• No se han encontrado resultados

Evaluación de la actividad antimicrobiana de los metabolitos secundarios obtenidos por fermentación en medio liquido de una CEPA DE Aspergillus sp. nativa del Páramo de Guasca, Cundinamarca

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2017

Share "Evaluación de la actividad antimicrobiana de los metabolitos secundarios obtenidos por fermentación en medio liquido de una CEPA DE Aspergillus sp. nativa del Páramo de Guasca, Cundinamarca"

Copied!
68
0
0

Texto completo

(1)

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS OBTENIDOS POR FERMENTACIÓN EN MEDIO LIQUIDO DE

UNA CEPA DE Aspergillus sp.

NATIVA DEL PÁRAMO DE GUASCA, CUNDINAMARCA

GIULIANA CAROLINA DAZA GÒMEZ

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar al título de Microbiólogo Industrial

Director

JORGE ROBLES CAMARGO PhD.

Codirectora

ANDREA GARCÍA CAYCEDO

(2)

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS OBTENIDOS POR FERMENTACIÓN EN MEDIO LIQUIDO DE

UNA CEPA DE Aspergillus sp.

NATIVA DEL PÁRAMO DE GUASCA, CUNDINAMARCA

GIULIANA CAROLINA DAZA GÒMEZ

APROBADO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C.

2011

Dra. INGRIDSCHULER GARCÍA PhD

Decana académica Dra. JANETH ARIAS PALACIOS M.Sc-M.Ed

(3)

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS OBTENIDOS POR FERMENTACIÓN EN MEDIO LIQUIDO DE

Aspergillus sp.

NATIVO DEL PÁRAMO DE GUASCA, CUNDINAMARCA

GIULIANA CAROLINA DAZA GÒMEZ

JORGE ROBLES CAMARGO Director

ANDREA GARCÍA CAYCEDO Codirectora

LUIS DAVID GÓMEZ M.Sc Jurado

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C.

(4)

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos

en sus trabajos de tesis. Sólo velará por qué no se publique nada contrario al dogma y

a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra

persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

(5)
[image:5.595.107.482.194.337.2]

TABLA DE CONTENIDO

1. Resumen 1

2. Introducción 2

3. Planteamiento del problema 3

4. Marco Teórico 4

5. Objetivos 6

6. Metodología 6

7. Resultados y Discusión 8

8. Conclusiones y Recomendaciones 15

9. Anexos 16

(6)

LISTA DE ANEXOS

ANEXO No1. Tabla No1. Metabolitos secundarios producidos por especies del género Aspergillus.

ANEXO No2. Tabla No2. Identificación macroscópica de la cepa SPG en diferentes medios de cultivo

ANEXO No3. Imagen No1. Identificación macroscópica de la cepa SPG, en medio Hanson.

ANEXO No4. Imagen No2. Identificación macroscópica de la cepa SPG, en medio AspergillusDifferentiation Agar, Base (AFPA).

ANEXO No5. Imagen No3. Identificación macroscópica de la cepa SPG, en Extracto de levadura, Extracto demalta y en medio Czapeck.

ANEXO No6. Tabla No3.Identificación microscópica de la cepa SPG, en diferentes medios de cultivo.

ANEXO No7. Imagen No4. Identificación microscópica de la cepa SPG mediante la técnica de impronta con azul de lactofenol, en agar PDA.

ANEXO No8. Imagen No5. Identificación microscópica de la cepa SPG mediante la técnica de impronta con azul de lactofenol, en agar Hanson.

ANEXO No9. Imagen No6. Identificación microscópica de la cepa SPG mediante la técnica de impronta con azul de lactofenol, en agar Saboureaud.

ANEXO No10. Imagen No7. Identificación microscópica de la cepa SPG mediante la técnica de impronta con azul de lactofenol, en agar AFPA.

ANEXO No11. Imagen No8. Identificación microscópica de la cepa SPG mediante la técnica de impronta con azul de lactofenol, en agar Extracto de Levadura.

ANEXO No12. Imagen No9. Identificación microscópica de la cepa SPG mediante la técnica de impronta con azul de lactofenol, en agar Extracto de malta.

ANEXO No13. Imagen No10. Identificación microscópica de la cepa SPG mediante la técnica de impronta con azul de lactofenol, en agar Czapeck.

ANEXO No14. Imagen No11. Cultivo monospòrico en Agar PDA.

ANEXO No15. Imagen No12. Conservación de la cepa SPG en Suelo, Agua

destilada con NaCL, Aceite mineral, Papel filtro y Glicerol.

ANEXO No16. Imagen No13. Detección de Metabolitos secundarios a partir de la cinética de crecimiento durante 15 días en medio líquido Hanson de la cepa SPG mediante extracción con éter de petrolero. CCD.

(7)

ANEXO No18. Imagen No15. Detección de Metabolitos secundarios a partir de la cinética de crecimiento durante 15 días en medio líquido Hanson de la cepa SPG mediante extracción con Acetato de Etilo. CCD.

ANEXO No19. Imagen No16. Pruebas de Actividad antimicrobiana contra S. aureus.

ANEXO No20. Imagen No17. Pruebas de Actividad antimicrobiana contra B. subtilis ANEXO No21. Imagen No18. Cromatografía en capa fina de los extractos obtenidos por fermentación en medio liquido Hanson de la cepa SPG. Fase móvil: diclorometano-metanol (9,5:0,5) Revelado con Vainillina en Acido Sulfúrico concentrado.

ANEXO No22. Tabla No4. Rf de las diferentes fracciones evaluadas: Éter de petróleo, Diclorometano y Acetato de etilo de las CCD reveladas con vainillina en acido sulfúrico concentrado.

ANEXO No23. Imagen No19. Cromatografía en capa fina de los extractos obtenidos por fermentación en medio liquido Hanson de la cepa SPG. Fase móvil:

diclorometano-metanol (9,5:0,5), Revelado con Luz UV λ larga 366nm.

ANEXO No24. Tabla No5. Rf de las diferentes fracciones evaluadas: Éter de petróleo, Diclorometano y Acetato de etilo de las CCD reveladas con Luz UV longitud de onda larga 366nm.

ANEXO No25. Imagen No20. Cromatografía en capa fina de los extractos obtenidos por fermentación en medio liquido Hanson de la cepa SPG. Fase móvil:

diclorometano-metanol (9,5:0,5), Revelado con Luz UV λ corta 254nm.

ANEXO No26. Tabla No6. Rf de las diferentes fracciones evaluadas: Éter de petróleo, Diclorometano y Acetato de etilo de las CCD reveladas con Luz UV longitud de onda larga 366nm.

ANEXO No27. Imagen No 21. Cromatografía en capa fina de los extractos obtenidos por fermentación en medio liquido Hanson de la cepa SPG. Fase móvil: Éter de petróleo – Acetato de etilo (7:3), Revelado con Vainillina en Acido Sulfúrico concentrado.

ANEXO No28. Tabla No7. Rf de las diferentes fracciones evaluadas: Éter de petróleo, Diclorometano y Acetato de etilo de las CCD reveladas con vainillina en acido sulfúrico concentrado.

ANEXO No29. Imagen No 22. Cromatografía en capa fina de los extractos obtenidos por fermentación en medio liquido Hanson de la cepa SPG. Fase móvil: Éter de petróleo – Acetato de etilo (7:3), Revelado con Luz UV λ larga 366nm.

ANEXO No30. Tabla No8. Rf de las diferentes fracciones evaluadas: Éter de petróleo, Diclorometano y Acetato de etilo de las CCD reveladas con Luz UV longitud de onda larga 366nm.

ANEXO No31. Imagen No 23. Cromatografía en capa fina de los extractos obtenidos por fermentación en medio liquido Hanson de la cepa SPG. Fase móvil: Éter de petróleo – Acetato de etilo (7:3), Revelado con Luz UV λ corta 254nm.

(8)

ANEXO No33. Imagen No 24. Cromatografía en capa fina de los extractos obtenidos por fermentación en medio liquido Hanson de la cepa SPG. Fase móvil: Éter de petróleo – Acetato de etilo (9:1), Revelado con Vainillina en Acido Sulfúrico concentrado.

ANEXO No34. Tabla No10. Rf de las diferentes fracciones evaluadas: Éter de petróleo, Diclorometano y Acetato de etilo de las CCD reveladas con vainillina en acido sulfúrico concentrado.

ANEXO No35. Imagen No25. Cromatografía en capa fina de los extractos obtenidos por fermentación en medio liquido Hanson de la cepa SPG. Fase móvil: Éter de petróleo – Acetato de etilo (9:1), Revelado con Luz UV λ larga 366nm.

ANEXO No36. Tabla No11. Rf de las diferentes fracciones evaluadas: Éter de petróleo, Diclorometano y Acetato de etilo de las CCD reveladas con Luz UV longitud de onda larga 366nm.

ANEXO No37. Imagen No26. Cromatografía en capa fina de los extractos obtenidos por fermentación en medio liquido Hanson de la cepa SPG. Fase móvil: Éter de petróleo – Acetato de etilo (9:1), Revelado con Luz UV λ corta 254nm.

ANEXO No38.Tabla No12. Rf de las diferentes fracciones evaluadas: Éter de petróleo, Diclorometano y Acetato de etilo de las CCD reveladas con Luz UV longitud de onda larga 366nm.

ANEXO No39. Tabla No13. Medios de cultivo.

ANEXO No40. Tabla No14. Relación entre color de la mancha en luz UV y

estructura.

ANEXO No41. Tabla No15. Relación de los compuestos encontrados por cromatografía de gases. Fuente: Elaboración propia.

ANEXO No42. Grafica No3. cromatograma general de la fraccion de Diclorometano.

(9)

1

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS OBTENIDOS POR FERMENTACIÓN EN MEDIO LIQUIDO DE

UNA CEPA DE Aspergillus sp.

NATIVA DEL PÁRAMO DE GUASCA, CUNDINAMARCA

Grupo de investigación en Fitoquímica Universidad Javeriana (GIFUJ)- COLCIENCIAS

Metabolitos de cepas nativas colombianas de hongos filamentosos y evaluación de su actividad biológica III

1. RESUMEN

Los hongos microscópicos son fuente de una gran diversidad de compuestos químicos, considerándoseles la fuente de más del 50% de metabolitos utilizados por la industria farmacéutica. Estos compuestos denominados metabolitos secundarios presentan estructuras químicas complejas y su función básicamente está relacionada con la satisfacción de necesidades secundarias de los organismos productores, proporcionando principalmente mecanismos de defensa y facilitando procesos reproductivos, generando un impacto a nivel industrial, agrícola y ambiental debido a las múltiples aplicaciones entre las que se conocen su actividad como: agentes antibacterianos, antifúngicos, reductores del colesterol, inmunosupresores, antiparasitarios, herbicidas, antitumorales, inmunosupresores, antiparasitarios y antihelmíntico.

Diferentes especies de hongos aislados del páramo de Guasca, (Cundinamarca) han sido objeto de estudio en los que se ha demostrado la producción de sustancias con actividad antimicrobiana en fermentación liquida, por lo cual el objetivo principal de este estudio es detectar metabolitos secundarios que presenten actividad antimicrobiana por medio de fermentación liquida de una cepa nativa de Aspergillus sp. nativa del páramo de Guasca (Cundinamarca). Para esto se realizó la cinética de crecimiento del microorganismo en medio liquido Hanson, determinando así la trofofase e ideofase del día 0 al día 2 y del día 2 al 12 respectivamente; adicionalmente se realizaron extracciones con éter de petróleo (baja polaridad), diclorometano (mediana polaridad) y acetato de etilo (alta polaridad) para detectar la producción de metabolitos mediante CCD (cromatografías de capa fina), revelándolas con luz UV y vainillina en ácido sulfúrico concentrado, detectando presencia de metabolitos en los tres solventes.

Determinados los parámetros cinéticos, se llevó a cabo la fermentación en medio liquido Hanson (10L) , a temperatura ambiente y agitación constante durante 12 días; terminada la fermentación se filtro al vacio para separar la biomasa y la fase acuosa, a la cual se le realizo extracción líquido- liquido en embudo de decantación con los mismos solventes.

Adicionalmente, se realizaron dos pruebas diferentes a la fermentación y extracción

con solventes orgánicos usada para la obtención de metabolitos secundarios. La primera consistió en fermentar 50mL en medio Hanson por 12 días, se centrifugó

(10)

2

uno, finalmente se filtró y se recogió la fase acuosa la cual se dejó en cabina de extracción por 12 horas y se obtuvieron 43mg del compuesto .

Obtenidas todas las fracciones (Diclorometano, Acetato de Etilo, Acetona-Cloroformo, fase acuosa) se realizaron pruebas de actividad antimicrobiana mediante la técnica de difusión de disco para bacterias y la técnica en difusión en placa de agar para el hongo, a una concentración de 25mg/350µL y 50mg/350µL en dimetilsulfóxido (DMSO) (excepto el extracto acetona-cloroformo el cual se evaluó a concentración de 43mg/350µL en acetona) contra bacterias Gram negativas (Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027), Gram positivas (Staphylococcus aureus ATCC 6535, Bacillus subtilis ATCC 6633) y un hongo fitopatógeno (Fusarium oxysporum)

Se encontró inhibición únicamente frente a las bacterias Gram positivas; en el caso de S. aureus ATCC 6535 se observo inhibición con la fracción de acetato de etilo tanto de 25mg/350µL como con 50mg/350µL, con la fracción de diclorometano solo se detecto inhibición a los 25mg/350µL y con el ensayo acetona-cloroformo 43mg/350µL también se observo inhibición. En el caso de B. subtilis ATCC 6633 solo se observo inhibición con la fracción de diclorometano tanto de 25mg/350µL como con 50mg/350µL.

Debido a esto se corrieron las fracciones de diclorometano y acetato de etilo por cromatografía de gases acoplado a detector de masas y se comparó con la base de datos del cromatografo (librerías Nist 0.5 y Willey 7), encontrándose las siguientes sustancias: 6-Methyl-2-pyrazinylmethanol, 2,3-Dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one y 4-hydroxy Benzene ethanol, a las cuales se les puede atribuir la actividad antimicrobiana.

Las CCD de la curva de crecimiento permitieron detectar la producción de sustancias en el transcurso de la fermentación, de acuerdo a los valores de Rf de las sustancias comunes en los extractos que reportaron actividad, se evaluaron las bandas obtenidas en las fracciones de la curva; las bandas con los valores de Rf comunes y comportamiento similar frente a la luz UV (λ corta 254nm y larga 366nm), y al revelador vainillina en ácido sulfúrico, comenzaron aparecer entre los días 3 y 15, lo que indica que son sustancias propias del metabolismo secundario.

2. INTRODUCCIÓN

Los metabolitos secundarios son compuestos que presentan estructuras químicas complejas y son conocidos como aquellos productos del metabolismo que no son esenciales para el crecimiento y desarrollo de un organismo. Estos compuestos tienen como función satisfacer necesidades secundarias de los organismos productores, proporcionando principalmente mecanismos de defensa y facilitando los procesos reproductivos.

(11)

3

esto los microorganismos nativos se encuentran adaptados a ecosistemas complejos, no solamente por el clima sino también por la competencia constante entre otros organismos que habitan en el suelo; entre los mecanismos de adaptación conocidos se encuentran principalmente aquellos relacionados con la función de enzimas y función del transporte de nutrientes, además según reportes de Arias y Piñeros, 2008 (4) los organismos que se encuentran adaptados producen sustancias metabólicas, las cuales pueden presentar características de interés industrial.

Los hongos pertenecientes al género Aspergillus son uno de los principales contribuyentes de los metabolitos secundarios de origen fúngico (5)(6), entre los compuestos más reportados aislados de este género se encuentran las aflatoxinas, la patulina, ácido penicìlico, citroviridina, esterigmatocistina, ocratoxinas, ácido ciclopiazónico y citocalasinas. (7)

Estudios anteriores realizados a partir de cepas nativas del páramo de Guasca (Cundinamarca), han demostrado la existencia de sustancias con actividad antimicrobiana mediante la extracción de metabolitos secundarios en medio líquido. Razón por la cual el objetivo principal del presente estudio es obtener los metabolitos secundarios de una cepa nativa de Aspergillus sp., proveniente del suelo del páramo de Guasca (Cundinamarca) a partir de fermentación en medio liquido y evaluar la actividad antimicrobiana.

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Los hongos producen una gran variedad de metabolitos secundarios, los cuales constituyen una fuente de productos naturales con actividad biológica diversa comprobándose, entre otras, su actividad antibacteriana, antifúngica, antiviral, anticancerígena, anticoagulante, citotóxica, hipocolesterolémica, neurotóxica, inhibidores o promotores de crecimiento vegetal. Esta gama de propiedades, permite a estos compuestos tener un gran potencial de aplicación, ya sea aislándolo o usando directamente el extracto del compuesto al que se le ha detectado una actividad biológica específica, empleándolo como precursor en la síntesis de compuestos orgánicos o para caracterizar la estructura de sus centros activos con el fin de modelar nuevas sustancias con propiedades preestablecidas, siendo utilizados especialmente por industrias farmacéuticas, y cada vez más en terapias para animales, y en la agricultura como plaguicidas(8)(9).

Estos hongos microscópicos son fuente de una gran diversidad de compuestos químicos, considerándoseles la fuente de más del 50% de metabolitos utilizados por la industria farmacéutica ya sea en su forma nativa o como derivados. Sin embargo solo una pequeña parte de estos microorganismos se conoce, y la mayoría de ellos producen varios metabolitos aun desconocidos, lo que los hace ser todavía uno de las principales fuentes de estudio (10).

Además, la creciente necesidad por descubrir compuestos capaces de controlar las enfermedades emergentes y la resistencia desarrollada por los fármacos ya existentes a los patógenos comunes, ha despertado el interés de numerosos científicos sobre los metabolitos secundarios, producidos por hongos. (11)

(12)

4

del páramo de Guasca (Cundinamarca), han demostrado la existencia de sustancias con actividad antimicrobiana mediante la extracción de metabolitos secundarios. Debido a esto, el presente trabajo pretende detectar la presencia de metabolitos secundarios de una cepa nativa del suelo de Aspergillus sp., del páramo de Guasca (Cundinamarca), obtenidos por fermentación en medio líquido, y determinar si presentan actividad antimicrobiana, y contribuir así al conocimiento científico, sobre metabolitos secundarios producidos por hongos filamentosos nativos del suelo.

4. MARCO TEÓRICO

Los hongos son organismos eucariotas, que presentan ergosterol hacia el exterior en la membrana citoplasmática, la pared celular está compuesta por polisacáridos principalmente: quitina (polímero de de n-acetil glucosamina), el manano (polímero de manosa), glucano (polímero de glucosa) y proteínas.

Se encuentran clasificados en el Reino Fungí, que se divide en cinco Phyla denominados Ascomycota (el más extenso que comprende el 50% de los hongos conocidos), Basidiomycota, Zygomycota, Chytridiomycota y Glomeromycota. Los hongos en los que no se conoce su reproducción sexual, constituyen un grupo heterogéneo denominado Deuteromicetes, hongos imperfectos o mitospóricos, que representa el segundo grupo más numeroso.

Estos organismos presentan un metabolismo quimioheterótrofo, es decir que obtienen la energía y el carbono de compuestos orgánicos sintetizados por otros organismos, mediante exoenzimas que degradan diversidad de compuestos que posteriormente son absorbidos a través de la pared. (13)

Los metabolitos secundarios son moléculas estructuralmente heterogéneas de bajo peso molecular producidas por un gran número de microorganismos, especialmente por bacterias y hongos que viven en el suelo, lo cual se debe principalmente a que estos microorganismos se desarrollan en ecosistemas complejos en los cuales compiten constantemente con otros organismos, desde bacterias, hongos, algas, protozoos e incluso metazoos.(14)

Una característica importante de estos compuestos, es que por lo general se ven suprimidos cuando se presenta una alta tasa de crecimiento, y las vías biosintéticas se ven afectadas por mecanismos de regulación tales como la inducción, represión de nutrientes, decaimiento de la sintetasa y la regulación del producto final. Cuanto más compleja es la ruta biosintética de estos metabolitos secundarios más restringido es el número de especies de hongos productores de estas sustancias. (2)

Se define páramo como un ecosistema de alta montaña, ubicado entre el límite superior del bosque Andino, y, si se da el caso, el límite inferior de los glaseares o nieves perpetuas, en el cual domina una vegetación herbácea y de pajonales, frecuentemente frailejones y pueden haber formaciones de bosques bajos y arbustivos y presentar humedales como los ríos, quebradas, arroyos, turberas, pantanos, lagos y lagunas (15). En Colombia se encuentra el 60% de los páramos del mundo, lo que le confiere una ventaja biológica ya que son una importante reserva de biodiversidad, en el cual se encuentran y desarrollan numerosas especies de plantas, animales y microorganismos nativos (16)(17)

(13)

5

rápida, reacción de ácida a muy ácida, compuesto principalmente por arena 63%, limo 18% y arcilla 19%. Con una porcentaje de humedad del 19,36%, un pH de 4,7, con un porcentaje de carbono orgánico total de 1,73 y con un porcentaje de nitrógeno orgánico total de 10,86; Se caracteriza por presentar un clima frio-húmedo donde las lluvias anuales alcanzan 3.000mm, con una temperatura anual en promedio menor a los 10ºC en sectores que se encuentran por debajo de 3600msnm y 8ºC en donde la altitud se encuentre por encima de 3600msnm. (16)

Debido a la amplia diversidad biológica de los páramos colombianos, se han desarrollado varias investigaciones con el fin de aislar hongos filamentosos de los suelos paramunos, en estudios realizados por Romero y Sánchez, 2004 (18) y Chitiva y Torrenegra et al, 2001 (16) se reportaron la presencia de diferentes géneros de hongos tanto patógenos como saprofitos entre los que se encuentran: Absidia sp., Acremonium sp., Alternaria sp., Ascochyta sp., Aspergillus sp., Bartalinia sp., Circinella sp., Cladosporium sp., Cuninghamella sp., Curvularia sp., Emericella sp., Epicoccum sp., Fusarium sp., Geotrichum sp., Gliocadium sp., Metarhizium sp., Monilliella sp., Mortierella sp., Mucor sp., Nannizia sp., Nigrospora sp., Paecilomyces sp., Penicillium sp., Pestalotia sp., Phitomyces sp., Phoma sp., Rhizopus sp., Scopulariopsis sp., Stachybotris sp., Syncephalastrum sp., Stemphyllium sp., Thielaviopsis sp., Trichoderma sp., Trichotecium sp., y micelios esteriles.

El género Aspergillus representa un número grande de especies de hongos asexuales u hongos imperfectos, Deuteromycetes, y aproximadamente un tercio de las especies descritas poseen forma sexual o teleomòrfica conocida (19). Se encuentran distribuidos en una amplia gama de hábitats (20) y presentan un amplio rango de temperatura, humedad y aerobiosis para su desarrollo. (21) (22).

Este género se caracteriza por la producción de hifas especializadas, denominadas conidióforos, sobre los que se encuentran las células conidiógenas que originarán los conidios. El conidióforo característico de Aspergillus, aunque es una estructura unicelular posee tres partes bien diferenciadas: vesícula (extremo apical hinchado), estipe (sección cilíndrica situada debajo de la vesícula) y célula pie (sección final, a veces separada por un septo, que une el conidióforo con el micelio). Sobre la vesícula se disponen las células conidiógenas, denominadas habitualmente fiálides. En muchas especies, entre la vesícula y las fialides se encuentran otras células denominadas métulas. Las cabezas conidiales que sólo presentan fiálides se denominan uniseriadas, y las que presentan fiálides y métulas biseriadas. (23)

El género Aspergillus es uno de los que más contribuye a los metabólitos secundarios (22), entre los más reportados aislados de este género se encuentran las Aflatoxinas, la Patulina, Acido penicìlico, citroviridina, esterigmatocistina, Ocratoxinas, Acido ciclopiazònico, citocalasinas, emodina, caternarin, gliotoxina, esterigmatocistina y Aflatrem entre otros (Anexo No1). (23) (24)

(14)

6

5. OBJETIVOS 5.1 Objetivo General

Detectar metabolitos secundarios de una cepa nativa de Aspergillus sp., proveniente del suelo del páramo de Guasca (Cundinamarca) a partir de fermentación en medio liquido y evaluar su actividad antimicrobiana. 5.2 Objetivos Específicos

Caracterizar la cepa la cepa SPG aislada del suelo del páramo de Guasca (Cundinamarca)

Determinar las fases trofofase e idiofase de la cepa SPG mediante cinética de crecimiento.

Detectar las sustancias producidas por la cepa SPG a partir de fermentación en medio líquido.

Evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos producidos por la cepa SPG.

6. METODOLOGÍA

Reactivación de la cepa: La cepa suministradas por el GIFUJ, obtenida a partir de muestras de suelo del Páramo de Guasca (Cundinamarca) por Cabrera y Chitiva en 2001 (16), conservada en tubo de agar se repico en agar PDA para su reactivación, el medio inoculado se llevo a incubación 7 días a 25°C.

Elaboración de un cultivo monospòrico: Se realizó un cultivo monospórico a partir de la suspensión de conidios en Tween 0,5% (v/v), posteriormente se realizó un recuento en cámara de Neubauer, y se realizaron diluciones en base diez con un volumen final de 5mL, hasta obtener una concentración de 10 conidios por mililitro, finalmente se siembro por agotamiento en agar PDA con cloranfenicol (50ppm) y se incubo a 25ºC.

La selección del conidio germinado se realizo bajo observación por estereoscopio a las 12 horas de la siembra, la cual se incubo nuevamente durante 48 horas para posteriormente realizar un repique en agar PDA suplementado con cloranfenicol. (43) Identificación de la cepa: Una vez obtenido el microorganismo axénico y viable, por medio del cultivo monospórico, se realizo la clasificación a partir de repiques realizados en 6 medios de cultivo diferentes: agar PDA, agar Sabouraud, agar Czapeck dox (CZ), agar Extracto de malta (MEA) (44) agar Extracto de levadura y agar AFPA (Aspergillus Differentiation Agar, Base); y la identificación mediante el uso de claves taxonómicas de Samsom y Hoekstra et al, 2000 (45), de acuerdo a características macroscópicas como el diámetro, color (anverso y reverso), exudados, pigmentos difusibles y textura de la colonia; y características microscópicas como cabezas conidiales, la forma y tamaño de la vesícula, el tamaño y disposición de las fialides, la presencia o ausencia de metulas, la forma y tamaño de los conidios (44), mediante el uso del programa Motic images Plus®.

(15)

7

conservación en suelo, según la técnica de Chang y Miles, 1989 (46), conservación en agua destilada y aceite mineral según la metodología realizada por Beltrán, 2006 (47), y adicionalmente se realizo el método de tubo inclinado, según la metodología realizada por Scragg, 1997 (48).

Cinética de crecimiento: La curva de crecimiento se realizo por triplicado durante 15 días en erlenmeyers de 200mL con 36mL de medio liquido Hanson y cada uno fue inoculado con 4mL de una concentración de 106 108 conidios/mL de la cepa SPG, en constante agitación a 120rpm y a temperatura ambiente. Posteriormente se cuantificó la biomasa mediante la determinación de peso seco (55ºC por 24 horas), se mido el pH, y adicionalmente se realizo la técnica de DNS para la cuantificación de azucares residuales según Miller, 1959. (49)

Determinación de los metabolitos secundarios: paralelamente a la cinética de crecimiento se recogió la fase acuosa del filtrado realizado para la determinación del peso seco de cada uno de los días, y posteriormente se realizo el proceso de extracción mediante el uso de solventes con tres polaridades diferentes: baja (éter de petróleo), media (diclorometano) y alta (acetato de etilo), finalmente obtenidos los diferentes extractos se realizaron cromatografías en capa delgada de cada uno de los extractos por cada día según la metodología empleada por Frisvad y Andersen et al., 2008 (50)

Fermentación: La fermentación se llevo a cabo en el medio Hanson con un volumen total de 10L, en 4 erlenmeyers de 5L con un volumen total de 2.5L, a temperatura ambiente durante 12 días en agitación constante a 120rpm.

Posteriormente se realizo un proceso de filtración al vacio y se recogió la fase acuosa, y la biomasa se seco a 50ºC por 24 horas.

Pruebas Complementarias:

Se realizó la técnica descrita por Kumar y Mongolla et al 2010 (51): en la cual se realizo una fermentación de 50mL en medio Hanson a temperatura ambiente por 12 días, posteriormente se centrifugó y se filtró con papel filtro Whatman No3, y se recogió la fase acuosa y se almaceno a 4ºC en tubos Falcón estériles.

Adicionalmente, se sembró el microorganismo una caja de agar Hanson por 12 días a 25ºC, posteriormente con una pipeta Pasteur invertida se sacaron discos de agar con microorganismo crecido, los cuales se adicionaron a un erlenmeyer de 500mL al cual se le adición 40mL de acetona y se dejo en agitación constante y temperatura ambiente por una hora, posteriormente se adicionaron 40mL de cloroformo y se dejo igualmente en agitación constante y a temperatura ambiente por una hora, finalmente se filtro y se recogió la fase acuosa la cual se dejo en cabina de extracción por 12 horas y se obtuvieron 43mg del compuesto, el cual se adiciono a un tubo eppendorf con 1mL de acetona en condiciones de esterilidad de acuerdo a la técnica descrita por Losada y Ajayi et al 2009 (52).

Extracción y Fraccionamiento

La extracción de la fase acuosa se realizo mediante el uso de solventes con tres polaridades diferentes: baja (éter de petróleo), media (diclorometano) y alta (acetato de etilo).

(16)

8

Pruebas de actividad antimicrobiana: Se realizaron pruebas antimicrobianas contra bacterias Gram positivas: Staphylococcus aureus ATCC 6535 y Bacillus subtilis ATCC 6633, Gram negativas: Escherichia coli ATCC 8739 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 y un hongo fitopatógeno (Fusarium oxysporum), mediante la técnica de difusión en discos para las bacterias, según la metodología NCCLS (54) , y mediante la técnica de difusión en placa de agar para el hongo, según la metodología de Steven y Rusell (2007) (55)

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La identificación de la cepa SPG obtenida del banco del laboratorio de química microbiológica de la Pontificia Universidad Javeriana, se realizó teniendo en cuenta características morfológicas tanto macroscópicas como microscópicas, para lo que se realizaron diferentes siembras en medios de cultivo comunes: PDA, Extracto de Malta, Extracto de Levadura, Hanson, Sabouraud, Czapeck, en las cuales se observaron características propias y representativas del genero Aspergillus (Tabla No2) (Tabla No3 Imágenes No1, No2 y No3). Posteriormente se realizó el seguimiento de la clave taxonómica de Samsom y Hoekstra et al, 2000 (45), al igual que la siembra en el medio Aspergillus Differentiation Agar, Base (AFPA) (56), identificando al microorganismo posiblemente como Aspergillus flavus, debido a las características macroscópicas y microscópicas observadas en los medios de cultivo anteriormente mencionados, y además a que el desarrollo del microorganismo en el agar AFPA produjo un color naranja intenso en el reverso de la caja, lo cual se explica en que los iones de hierro presentes en el medio reaccionan con el ácido penicilínico generado por el microorganismo (57) tal como se observa en la Imagen No2. d; sin embargo para la confirmación de la especie se recomienda realizar pruebas moleculares.

Identificado el microorganismo se realizó un cultivo monospórico (Imagen No.11), lo que permitió que se obtuvieran cultivos axénicos y que además se mantuvieran tanto

características bioquímicas como fisiológicas disminuyendo la variabilidad genética (58)

Posteriormente se realizó un banco de trabajo utilizando métodos de conservación que garantizaran la pureza, viabilidad y estabilidad del cultivo, por lo cual se emplearon métodos de mediano y corto plazo: conservación de conidios en Suelo estéril, disco del microorganismo en aceite mineral, en glicerol y en agua destilada con una concentración de 0,85% de cloruro de sodio almacenados a 4ºC (Imagen No.12), debido a que son los métodos comúnmente utilizados para la conservación de hongos filamentosos (59)(60), y se fundamentan básicamente en que el medio en el cual se encuentran inmersos (suelo, aceite, agua, glicerol) disminuyen la transferencia de oxigeno y acompañado de una baja temperatura (4°C), genera la disminución del metabolismo celular, permitiendo así la conservación. (59).

(17)

9

los cuales se ha reportado que en especies pertenecientes al género Aspergillus. Estos microelementos son esenciales para la síntesis y producción de metabolitos secundarios (61)(52)(62), siendo Hanson un medio que proporciona los elementos descritos anteriormente. (Anexo Medios de Cultivo).

Al realizar la cinética del microorganismo, lo que se quería observar era el comportamiento del crecimiento de la cepa SPG en un medio de cultivo determinado, entendiendo el crecimiento como un incremento de biomasa; para lo que se realizó un proceso discontinuo, en el que se observó un comportamiento típico de los hongos filamentosos caracterizado por dos fases, una fase inicial o primaria denominada trofofase y una fase secundaria denominada ideofase.

La trofofase o fase de crecimiento se caracteriza por la síntesis de metabolitos primarios, los cuales son esenciales para el desarrollo del microorganismo, dada por los nutrientes suficientes y condiciones ambientales optimas (pH, Tº, oxigeno), generando un aumento en biomasa del microorganismo (6), tal como se observo en la cinética de crecimiento de la cepa SPG donde a partir del día 0 hasta el día 2 se evidencia un incremento de biomasa del microorganismo (Gráfica No1). Posteriormente cuando el microorganismo ha alcanzado el máximo crecimiento se da inicio a la siguiente fase denominada ideofase, donde se mantiene el crecimiento del microorganismo, lo cual se atribuye al agotamiento de los nutrientes y a la acumulación de metabolitos tóxicos entre los que se encuentran principalmente: ácidos orgánicos y amoniaco(63); en este momento se da la producción de los metabolitos secundarios, que para el microorganismo estudiado se observó a partir del día 2 hasta el día 12, tal como se muestra en la Grafica No1., estos compuestos o sustancias proporcionan principalmente mecanismos de defensa y facilitan procesos reproductivos del organismo productor (1), y a pesar de que se generan posteriormente al crecimiento se ha reportado que para su producción se apoyan necesariamente en el metabolismo primario, utilizando enzimas, sustrato, energía y la maquinaria celular para la producción de dichas sustancias(64). A pesar de que son dos fases diferentes la torofase es importante para la producción de los metabolitos secundarios ya que se sabe que a partir del metabolismo primario se proveen precursores y cofactores necesarios en las vías biosintéticas de compuestos con características antimicrobianas (65); finalmente se observa una fase en la cual decrece la biomasa, tal como se observa a partir del día 12 al día 15 (Grafica No1), dada por la autolisis del micelio que conlleva al rompimiento de la pared del hongo, liberando componentes de la misma como lo es la quitina, proteínas y otros polisacáridos.(63) Adicionalmente se determinaron azucares residuales, mediante la técnica de Miller (1959), para cuantificar azucares reductores producidos durante la fermentación, ya que es otro método que proporciona información sobre el comportamiento del microorganismo en el medio de cultivo, observando que entre los días 0 y 2, se da el máximo consumo del sustrato, durante los días 3 hasta el 15, se observa que el sustrato residual es muy bajo, tal como se observa en la Grafica No1, resultado esperado, ya que como se mencionó anteriormente durante los días 0 y 2, el microorganismo se encontraba en trofofase (alto consumo de nutrientes), entre los días 3 hasta el 12 en ideofase y del 12 al 15 en periodo de lisis celular.

(18)

10

pH se encuentra por debajo a 4.0 la producción de estos compuestos se potencializa.(67)(52)

Cinética de crecimiento de la cepa SPG Fermentación en medio liquido.

Gráfica No1. Cinética de crecimiento de la cepa SPG por Fermentación en medio líquido (Hanson). Fuente: elaboración propia.

Paralelamente se realizó el seguimiento de los metabolitos secundarios producidos en la cinética de crecimiento del microorganismo, esto con el fin de detectar los días en los cuales se producen estos compuestos, para lo cual, se utilizaron tres solventes orgánicos diferentes con polaridad creciente empezando con éter de petróleo, aumentando la polaridad con diclorometano y terminando con acetato de etilo para arrastrar sustancias de mayor polaridad, ya que al utilizar diferentes polaridades aumenta la posibilidad de arrastran diversos metabolitos secundarios.

Para detectar los metabolitos secundarios presentes en cada una de las tres fracciones se realizaron CCD en sílica gel observando diferentes compuestos tal como se muestra en la Imagen No13, No14 y No15., donde se aprecia que los compuestos aparecieron después del día 2, lo cual coincide con el inicio de la ideofase. (Grafica No1)

(19)

11

Terminada la fermentación, se separó la fase acuosa, y se realizó extracción con solventes orgánicos de la misma manera como se llevó a cabo en la detección de metabolitos secundarios producidos en la cinética de crecimiento, obteniendo tres fracciones: fracción de Éter de petróleo (101mg), fracción de Diclorometano (254mg) y la fracción de Acetato de etilo (234mg).

Al mismo tiempo se realizaron dos ensayos según Kumar y Mongolla et al (2010) y Losada y Ajayi et al (2009) obteniendo 43mg por extracción con acetona y cloroformo, y 50mL aproximadamente de fase acuosa respectivamente. Obtenidos los 4 extractos y la fase acuosa se realizaron las pruebas antimicrobianas.

En el caso de los 4 primeros extractos (Éter de petrolero, Diclorometano, Acetato de etilo y acetona-cloroformo) se probaron dos concentraciones mediante la técnica de difusión de disco para las bacterias y la actividad antifúngica mediante difusión en placa de agar probando dos cantidades: 1,43mg y 2,86mg; en el caso de la fase acuosa se agregaron directamente 20µL de la solución obtenida en los discos y en el

medio. Para todas las pruebas se llevaron a cabo controles positivos, negativos y pruebas de viabilidad, que permitieran dar validez a los ensayos realizados. Los resultados obtenidos se muestran en las Graficas No.2 y No.3 y en los Anexos Imagen No.16 y No.17.

Tal como se observa, se encontró inhibición únicamente frente a las bacterias Gram positivas; en el caso de S. aureus ATCC 6535 se observó inhibición con la fracción de acetato de etilo tanto de 25mg/350µL con un halo de 0,18cm de diámetro, como con 50mg/350µL con un halo de 0,47cm de diámetro, con la fracción de diclorometano solo se detectó inhibición a los 25mg/350µL con un halo de 0,23cm de diámetro, y con el ensayo acetona-cloroformo 43mg/350µL también se observó inhibición con un halo de 0,26cm de diámetro. En el caso de B. subtilis ATCC 6633 solo se observó inhibición con la fracción de diclorometano tanto de 25mg/350µL con un halo de 0,42cm, como con 50mg/350µL con un halo de 0,52cm.

Grafica No.2 . Resultado de pruebas de actividad antibacterial de las fracciones obtenidas de los extractos Acetato de etilo, Diclorometano (CH2CL2), Acetona-cloroformo, Fase acuosa y el

(20)

12

Grafica No.3. Resultado de pruebas de actividad antifúngica de las fracciones obtenidas de los extractos Acetato de etilo, Diclorometano (CH2CL2), Acetona-cloroformo, Fase acuosa y el

control positivo: Terbinafina 2,5mg/mL. Fuente: Elaboración propia

El hecho de que se encontrara inhibición en las bacterias Gram positivas y no en las Gram negativas y en el hongo filamentoso, se puede explicar en las diferencias que se encuentran en los componentes de la pared de cada uno de estos microorganismos. En el caso de las bacterias el no encontrar inhibición en E. coli y P. aeruginosa se debe básicamente a la baja permeabilidad que presenta la pared celular frente a los compuestos antibióticos, impidiendo la acumulación de estos en la membrana citoplasmática y por ende reprimir la acción eficaz de estos compuestos (69), tal como se puede observar en la Gráfica No.2.

Para el caso del hongo filamentoso, la resistencia a los compuestos ensayados se debe principalmente a la complejidad de la pared del hongo (quitina, manano, glucano, y proteínas) y a la resistencia que puede presentar el Ergosterol frente a los extractos obtenidos a partir de la cepa SPG, ya que se sabe que la mayoría de los fármacos empleados para inhibir patógenos fúngicos la mayoría actúan inhibiendo de alguna forma, la síntesis del ergosterol, como en el caso del control positivo en el que se utilizó la Terbinafina, compuesto que inhibe la enzima escualeno epoxidasa que realiza la epoxidación del escualeno, evitando que este se transforme en lanosterol, y se acumula en la célula generando la ruptura de la membrana y por ende la muerte celular (70), tal como se observa en la Gráfica No.3

Por otro lado el hecho de no encontrar inhibición contra los diferentes microorganismos ensayados a partir de la fase acuosa, no significa que no se encontraran metabolitos secundarios con actividad biológica, sino que se pudo presentar un efecto de sobrelapamiento, es decir, que la actividad de una o más sustancias presentes en la fase acuosa de manera individual, pueden ser inhibidos por la combinación de todas las sustancias presentes en la muestra (71)

(21)

13

acetato de etilo y acetona-cloroformo, que presentaron inhibición frente a algunos microorganismos ensayados, como se señalo anteriormente. (Gráfica No.2).

Se realizaron CCD de los extractos de éter de petróleo, diclorometano y acetato de etilo, obtenidos a partir de la fermentación utilizando diferentes fases móviles: diclorometano-metanol 9,5:05, en la cual se observaron mayor cantidad de bandas en los extractos de acetato de etilo y diclorometano que en éter de petróleo, tanto al revelarlos con luz UV λ corta 254nm y larga 366nm como con vainillina en ácido sulfúrico, resultado esperado, debido a la naturaleza de la fase móvil (medianamente polar) que es más afín a estos extractos, permitiendo arrastrar compuestos con características medianamente polares y polares.(Imagen No18, No19 y No20).

Se evaluaron también la fase móvil: éter de petróleo-acetato de etilo 7:3 y 9:1, en las que se observaron mayor cantidad de bandas en el extracto de éter de petróleo que en los extractos de diclorometano y acetato de etilo, tanto al revelarlos con luz UV λ corta 254nm y larga 366nm como con vainillina en ácido sulfúrico, resultado esperado, debido a la naturaleza de la fase móvil (apolar) que era más afín a este extracto, permitiendo arrastrar compuestos con características apolares.(Imagen No21, No22, No23, No24, No25 y No26).

En el caso de las placas reveladas con vainillina en ácido sulfúrico (revelador universal), se muestra la presencia inespecífica de alcoholes, fenoles, esteroides y aceites esenciales (72) que se pudieran encontrar presentes en la muestra, tal como se observa en las Imagen No13 B y No15 C.

En el caso de las placas reveladas con luz UV λ larga 366nm, la mayoría de las bandas presentaron coloraciones azules celestes fluorescentes con diferente intensidad (Imagen No14, No19, No22 y No25), y según lo reportado por Ugaz (1997) (73) se trata de compuestos pertenecientes a flavonas y flavanonas (Tabla No14)

[image:21.595.94.479.531.655.2]

Debido a los resultados obtenidos en las pruebas antimicrobianas y a las CCD en las cuales se observaron la presencia de diferentes compuestos se realizó cromatografía de gases acoplada a espectrofotometría de masas, a los extractos diclorometano y acetato de etilo, para posiblemente determinar las sustancias que se encontraran asociadas a la actividad antimicrobiana reportada, detectándose los siguientes compuestos:

Figura No 27. Compuestos obtenidos a partir de los extractos de CH2CL2 y AcOEt, basado en

el análisis obtenido por cromatografía de gases-espectroscopia de masas.

A. 6-Metil-2-pyrazinyl metanol B. 2,3-Dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-4H-pyran-4-ona C. 4-hidroxi Benceno etanol. Fuente: Elaboración propia.

C B

(22)

14

El compuesto 6-Metil-2-pyrazinyl metanol es reportado como un derivado de las pirazinas (74), uno de los compuestos al cual se le puede atribuir la actividad antimicrobiana, ya que compuestos derivados del pirazol como las alquilpirazinas y pirrolpirazinas, se les ha comprobado actividad biológica(75).

Estos compuestos son precursores y forman parte del sitio activo de antibióticos del tipo quinolonas, los cuales actúan sobre las bacterias bloqueando la enzima ADN girasa, inhibiendo la replicación (75). Reportes de Foks y Kvdzia et al (2005) reportan actividad contra las bacterias Staphylococcus aureus, Corynbacterium spp., Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ,y Pseudomonas stutzeri, a partir del compuesto 1H-pyrazolo[3,4-b]pyrazine.

Así mismo estudios realizados por Lòpez (2006)(76) reportan compuestos de tipo pirazinas, como el flavacol y el acido penicìlico obtenidos a partir Aspergillus flavus, importantes por sus propiedades antibióticas.

El compuesto 2,3-Dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-4H-pyran-4-ona, conocido como DDMP es un producto intermedio generado a partir de D-glucosa, hexosas, dextrosa y maltosa (Figura No.28), en un estudio realizado por Teoh y Don et al (2011) (77) a partir del hongo P. sanguineus obtuvieron el compuesto DDMP, el cual presentó actividad frente a las bacterias E. coli, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, S. aureus y algunas especies del género Streptococcos; y adicionalmente frente a hongos degradadores de madera como Trametes elegans, Trametes versicolor, Lentinus sp, Microporus affinis, Gloeophyllum trabeum.

Otras investigaciones reportan diferentes actividades biológicas a partir de este compuesto, entre las que se encuentran: actividad alfa.glucosidasa, anti-mutagenica y anti-tumoral. (78)(79)

Además se encuentran reportes de que las Flavonas, flavonoides y flavonoles, compuestos que presentan un fenol con un único grupo carbonil, como es el caso de la sustancia DDMP, la cual pertenece al grupo de los flavonoides, ha demostrado

actividad antimicrobiana, antioxidante y antiinflamatoria principalmente.(80) ( 81)(82)( 83)(84). Resultado esperado ya que como se menciono anteriormente por

CCD se esperaban obtener compuestos pertenecientes a las flavonas, flavanonas y flavonoides.

Encontrándose también, otros compuestos que presentan las mismas características, como la Erinapirona A y B (Dhidro-6-hidroximetil-2-metil-4H-piran-4-on y 2,3-Dhidro-2-hidroximetil-6-metil-4H-piran-4-ona) reportados como metabolitos secundarios, aislados a partir de Hericium erinaceum,que presentan citotoxicidad. (85) Por último se detecto el compuesto 4-hidroxi Benceno etanol, sin embargo no se encontraron reportes de este en las bases de datos y bibliografías consultadas con actividad biológica, por lo cual se recomienda el estudio de este compuesto para determinar su posible actividad antimicrobiana.

(23)

15

8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Se obtuvo actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus con la fracción de acetato de etilo tanto de 25mg/350µL como con 50mg/350µL, con la fracción de diclorometano a los 25mg/, y con el ensayo acetona-cloroformo 43mg/350µL; y contra Bacillus subtilis se observo inhibición con la fracción de diclorometano tanto de 25mg/350µL como con 50mg/350µL

Se detectó la presencia de pirazinas y DDMP en las fracciones que presentaron actividad antibacteriana, compuestos con actividad antimicrobiana reportada, y el compuesto 4-hidroxi Benceno etanol, sin embargo no se encontraron reportes de este, por lo cual se recomienda su estudio para determinar su posible actividad biológica. Se recomienda además, realizar cromatografía de gases acoplada a espectrofotometría de masas, a las fracciones de la cinética de crecimiento, lo cual permitirá detectar la formación de los compuestos detectados al final de la fermentación.

(24)

16

9. BIBLIOGRAFIA

1. Vaishnav P, Demanin A. Unexpected applications of secondary metabolites. Biotechnology Advances 2010; 29, 223–229.

2. Demain A. Regulation of Secondary metabolism in Fungi. Pure & AppL Chem 1986; 58, 219-226.

3. Isaza J. Agro, Farmacia y metabolitos secundarios: algo en común. En: Memorias del seminario internacional –ACCEFYN. Tendencias y futuro en investigación en parasitología y en productos naturales. CORREDOR, C. GUHL, F. DUQUE, C. (2009). Editorial Guadalupe S. A.

4. Arias L., Piñeros P. Aislamiento e Identificación de hongos filamentosos de muestras de suelo de los Paramos de Guasca y Cruz Verde. Trabajo de grado de Pregrado. Faculta de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá. 2008.

5. Parvatkar R, D`souza C, Tripathi A, Naik C. Aspernolides A and B, butenolides

from a marine-derived fungus Aspergillus terreus. Elsevier, Phytochemistry. 2009; 70, 128-132.

6. Frisvad JC, Larsen T, De Vries R, Meijer M, Houbraken J, Cabañes FJ, Ehrlich K, Samson RA. Secondary metabolite profiling, growth profiles and other tools for species recognition and important Aspergillus mycotoxins. Stud Mycol. 2007; 59, 31-7.

7. Carrillo L. Hongos de los Alimentos y los Forrajes. Primera edición. Editorial Salta. 2003. 165p.

8. Donaido S, Monociardini P, Alduina R, Mazza P, Chiocchini C, Cavaletti L, Sosio M, Puglia A. Microbial Technologies for the Discovery of Novel Bioactive Metabolites. Journal of Biotechnology. 2002; 99, 187-198.

9. González F. & M. Silva. ―Biodiversidad química de macroalgas marinas. En:Sustentabilidad de la biodiversidad un problema actual‖. Alveal K. & T. 2001. Antezana (Eds) 1era Ed.Universidad de Concepción de Chile. 496 pp. 10. Nielsen K, Smedsgaard J. Fungal metabolite screening: database of 474

mycotoxins and fungal metabolites for dereplication by standardised liquid chromatography–UV–mass spectrometry methodology. Journal of Chromatography A. 2003; 1002, 111-136.

11. Rajeev K, J. & X Zi-rong. ―Biomedical Compounds from Marine Organisms‖. Mar. Drugs. 2004; 2, 123-146.

(25)

17

13. Aristegui B. El reino de los Hongos. Rev Iberoam Micol. 2002; 1-3.

14. Brakhage A, Schroeckh V. Fungal secondary metabolites – Strategies to activate silent gene clusters. Fungal Genetics and Biology. 2011; 48, 15–22. 15. Proyecto Ley De Paramos. Proyecto de Ley No 032 De 2003, Senado y No

242 de 2004, Cámara ―Por medio de la Cual se Dictan Disposiciones para Garantizar la Conservación y Uso Sostenible de las Aéreas de Paramo en Colombia‖.

16. Chitiva A, Torrenegra R, Cabrera C, Díaz N, Pineda V.. Contribución al estudio de microhongos filamentosos en los Ecosistemas páramo de guasca y el tablazo. Estudio preliminar de mohos de páramos colombianos. Tesis de maestría. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, Colombia. 2009.

17. Rangel-Ch JO. Consideraciones sobre la diversidad y la vegetación de alta montaña en Colombia. En: J.A. Lozano & D. Pabón. (eds). Memorias del I seminario taller sobre alta montaña colombiana. Acad.Colomb.Cienc. Colección de Memorias, N° 3:33-60. 2001.

18. Romero, O. Sanchez, J. Hongos Asociados a Macleania Rupestris (H.B.K) A.C. Smith en los Páramos El Granizo Y Guasca, Colombia. Acta Biológica Colombiana 2004;. 9: 2.

19. Geiser D.M.. Sexual structures in Aspergillus: morphology, importance and genomics. Medical Mycology. 2008; 12,1E.

20. Chan P-K, Ehrlich K. What does genetic diversity of Aspergillus flavus tell us about Aspergillus oryzae?. International Journal of Food Microbiology. 2010; 138, 189–199.

21. Pointing S.B, Hyde K.D. BioEexploitation of Filamentous Fungi. Fungal Diversity Press, Hong Kong. 2001; 223, E251

22. Perrone G, Susca A, Cozzi G, Ehrlich K, Varga J, Frisvad J.C, Meijer M, Noonim P, Mahakarnchanakul W, Samson R.A. Biodiversity of Aspergillus species in some important agricultural products. Studies in Micology, 2007; 59, 53E-66.

23. Abarca L. Taxonomía e Identificación de Especies Implicadas en la Aspergilosis nosocomial.Rev Iberoam Micol. 2000; 17, S79-S84.

24. Golan R. Mycotoxins in Fruits and Vegetables, Chapter 6. 2008, Pages 115-151.

25. Murray P, Rosenthal K, Pfaller M. Microbiología Médica. Quinta Edición ELSEVIER España, S.A. Infanta Mercedes, 90-7. Planeta 28020 Madrid, España. 2007, 939 p

(26)

18

27. Bouras N, Strelkov S. The anthraquinone catenarin is phytotoxic and produced in leaves and kernels of wheat infected by Pyrenophora tritici-repentis.Physiological and Molecular Plant Pathology 2008; 72, 1-3.

28. Wakuliński W, Sobiczewski P, Kachlicki P, Schollenberger M, Zamorski Cz. Catenarin Production by Isolates of Pyrenophora tritici-repentis (Died.) Drechsler and its Antimicrobial Activity. Journal of Phytopathology.2003; 151, 74-79

29. Grovel O, Pouchus F, Verbist JF. Accumulation of gliotoxin, a cytotoxic mycotoxin from Aspergillus fumigatus, in blue mussel (Mytilus edulis).Toxicon.2003; 42, 297-300

30. Terigmatocystin- Substance Summary.

http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?sid=49857152&loc=ec _rcs. Consultado el 31 de Marzo de 2011.

31. Chan WH. Citrinin induces apoptosis via a mitochondria-dependent pathway and inhibition of survival signals in embryonic stem cells, and causes developmental injury in blastocysts. Biochem. 2007; 2,317-326.

32. Duran M, Cary J, Caly A. Production of cyclopiazonic acid, aflatrem, and aflatoxin by Aspergillus flavus is regulated by veA, a gene necessary for sclerotial formation. Appl Microbiol Biotechnol. 2006; DOI 10.1007/s00253-006-0581-5.

33. Lamarani K, Lakhtar H, Alaoui M, Ettalibi M, Boiron P, Augur C, Gaime I, Roussos S. Production of Fumagillin by Aspergillus fumigatus isolated from traditional trituration units, ―MAASRA‖, in Morocco. Micologia Aplicada Internacional. 2008; 20, 35-41

34. Bioaustralis: Fine Chemicals. Verruculogen.

http://www.bioaustralis.com/pdfs/verruculogen.pdf. Consultado el 31 de Marzo de 2011.

35. Herez W, Falk H, Kirby G, Moore E. Progress in the Chemistry of Organic Natural Products. Springer, 2001, 313 p.

36. Sosa K, Alvarez N, Lubben P, Rodriguez L. Chrysophanol, an Antimicrobial Anthraquinone from the Root Extract of Colubrina greggii. Mex. Chem. Soc. 2006; 2, 76-78

37. Life Science Xanthomegnin. http://www.enzolifesciences.com/ALX-350-180/xanthomegnin/. Consultado el 4 de Abril de 2011.

38. Life Science Malformin C. http://www.enzolifesciences.com/ALX-380-318/malformin-c/ Consultado el 4 de Abril de 2011.

(27)

19

40. Carrillo L. Hongos de los Alimentos y los Forrajes. Primera edición. Editorial Salta, 2003. México, 165p.

41. Marks K, Park E.S, Arefolov A, Russo K, Ishihara K, Ring E, Clardy J, Clarke

A, Pelish E. The Selectivity of Austocystin D Arises from Cell-Line-Specific

Drug Activation by Cytochrome P450 Enzymes. The American Chemical Society and American Society of Pharmacognosy. 2011; XXXX, XXX, 000– 000.

42. Yaylayan V, Mandeville S. Stereochemical Control of Maltol Formation in Maillard Reaction. Food Chem. 1994; 42, 771-775.

43. Camacho N, Gil J. Evaluación Preliminar de Modelos de Infección Cruzada por Fusarium sp., Aislados de Procesos Patológicos en Plantas, Animales y Humanos.Tesis de Pregrado. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, Colombia. 2008.

44. Diba K, Kordbacheh P, Mirhendi Sh, Reazaie S. Mahmouudi M. Identification of Aspergillus Species Using Morphological Characteristics. Pak J Med Sci. 2007; 23, 867-872.

45. Samson R, Hoekstra E, Van Oorschot C. Introduction To Food-Borne Fungi. . 2000.

46. Chang S.T, Miles P.G. 1989. Edible Mushrooms and Their Cultivation. Boca Raton, FL: CRC Press.

47. Beltran A. Caracterización Química de Metabólitos Secundarios Producidos en la Fermentación de Dos Cepas Nativas de Acremonium sp. Tesis de Maestría. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, Colombia. 2006.

48. Scragg A. 1997. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas Biológicos en Procesos Tecnológicos. México. ed. Limusa. p 48.

49. Miller G. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Analytical Chemistry.1959. 3: 426-428.

50. Frisvad J, Andersen B, Thrane U. The use of secondary metabolite profiling in chemotaxonomy of filamentous fungi. mycological research. 2008; 2, 231–240. 51. Kumar C, Mongolla P, Joseph J, Nageswar Y.V.D, Kamal A. Antimicrobial

activity from the extracts of fungal isolates of soil and dung samples from Kaziranga National Park, Assam, India. Journal de Mycologie Médicale. 2010; 20, 283—289.

52. Losada L, Ajayi O, Frisvad J, Yu J, Nierman W. Effect of competition on the production and activity of secondary metabolites in Aspergillus species. Medical Mycology. 2009; S1-S9.

(28)

20

54. National Committee for Clinical Laboratory Standard. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard. Document M2-A8. 2003. National Committee for Clinical Laboratory Standard Vol 23 (1). Wayne. Pennsylvania

55. Steven C, Rusell M. Bioactive natural products: detection, isolatin, and structural determination. Taylor and Francys group. Second edition. Boca ratón, (2007). 603 p.

56. Rodriguez P, Soarez C, Kozakiewicz Z, Paterson RRM, Lima N, Venancio A. Identification and characterization of Aspergillus flavus and aflatoxins. Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology. 2007.

57. Fluka analytical, 17121 Aspergillus Differentiation Agar, Base (AFPA, Base). http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Fluka/Datasheet/17121dat.Par. 0001.File.tmp/17121dat.pdf. Consultado el 6 de Abril de 2011.

58. Estrada V, Vélez A, Montoya R. Caracterización de cultivos monospóricos del hongo Beauveria bassiana. Cenicafé.1997; 4, 217-224.

59. Henao I, Franco M, Marin G. Evaluación de Métodos de Conservación para Aspergillus niger con Actividad Enzimática Amilolítica . Universitas Scientiarum. 2006; 11, 51-60.

60. Bueno L, Gallardo R. Preservación de hongos filamentosos en agua destilada estéril. Rev. Iberoam. Micol. 1998; 15, 166-168.

61. Franco A. Aspergillus sección Nigri. Estudio Fisiológico y Molecular de Especies Ocratoxigènicas. Tesis de Doctorado. Universidad Autónoma de Barcelona, Barcelona, España. 2005.

62. Kozlovsk A, Zhelifonova V, Vinokurova G, Ozerskaya S. Effect of Microelements on the Biosynthesis of Secondary Metabolites by the Fungus Penicillium citrinum Thom VKM F- 1079. Microbiology. 2000; 69, 536-540.

63. Puglia M. Microbial Technologies for the Discovery of Novel Bioactive Metabolites. Journal Biotechnology. 2002; 99, 187-198.

64. Roze L, Chanda A, Linz J. Compartmentalization and molecular traffic in secondary metabolism: A new understanding of established cellular processes. Fungal Genetics and Biology xxx (2010) xxx–xxx.

65. Gunnarsson N, Eliasson A, Nielsen J. Molecular Biotechnolgy of Fungal Beta-Lactam Antibiotics and Related Peptide Synthetases: Control of Fluxes Towards Antibiotics and the Role of Primary Metabolism in Production of Antibiotics. Chapter: p. 137. Advances in Biocehmical Engineering/Biotechnology. Publisher: Springer-Verlag Heidelberg Online www.springerlink.com (abstract, Consulta: 12 Enero de 2011).

(29)

21

67. Calvo A, Wilson R, Bok J, Keller N. Relationship between Secondary Metabolism and Fungal Development. Microbiology And Molecular Biology Reviews. 2002; 3, 447-459.

68. Laskin A, Gadd G, Sariaslani S. Advances in Applied Microbiology. 2008. Academic Press. 352 pp. 44.

69. Farrell D, Robbins M, Williams W, Love W. In vitro activity of XF-73, a novel antibacterial agent, against antibiotic-sensitive and -resistant Gram-positive and Gram-negative bacterial species. International Journal of Antimicrobial Agents.2010; 35, 531-536.

70. Universidad Autónoma de Madrid. Departamento de Farmacología y Terapéutica Facultad de Medicina. Fármacos antifúngicos. Guión No 70. http://www.uam.es/departamentos/medicina/farmacologia/especifica/F_Genera l/FG_T70.pdf. consultado el 8 de Mayo de 2011.

71. Shmid I, Sttler I, Grabley S, Thiericke R. Natural Products in High Throughput

Screening:Automated High- Quality Sample Preparation. Journal of biomolecular screening. 1999; 4, 15-25.

72. Castañeda B, Mata R, Manrique R, Ibañez L, Fujita R, Barnett E. Phytochemical and Pharmacological Studies in Four Plants with Hypoglycemic Effect. Revista Horizonte Médico. 2008; 8, 6-34

73. Ugaz, O. Colorantes naturales. Fondo Editorial PUCP. 1997. Pp 71-91

74. Chundawat S, Vismeh R, Sharma L, Humpula J, Sousa L, Chambliss K, Jones D, Balan V, Dale B. Multifaceted characterization of cell wall decomposition products formed during ammonia fiber expansion (AFEX) and dilute acid based pretreatments. Bioresource Technology. 2010; 101, 8429–8438.

75. Henryk Foks, H., Pancechowska-Ksepko KVdzia, A., Zwolska, Z., Mieczysław J., Augustynowicz-Kopec. Synthesis and antibacterial activity of 1H-pyrazolo[3,4-b]pyrazine and -pyridine derivatives. Il Farmaco 60 (2005) 513– 517.

76. López M. Aislamiento, purificación y caracterización estructural de nuevos principios bioactivos a partir de extractos fúngicos. Tesis de doctorado. Universidad Politécnica de Valencia. Valencia, España. 2006.

77. Teoh Y, Don M, Ujang S. Media Selection for Mycelia growth, Antifungal Activity Against Wood-Degrading Fungi, And GC-MS Study By Pycnoporus sanguineus. Bioresources. 2011; 3, 2719-2731

78. Takara K, Otsuk K, Wada K, Iwasaki H, Yamashita M. 1,1-diphenyl 2-picrylhydrazyl radical scavenging activity and tyrosinase inhibitory effects of constituents of Sugarcane molasses. Biosci.Biotech.Bioch. 2007; 1, 183-191. 79. Ban J, Hwang I, Kim G, Hwang T.M, Lee Y, Jeong S, Yoon Y, Kim W, Hong T.

(30)

2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-22

4H-pyranone through inactivation of NF-KB in human colon cancer cells. Arch. Pharmacal. Res. 2007; 11 1455-1463.

80. Das K, Tiwari R, Shrivastava D. Techniques for evaluation of medicinal plant products as antimicrobial agent: current methods and future trends. Med.Plants Res. 2010; 2, 104-11.

81. Kumar M, Maneemegalai S. Evaluation of larvicidal effect of Lantana camara Linn against mosquito species Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus.Biol Res. 2008; 2, 39-43.

82. Kumar P, Kumaravek S, Lalitha C. Screening of antioxidant activity, total phenolics and GC-MS study of Vitex negundo. Biochem Res. 2010; 7, 191-195.

83. Taylor W.G, Sutherland D, Richards K.Soyasaponins and related glycosides of Desmodium canadense and Desmodium illinoense. The Open Nat Prod. 2009; 2, 59-67.

84. Chaturvedi A, Singh S, Nag T. Antimicrobial activity of flavonoids from in vitro tissue culture and seeds of Gossypium species. Rom. Biotech.Lett. 2010; 1, 4959-4963.

(31)

23

[image:31.595.39.572.142.675.2]

10. ANEXOS

Tabla No1. Metabolitos secundarios producidos por especies de Aspergillus. Fuente:

Elaboración Propia.

Especie Aspergillus (Fuente: Golan 2008)

Micotoxina- metabolito secundario (Fuente: Golan 2008)

características Estructura

A.alliaceous, A. ochraceus, A. sclerotiorum, A.sulphureus, A.albertensis, A. auricomus, A. wentii, A. aculeatus, A. carbonariu A. japonicus var.

aculeatus, A. melleus,

A. niger, A. niger var. awamori, A. sclerotiorum,

A. tubingensis

Ocratoxina A teratogènica y Nefretòxica, cancerígena. Generadora de respuestas colinérgicas. (25) Fuente: http://www.food-info.net/es/tox/ochra.htm A. aculeatus, A. glaucus, A. wentii Emodina Antitumoral, antibacterial, diurética y vaso

relajante.(26) Micotoxina diarreogénicas y genotóxicas (27) Fuente: http://www.molcan.com/diacerein.htm A.amstelodami A. glaucus Catenarin Pigmento rojo bioactivo (27). Propiedades antibióticas contra bacterias Gramm positivas ( Aureobacterium liquefaciens, Arthrobacter globiformis, Bacillus brevis, B. circulans,B. subtilis y Curtobacteri

um plantarum). (28)

(32)

24

A. chevalieri, A.

fumigatus Gliotoxina

Micotoxina citotóxica. alcaloide tricíclicos,

en

el que el puente disul furo es responsables de numerosas activid ades biológicas como

agente inmunosupresor(29)

Fuente:

Grovel y Pouchus et al 2003

A.Flavipes, A. flavus, A nidulans, A. sydowi, A. ustus, A. versicolor Esterigmatocistia Potente carcinógeno mutágeno y teratógeno, tiene un

efecto inhibitorio sobre la

incorporación de ácido orótico en ARN

nuclear. (30) Fuente:

http://www.micotoxinas.com.br/Sterigmafacts.htm

A. flavipes, A. niveus, A.

terreus

Citrinina

Micotoxina capaz de inducir la permeabilidad

mitocondrial, también inhibe la

polimerización

de microtúbulos (31) Fuente:

http://www.romerlabs.com/uploads/RTEmagicC_Pi c_MT_Citrinin_v01.jpg.jpg

A. flavus Aflatrem

Micotoxina Tremorgénica ( perteneciente al

grupo: indol-diterpenos), responsable de

desordenes neurológicos.(32)

Fuente: Duran y Cary et all 2006

A. flavus, A. tamari, A. versicolor Acido Ciclopiazónico Inhibidor específico de

la ATPasa dependien te de calcio en el

retículo sarcoplásmico

generando alteración celular de

los niveles de

(33)

25

A. fumigatus Fumagillin

Presenta características antimicrobianas y antitumorales. (33)

Fuente: www.agscientific.com

A. fumigatus Verruculogen

Micotoxina Tremorgénica (34)

Fuente:

http://www.fermentek.co.il/verruculogen.htm

A. glaucus Erythroglaucin

Actividad biológica frente a: Arthrobacter citreus,

Bacillus brevis, B. subtilis, Streptomyces viridochromogenes,

S. aureus,

B. megaterium.(35) Fuente:

http://img1.guidechem.com/chem/e/dict/28/476-57-3.jpg

A. glaucus Antraquinonas

Actividad antifúngica y antibacteriana (36)

Fuente:

Figure

TABLA DE CONTENIDO
Figura No 27. Compuestos obtenidos a partir de los extractos de CH2CL2 y AcOEt, basado en el análisis obtenido por cromatografía de gases-espectroscopia de masas
Tabla No1. Metabolitos secundarios producidos por especies de Aspergillus. Fuente: Elaboración Propia
Tabla No4.  Rf de las diferentes fracciones evaluadas: Éter de petróleo, Diclorometano y Acetato de etilo de las CCD reveladas con vainillina en acido sulfúrico concentrado
+7

Referencias

Documento similar

La campaña ha consistido en la revisión del etiquetado e instrucciones de uso de todos los ter- mómetros digitales comunicados, así como de la documentación técnica adicional de

If certification of devices under the MDR has not been finalised before expiry of the Directive’s certificate, and where the device does not present an unacceptable risk to health

In addition to the requirements set out in Chapter VII MDR, also other MDR requirements should apply to ‘legacy devices’, provided that those requirements

The notified body that issued the AIMDD or MDD certificate may confirm in writing (after having reviewed manufacturer’s description of the (proposed) change) that the

En estos últimos años, he tenido el privilegio, durante varias prolongadas visitas al extranjero, de hacer investigaciones sobre el teatro, y muchas veces he tenido la ocasión

que hasta que llegue el tiempo en que su regia planta ; | pise el hispano suelo... que hasta que el

Para ello, trabajaremos con una colección de cartas redactadas desde allí, impresa en Évora en 1598 y otros documentos jesuitas: el Sumario de las cosas de Japón (1583),

E Clamades andaua sienpre sobre el caua- 11o de madera, y en poco tienpo fue tan lexos, que el no sabia en donde estaña; pero el tomo muy gran esfuergo en si, y pensó yendo assi