue es una enfermedad viral, de carácter endémico-epidémico, transmitida por mosquitos del género Aedes, principalmente por Aedes aegypti, que
constituye hoy la arbovirosis más importante a nivel mundial en términos de morbilidad, mortalidad y afectación económica que tiene diversas formas de expresión clínica: desde fiebre indiferenciada (frecuente en niños) y fiebre con cefalea, gran malestar general, dolores osteomioarticulares, con o sin exantema, leucopenia y algún tipo de sangrado hasta formas graves que, habiendo comenzado con lo anterior presenta choque hipovolémico por extravasación de plasma, con trombocitopenia moderada o intensa y con grandes hemorragias en aparato digestivo y otras localizaciones. También el dengue es capaz de expresarse mediante las llamadas formas "atípicas" que son relativamente infrecuentes y resultan de la afectación particularmente intensa de un órgano o sistema: encefalopatía, miocardiopatía o hepatopatía por dengue, entre otras.
El complejo Dengue lo constituyen cuatro serotipos virales serológicamente diferenciables (DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4) que comparten analogías estructurales y patogénicas, por lo que cualquiera puede producir las formas graves de la enfermedad, aunque los serotipos 2 y 3 han estado asociados a la mayor cantidad de casos graves y fallecidos. Son virus constituidos por partículas esféricas de 40 a 50 nm de diámetro que constan de las proteínas estructurales de la envoltura (E), membrana (M) y cápside (C), así como un genoma de ácido ribonucleico (ARN), También tienen otras proteínas no estructurales (NS): NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5-3. Los virus del dengue pertenecen al género Flavivirus de la familia Flaviviridae.
Carga mundial de Dengue: En las últimas décadas ha aumentado enormemente la incidencia de Dengue en el mundo. El número real de casos de Dengue está insuficientemente notificado y muchos casos están mal clasificados. Según una estimación reciente, se producen 390 millones de infecciones por dengue cada año (intervalo creíble del 95%), de los cuales 96 millones se manifiestan clínicamente (cualquiera que sea la gravedad de la enfermedad). En otro estudio sobre la prevalencia del Dengue se estima que 3.900 millones de personas, de 128 países, están en riesgo de infección por los virus del Dengue.
Los Estados Miembros de tres regiones de la OMS notifican sistemáticamente el número anual de casos. El número de casos notificados pasó de 2,2 millones en 2010 a 3,2 millones en 2015. Aunque la carga total de la enfermedad a nivel mundial es incierta, el comienzo de las actividades para registrar todos los casos de dengue explica en parte el pronunciado aumento del número de casos notificados en los últimos años. Otra característica de la enfermedad son sus modalidades epidemiológicas, en particular la hiperendemicidad de los múltiples serotipos del virus del dengue en muchos países y la alarmante repercusión en la salud humana y en las economías nacionales y mundiales.
Antes de 1970, solo nueve países habían sufrido epidemias de Dengue grave. Ahora, la enfermedad es endémica en más de 100 países de las regiones de África, las Américas, el Mediterráneo Oriental, Asia Sudoriental y el Pacífico Occidental. Las regiones más gravemente afectadas son las Américas, Asia Sudoriental y el Pacífico Occidental.
En 2008, en las regiones de las Américas, Asia Sudoriental y Pacífico Occidental se registraron en conjunto más de 1,2 millones de casos, y en 2015, más de 3,2 millones (según datos oficiales presentados por los Estados Miembros a la OMS). En fecha reciente el número de casos notificados ha seguido aumentando. En 2015, se notificaron 2,35 millones de casos tan solo en la Región de las Américas, de los cuales más de 10.200 casos fueron diagnosticados como Dengue grave y provocaron 1.181 defunciones.
paludismo.
En 2013 ha habido casos en Florida (Estados Unidos de América) y la provincia de Yunnan (China). Además, el Dengue sigue afectando a varios países de América Latina, especialmente Costa Rica, Honduras y México. En Asia se ha notificado un aumento del número de casos al cabo de varios años en Singapur, y también se han notificado casos en Laos. Las tendencias observadas en 2014 indican un aumento del número de casos en China, Fiji, las Islas Cook, Malasia y Vanuatu, y que el virus del Dengue de tipo 3 (DEN 3) está afectando a los países insulares del Pacífico tras un periodo de 10 años. El dengue se ha notificado también en el Japón tras un lapso de más de 70 años.
En 2015, en Delhi (India) se registró el peor brote desde 2006, con más de 15.000 casos. La isla de Hawai, en el estado homónimo de los Estados Unidos de América, se vio afectada en 2015 por un brote con 181 casos, y la transmisión continúa en 2016. Se han seguido registrando casos en estados insulares del Pacífico: Fiji, Tonga y Polinesia francesa.
El año 2016 se caracterizó por grandes brotes de Dengue en todo el mundo. La Región de las Américas notificó más de 2.380.000 casos ese año, y solo en Brasil hubo poco menos de 1.500.000 casos, es decir, cerca de tres veces más que en 2014. En la región se notificaron asimismo 1.032 muertes por Dengue. En la Región del Pacífico Occidental, en 2016 se notificaron más de 375.000 casos, 176.411 de ellos en Filipinas y 100.028 en Malasia, cifras que representan una carga similar a la de años anteriores en ambos países. Las Islas Salomón declararon un brote con más de 7.000 casos sospechosos. En la Región de África, Burkina Faso notificó un brote localizado con 1.061 casos probables.
Hasta la semana epidemiológica 11 del 2017, la Región de las Américas había notificado 50.172 casos, cifra inferior a la registrada en el mismo periodo en años anteriores. En la Región del Pacífico Occidental se han notificado brotes de Dengue en varios Estados Miembros, y la circulación de los serotipos DENV-1 y DENV-2. Cada año, unas 500.000 personas que padecen Dengue grave necesitan hospitalización, y aproximadamente un 2,5% fallecen.
En el 2017 en la ciudad de Villavicencio se ha visto reducido el número de personas infectadas por Dengue, Chicunguña y Zika en un 60%, gracias a que las personas han empezado a tomar conciencia de que se deben evitar los criaderos de zancudos, gracias a las campañas que adelantan las autoridades. La secretaria de salud de la ciudad reporto que mientras el año pasado, hasta la semana epidemiológica 42, se habían registrado 1.174 casos, este año se han presentado 454. De Dengue grave en el 2016 se presentaron 15 casos y este año van 6, y el año pasado murieron 2 personas, mientras que en este año no se ha presentado ningún fallecimiento.
Pero para las autoridades aún falta mucho por hacer, especialmente ante la proximidad de la temporada vacacional y el paso de la época de lluvias. Por lo que la Secretaria de Salud intensifica las acciones preventivas y pedagógicas para la eliminación de pozos de agua que sirvan de criadero a estos vectores, se espera culminar el año con 10.000 visitas a locales comerciales, viviendas, lotes y demás.
Para lograr esto las autoridades están repartiendo afiches, folletos, volantes, material didáctico y demás elementos que brinden información necesaria para saber cómo disminuir la población de los zancudos. Al mismo tiempo se realizan brigadas de inspección de las zonas que puedan acumular agua y verificar si hay presencia de larvas del zancudo en la zona.
En la semana epidemiológica 22 del 2017, en Colombia se notificaron al Sivigila 583 casos probables de Dengue; en la misma semana epidemiológica 22 del 2016 se notificaron 2.684 casos.
Se reportaron casos procedentes de 36 entidades territoriales, cuatro distritos y 675 municipios; Cali con el 17,0 %, Medellín con el 9,3 %, Neiva con el 2,2 %, Cúcuta con el 2,1 %, Ibagué con el 2,0 %, Villavicencio con el 1,9 %, Bucaramanga con el 1,6 %, Floridablanca con el 1,4 %, Armenia con el 1,3 %, Espinal con el 1,2 %, Palmira y Sincelejo con el 1,1 % cada uno, Girardot y Tuluá con el 1,0 % cada uno, registran el 44,1 % de los casos notificados como dengue; Neiva con el 10,6 %, Ibagué y Cali con el 4,9 %, Villavicencio y Buenaventura con el 2,8 % cada uno, Purificación, Galapa, Cartagena, Espinal y Medellín con el 2,1 % cada uno, registran el 36,6 % de los casos notificados como dengue grave.
el 2016 ha dado frutos, los reportes han bajado, sostuvo Judith Ortega, secretaría de Salud. Este año, el programa continuará la meta es no volver a tener que pasar por situaciones como las que vivió la ciudad con el Dengue, Chikungunya y Zika.
Por su parte, la empresa Aguas Kpital inició una campaña para que todos sus usuarios mantengan en buen estado los tanques de almacenamiento de agua potable, siguiendo la regulación vigente del gobierno, para contribuir con la erradicación de criaderos de mosquitos.
La infección por Dengue puede ser clínicamente inaparente o puede causar una enfermedad de variada intensidad. Luego de un período de incubación que puede ser de 5 a 7 días, (se han observado casos con un período de incubación de 3 hasta 14 días), podrán aparecer las manifestaciones clínicas, aunque una alta proporción de las personas infectadas cursarán de manera asintomática. Las infecciones sintomáticas pueden variar desde formas leves de la enfermedad, que solo se manifiestan con un cuadro febril agudo, de duración limitada (2 a 7 días) a otros cuya fiebre se asocia a intenso malestar general, cefalea, dolor retroocular, dolor muscular y dolores articulares. En no más del 50% de los casos estos síntomas pueden acompañarse de un exantema en la mayoría de los casos pruriginoso, no patognomónico.
Algunos casos de Dengue pueden evolucionar a formas graves (Dengue grave) en las que hay manifestaciones hemorrágicas, pérdida de plasma debida al aumento de la permeabilidad vascular, (lo que ocasiona un incremento del hematocrito) y presencia de colecciones líquidas en cavidades serosas (derrame pleural, ascitis y derrame pericárdico), lo que puede llevar a un cuadro de shock. Los casos de dengue grave son más frecuentes en personas que ya padecieron dengue por un serotipo (infección primaria) y se infectan nuevamente (infección secundaria) con un serotipo diferente al que le ocasionó el primer cuadro. Este fenómeno puede ocurrir hasta muchos años después de ocurrida la infección primaria, pero no implica necesariamente que toda infección secundaria conduzca a dengue grave. No obstante, también la infección primaria puede asociarse a dengue grave, en relación a virulencia de la cepa o a otros factores del hospedero.
junto a su grupo familiar deben estar atentos a los signos de alarma, controlando a todo paciente con dengue hasta al menos 48 horas de finalizada la etapa febril.
El virus Zika es un arbovirus (virus transmitidos por artrópodos) de la familia
Flaviviridae. Es un virus ARN monocatenario, muy relacionado genéticamente con
los virus Dengue dentro de la familia viral. Las comparaciones genómicas han revelado varios genotipos que componen tres linajes, dos africanos y uno asiático. La estructura de este virus es similar a la de otros flavivirus, los cuales presentan una estructura icosaé- drica, de alrededor de 50 nm de diámetro, y contienen una envoltura lipídica cubierta con proyecciones de superficie que incluyen: una proteína M (membrana), una proteína E (“envoltura”). El virus Zika es muy cercano filogenéticamente a virus como el dengue, fiebre amarilla, la encefalitis japonesa, o el virus del Nilo Occidental. El virus fue identificado por primera vez el 18 de abril de 1947, en un Macaco Rhesus (primate no humano) en cautiverio, que desarrolló fiebre durante una investigación sobre la fiebre amarilla selvática y al cual se le realizaron pruebas de laboratorio que permitieron identificar este virus. Se ha detectado en mosquitos, primates no humanos y humanos en 19 países a lo largo de África, Asia, Oceanía y recientemente en América del Sur.
La transmisión es principalmente vectorial, a partir de mosquitos infectados, principalmente del género Aedes. El virus se transmite generalmente a los
artrópodos hematófagos durante su ingesta de sangre y se reproduce en ellos sin afectarlos, manteniéndose en el insecto toda la vida y transmitiéndose en la próxima picadura. Para la mayoría de los países de del mundo, las especies Aedes aegypti y Aedes albopictus pueden plantear las mayores
amenazas, dada su casi omnipresencia en muchos países tropicales y subtropicales, su adaptación a los entornos urbanos y peri-domésticos, sus comportamientos altamente antropófilos, y su competencia para actuar como vectores para muchas otras arbovirosis. En particular, se considera que A.
aegypti, es el vector principal para la transmisión de virus Zika entre los humanos.
transmisión transfusional del virus Zika11".
Entre las enfermedades emergentes del Siglo XXI, la enfermedad por virus Zika se encuentra entre las mayores preocupaciones para la salud pública a nivel mundial. Comparte el mismo mosquito vector con otros arbovirus de particular importancia para Salud Pública en las Américas, tales como Dengue y Chikungunya, además de la Fiebre Amarilla Urbana.
El virus se aisló por primera vez en 1947 en los bosques de Zika (Uganda), en un mono Rhesus durante un estudio sobre la transmisión de la fiebre amarilla selvática. En 1952 mediante estudios serológicos se demostró la infección en seres humanos (Uganda y Tanzania). En 1968 se logró aislar el virus a partir de muestras humanas en Nigeria. Finalmente, en 2007 ocurrió el primer brote importante de infección por virus Zika en la Isla de Yap (Micronesia), con 185 casos.
En 2013 se registró un brote en las islas del Pacífico Sur, en la Polinesia Francesa, con 8510 casos sospechosos notificados en diversas islas (Bora-Bora, Moorea, Raitea, Tahaa, Tahiti, Nuku-Hiva y Arutua) y en Nueva Caledonia (perteneciente a Nueva Zelanda), afectando el 10% de la población. Durante este brote 74 pacientes registraron síndromes neurológicos o síndrome autoinmune luego de que se manifestaran síntomas compatibles con infección por virus Zika. De éstos, 42 fueron confirmados como SGB, de los cuales 37 presentaron un síndrome viral previo.
En 2014 se registraron también casos de enfermedad por virus Zika en Nueva Caledonia y en Islas Cook, y en los últimos siete años se han notificado casos en viajeros de forma esporádica (Tailandia, Camboya, Indonesia y Nueva Caledonia). Entre octubre y diciembre de 2015 se registró un brote en Cabo Verde, con 4744 casos notificados.
Desde el año 2014 se ha detectado la circulación autóctona de virus Zika en las Américas. En febrero del 2014 las autoridades de salud pública de Chile confirmaron el primer caso de transmisión autóctona de infección por virus Zika en la isla de Pascua (Chile).
En mayo de 2015, las autoridades de salud pública de Brasil confirmaron la transmisión autóctona de virus Zika en el nordeste del país. En julio de 2015 Brasil informó a la OMS sobre la detección de 76 pacientes con síndromes neurológicos que tenían historia reciente de infección por virus Zika, especialmente en el estado de Bahía.
En octubre de 2015 se confirmó la transmisión autóctona del virus en Colombia. Adicionalmente, en noviembre de 2015, El Salvador, Guatemala, México, Paraguay, Suriname y Venezuela confirmaron casos de transmisión autóctona.
La vinculación epidemiológica entre Zika y microcefalia se observó por primera vez en Brasil en 2015. También se habían reportado casos de microcefalia durante la epidemia de zika registrada en la Polinesia Francesa en 2013. Durante este brote se estimó que la incidencia de microcefalia asociada a virus Zika fue del 1%.
En Brasil (Bahía) estiman tasas de microcefalia entre 0.88% y 13%, y en un estudio de Rio de Janeiro, de 42 mujeres con infección confirmada por Zika a las cuales se les realizó estudios ecográficos, 12 presentaban anomalías fetales (29%) de los cuales 5 presentaban retraso de crecimiento intrauterino con o sin microcefalia. Debido a la asociación epidemiológica detectada en los últimos años entre brotes de zika y conglomerados de otras enfermedades autoinmunes o neurológicas, principalmente Guillain- Barré (SGB) y microcefalia, el 1 de febrero de 2016, la Organización Mundial de la Salud (OMS) declaró que el virus Zika representaba una emergencia de salud pública de importancia internacional (ESPII).
Desde 2015 y hasta el 17 de noviembre de 2016, 48 países/territorios de las Américas confirmaron casos autóctonos por transmisión vectorial del virus Zika y cinco países notificaron casos de Zika transmitido sexualmente. Además, 20 países han confirmado casos de síndrome congénito asociado a virus Zika.
América del Norte: En los Estados Unidos de América, el Departamento de Salud de Florida informó que el estado no tiene actualmente áreas identificadas con transmisión activa de Zika y no se notificaron casos de transmisión vectorial local en 2017. En la SE 30 de 2017, el Departamento Estatal de Salud de Texas y el Condado de Hidalgo notificaron un caso probable de transmisión vectorial local durante 2017.
27 de 2017 comportamiento similar a lo observado con dengue en el mismo periodo en el país. El 51% de los casos confirmados de Zika en las primeras 32 semanas de 2017 correspondieron a los estados de Nayarit (171 casos), Tamaulipas (146 casos) y San Luis Potosí (123 casos) y en estos estados el número de casos confirmados fue superior a lo notificado en 2015-201612".
América Central: “Desde la SE 20 y hasta la SE 30 de 2017 se observó un pequeño aumento de casos sospechosos y confirmados en la subregión a expensas de un ligero aumento registrado en Belice y Costa Rica, con un promedio semanal de 117 casos sospechosos y confirmados entre las SE 21 y SE 30 de 2017 en esta sub región13".
Caribe:
“En los países/territorios de esta subregión continúan notificándose casos esporádicos con un promedio semanal de 252 casos sospechosos y confirmados entre las SE 21 y SE 30 de 2017. En Puerto Rico la tendencia de casos observada en las últimas 10 semanas es decreciente14”.
América del Sur: Desde la semana epidemiológica (SE) 44 de 2016 ningún nuevo país o territorio de las Américas confirmó transmisión autóctona vectorial de Zika; por lo que se mantiene en 48 el número de países y territorios de las Américas que confirmaron casos autóctonos por transmisión vectorial de Zika y en cinco el número de países que notificaron casos de Zika transmitidos sexualmente. Desde la SE 14 de 2017 se observa una tendencia decreciente de casos sospechosos y confirmados notificados en esta subregión, con excepción de Ecuador donde se observó un aumento en el número de casos sospechosos y confirmados entre las SE 4 y 20 de 2017. Entre las SE 21 y 30 de 2017, en promedio se registraron 293 casos sospechosos y confirmados semanales en la subregión15".
En total, Colombia reporta 61.393 casos de Zika desde el inicio de la circulación del virus, de los cuales 2.603 fueron confirmados por laboratorio y 58.790 sospechosos por clínica, se han confirmado 1.186 mujeres embarazadas
12 ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD Y ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. Zika - Actualización Epidemiológica Regional de la OPS (Américas) 25 de agosto de 2017 [Documento en línea]. 2017, pp.3 [Consulta: 15/11/2017]. Disponible:
http://www.paho.org/hq/index.php?option=com_content&view=article&id=11599%3Aregional-zika- epidemiological-update-americas&catid=8424%3Acontents&Itemid=41691&lang=es
infectadas con Zika, a las que se suman 10.053 casos sospechosos. Desde el inicio de la epidemia hasta el 26 de marzo del 2016, se han presentado 34 casos de microcefalia por diferentes causas y ocho están en estudios por posible relación con el Zika. Además, en el país se han notificado 401 casos de síndromes neurológicos con antecedentes compatibles con infección por Zika. De estos, 270 están relacionadas con el Síndrome Guillain-Barré.
En el 2016 más del 80% de los casos registrados en Norte de Santander se han reportado en Cúcuta. Las autoridades de salud hacen especial seguimiento a las mujeres embarazadas y continúan en alerta ante el alto número de casos de personas contagiadas con el virus del Zika. El departamento es el que más se ha visto afectado por la epidemia. En un día, tan solo el número de casos de mujeres embarazadas con el virus aumentó a 30 casos. En los centros médicos se mantiene la atención especializada a embarazadas, adultos mayores y niños.
Según Daniel Gutiérrez, auditor del Instituto departamental de Salud de Norte de Santander, desde octubre se registran 3.274 casos de Zika en el departamento, siendo Cúcuta la zona más afectada con cerca del 84% de los registros, seguido por Los Patios con el 10%. Las autoridades continúan además haciendo seguimiento médico especial a los bebés recién nacidos cuyas madres presentaron el virus en la última etapa del embarazo.
En la semana epidemiológica 20 de 2017 se notificaron 48 casos de Zika, 29 casos correspondientes a la semana epidemiológica 20 de 2017 y 19 casos ingresaron como notificación tardía de las semanas epidemiológicas anteriores; en la misma semana del año 2016 se notificaron 2.646 casos. En total se han notificado 1.211 casos de Zika, tres casos confirmados procedentes de tres municipios, 1.113 casos proceden de 162 municipios donde se han confirmado casos por laboratorio, 95 casos proceden de 25 municipios donde no se han confirmado casos por laboratorio. Se notificaron 12 casos procedentes del exterior, ocho por el distrito de Bogotá, dos por el departamento de Amazonas y dos por el departamento de Nariño.
Durante los años 2015 a 2017, se confirmó la circulación de virus Zika en 552 municipios y cuatro distritos del territorio nacional; Antioquia es la entidad territorial con el mayor número de municipios con casos confirmados por laboratorio (55 municipios). Se han notificado casos sospechosos de enfermedad por virus Zika en 247 municipios, sumando un total de 803 municipios con casos reportados entre confirmados y sospechosos.
maculopapular descendente que involucra palmas y plantas, fiebre, malestar general, mialgias, anorexia, conjuntivitis no purulenta, artralgia, edema de extremidades y algunas veces síntomas abdominales (Dolor abdominal, diarrea). El rash puede ser pruriginoso e interferir en las actividades diarias del paciente, incluso dificultar el sueño. En su fase de convalecencia puede producir descamación laminar. El compromiso articular habitualmente se presenta en forma de poliartralgia con edema periarticular, bilateral y simétrico. A diferencia de los casos de infección por virus del Chikungunya, el dolor en los casos de enfermedad por el virus Zika tiende a ser menor y no es incapacitante: al examen físico puede observarse la presencia de un leve edema articular, aunque sin hiperemia ni calor local. Las articulaciones de las manos y las muñecas son las afectadas con mayor frecuencia, seguidas de las rodillas y los tobillos.
El edema de miembros y la conjuntivitis parecerían ser más comunes en las infecciones por virus Zika que en el dengue o el chikungunya, mientras que la hepatomegalia, leucopenia y trombocitopenia fueron menos comunes en infecciones por Zika. La evidencia disponible en cuanto al espectro de la enfermedad por virus Zika en bebés y niños infectados a través de picaduras de mosquitos indica que la mayoría de los niños no presentan síntomas o tienen una enfermedad leve, similar a los resultados en adultos infectados con la enfermedad por virus Zika.
La infección intrauterina por virus Zika ha sido asociada con la aparición de diversas anomalías congénitas. El síndrome actualmente descrito incluye la presencia de microcefalia, y otros signos tales como desproporción cráneo-facial, cuero cabelludo redundante con rugosidades, hipertonía o espasticidad, irritabilidad, secuelas cognitivas y crisis epilépticas. Se presenta un amplio espectro de alteraciones del sistema nervioso central: se observó hipoplasia cerebral, así como hipoplasia o agenesia del cuerpo calloso. Es característica la presencia de calcificaciones cerebrales (principalmente corticales y subcorticales), alteraciones de los ventrículos cerebrales, anomalías de la fosa posterior y lisencefalia, así como anormalidades auditivas y visuales, tales como hipoacusia central, alteraciones pigmentarias focales de la retina y atrofia coriorretiniana, predominantemente en el polo posterior, especialmente en la mácula e hipoplasia del nervio óptico.
inflamatoria y alteraciones de nervios craneales.
El síndrome de Guillain-Barré es un trastorno en el que el sistema inmunitario del organismo ataca el sistema nervioso periférico, afectando tanto las fibras motoras como sensitivas, produciendo así debilidad muscular y alteración de sensibilidad en los miembros superiores o inferiores. Puede ser desencadenado por diversas infecciones, entre ellas las producidas por arbovirus. Un estudio realizado a partir del brote en la Polinesia Francesa obtuvo información sobre las características clínicas y neurofisiológicas de los casos, estimando que el riesgo de SGB fue 0,24 por 1 000 infecciones por virus Zika, partiendo de una tasa de ataque de 66% en la población general.
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
¿Se pueden identificar los virus del Dengue y Zika mediante RT-PCR en personas asintomáticas?
1.3 OBJETIVOS
1.3.1 Objetivo general. Identificar los virus de Dengue y Zika mediante RT-PCR en personas asintomáticas de San José de Cúcuta.
1.3.2 Objetivo específico. Se plantea el siguiente:
Determinar la presencia o ausencia de los virus Dengue y Zika en ARN aislado de muestras de suero mediante la amplificación por RT-PCR.
1.4 JUSTIFICACIÓN
El virus Zika es un arbovirus de la familia Flaviviridae género
(Flavivirus) transmitido por mosquitos causante de la fiebre Zika un síndrome febril
exantemático autolimitado similar al dengue los signos y síntomas más frecuentes son: fiebre moderaba, exantema maculopapular, artralgias, mialgias, cefalea y conjuntivitis. Con menor frecuencia pueden manifestarse edemas, faringitis, tos y vomito. Existen casos que se han acompañado de sindroma de Guillain-Barré y de Hipoacusia. Actualmente existen evidencias que se continúan investigando, que relacionan a este virus con el incremento de las tasas de incidencia de microcefalia en las regiones afectadas.
La infección por este virus suele cursar con sintomatología leve o incluso con infección asintomática en el 75% de los casos. Su sintomatología puede confundirse con la causada por la infección con Virus Dengue o Virus Chinkungunya.
Existe dificultad para su diagnóstico porque en la mayoría de los casos (75%) la infección es asintomática. Además, la sintomatología es similar a la desencadenada por otras infecciones por otros arbovirus que cambien cursan con fiebre de mayor o menor intensidad y exantema. Por ellos existe el riesgo por los viajeros procedentes de áreas donde actualmente existe incidencia de casos (Países de América latina como Brasil y del Sudeste Asiático como Tailandia y Polinesia) y que en nuestro país pueden desplazarse a regiones donde está presente la especie de mosquito Aedes albopictus constituyen un riesgo para
establecer un foco.
El diagnóstico de la infección por virus Zika y Dengue puede realizarse por:
Aislamiento del virus en cultivo celular
Detección molecular por RT-PCR o por PCR en tiempo real
Detección de anticuerpos a partir del 3° o 5° día de la aparición de los síntomas
Se han utilizado varios métodos como ELISA o Inmunofluoresencia indirecta. Estos métodos tienen el problema de las reacciones cruzadas existentes de los anticuerpos generados por otros virus causantes de sintomatologías similares como ocurre con otros flavivirus Dengue y Chinkungunya.
2. MARCO REFERENCIAL
2.1 ANTECEDENTES DE INVESTIGACIÓN
En el año 2007 LANCIOTTI y colaboradores realizaron un estudio sobre las propiedades genéticas y serológicas del virus zika asociados con una epidemia, estado de Yap, Micronesia, 2007
El Virus Zika (ZIKV) es un virus transmitido por mosquitos en la familia Flaviviridae y del género Flavivirus .Inicialmente se aisló en 1947 a partir de
sangre de un mono rhesus centinela febril durante un estudio de la fiebre amarilla en el bosque Zika de Uganda El virus fue aislado posteriormente de un grupo de Aedes africanus mosquitos recogidos en 1948 de la misma región de
la selva Zika; una encuesta serológica realizada en ese momento mostró que 6,1% de los residentes en regiones cercanas de Uganda tenía anticuerpos específicos para ZIKV.
Durante los próximos 20 años, varios aislados ZIKV se obtuvieron de Aedes spp. en África ( Ae . africanus ) y Malasia ( Ae . aegypti ),
que implican estas especies de probabilidades epidémicas. Varias cepas humanas ZIKV También se obtuvieron en los años 1960 y 1970 de África oriental y occidental durante los estudios de vigilancia de arbovirus de rutina en la ausencia de epidemias. Estudios serológicos adicionales en los años 1950 y 1960 detectaron ZIKV infecciones entre los seres humanos en Egipto, Nigeria, Uganda, India, Malasia, Indonesia, Pakistán, Tailandia, Vietnam del Norte, y Filipinas. Estos datos sugieren fuertemente práctica generalizada de la ZIKV desde África hasta el sudeste de Asia oeste y norte de la línea de Wallace.
En 1977, la infección se confirmó ZIKV entre los 7 pacientes en el centro de Java, Indonesia, durante un estudio de fiebre aguda. Los datos sobre estos casos y 7
ZIKV varios ya se ha informado infecciones en humanos indicaron que las características clínicas de la infección con ZIKV incluyen fiebre, dolor de cabeza, malestar general, dolor de estómago, mareos, anorexia y erupción maculopapular; en todos los casos la infección apareció relativamente leve, autolimitada y no letal.
por los médicos en el estado de Yap, Estados Federados de Micronesia .Las pruebas de laboratorio con un ensayo rápido sugiere que un virus del dengue (DENV) era el agente causal. En junio de 2007, se enviaron muestras para pruebas de confirmación al Laboratorio de Diagnóstico de Arbovirus en los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC, Fort Collins, CO, EE.UU.). Las pruebas serológicas por inmunoglobulina IgM ELISA de captura de antígeno con DENV confirmó infección reciente flavivirus
en varios pacientes. Realizar el ensayo por PCR con transcripción inversa (RT-PCR) con cebadores de consenso flavivirus generados fragmentos de ADN,
que cuando se somete a secuenciación de ácidos nucleicos, demostraron identidad de nucleótidos ≈90% con ZIKV. Estos hallazgos indicaron que ZIKV era el agente causante de la epidemia Yap. Presentamos parámetros serológicos de la respuesta inmune entre los humanos ZIKV infectados, los datos sobre los niveles estimados de viremia, y la secuencia completa región de codificación de ácido nucleico de ZIKV asociado con esta epidemia.
Análisis de muestras de pacientes: Detalles de la epidemia, incluyendo los hallazgos clínicos y de laboratorio para todos los pacientes, serán reportados en otra parte (MR Duffy et al., Sin publicar. Datos). Un subconjunto de pacientes infectados por el ZIKV para quienes aguda y de las muestras de suero se combina la fase de convalecencia se había recogido se analizó mediante el uso de varios ensayos serológicos para evaluar el grado de reactividad cruzada con varios flavivirus relacionados. Los pacientes fueron clasificados como primarios
flavivirus
epidemia en Yap, una relativamente pequeña y aislada isla.
Metodología utilizada: Las pruebas serológicas: Muestras de suero aguda y de la fase de convalecencia fueron probadas por IgG ELISA con antígeno ZIKV como se describe para la detección de IgG a los arbovirus. Las muestras también se ensayaron mediante IgM ELISA como se describe con los siguientes antígenos virales: ZIKV, DENV 1-4 mezcla, el virus de la fiebre amarilla (VFA), virus de la encefalitis japonesa, y Murray Valley virus de la encefalitis. Las pruebas para detectar IgM contra el virus del Nilo Occidental (VNO) y el virus de la encefalitis de San Luis se llevó a cabo mediante el uso de un inmunoensayo de microesferas. Las relaciones de los valores de densidad óptica de pacientes a los valores de control negativo (P / Ns) se calcularon para IgG e IgM ELISA. Valores> 3 se consideraron positivos y valores 2-3 se consideraron ambiguos. Títulos de anticuerpos neutralizantes se determinaron mediante el uso de un PRNT con un valor de corte del 90%.
En tiempo real RT-PCR: Dos en tiempo real de cebadores / sondas fija específica para la cepa ZIKV 2007 fueron diseñados utilizando ZIKV 2007 de datos de secuencias de nucleótidos en el paquete de software PrimerExpress (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Los cebadores fueron sintetizados por Operon Biotecnologías (Huntsville, AL, EE.UU.) con 5-FAM como el colorante indicador para la sonda.Todos los ensayos en tiempo real se llevaron a cabo utilizando el Kit de QuantiTect sonda RT-PCR (QIAGEN, Valencia, CA, EE.UU.) con la amplificación en el instrumento iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante. La especificidad de los cebadores ZIKV se evaluó ensayando los siguientes ARN virales, todos los cuales dieron resultados negativos: DEN-1, DEN-2, DEN-3, DENV-4, el WNV, encefalitis de San Luis virus, VFA, virus Powassan, Semliki virus del Bosque, O'nyon-Nyong, virus chikungunya, y el virus Spondweni (SPOV).
fracasaron inicialmente para amplificar por lo tanto, los cebadores se rediseñaron mediante el uso de datos de secuencias de ADN recién generados desajustes de secuencia entre ZIKV MR 766 y ZIKV Yap 2007., y un enfoque de “paseo genómico” se utilizó para derivar completas de codificación de sequence data de la región. La lista completa de cebadores de amplificación y secuenciación está disponible bajo petición.
Todos RT-PCR se realizaron con 10 ul de ARN utilizando el Kit de OneStep RT- PCR (QIAGEN) siguiendo el protocolo del fabricante. Los ADN se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 2%, y las bandas del tamaño predicho se escindieron del gel y se purificó usando el Kit de Extracción de Gel QIAquick (QIAGEN). Los ADN purificados se sometieron a análisis de secuencia de ácido nucleico con cebadores de secuenciación espaciados ≈500 bases aparte en ambas cadenas de los fragmentos de ADN mediante el uso de la mezcla de reacción de secuenciación de ciclo ABI BigDye Terminator V3.1 Ready (Applied Biosystems). Secuencia de nucleótidos se determinó por electroforesis capilar usando el analizador genético ABI 3130 (Applied Biosystems) siguiendo Protcol del fabricante. Datos de la secuencia primas fueron alineados y editarse utilizando el módulo de SeqMan de LaserGene (DNASTAR Inc.). Debido a volumen de muestra insuficiente, no RNA paciente fue suficiente para generar ADN que incluía la región codificante entera. Por lo tanto, los datos de ADN obtenidos a partir de 4 pacientes se combinaron para generar una secuencia de consenso designado hasta ahora la ZIKV 2007 epidemia de consenso (CE) secuencia (GenBank adhesión no. EU545988 ).
La región de codificación completa de ZIKV 2007 CE o la proteína no estructural subregión gen 5 (NS5) se alineó con todas las secuencias de flavivirus disponibles en GenBank utilizando el algoritmo Clustal W dentro del paquete de software de la versión 4 MEGA. Se construyeron árboles filogenéticos utilizando ya sea la región de codificación completa o la región NS5 porque un gran número de secuencias de NS5 estaban disponibles en GenBank y los árboles para la región NS5 se han construido. Cepas ZIKV adicionales de la colección de referencia Organización CDC / Mundial de la Salud (cepas 41662, 41524, y 41525) aislado de Aedes spp. Mosquitos recogidos en Senegal en 1984
el árbol NS5 vecino a participar se muestra"16.
En el año 2011 PAUDEL y colaboradores realizaron un estudio sobre la Comparación del ensayo de dengue SYBR Green en tiempo real con el ensayo de dengue en tiempo real taqman RT-PCR y la PCR anidada convencional para el diagnóstico de infección primaria y secundaria de dengue, el objetivo fue: Desarrollar un ensayo de dengue de diagnóstico SYBR Green de bajo costo, rápido y confiable en tiempo real y compararlo con el ensayo en tiempo real Taqman y la PCR anidada convencional (Lanciotti modificado).
El dengue es una enfermedad humana causada por un virus transmitido por
el Aedes spp. Los mosquitos con cuatro serotipos distintos, pero
estrechamente relacionados de virus, que se refiere como el dengue "serotipos" DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4. Anualmente entre 50 y 100 millones de personas están afectadas por el dengue, y 500.000 de ellos progresan a la fiebre del dengue hemorrágico (DH) con 25.000 muertes. Zona de riesgo de infección por dengue está aumentando año tras año. Alrededor de 2,5 mil millones de personas están en riesgo de dengue y otros 120 millones de personas visitan el dengue área endémica cada año. La vida ajustada por discapacidad por año para el dengue es de 520 a 580 por millón de población.
La fiebre del dengue (FD) y la fiebre hemorrágica del dengue (FHD) son la principal manifestación clínica de la enfermedad. DH con choque (síndrome de choque del dengue o DSS) es la etapa más grave de la enfermedad. La presentación clínica de los pacientes con dengue y dengue hemorrágico en 3-5 días después de la aparición de la enfermedad son de alguna manera similar con la presencia de desaparición de la fiebre en el mismo tiempo , de modo que Fiebre del Dengue son difíciles de diagnosticar en este período crítico. Fiebre del Dengue se clasifican de acuerdo a la directriz de la OMS de 1998, la sensibilidad y la especificidad de esta clasificación clínica todavía siguen siendo bastante bajos. Inmunidad de por vida del virus del dengue para el serotipo homólogo es posible, sin embargo parcial o falta de inmunidad después de la infección con el serotipo heterólogo exacerbar la replicación del virus en la infección secundaria. Inmunidad mejora dependiente de anticuerpos basado (ADE) es uno de los procesos patogénesis declare, por la causa grave de la enfermedad. A medida que la infección progresa secundaria con la manifestación clínica más grave, que puede correlacionarse con una mayor viremia y DH / SCD.
16 LANCIOTTI RS, KOSOY OL, LAVEN JJ, VÉLEZ JO, LAMBERT AJ, AJ JOHNSON, et al. Propiedades genéticas y serológicos del virus Zika asociados con una epidemia, Estado de Yap, Micronesia, 2007. [Artículo
La detección de anticuerpos mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) es útil y herramienta más popular para el diagnóstico, después de 1 semana de la fiebre, pero no se puede utilizar antes de 3-5 días después de la fiebre ni se puede utilizar para discriminar los serotipos. Método molecular de diagnóstico de dengue va a reemplazar el método tradicional de cultivo de células como la prueba estándar de oro para la detección viral. SYBR reacción verde cadena de transcripción inversa de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) tiene más ventaja en encuesta epidemiológica, ya que es rápido, simple y sensible que los métodos de RT-PCR tradicionales. Debido a la detección del producto amplificado y la sonda en el mismo recipiente cerrado, la contaminación se reduce considerablemente en comparación con otra reacción PCR. RT-PCR es una herramienta útil para la detección y la cuantificación de dengue.
Sonda Taqman RT-PCR que contiene el par de cebadores específicos para cada serotipo y las sondas es más específico. Este es el método de diagnóstico rápido, específico y costoso que SYBR verde RT-PCR. El desarrollo de los cebadores específicos para la detección y tipificación del virus del dengue mediante el ensayo de verde SYBR RT-PCR podría ser más exacto. El par de cebadores desarrollado en los estudios anteriores no puede amplificar la muestra respectiva debido a que estos cebadores no pudieron alinearse con la mayor parte de la cepa asiática debido a la variación de los genotipos en diferentes países. Los cebadores de PCR deben variar para lograr una mayor sensibilidad. Objetivo de nuestro estudio fue desarrollar el cebador específico de la región de la cápside más conservada del virus y optimizar la condición de este manual, para desarrollar una rápida menor costo, ensayo SYBR dengue verde en tiempo real y comparar la sensibilidad a la más lenta convencional anidada PCR y ensayo de PCR más caro sonda TaqMan en tiempo real.
Metodología realizada: El estudio se realizó en la colaboración de la Facultad de Medicina Tropical de la Universidad de Mahidol y las fuerzas armadas Instituto de Investigación de Ciencias Médicas (AFRIMS) Bangkok, Tailandia. La investigación se llevó a cabo después de la aprobación por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina Tropical de la Universidad de Mahidol y el permiso otorgado por el Walter Reed Nacional Centro Médico Militar, EE.UU.
Las muestras de suero. Doscientos veintitrés muestras clínicas de suero fueron utilizados en el estudio fueron recogidos desde 2006 para 2008, de pacientes febriles. La confirmación del diagnóstico de dengue hecho por tanto ELISA y PCR anidada convencional. Las muestras se mantuvieron en -700C en AFRIMS. Fuera de 223 muestras se utilizaron 30 muestras ciegas para la validación inicial del ensayo en tiempo real verde SYBR. Fuera de 193 muestras de 43 fueron primario, 130 eran secundaria y 20 fueron negativos por ELISA.
Dilución y extracción de RNA de Wild y cepa estándar. Cuatro de
laboratorio cepas virulentas: DENV-1 cepa Hawaii, DENV-2 cepa NGC, DENV-3 H87 Filipinas tensión, y DENV-4 814 669 de deformación Dominica y ocho cepas estándar de C6 / 36 dengue aislado virus se utilizaron para determinar el límite de detección. Cepas de virus estándar se propagaron en células C6 / 36; Los títulos de UFP se determinaron por ensayo de placas y se almacenaron a -70 ° C. Cepa de virus salvaje se diluyó en solución RPMI, mientras que la cepa estándar fue diluido en suero humano normal. Diez veces diluciones en serie se realizaron para hacer que la concentración más baja de 0,0001 pfu / ml en ambos grupos de cepas. La solución diluida de cada concentración de 140 l se tomó como muestra de interés y el ARN total se extrajo por QIAGEN kit comercial (EE.UU.) de acuerdo con la recomendación del fabricante. 50! L de tampón AVE se aplicó para la elución. RT-PCR: protocolo
Lanciotti Modificado se aplicó por una etapa de RT-PCR y PCR anidada
Un escalón RT-PCR de un solo paso 1 st ronda de RT-PCR se estableció en 50
l de volumen final que contiene 5 l de suspensión de ARN, 5 l de 10 x tampón de PCR II, 1! L de dNTPs 10 mM, 3 l de 25 mM MgCl 2 , 1,25 l de 10 pmoL/μl de cebador directo D1, 1,25 l de 10 pmoL/μL de cebador inverso D2, 0,25 l de DTT 1 M, 0,10 l de transcriptasa inversa de virus de la mieloblastosis aviar (AMV RT, 10 U / l, Promega, Madison, WI, 0,25 l de AmpliTaq DNA polimerasa (5 U /! l, Applied Biosystems), y 32,9 l de RNasa libre de agua se aplicó en termociclador. se realizó la etapa de RT a 42 ° C durante 60 min fue seguido por 35 ciclos de ciclismo termo ; 94 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 1 min, y 72 ° C durante 2 min, usando el sistema gene Amp PCR 9600 (Perkin Elmer, Norwalk, CT, EE.UU.).
Nested PCR: 5 l de tampón 10 x PCR II , 4 l de dNTPs 10 mM, 5 l de 25 mM
La etapa de la PCR anidada se realizó durante 25 ciclos de ciclismo termo; 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 1 min, y 72 ° C durante 2 min, usando el sistema Gene Amp PCR 9600 (Perkin Elmer, Norwalk, CT, EE.UU.).
Electroforesis en gel de: los productos de PCR tanto de RT-PCR y los pasos
Nested PCR (9 l de producto de PCR con 1 l de tampón de carga de gel) eran electroforesis en gel de agarosa y se tiñeron con bromuro de etidio. Se observó la banda común de 511 pares de bases (pb.) De tamaño en la etapa de RT-PCR, mientras que en la muestra de paso de PCR anidados que contienen 3 o 4 fue identificado como la banda de ADN de 482, 119 DENV-1, 2. 290, o 392 pb.
Diseño de cebadores oligonucleotídicos para la base-SYBR Green RT-PCR: Los
cebadores descritos por Shu et al. Fueron considerados y re-diseñada por alineación de secuencias para dar la máxima homología de secuencia entre las cepas de DENV Thai y otras cepas de Asia y el Pacífico la cepa Dominicana. The Thai DENV cepas de secuencias se obtuvieron de GenBank (números de acceso entre paréntesis) incluyen 10 DENV-1 (AY732474-AY732483), 10 DENV-2 (DQ181797-DQ181806), 6 DENV-3 (AY676348-AY676353), 6 DENV- 4 (AY618988-AY618993) fueron alineados utilizando software Clustal X.
Las secuencias de algunos cebadores fueron modificados para degenerar para que coincida con las secuencias de las cepas de DENV Thai y otras cepas. Los cebadores se diseñaron para evitar el dímero cebador y la estructura secundaria Cebador diseñado a partir de la región de la cápside más conservada del virus se ha optimizado en hibridación a 540C durante 30 segundos y extensión a 600C durante 30 segundos. Para un paso RT-PCR, RT mezcla maestra se preparó de acuerdo con el protocolo de la energía SYBR Green
RNA-a-C T 1-Step Kit (Applied Biosystems, Foster, CA, EE.UU.). 20! L de mezcla de
PCR fue preparado con RNasa libre de agua a 4,24 l, 10 volumen mol, Potencia SYBR® Green Mix RT- PCR (2 x) 0,3! L, cebador directo (10? Mol) de 0,3 l de cebador inverso (10! Mol), RT Enzyme Mix (125 x), 0,16 l. Los tubos con la mezcla Se tomaron alícuotas en el tubo de micro y se añaden 5 l de molde de ARN. Los tubos ópticos de reacción se sellaron con tapas ópticas y se sometieron en 7300 Applied Bio Sistemas de PCR en tiempo real con transcripción inversa (480C, 30 min), la activación de ADN Gold® polimerasa ampliTaq, UP (Ultra Pure) (950C, 10 min), la desnaturalización (950C, 15 sec) de recocido 540C 30 seg y la sEC y disociación etapa de extensión 600C 30 con 950C 15 seg, 600C 1 min, 950C 15 seg, y 600C 15 seg.
TaqMan en tiempo real RT-PCR: El TaqMan en tiempo real RT-PCR se realizó de
