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KITO- CONDRIAL Y EL TRANSPORTE DE IONES MEDIANTE EL USO DE IONOFOROS, I.-CINfTICAS

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(1)

Casaabiataaltii

uNNwsloAo WTONoMA

mrrw-lzTm

- c 3 s

-

INFORME FINAL DE SEVICIO SOCIAL

ry

1 J~~~~~~~~~ MIGUEL DE LA VEGA VACA TEL. 572-0353

UJ

MATR

I CULA 80332270

A / C <

J CARRERA : B I O L O G I ~ A R E A DE CONCENTRACION BIOLOGIA EXPERIFENTAL

TRIPESTRE 85-0

HORARIO: 1 0 HORAS POR SEMANA EN PROMEDIO.

LUGAR: LABORATORIOS 5-251 Y S-253 (BIOQUIFICA Y BIOFISICA) AREA DE INVESTIGACION BASICA,

DEPTO. DE CIENCIAS DE LA SALUD,

D.C.B.S. UAM-I.

INICIO: 1 0 DE MAYO DE 1984.

* J'$ERF'INACION: 1 0 DE NOVIEMBRE DE 1 9 8 5 9 _-

1 TUTOR: M. en C. LIGIA G. TORO CALZADA PROFESOR ASOCIADO "C"

,

DEPTO. DE CIENCIAS DE LA SALUD,

D.C.B.S. UAM-I.

/TITULO:

ESTUDIO DE

LA

RELACION

ENTRE LA

H+-ATPA~A KITO- CONDRIAL Y EL TRANSPORTE DE IONES MEDIANTE EL USO DE IONOFOROS, I.-CINfTICAS DE HIDR6LISIS DE ATP Y KED I C I bN DE OTROS PARAMETRO& lND1 CAT I VOS DEL CONTROL DE L CI~N

P?ITOCONDRIAL,

FRANCISCO f?. DE LA VEGA 80332270.

Av#. Purísima y Michoacón, Iztapalapa, Múxico 13, D.F.,

(2)

Unidad I z t a p s l a p e D.C+E*S*

.

7 '

, .,.

Informe F i n a l de S e r v i c i o S o c i a l

ESTUDIO DE LA RELACIÓN ENTRE LOS

FLUJOS IdNICOS INTRAMITOCONDRIALES

Y LA TRANSFORMACI6N DE LA ENERCÍA

BIOLÓCICA EN LA MITOCONDRIA, POR

MEDIO DEL USO DE IONÓFDROS.

i

i

1 . <

por

F r a n c i s c o M e De L e Vega

Noviembre, 1905.

(3)

J

I. ,.

- <

Este trabajo f u é realizado en los laboratorios 6-251 Y S-253

(Bioqufmica y Eiofísica) del Departamento d e Ciencias de la

Salud, Divisidn de Ciencias Eioldgicas y de la Salud,

Universidad Autonoma Metropolitana-I%tapalapat bajo la

direction

de;

M,

en C. Ligia G I T o r o Calzad8 Depto. de C. de la Salud, UAM-I

TUTOR

Y

Dr.

Cergio Estrada Orihuela Depto, de C. de la Salud, UAn-I

-

-

.- ASESOR

I . .

a quienes debo gran parte de m i formación C O M O investigador,

y agradezco el haberme ofrecido un ambiente estimulante, de

libertad, responsabilidad y exelencia academics, que

permitid el desarrollo tanto de esta investigacidn C O M O de mis facultades profesionales.

(4)

/ <

I .

CONTENIDO

I/INTRODUCCION

a ) Actividades de la Materia viviente, b ) Enerqía netabólica celular.

c ) Transduccidn de e n e r d a quiniosm6tica. d ) Perturbación de sistemas bioenerqéticos. e ) Evaluación de la hip6tesis sviniosn6tica.

Z/OBJETlUOC

J/MATERIALES Y METODOC

a) Aislamiento Mitocondrial.

b ) Actividad de ATPase.

c ) Potencial eléctrico transnembranal.

4/RESULTADOS

a ) Efecto de los ion6foros en la ATPasa..

b ) Efecto de los ionóforoe en el potencial.

c ) Efecto de la rotenonair

W D I C C U S I O N

6/CONCLUSIONES

í/RESUMEN

W L I T E R A T U R A CITADA

-2-

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14

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45

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...

59

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-61

(5)

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l/ INTROOUCCION+

En esta sección se introduciren conceptos necesarios pera entender la relevancia del estudio del flujo d e iones

intramitocondrial, en relación con las reacciones de

s h t e s i s e hidrólisis de ATP, y con la conservación de la enerqía biolóqica. También se presentará una explicacidn de la hipótesis explicativa de la transduccidn enerqética mas

aceptada, la quiniosndtica; se presentaran sus métodos de

estudio y una evaluacidn actual +

A ) Actividades de la Materia Viviente.

El avarice en el estudio de los sistemas h i o l d ~ i c o s ha

traido consiqo la intención de definir lo que es vida con

mayor precisión. Sin enbarqo, al estudiar mas a fondo las

características esenciales de la vida, se vuelve evidente

que el dar una definición satisfactoria de vida es una meta

mur dificil. As:, una vez que se han distinquido las

características comunes a todo ser vivo, se vuelve una tarea

mas sencilla enunciar que no e s la vida, a poder decir que

s í lo es, de una manera clara ( 1 ) .

Siguiendo esta estrategia, empezaré ni discusidn distinquiendo alqunos conceptos erroneos acerca de la concepción d e vida. En primer lugar, a le, vida se le ha

tratado de definir en base a 1s estructura que presentan los seres vivos. A s í por ejemplo, se puede hablar d e sue los seres vivos son aquellos que poseen noleculas formadas de

carbono, hidrdqeno, oxígeno, nitrdqeno, y otros componentes

secundarios. O que son aquellos que poseen protefnas, o

células, o cualquier otro componente o estructura

distinquibie en ellas. Sin embargo le vida no s e caracteriza por una estructura en si. Es decir, que no es posible

definir la vida mencionando una serie de estructuras

pertenecientes a los orqanismos vivos. Esto se deriva del hecho de que las estructuras que componen a los seres vivos se encuentran en un cambio continuo$ nunca son las nisnas

( 3 ) . Tambien por esto no se puede empezar a explicar la vida mencionando las sustancias que se presentan en los seres vivos, porque estas se encuentran en un continuo recambio, Se puede afirmar que los átomos o sustancias de un ser vivo, no son los mismos en un momento dado y unos días antes. Los orqanos de u n organismo adulto no son los mismos que tenra

en etapas del desarrollo mas tempranas, no solo porque

crecieron Y tal vez modificaron su forma, sino porque todos

los Stomos que l o s componen ahora son otros. Es entonces inútil tratar de definir a la vida apropiadamente partiendo de estructuras determinadas.

También, como ya disernió 1411, Oparin hace tiempo i S 4 ) ,

(6)

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las características nacimiento, crecimiento, reproducción Y

muerte, no son privativas de los seres vivos, aunque tal vez sea raro encontrarlas a todas ellas reunidas

en un

solo

sistema no vivo. De hecho este es el arqumento primordial para apoyar su hip6tesis del oriqen abiático de los seres

vivos. Vemos entonces que lo que antes se consideraba para

definir el objeto de estudio de la hiologfa, es

insuficiente, y no s e tomaba en cuenta las cualidades más importantes del fenómeno vivo.

;Que es entonces la vida? Dado que a h no es posible dar

una definición que satisfaga de lo que es vida, para poder

operar en algún marco de referencia en donde contrastar

nuestras observaciones sobre la biósfera, debemos recurrir a

una definición operacional del fenómeno de la vida. Esta definición no es mas que un enlistado de características importantes que posee la vida ( 2 ) .

La primera característica que podemos señalar, es que la vida no es una cosa, sino un proceso, una actividad ( 2 , 3 ) + Realmente la vida no s e caracteriza por conponentes

determinados, sino por una actividad que mantiene estos

componentes en una relación diribmica entre sf mismos,

conservando cierto orden. Esta actividad tambien mantiene una relación dinamica con el medio ambiente que rodea al individuo. Esto nos lleva a la siquiente característica: los sistemas vivos son sistemas abiertos que intercambian con su ambiente materia y enerqía con un cierto patrón ( 1 , 5 ) .

Esto Último s e torna necesario si consideramos que, para la permanencia de la actividad que denota la vida en un

sistema, es requisito un rápido recambio de sus componentes. P r O f U n d i Z a r e ~ O S un poco más en esto. Es verdad que la

orqanización estructural de los seres vivos es una de las

cualidades mas evidentes de estos, y es gracias a la

relaci6n con el medio ambiente C O M O esta s e puede consesuir. Si el sistema fuera cerrado, seria en contra de le sequrida ley de la termodinámica la existencia de una estructuración

dentro de 61. Ya Priqosine hizo notar que para los sistemas

abiertos, la sequnde ler se cumple a nivel de todo el

universo, y que los seres vivos pueden disminuir su entropia

a costa de aumentar la del medio ambiente ( 5 5 ) . Pero para que esto se pueda dar, no es suficiente que el sistema sea abierto, sino que también s e tiene que cumplir una condicidn más, lo cual nos lleva a considerar la siquente

característica importante de los seres vivos: Los seres vivos son sistemas MIJY alejados del equilibrio ( 4 ) .

El mantenimiento del orden en un sistema abierto sólo s e puede consesuir Cuando el sistema esta muy alejado del

equilibrio. Aquí se hace entonces la primera aseveracián de tipo enersético, pues el mantenimiento del sistema lejos del

(7)

1 .

e q u i l i b r i o cuesta nucha energfar 4ue obvianente debe provenir del nedio enbiente ( 5 9 ) . Es entonces ú t i l

considerar a l s i s t e n a v i v i e n t e COMO un sistena internedio en

un f l u j o de energía; e s d e c i r que de aiqcina fuente r e c i b e energia, é s t a pasa por é l , y é l l a u t i l i z a r , . f i n a l n e n t e , l a

expulsa de s í ( 5 9 ) . Morowitz h i z o notar con su fanoso

teorena

is),

que s i un s i s t e n a s e encuentra en nedio de un fli-tjo de energía, é s t e l e organiza y l e crea por l o plenos un

c i c l o Material, cualidades evidentenente presentes en un ser vivo. Venos pues, qi-ie una de l a s t a r e a s p r i n o r d i a i e s de l a

actividad que c a r a c t e r i z a l o vivo, e s precisamente Mantener esta circunstancia.

E l sistena vivo s e encuentra MUY a l e j a d o d e l eqi.Jilibrio quínico t r a d i c i o n a l , y por i o tanto l e j o s de sus

r e s t r i c i o n e s ( 5 7 ) . Sin embargo e l s i s t e n a parece estar en un

t i p o de e q u i l i b r i o , pues e5 p o s i b l e observar que se Mantiene relativanente constante, con vida. Mantiene sus estructuras

y sus funciones. Pero e s t e e q u i l i b r i o s e nantiene con una actividad interna d e l organisno M U Y grande. Este es e l

iianado estado e s t a c i o n a r i o , que s e d i f e r e n c i a d e l

e q u i l i b r i o qufnico, en l a gran actividad e inversi6ri de energía necesarias para naritener i o . Algunos p r e f i e r e n llamarlo ' f l I J j 0 ' estacionario para r e s a l t a r que este s e

Mantiene por e l continuo ficijo de energía Y Materia a t r a v é s

d e l sistena.

Otra c a r a c t e r í s t i c a nuy inportante de l o s s i s t e n a s b i o l ó g i c o s , es su gran capacidad de autoregulaci6n (56).

Poseen subsistenas que l e s perniten regular todo ese f l u j o energético para hacerlo f l u i r de l a Manera nas adecuada para

S ~ J aprovechaniento ( 3 ) . Lo hacen pasar adenas, a l a

velocidad adecuada segun l a necesidad. Esta cualidad de alJtOPregUlaCi6n s e e j e n p i i f i c a tanbien en l a capacidad, d e s c r i t a por Bernard ( 5 6 , 6 0 ) , que tienen l o s seres vivos para mantener una coristaricia en si-1 Medio internot l a homeostasis.

Esta tendencia a l a constancia l a ejercen l o s s e r e s vivos a todos l o s n i v e l e s de organización, pues de e l l o depende su perpetuación, o sea, l a constancia de esas cualidades qide l e dart e l a d j e t i v o de v i v o (2). Es una cualidad que l e p e r n i t e a l organisno adaptarse a l a s fluctuaciones d e l medio

anbiente, y responer a cualquier e s t i n u l o .

La honeostasis l e c o n f i e r e a l o s organisnos vivos esa propiedad de no-linearidad que s e puede observar en estos s i s t e n a s . Aunque l a homeostasis e s una propiedad que

compensa todo canbio que pudiera suceder en e l sistema a t r a v e s de una retroalimentación negativa, e l s e r vivo no puede ser un honeóstato p e r f e c t o , pues de e s t a forma no cambiaría, c r e c e r í a o evolucionaría (56). üaddington ( 6 1 ) .

(8)

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.,

I . ,

observando que un organismo no t r a t a de mantener en su c i c l o de vida e l mismo tanaño, s i n o que mas bien t r a t a de mantener constante un patr6n de crecimiento, u t i l i z ó e l término

homeorresis para d i s t i n g u i r esta respuesta de f l u J o

e s t a b i l i z a d o , de l a honeostasis (un estado e s t a b i l i z a d o ) . ES

evidente que, para que l o s subsistemas que mantienen estas respuestas puedan funcionar, e s d e c i r , puedan mantener l a resulación y e l c o n t r o l , es indispensable e l f l u j o de

información entre l o s componentes del sistema. Por e l l o es una de l a s cualidades mas sobresalientes de l o s s e r e s vivos e l poseer una compleja red de comunicaciones entre sus

subsistemas ( 2 ) , y almacenar una gran cantidad de

información en <jus estructuras, De hecho l a condición neqentrópica que e x i s t e en e l i n t e r i o r de io5 orsariisnos puede ser d e f i n i d a en r e l a c i ó n

a

l a cantidad de información que poseen ( 1 ) . Esto siqrtifica que l a entropia e s t a

relacionada con l a información de t a l forma que, a l aumentar l a entropia, disminuye l a capacidad de poseer información d e l sistema.

Esta capacidad de autorregulación de l o s seres v i v o s , es una función c r u c i a l , puesto que de esto depende su

mantenimiento en una condicibn negentrópica. Es tan

importante, que una gran cantidad de l a energía que f l u y e por e l sistema es destinada

a

cumplir con fenomenos de

control, y es mayor

a

l a cantidad destinada a l mantenimiento en s$ de l a s estructuras, o sea, a l a s í n t e s i s de

macromoleculas. Un ejemplo de e s t o es l a existertcia de l o s llamados c i c l o s ' r u t i l e s ' , que aunque

a

primera v i s t a s ó l o desperdician energía, sori muy abundantes en l a s c é l u l a s donde cumplen funciones de control y regulacibn f i n a s ( 9 ) .

La ultima c a r a c t e r í s t i c a primordial de l a vida e s l a

autorreplicaci6n. Esta cualidad e s l a primera c a r a c t e r í s t i c a que s e asisnó

a

l o s s e r e s vivos, y surge de dos propiedades

f í s i c a s de l o s s i s t e n a s . 1 ) Como e l sistema e s a b i e r t o , t r a t a de contrarrestar e l cumplimiento de l a segunda l e y de l a termodinámica dentro de sí, insertandose como un sistema

intermediario en un fll.ijo de energía ( 5 ) . Es d e c i r que e l sistema se encuentra situado en un f l u j o de enerqia entre o t r o s dos (o mas) sistemas, usando de paso l a energía que

a h í f l u y e . S i n embargo l a segunda ley es potente, y

finalmente s o l o permite que e l orqanismo s e encuentre en e s t e estado por un tiempo reducido, y por l o tanto, l l e v a a l

individuo f i n a l n e n t e

a

l a muerte, Pero l a vida, actuando mas a l l 6 d e l n i v e l d e l individuo, d e s a r r o l l a s i s t e n a s de

reproducción para perpetuarse

a

n i v e l de especie en

evoluci6n. La informaci6n inherente en e l organismo no se pierde, s e transmite, aunque s u f r e cambios, evoluciona, siguiendo e l p r i n c i p i o de homeoresis.

2 ) Está también, una propiedad de todos l o s s i s t e n a s ,

(9)

vivos o no v i v o s , que s e encuentren MUY a l e j a d o s d e l

e q u i l i b r i o : l a tendencia a l a ' c r i s i s ' 9 a l cambio (entendiendose COMO c r i s i s un cambio rápido, r a d i c a l Y

discontinuo con e l patrón seguido hasta e l momento por e l

sistema) (55). Esta es una condicion i n e l u d i b l e de estos

sistemas y e5 l a causa esencial d e que e l ser vivo no pueda ser un homeóstato perfecto. Esta propiedad enunciada por

primera vez por Thon (62), surge de l a amplificación de l a s

pequenas fluctuaciones en l a s v a r i a b l e s d e l sistema, que finalmente l o llevan a un cambio brIJSC0, ocasionado Por a r r i b a r a un estado de c r i s i s . Este cambio no es del t i p o homeoretico, gradual, sino que verdaderament,e s i ~ r q e de una c r i s i s , Thorn PUSO en evidencia que esto e r a ohservable

desde l a s etapas d e d e s a r r o l l o de l o s s e r e s vivos, donde en

ocasiones suceden cambios notables, ejemplo t í p i c o , l a netanorfósis. Pero además es observable también a n i v e l evolutivo. Esto tambien j l i s t i f i c a l a autoreplicaci6nt donde

e l organismo, de e s t a r en un estado de crecimiento Y

mantenimiento constante, entra en c r i s i s (aunque 5610 sea evidente en l a cepa germina1,a veces) y se autOdL.iPliCa+

Con esto podemos l l e g a r y a a una definition operacional de vida ú t i l para nuestros propósitos, y siquiendo e l e s t i l o de Perez Tanaro (6) decimos que "La vida e s un proceso que ociJrre en sistemas complejos de macromnleculas, organizadas en j e r a r q u í a s , de patrones e s t r u c t u r a l e s diñcontinuos,

termodinánicamente poco probables, pero que se mantienen

e s t a b l e s g r a c i a s a l continuo f l u j o de energía. Sus t r e s c a r a c t e r c s t i c a s fundamentales son: a ) recambio más o menos rápido de sus componentes, b) capacidad para autorresularse

y c ) capacidad para autorreplicarse".

De esta discusion es f 5 c i l a d v e r t i r sue, l a s múltiples actividades que r e a l i z a n l o s sistemas b i o l ó g i c o s , tanto a n i v e l c e l u l a r , de individuo Y de b i ó s f e r a , requieren de un gasto de energía, aún cuando aparentemente no se efectue un t r a b a j o , pues es requerida l a inversión de energía tan s o l o para mantener l a condicidn de v i d a , Analizando l o s

requerimentos energéticos que se requieren para mantener e s t a condición, no e s d i f í c i l l l e g a r

a

l a conclusión de que

l a vida misma es una expresión de l a energía contenida en e l sistema, Y de l a forma en que s u f l u j o , e s regulado.

6) La Energía Hetabólica C e l u l a r .

La energía que pone en marcha todos l o s procesos v i t a l e s existentes en l a b i ó s f e r a , es l a energía proveniente del Sol

(22). Aunque existen o t r a s fuentes de energca internas a nuestro planeta, e s t a s son pequeñas y d i f i c i l e s de 1-ttilizar,

Y por e l l o l o s sistemas v i v i e n t e s se d e s a r r o l l a r o n en base a l a nvy abundante energía elrctromaqnética proveniente d e l Col, Es entonces l a B i ó s f e r a un sistema intermedio en un

I

(10)

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f l u j o de energía que proviene del Col, y despues e s devuelta e l espacio, En su permanencia en la T i e r r a , esta energía es obligada a hacer t r a b a j o para e l nanteniniento de l o s

sistemas v i v i e n t e s , Mucha energfa tanbién se i n v i e r t e para auneritar l a entropia d e l universo, y a s í permitir l a

estructuraciÓn de los sistemas v i v o s . Esta energía se

p i e r d e , pues y a no e s u t i l i z a b l e para hacer t r a b a j o .

L a energía f l u y e por l a b i ó s f e r a en un c i c l o en e l que

intervienen dos componentes n ~ i y inportantest l o s organismos autbtrofos y l o s heter6trofos. Este c i c l o e s p a r a l e l o en gran parte a l llamado c i c l o d e l carbono, llanado a s í para indicar que l a energía s e conserva frecuentemente en l o s organisnos en forma de enlaces de conpuestos del carhono. Los organismos a u t b t r o f o s son l o s únicos capaces de captar directamente l a energía s o l a r para narttener su condición de

vida. Esta e n e r g í a , adends de u t i l i z a r l a para su5

necesidades inmediatas, l a alnacenan transfornandoia

a

una f o r n a de energía e s t a b l e y f á c i l de u t i l i z a r posteriornente:

l a energía de enlaces químicos. Esta propiedad de l o s organisnos de alnacenar l a energía que no requieren de nomento, surge COMO una condicidn para s a t i s f a c e r sus

necesidades energ6ticas durante l a p a r t e obscura d e l c i c l o noche/dfa d e l planeta. Además, COMO l o s organismos estan constituidos por macronoleculas, en l o s enlaces de é s t a s , se conserva una energía potencialnente u t i l i z a h l a por 6stos o

por SUS depredadores+ S i n embargo, l a s molecules M ~ S

u t i l i z a d a s para e l alnacenaniento

a

l a r g o p l a z o de energía son l o s carbohidratas. Estos son s i n t e t i z a d a s por una serie

de reacciones sue reducen e l carbono a COZ formandose enlaces entre v a r i o s carbonos con l a energía captada del Col.

La energía alnacenada en e s t o s enlaces, puede ser u t i l i z a d a posteriormente por e s t o s organisnos, o por su5 depredadores, l o s organismos h e t e r d t r o f o s , que fornan l a segunda p a r t e de e s t e c i c l o + Estos organisnos, a l no poder

captar l a e n e r g f a del Col directannete, s e han adaptado, a t r a v e s de necanismos e s p e c i a l e s para e l l o , para u t i l i z a r l a energía de l a s moleculas de l o s a u t b t r o f o s , siendo l a s

moiecuias de naYor inportancia energéticanente, otra vez l o s

carhohidratosr Anbos organismos, aIJt6tTOfOS y heter6trofos, u t i l i z a n l a energca conservada en l o s carbohidratos por una s e r i e de reacciones o)4idativas, donde son r o t o s i o 5 enlaces entre l o s carbonos, liherandose C O M O desecho COZ ( 6 3 ) .

C O M O venost e s t e c i c l o empieza con

coz,

agua 3 energía

s o l a r , Y terniria en COZ, aqua y e n e r g í a u t i l i z a d a para hacer t r a b a j o o perdida para aunenter l a entropia d e l universo. La energía s o l a r e s ainecenada en e s t e c i c l o COMO energía

contenida en electrones. La energía electromagnEtica es absorbida inicialmennte por una nolecula que puede e x i t a r

i

-a-

(11)

alguno de sus electrones: estos electrones sufren diversos procesos, desde pasar a formar enlaces hasta ser

transportados por moleculas especiales. Un compuesto

intermedio en este ciclo, el oxíqeno, es liberado en los

orqanismos aerobios, C O M O desecho en la primera parte del mismo. Este proviene d e las moleculas de aqua, que son utilizadas como donadures iniciales de electrones. En la

ultima fase del ciclo este oxígeno acepta electrones Y

vuelve a formar aqua. Es evidente entonces, que la propiedad

de los electrones de poder almecenar energia, adquiriendo

diversos estados energéticos cuantizados, es central en el flujo de energía por la biosfera.

Restringiré en adelante m i discusibn a los organisnos

heterótrofos y aerohios, aunque muchos de los procesos que

discutire, tafibien son compartidos por otros orgariismo~. Tambien me limitaré a la segunda face del ciclo

anteriormente discutido, mismo que s e lleva a cabo en estos organismos, principalmente, dentro de sus unidades

estructurales: las células.

La célula puede definirse operacionalmrnte como la región mas pequeria de los organismos vivos, que posee todas las cualidades que distinguen a la vida, aunque solo en el caso de los organismos unicelulares son realmente independientes.

Por ello no es conveniente denotar a las celulas como

unidades funcionales, s6l0 como estructurales. Dentro de las

células s e llevan a cabo las reacciones oxidativas que

caracterizan el aprovechamiento de la energía inherente a

los carbohidratos. Como se mencionó arriba, estas reacciones

sdlo llevan a cabo una transformación o transducción, de la

energía originalmente proveniente del Col, en diversas formas de enerqía química o de exitación d e electrones. No se lleva a cabo una 'producción de energía' C O M O en

ocasiones s e menciona.

Las d a s metabálicas principales con las que los

organismos eucar iontes transducen enerqía química, son la

glicolisis 3 la fosforilación oxidativa. Este Gltimo

proceso, que involucre la comhustibn completa de los

carbonos de la glucosa a dioxido de carbono y aqua, resulta

en aproximadamente 17 veces mas energía rjtil que la

producida por l a slicolisis anaerobia. Cidemas se lleva cabo en un sitio m u y especial dentro de la célula: la

mitocondria. Debido al alto rendimiento de esta vía, la

fosforilación oxidativa nitocondrial es responsable de

suplemntar mas del 95X del requerimiento total de energía en

las celulas (9).

La forma de energra química universalmente utilizada por los organismos, para alimentar con energía SIJS procesos que

a s í lo requieren, es la almacenada en la reacci6n de

-

9-

(12)

1::

hidrólisis del ATP ( 7 ) .

El

ATP es una nolecula pequeña, Y

por lo tanto, adecuada para este papel í22)t pues puede

difundir rapidanente a todos los conpertinentos celulares+

Adenas, la energía libre estaridar de la reacción de

hidrdlisis del ATP a ADP y

Pi,

tiene un valor de - 7 5 0 0

calorías por M O ~ , lo cuál facilita la creación, dentro de la

célula, del desequilibrio necesario en esta reacci6n para

que tenga la capacidad de realizar trabajo ( 8 ) . Pues es la

tendercia ai equilibrio químico l a que faculta

a

una

reaccibn qulnica para poder ser acoplada a otras reacciones

que necesitan energfat Y as4 poder realizar un trabajo. Son

entonces estas condiciones las que han deterninado que la

reacci6n de hidr6lisis del ATP sea utilizada por todos los

orqanisnos COMO interMediaria de energía para la mayoría de

los procesos celulares.

DiSCUtireMOS ahora algunas características notables de la fosforilacibn oxidativa nitocondrial.

Cono ya se Mencionó, todos los organisnos son sisteMas en

estado estacionario, y por lo tanto, la velocidad de

producción de ATP debe ser igual a la velocidad de su

consuno (excepto en condiciones transitorias rápidas en las

que (.Sto no es necesarianente cierto). Esto significa que un

balance dinánico y preciso es sostenido entre las reacciones

que producen

ATP

Y aquellas que lo utilizan, y por ello, las

concentraciones de ATP en la célula permanecen esencialnente

a un nivel constante. Cualquier diSMinIJCi6n en la

utilization.

de

ATP

en el organisno, causa 'una inmediata

dis~in~ici6n en la velocided de su síntesis y 'vice versa'.

El

rango de actividad dentro del cuél la fosforilaci6n

oxidativa opera 'in vivo', puede ejenplificarse por el hecho

de que en el honbre, la velocidad de síntesis de ATP varía

de 0.4s ATP/nin

Ks

de peso corporal, en reposo, a 9.09

ATP/Min Kg de peso, durante ejercicio exahustivo ( 9 ) .

En las CéllJlaS eucariontes, las enzinas de la

fosforilacidn oxidativa est& intinamente asociadas, o

forman parte integral, de la MeMbrana interna nit,ocondrial

(figura 1 ) ( 1 0 ) .

El

sitio de la síntesis de ATP, la ATP

sintetasat está localizado en la superficie interna de la

Membrana interna nitocondrial, y es coritinuo con e l espacio

de la Matriz nitocondrial, es decir, se encuentra aislado

del exterior de la nitocondria. Es hi& conocido que en la

natriz Mitocondriai existen ~ 6 1 0 un par de reacciones que

utilizan ATP, mientras que el citosol es el sitio principal

de utilización de

ATP.

Por ellot se infiere que existen

necanisnos que perniten a la natriz nitocondrial, detectar

las necesidades en el citosol por una velocidad apropiada de

serieración de ATP. Además, el ATP debe ser suninistrado bajo

condiciones en las que la hidrolisis sea lo suficientenente

exersónica para realizar el trabajo netahólico requerido

J

I"

(13)

E.-

Figura 1. Componentes Principales de l a Membrana Interna Mitocondrial. (Tomado de Investigacidn y Ciencia 1(20):65, Mayo 1978)

Figura 2. Algunos acarreadores importantes de la membrana interna mito- condrial, a s i como algunos complejos enzimaticos, esquematiza- dos durante las reacciones de Sintesis de ATP. (Tomado de Fox

R.F. Biological Energy Transduction. 1982, Wiley)

(14)

. I

..

1

"

1 < /

1''

.

, , t , ' I

.

, . "

( 9 ) . Es d e c i r t que l a interaccibri de los f l u j o s de

n e t a b o l i t o í (por ejemplo A T P ) entre e l r e s t o de l a c é l u l a Y

l e nitocondriet deben de Mantener e l d e s e q u i l i h r i o necesario para que l e reacción de h i d r d l i s i s de ATP pueda ser ú t i l r Y a

que e l t r a b a j o nSximo que l a h i d r a l i s i s de ATP puede

r e a l i z a r depende de l a r e l a c i ó n CATP3/CADP3CPi7 ( 2 2 ) ~ l a s

variaciories en l a s concentraciones cell-llares de A T P 7 ADP Y P i proveen de un nedio s e n s i t i v o a través d e l cuál l o s

necanismos homeostrticos pueden regi-llar l a t r a n s f o r n a c i i h energética y l a producción de ATP.

Dado que e l ATP que s e produce dentro de l a nitocoridria e s consunido en e l c i t o s o l , l a mitocondria e s t a equipada con

un sistema de transporte de aderiín nucleótidos que

intercanhia ADP por ATP a traves de l a nenhrana interna nitocondrial ( f i g u r a 2) (ílt12). E l f o s f % t o es transportado

por un sistema separado que puede ser diferenciado d e l acarreador ADP/ATP Mediante inhibidores (13714). La

nitocondria posee una poza de adenín nucleótidos en su

matriz que interacciona directamente con l a ATP siritetesa de l a f o s f o r i l a c i ó n o n i d a t i v a t y e l ATP s i n t e t i z a d o deja e s t a poza por un iritercanbio equimolar por ADP c i t o s ó l i c o . Este

intercanbio cunple con l a función de tonar e l ADP c i t o s ó l i c o (derivado de l a h i d r ó l i s i s d e l ATP en e l c i t o s o l ) y l i b e r a r

A T P a l c i t o s o l t sin un aunento o disninucidn netos de l a poza de adericn nucleotidos nitocondrial ( 1 1 ) +

Metabolito5 a t r a v é s - d e l a nenbrana interna tienen una doble funciónt p ~ l e s ~ adenas de ser r e a c t i v o s y prodcictos de l a s reacciones de s í n t e s i s e h i d r 6 l i s i s de ATP, son eleneritos de

informaci6n ( s e ñ a l e s ) que comunican l a n a t r i r nitocondrial con e l c i t o s o l t y l l e v a n nensajes r e l a t i v o s a l control d e l netaholisno energético c e l u l a r y a e l manteniniento de l a

honeostasis (3). Por l o t a n t o 7 l a honeostasis s e hace

p o s i b l e porque l a nitocondria r e c i b e infornación acerca de l o s cambios en l a s necesidades del c i t o s o l y esta

infornacidn controla e l r i t n o de sus actividades ( 5 1 ) . Estos s i s t e n a s de señales osn6ticos son nuy importantes para e l control de l a funcibn n i t o c o n d r i a l t dehido a l hecho de que l a s menbranas nitocondriales conpartanentalizan l o s sistenas de prodvcci6n Y consiJno de ATP.

Debenos destacar a q u í que estos f l u j o s de iories y

Ademas de l o s filJjO5 ionicos ya ~ e n c i o n a d o s ~ existen una Multitud de fenonenos de transporte e s p e c i f i c o s t que

participan tanto en l a s reacciones de conservacibn de l a e n e r g í a t cono en procesos de honeostasis c e l u l a r ( 5 2 ) . Por ejenplot dado que l a p r i n e r a etapa de l a o:<idaciSn de l o s c a r b o h i d r a t o ~ ~ l a ~ l i c o l i s i s ~ s e encuentra l o c a l i z a d a en e l citoplasma c e l u l a r , l o s productos de e s t a , a h conteniendo nucha e n e r g í a t deben pasar a l a Matriz mitocondriai para que SIJ energra pueda ser mas aprovechada. Esto scicede en e l

(15)

c i c l o de Krebs, donde se l l e v a a cabo l a oxidación de l o s carbonos a COZ, y los electrones portadores de l a enerqca de

l o s sustratos s e disponen para entrar a l a cadena

r e s p i r a t o 5 i a (en forna de NADH), donde se u t i l i z a su enerqía para l a s i n t e s i s de ATP. Otro ejenplo e s e l transporte de o t r o s iones COMO e l c a l c i o ( Z J - 2 7 ) + que p a r t i c i p a n en

funciones de transnisi6n de nensa j e s i n t r a c e l u i a r e s . Estos novinientos estan acoplados a una fuente de energía

i n t e r n e d i a r i a entre e l paso de io5 electrones por l a cadena r e s p i r a t o r i a y l a s g n t e s i s de A T P I

Podenos cortcluir, de l o expiiesto anteriornente, que e l estudio de l a s r e l a c i o n e s entre l o s f l u j o s ionicos a t r a v e s de l a nenbrana interna nitocondrial y l a s í n t e s i s de A T P , es

relevante para d i s c e r n i r el funcionaniento y constituci6n de l o s sistenas homeostaticos bioerierq6ticos, Y por l o tanto para conprender l a conservación de l a eriersía b i o l ó q i c a

(21930)

C ) Transducción de Enerqía ~ u i m i o s n ó t i c a r

Es ahora pertinente d e t a l l a r un poco mas l o s procesos p o r

l o s cuales l a oxidaci6n de s i ~ s t r a t o s su n i n i s t r a enersfa para l a s f n t e s i s de ATP en l a nitocondria+ Las M ~ ~ b r a n a S

transductoras de energía poseen un nunero de c a r a c t e r í s t i c a s d i s t i n t i v a s , Cada Menbrana t i e n e dos ensanblajes de

proteínas d i s t i n t o s . Uno e s usualmente llamado l a ATFasa, pero en r e a l i d a d debe l l a n a r s e l a ATP s i n t e t a s a , Y c a t a l i z a

l a s f n t e s i s de ATP a p a r t i r de ADP, P i Y energre, l i b r e (15-18). E l o t r o complejo est en e l caso de l a nitocondria, una cadena r e s p i r a t o r i a que c a t a l i z a l a t r a n s f e r e n c i a de electrones de l o s scistratos (NADH d e l c i c l o de Krebs) hasta e l aceptor P i n a l , que en e s t e caso e s e l oxiqeno nolecular

(52,8,22). Esto involucra l a t r a n s i c i b n de e s t o s electrones de un estado de nayor energfat a uno de Menor, con l a

consiquiente p o s i b i l i d a d de poder aprovechar l a enerqca l i b r e liberada,para l a s$ntesis de ATP. Otras

c a r a c t e r í s t i c a s inportantes son; l a poca pernebilidad de e s t a s MeMbranaS, i n c l u s i v e a l protón, para e l cuál t i e n e una a l t a r e s i s t e n c i a , Y l a a l t a r e l a c i ó n proteína/lfpido (702 de

p r o t e í n a s ! ) , que se debe a l a l t o contenido de l o s

ensanbiajes proteicos ya nencionados, principainente. L a

identidad del ' i n t e r n e d i a r i o transductor de enerqía' que acopla ese par de ensanblajes f u e nuy d i f Í c i i de d i l u c i d a r . Muchos años de bihqueda de un i n t e r n e d i a r i o qulnico que acoplase l a oxidacibn de l o s s u s t r a t o s a l a s í n t e s i s de ATP no tuvieron e x i t o , Entonces, en 1961, Peter Mitchell

apareció en escena con su h i p á t e s i s de acople quiniosmótico, en l a que s u s e r í a que e l 6nico i n t e r n e d i a r i o de energía e r a

cin qradiente electroquinico de protones a traves de l a

nenbraria interna nitocondrial ( f i s u r a 3) ( 1 9 ) . Ciquieron 15

años de intensas contrastaciones a e s t a h i p á t e s i s , con l o

(16)

Light Respiratory substrates

Bacteriomodopsin Redox chains

Transhydrogenase

-

Osmotic work

5

Mechanical work

J

Electric work

I

I

Heat

1

. Chemical work

creatine phosphate

1

Mechanical work

I/

/

J

\

\'I

Osmotic work

Substrate-level phosphorylations

Glycolytic substrates, keto-acids

F i g u r a 3. L a H i p ó t e s i s Q u i m i o s m ó t i c a de M i t c h e l l r e v o l u c i o n ó La manera de p e n s a r s o b r e l a e n e r g é t i c a c e l u l a r y a s i g n 6 un p a p e l D r i m o r d i a l a l g r a d i e n -

t e de p o t e n c i a l de p r o t ó n (6@.(Tomado de TIBS 9(4):183, A p r i l 1984).

a. ATP hydrolysed b. equilibrium A?w ~enerated

c. reversal d. AT,,. contmuousIy replenished

AVw replenished ATP utilized

by second proton pump

F i g u r a 4. E l A c o p l a m i e n t o Q u i m i o s m ó t i c o . Ver e l T e x t o p a r a una e x p l i c a c i ó n .

(17)

* I

!

.

1"

i , ,

I "

I.,

I

"

I . #

que s e c o n v i r t i 6 probablemente en l a h i p 6 t e s i s biosuímica sonetida a l a s pruebas más r i g u r o s a s . l o s debates

concluyeron con l a otorgacibn d e l premio Nobel en Q u h i c a a

Peter Mitchell en 19784 S i n embargo, COMO d i s c u t i r é Mas

adelante, hoy d í a ha, vuelto l a polemica acerca de l a v a l i d e z de esta h i p ó t e s i s como s e plante6 originalnente, pues

existen datos exper inentales inportantes qiJe no pueden s e r reconciliados en e s t e marco, y que por ende ha t r a i d o una tendencia a Modificar e l planteamiento or igirial pare

perfeccionar l a h i p b t e s i s .

E l doqna central de la h i p á t e s i s quimiosnbtica, establece

que l a cadena de transferencia de electrones de la

nitocondria e s t á acoplada a l a s í n t e s i s de ATP, por nedio de

un potencial electroquímico de protón que e x i s t e a trav6s de l a newbraria. Este potencial e s una nedida ternodinánica d e l grado en e l que e l gradiente de protones a través de l a Membrana s e encuentra a l e j a d o d e l e q u i l i b r i o , y por l o tanto, e s un i n d i c a t i v o de l a energía alnacenada en esta

forma. La t r a n s f e r e n c i a de electrones y l a s f n t e s i s de A T P

son c a z t a l i z a d a s por bombas de protones r e v e r s i b l e 5 y separadas. Obviamente cuando s e opera en e l sentido de bombeo, s e requiere de energía, en e l o t r o sentido es

p o s i b l e u t i l i z a r l a enerqía, E l potencial electroquínico generado por l a transferencia de electrones, e s u t i l i z a d o para inpulsar una bonba de protones hidrolizante de A T P ( l a ATFasa) en sentido inverso, e s d e c i r , en l a dirección de 1.a s í n t e s i s de ATP ( 8 ) .

Para a c l a r a r estos conceptos consideremos e l s i g u i e n t e sistema. S i s e dispusieran l a s condiciones apropiadas para que s o l o l a ATPasa estuviera a c t i v a , y s e f u e r a adicionando

ATP a l orgarielo, e l nucledtido serca h i d r o l i z a d o ( a c t i v i d a d de ATPasa) y s e bombearían protones hacia e l e x t e r i o r ,

u t i l i z a n d o l a energfa de h i d r ó l i s i s , hast? que s e

e s t a b l e c i e r a un e q u i l i b r i o entre la energia disponihle para

una subsecuente h i d r b l i s i s de ATP y l a energía requerida

para bombear nas protones en contra d e l gradiente de

protones generado ( f i g u r a 4a y 4b). Este eqIJilibri0 e s un

e q u i l i b r i o químico gobernado por l a l e y de acción de masas,

en donde se incluye l a p a r t i c i p a c i ó n d e l gradiente. S i

ahora, e s t e e q u i l i b r i o fuera perturbado removiendo e l ATP,

l a ATP s i n t e t a s a s e r e v e r t i r i a y l a reacci6r1 s e d i r i g i r i a en sentido de la s f n t e s i s de ATP, iwpulsada por l a disipacidn

d e l gradiente de protones í f i q u r a 4 c ) . Esto, s i n enharso. rápidanente c o l a p s a r í a a l gradiente y , por l o tanto, s e r e q u e r i r í a de una segunda bonha de protories que

continuamente l o generara+ Esto es, precisanente, l o que

ocurre ' i n vivo': e l ATP e s continuamente renovido para s e r

u t i l i z a d o en reacciones c i t o s o l i c a s que conscinen ATP, mientras que e l gradierite electroqu$nico de protones e s continuanente alinentado por l a cadena r e s p i r a t o r i a a l

(18)

transferir electrones d e un potencial alto a uno ba.io(figura

4d).

El

efecto combinado de estas translocaciones de

protones establece un circuito de protones 8) través de la

membrana, Este circuito de protones semeje, un circuito

elBctrico, y ésta arialoda se mantiene aih discutiendo

flujos de energía complejos* COMO en un circuito eléctrico,

es posible medir a traves de la membrana un potencial (el potencial del gradiente electroquímico de protári, pues este tiene carga), una corriente, y una conductancia de protories

( 8 ) . Mitchell derivó una relación entre algunos de estos

parametros, partiendo del hecho de que el potencial electroquímico de protón consiste en dos componentes parcialmente independientes, a saber: un termino de concentración, dehido a la distrihuci6ri diferencial de

protones a través de la membrana (gradiente de pH), y un

termino eléctrico, dehido a la transferencia de cargas (de los protones) a través de la membrana (gradiente eléctrico) (28)

Es evidente que para evitar un 'corto circuito' en el

sistema, la memhrana debe ser cerrada y debe poseer una

alta resistencia (impermeabilidad) a los protones, y de

hecho, así es. Una de las mas exitosas predicciones de la hipatesis, fué que varios agentes que desacoplan la

oxidación (transferencia de electrones) de la síntesis de ATP, actuan incrementando la conductancia a protones (o a cargas) de la membrana, induciendo precisamente un corto

circuito (figura 5) Este desacoplamiento produce una

respiracidn incrementada (oxidaci6n de sustratos) sin una síntesis estequiométrica de ATP+

La ATP sintetasa es reversible, y 5610 está restringida a funcionar en la direccidn de síntesis de ATP, por la

continua regeneraci6n del gradiente de protones y por el uso

del ATP por la célula (22) y en ciertas ocaciones por la

acci6n de una proteína inhibidora natural+ Si, por lo tanto,

la cadena respiratoria es inhibida y se suministra ATP a la mitocondria, la ATP siritetasa funciona COMO ATPasa,

generando un gradiente de protones comparable al producido por la cadena respiratoria, utilizando la energía de

hidrfjlisis de ATP, en lugar de la proveniente de la

oxidación. El circuito de protones puede ser completado por

medio de una re-entrada de protones a la matríz, Por ello

los translocadores de protones aceleran la velocidad de hidrólisis de ATP de la misma forma que estos aceleran la respiraciónt esta es la llamada 'actividad de ATPasa

estimulada por desacoplantes' ( 8 ) .

En r e s w e n , la transformación de energía de oxidación en otras formas de energía, se lleva a cabo primariamente por el establecimiento de un potencial electroquímico, senerado por la translocación asimétrica (vectorial) de protones por

(19)

I "

I . ,

I '

I <

I"

.

, . I

1, I

..

a. Electrical circuit b. Proton circuit

Vímv) A?WIrnV)

Je-1

... .",/

._______

short circuits

Figura 5. Efecto de los desacoplantes en e l acoplamiento Quimiosmótico comparado con un circuito eléctrico. Como se observa ambos sistemas son análogos. Los dos tienen generadores de potencial, consumidores que rea- lizan trabajo, y se les puede medir un Voltaje y una Corriente. (Tomado de Nicholls D.G. Bioenergetics. 1982, Academic Press).

Figura 6. Algunos de las moleculas mas importantes que sirven como io- nóforos. Se esquematiza s u posible mecanismo de transporte del ión.

(Tomado de Investigacidn y

Ciencia

l(20): 64, Mayo 1978).

(20)

1 .

I ,

l o s acarreadores r e s p i r a t o r i o s , a t r a v é s de l a nembrana. Este transporte de protones e s l a causa, e l evento primario que, creando un puente ternodinámico entre l a maquinaria de transporte de electrones y l a ATP s i n t e t a s a , conduce J l a

conservaci6n de l a enerqía b i o l ó g i c a ( 2 8 ) .

D ) Perturbación de l o s Sistemas Bioenerqéticos por Ior16f o r OS *

Los ionóf oros son conpuestos capaces de inducir una

permeabilidad a c i e r t o s iories en una membrana, hiolóqica o

a r t i f i c i a l . Estos conpuestos, producidos en su m a y o r i a por

c i e r t a s cepas de hongos, permiten e l paso a pequeños cationes y / o a protones, en membranas donde estas

perneahilidades estaban muy bien requladas y r e s t r i n g i d e s + E l uso de estos como herramienta experimental en 10s

sistemas conservadores de enerqfia, ha p e r n i t i d o e l estudio de l o s papeles que juegan l o s gradientes de proten y catión en estos sistemas. En p a r t i c u l a r , fué p o s i b l e prequntarse s i l o s efectos de los ior16foros en l a mitocondria podrian ser

racionalizados dentro d e l marco de r e f e r e n c i a de l a t e o r í a

q u i n i O S M 6 t i C J de M i t c h e l l . Es e l e x i t o de e s t e u l t i n o

enfoque e l que e x p l i c a e l impacto de l o s ionóforos en e l estudio de l a hioenergética (29).

La gran u t i l i d a d de los ionóforos recae en e l hecho de

que pueden ser usados para nedir y manipular potenciales

e l é c t r i c o s y gradientes de pH separadanente. Los iorióforos

forman complejos con potasio, y con o t r o s cationes

metalicost para formar un conpiejo i i p o f í i i c o (con e l catión

unido en un ‘hueco’ interno). E l catibn ass oculto puede ser

s o l u b l e en solventes orqánicos, y por i o tanto, pasar

facilmente a t r a v é s de membranas a r t i f i c i a l e s y naturales

(30) t

La valinonicina, un dodecapéptido c c c l i c o , e s e l iorióforo neutro mejor conocido. Seqfin l o que aparece en l a l i t e r a t u r a hasta l a fecha, se une a l p o t a s i o , y e l Conpiejo resultante, cargado positivamente, permite a l potasio e q u i l i b r a r s e a

t r a v é s de l a nembrana de acuerdo a l sradiente de potencial e l é c t r i c o (6, 3 0 ) . A b a j a s concentraciones de potasio, e l

gradiente d e l catión r e s u l t a n t e , e s una nedida d e l potencial memhrarial S i n emharqo, a a l t a s concentraciones, e l

qradiente de potencial se d i s i p a . En l a nitocondria e l potasio, ern presencia de vaiinomicina, disMinuye e l potencial eléctrico, pero incrementa e l qradiente de pH, porque, a l ser abatida l a energía en forma de qradiente

e l é c t r i c o , l a cadena r e s p i r a t o r i a t r a t a de mantener un n i v e l equivalente de energía 1nCreMentandO e l gradiente de p H . Todos estos e f e c t o s fueron demostrados en c i e r t o s sistemas, principalmente a l f i n a l de l a decada de l o s sesentas.

I

(21)

Algunos ion6foros estén negativanente cargados debido o

la presencia de un grupo carboxílo. La nigericina es el nejor ejemplo d e este caso. El conplejo neutro de le

nigericina con el potasio, y el ior6foro protonado (libre de potasio), son perneables en la Membrana (31,32). Por ello la niqericina puede catalirar un intercanbio de potasio por protón a través de la nembrana y rápidanente, equilibrar el gradiente de potasio con el de protón. Los niveles eriddgerios

de potasio en natrfz son altos, y a niveles externos de

potasio elevados la niqericina sólo tiene un ligero efecto en el p H de natriz. A niveles externos de potasio bajos, sin enbargo, la nigericina cataliza en la nitocondria, un eflujo

de potasio y un influjo de protón que colapsa el sradiente

de protones, pero no afecta al potencial eléctrico

menbranal(30). Sin enbargo, a concentraciones relativanente

elevadas, este iori6foro parece ser capaz de transportar carqa neta, y por lo tanto, de afectar el potencie1 eléctrico nenbranal, a través de la fornación díneros o trímeros de la nolecula en la nenbrana (31,32).

También varios desacoplantes de la respiraci6n

mitocondrial pueden ser considerados cono ion6foros de

protones, El dinitrofenol y el carboriil cianido p-trifluoro

netoxi fenil hidrazana (FCCP), increnentan la perneabilidad

de la Membrana nitocondrial a protones. Estos agentes, por lo tanto, disyinuyen tanto el conponente electric0 cono el conponente quinico del potencial electroquínico de protbn, produciendo una disipación total de la energía ( 2 0 ) .

Dado que estos conpuestos resultan ideales para estudiar los necanisnos ionicos de las nenhranas conservadoras de

energía, su uso ha sido nuy extendido en este canpot Cabe

nencionar que muchas de las pruebas que favorecen a la hipdtesis qUiMiOSMbtiCat s e obtuvieron de estudios de perturbaci6n con ion6forosr Por ello la veracidad de los

necanismos con los que se asune, producen SIJS efectos los

ionSforos, es prinordial para la interpretación de estos

tipos de experimentos. Hasta la fecha, en la literatura la mayoría de los resultados obtenidos con ellos, estan en concordancia con la hipótesis quiniosm6ticat Sin embiwqo, solo en fechas recientes, aplicando este enfoque a

situaciones nos concretas, es que se ha podido constatar una

serie de efectos que todavia no hallan explicaci6n en el marco de referencia quiniosmdtico tradicional.

E ) Evaluación Actual de la Hipdtesis Quimiosnótica~

La hipdtesis de acoplaniento quiniosñótico presentada por Mitchell, s e considera actualment? cono el nejor modelo para explicar la transducción de enerqia ligada a newbranas. Sin enbargo han aparecido en la literatura una serie de datas que aparentenente no estan en concordancia c o n las

(22)

predicciones de este Modelo (64). Este hecho se ha considerado, por algunos autores, como evidencia para s u

revisión. En verdad existen autores que proponen no solo una

revisión a esta hipfjtesis sino un CaMhiO por otro nodelo

explicativo (65).

Esta preocupación se puede notar al leer la

correspondencia que aparece en las revistas especializadas, y que son f o r o de una serie de opiniones y discusiones

acerca de este punto (66-68). Aqui solo trataré de mencionar

aiqunos de estos conceptos, y la consecuencia de ellos en el

modelo de la hip6tesia quimiosmóticar En primer lugar está el hecho de que existen, ciertas evidencias que suqieren que el potencial eiectroquimico de protón no e s el M I S M O , entre las dos fases acuosas a cada lado de la menbraria, y en la

interfase MeMhranal (69). Las Mediciones d e este potencial

entre las dos fases llevaría por lo tanto a una

subestinaci6ri del potencial de fosforilación generado Por la

cadena respiratoria, Esto se explicaría si s e considerase

que en el orqarielo intacto, en el estado estacionario,

existen rutas privileqiadas para los protones que evitan su difusión total en las fases acuosas, y proporcionan un MJYOP

acoplamiento entre las bombas primarias de protones y las

secundarias (70 ) +

Esta hip6tesis es apoyada por estudios de nicroscopca y

de otro tipo, que Muestran que al parecer 'in vivo' la nitocondria no muestra espacio internenbranals o que este espacio es M U Y reducido (71-73). Aquí se podria presentar

agua estructurada, que se dice podría evitar la difusión de

los protones por toda la fase acuosa y proveer de una pista

para los nisnos.€stas observaciones han hecho aparecer una eofisticacion de la hipótesis quimiosndtica presentada por prestigiosos investiqadores, con el nombre de hipbtesis

Mosaico protónica del acoplamiento enerqético (74). En esta

hip6tesis,adenás de incluir los postulados de la hip6tesis quiniosm6tica original, aumentan uno donde se enuncia la existencia de dominios que no son conpartidns por todas las boMbaS de potones. Es C O M O si un protón acabado de bombear hacia afuera por las bombas redox, inflediatanente es tonado por una ATP sintetasa de la vecindad, Esto explicaria una

serie de observaciones donde se nuestra una relacibn no

univoca entre las boMbas primarias y las secundarias.

Algunos autores han neqado hasta la existencia de un

potencial transmembranal siqnif icativo producido por el

metabolismo Mitocondrial (75-76). Esto se apoya por

mediciones con nicroelectrodos y porque se dice que el

potencial que se observa en la nitocondria no es uno

generado por la cadena respiratoria, sino un potencial Donan (77). Siater efectivanente Menciona la imposibilidad de

medir un potencial 'Michelliano' puro (78), pues es

(23)

. I

*.. ”

.

,,

.

imposible evitar el movimiento secundario d e aniories. pero asegura que Tedeschi va muy lejos al decir que el potencial resultante no es significativo para la transducciún

enersética. Williams dice que el fliJJo localizado de

protones e s lo primordial para la transducción energética, y descarta el papel del potencial en este proceso, a s í cono le necesidad de una vesicula cerrada. El hecho e s que no 5e ha

losrado la sintesis de ATP sin vesicula cerrada (64).

A pesar de toda esta discusi6r1, la opinion gemneralirnda

e s que la hipótesis quimiosmdtica no perderá su sitio cono

explicación del fenomeno de acople enersético, pero sc se

refinará para incluir algunas de estas ideas. For ejemplo, s e piensa que en el estado estacionario, los flujos

localizados son mas importantes, y que el potencial

deslocalixado tiene un p a p e l menor, pero necesario ( 7 9 ) .

2/ OBJETIVüS

El objetivo esencial de esta investisación f u e el tratar de aportar datos, relativos a la relación entre la función de transporte y la fi~ncidn de conservación de energra, de l a membrana interna nitocondrial. Como ya he discutido

ampliamente, esto es necesario para una mejor conprensiljn de los procesos, a nivel bioqu~Micot que regulan la

transduccián de la energra bio16gicar Esta comprensidn es

fundamental para la prediccidn del comportamineto de los

seres vivos, la curación de los estados patolosicos (51) 5

para poseer una visidn más clara de los procesos esenciales que constituyen al fenomeno llamado vida.

El estudio de la bioenerqética ha pasado, hace algunos años, p o r un cambio paradigmatico radical, al considerarse por primera vez en bioquíMica conceptos procedentes de la física, tan importantes como ahora son paria la

bioenergt?tica, y que anteriormente eran inconcebibles. Me refiero al concepto de translocaciones vectoriales, pilar de la hipótesis quimiosmótica del acoplamiento energético ( 1 9 ) . Sin embargo, COHO ya s e nencioriá, el marco de referencia quimiosm6tico no es satisfactorio, hoy día, en su totalidad,

para una serie de observaciones relevantes (65-79).

En este caso se encuentran observaciones obtenidas hace alsunos años por Cersio Estrada-O., trabajando con el gri.,ipo de Henry Lard3 (49934-37). y que hoy dra se reunen con un

cuerpo de datos no aclarados en el marco quiniosn6tico. A la

luz del debate actual que tiende, en ocasiones, a nodificar

parcialmente los postulados quimiosn6ticos~ y en otras pocas

ocasiones, hasta tratar de cambiar el paradigma, Se hizo necesario el tratar de hallar una explicaci6n a estas

(24)

observaciones, o por lo menos, partiendo de ellas,

contribuir con datos que a la larga lleven

a

un mejor

planteamiento

de

la actual hip6tesis de acople.

Estos datos indican, que en un sistema en donde se induce

e la ATP sintetasa

a

trabajar en el sentida de la hidrólisis

de ATP, por medio de un iorióforo para cationes

(valinomicina), los ionoforos carbowílicos (cono niqericina)

inhiben esta hidrblisis (34). Sin embarso, esta no puede ser

inhihida si l a hidr6lisis es inducida por un decacoplante

(ionoforo de protones!). Tomando en cuenta lo descrito en la

literatura acerca de la función de la H+-ATF'asa como bomba

de protones, y de los acarreadores invoiucrados en esta

reacción (fisura l), no es posible hallar explicacibn+ Estos

datos vienen acompanados por otros obtenidas por el q r w o de

trabajo de Henry Lardy, en donde se demuestra que una serie

de efectos que promueven los ionóforos de cationes en

diversos sistemas, pueden ser revertidos por los iorióforos

carbowílicos (35-37).

A s í pues el primer objetivo especifico de investigación,

f8Je el obtener un sistema corifiable doride pudieran ser

reproducidas estos efectos. Era necesario contar con kina

técnica de preparación de mitocondrias de hisado de rata, en

donde se tuviera la completa seguridad de que las particulas

estaban lo mas intacto que se pudiera, contando con los

hallazqos mas recientes en este aspecto (42).

Posteriormente era necesario contar con las técnicas

adecuadas para el estudio de los parametros relevantes, Y

compatibles

a

las posibilidades de nuestros laboratorios.

Para ello había que cunplir con una serie de requisitos para

poder obtener datos riuevos Y confiables.

Despues de contar con la metodología necesaria, se trataría de obtener datos para contrastar la hipótesis de

traba jo inicial.:

La

niqericina irihibe la actividad de la ATPasa inducida por

valinomicina, porque de alsuria manera, crea condiciones que modifican la relacion de acción de masas de la reaccibn de

hidrdlisis de

ATP

(tomando en cuenta los movimientos ionicos

pertinentes) de tal forma que se lleqa al equilibrio.

Para que sucediera esto se contaban cuatro alternativas.

A ) Genersci6n de un potencial eléctrico (o electroquímico) desfavorable para la hidrdlisis extensiva, es decir, sue no

hubiera compensacibn de cargas que complete el circuito de

hidrólisis. B) Redciccidn de la accesibilidad de la parte

catalitica de la enzima (que está en la natríz)

a

su

sustrato, lo cuál podría ser causado por una limitación del

translocador de nucieótidos (38) + C ) Acumulacidn exesiva de

Figure

Figura  1.  Componentes Principales de  l a  Membrana Interna Mitocondrial.  (Tomado de  Investigacidn  y  Ciencia  1(20):65,  Mayo 1978)
Figura 6. Algunos de  las moleculas mas  importantes que sirven como io-  nóforos. Se esquematiza  s u  posible mecanismo de transporte del ión
Figura  8.  Trazos de Consumo de Oxigeno de preoaraciones mitocondriales
TABLA 1-  Efecto del medio  de  aislamiento en algunas funciones mito-  condriales. Valores  y  rangos  de 4  experimentos  en  oreoaracio-  nes diferentes
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