TRABAJO PRÁCTICO Nº 4: DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO DE
β
-TALASEMIAS
Dra. Silvia Mabel Varas
Objetivos:
- Análisis de los distintos índices hematimétricos: su aporte en el diagnóstico diferencial de anemias microcitarias (anemias ferropénicas y β-talasemicas).
- Diagnóstico Bioquímico de β-talasemias.
- Separación electroforética de hemoglobinas usando papel como soporte. - Importancia de la cuantificación de Hemoglobina Fetal.
- Observación de frotis sanguíneos normales y patológicos.
- Discusión de la aplicación de técnicas moleculares para la detección de las mutaciones más frecuentes.
DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO DE
β
-TALASEMIAS
1) DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE HB EN SANGRE TOTAL
La determinación de la concentración de Hb es el criterio fundamental para el diagnóstico de una anemia. Para ello la metodología a emplear debe ser precisa y fiable. Desde el año 1967 el ICSH (International Commitee for Standardization in Haematology), recomienda el método de la cianometahemoglobina como el más fiable para dosificar la Hb. Posee la ventaja, junto a su precisión y exactitud, que puede ser verificado mediante el empleo de un patrón de Referencia Internacional. Existen otros métodos más económicos que ocasionalmente pueden sustituir el recomendado por el ICSH y la OMS. Entre otros tenemos los métodos de la Oxihemoglobina y el de Sahli, los que poseen margen de error mayor al método de la cianometaHb.
Método de la Cianometahemoglobina
Fundamento:
La oxidación de la Hb (Fe2+) en metahemoglobina (Fe3+) por acción del ferricianuro y posterior combinación con iones cianuro a pH=7.2 da lugar a la formación de cianometa-Hb; la cual se cuantifica espectrofotométricamente a 540 nm.
Reactivos:
1- Solución Diluyente o de Drabkin: NaHCO3 ... 1 g. KCN ... 50 mg. K3[Fe(CN)6]... 200 mg. H2O destilada c.s.p... 1000 ml.
Para lograr la hemólisis completa se agrega una gota de Tritón cada 5 ml de solución. Debe guardarse en frascos color caramelo a temperatura ambiente y renovarse mensualmente.
2- Sangre extraída con anticoagulante (EDTA).
Técnica:
medidos.
2- Agregar 20 µl de sangre homogenizada (o del hemolizado). Es muy importante eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del tips de la micropipeta antes de introducirla en el reactivo diluyente. Asimismo una vez descargada la sangre enjuagar 2 ó 3 veces con el líquido diluyente para eliminar toda la sangre que hubiera quedado adherida a las paredes internas del tip.
3- Agitar en vórtex, para una correcta homogeneización.
4- Esperar 10’ y leer en espectrofotómetro a 540 nm. Usar como blanco la solución diluyente.
5- La concentración de Hb se expresara en g / dl (g%), y se calculará mediante una curva de calibración o mediante un testigo de concentración conocida.
De esta forma el sistema será.
B T M
Solución Diluyente 5 ml 5 ml 5 ml
Testigo de Hb. --- 20 µl ---
Muestra --- --- 20 µl
Cálculos:
Hb ( g/ dl ) = AM . [T] / AT
En donde la [T] , es la concentración del testigo expresado en g/dl. AM : es la absorbancia de la Muestra.
AT : es la absorbancia del Testigo.
2) ELECTROFORESIS DE Hb SOBRE CELLOGEL.
Fundamento:
Separación electroforética de las hemo-proteínas, utilizando como soporte de corrida acetato de celulosa y trabajando a pH=8,6.
Reactivos:
1- Buffer Tris-Glicina, pH=8,6:
Tris ...14.1 g Glicina ...22.6 g H2O dest. csp...2000 ml 2- Solucion Colorante Amidoschwarz:
Amidoschwarz ... 0.5 g Metanol ... 45 ml Ac.Acetico... 10 ml H2O dest... 45 ml 3- Solucion Decolorante :
Metanol ...45 ml Ac. Acetico ...10 ml H2O dest. ...45 ml
2- Tomar 1ml de la sangre bien homogeneizada y colocarla en un tubo de 1,5 ml. Centrifugar 10’ a 2000 r.p.m. y eliminar el plasma y glóbulos blancos. Lavar 4 veces con 1 volumen de solución fisiológica.
3- Agregar al concentrado de eritrocitos 1 volumen de agua y 0.4 volúmenes de tolueno. Agitar bien durante algunos segundos.
4- Centrifugar a 3500 rpm durante 20 ’.
5- Observar a trasluz: la capa roja brillante corresponde a la hemoglobina libre. 6- Dosar Hb libre mediante el método de la cianometahemoglobina
anteriormente descripto. En caso de obtenerse altos valores de Hb (18-20 %), se deben colocar 10 ml del reactivo diluyente y luego multiplicar los valores obtenidos por 2 (inversa de la dilución).
7- Preparar una solución de Hb al 5%, en un volumen final de 100 μl. Esta solución se usara para sembrar sobre las tiras de acetato de celulosa.
8- Siembra en tiras de acetato de celulosa:
a- Lavar las tiras de cellogel en buffer durante 30’. Eliminar el exceso de buffer con papel de filtro.
b- Colocar las tiras en la cuba de electroforesis, con la superficie opaca hacia arriba. c- Usar un microaplicador para sembrar las muestras a 3 cm del borde catódico d- Aplicar una tensión de 200 V ó 5 mA por tira durante 60-80 ’.
e- Sacar las tiras y sumergirlas en colorante durante 5 ’.
f- Decolorar en solución decolorante con tres o cuatro baños agitando suavemente, hasta que solamente quede colorante en las bandas correspondientes.
9- Cuantificación.
a- Cortar las bandas correspondientes a la Hb A y A2 y colocarlos en los tubos de
ensayo correspondientes, conteniendo ácido acético al 80%.
La banda de Hb A se coloca en un tubo que tiene 9 ml de dicho reactivo, mientras que la banda de HbA2 se coloca en un tubo que contiene 3 ml del mismo.
c- Agitar en vortex hasta disolución completa del acetato de celulosa. d- Leer a 415 nm en una cubeta de cuarzo (UV).
e- Cálculos de Valores Relativos:
A: lectura de Hb A (de 9 ml), Tubo A. B: lectura de Hb A2 (de 3 ml), Tubo B
C: es A x 3 (porque esta diluido 3 veces)
C+B --- 100 % C --- x = % HbA C+B --- 100 % B --- y = %HbA2
Valores Normales: HbA > 97% HbA2 hasta 3%.
Representación esquemática de la posición relativa de todas las Hbs descriptas, la presencia de cada una de ellas dependerá de cada patología.
3) CUANTIFICACION DE LA HEMOGLOBINA FETAL. Método de la desnaturalización alcalina
Fundamento
La Hb F es más resistente a la desnaturalización alcalina que las otras Hbs, apareciendo en el filtrado después de neutralizar el pH con una solución saturada de sulfato de amonio.
Muestra:
1- Lavar los eritrocitos 3 veces con SF. Lisar el paquete de eritrocitos con 2V de H2O y 1V de Tolueno.
hasta disolver. Guardar a t° ambiente]
3- Solución de NaOH, 1,2 N. [4,8 g en 100 ml de H2O destilada] 4- Hemolizado con una concentración de Hb aproximada de 8 g/dl
Técnica:
La técnica debe realizarse siempre a temperatura ambiente ( 20-25 °C).
1- Preparar la solución de cianometaHb de la siguiente manera: 600 µl del hemolizado se le añade 10 ml de la solución de Drabkin.
2- En un tubo medir 2,8 ml de solución de cianometaHb, agregar 0,2 ml de NaOH. Agitar.
3- Exactamente después de 2’ agregar 2 ml de sulfato de amonio. Agitar vigorasamente. El material desnaturalizado es precipitado en 5-10 minutos.
4- Remover el precipitado por filtración con papel Whatman n° 6 o 42. Leer la densidad óptica a 415nm. (AM).
5- Una solución CONTROL se prepara mezclando: 1,4 ml de solución de cianometaHb + 1,6 ml de H2O + 2 ml de sulfato de amonio. Diluir esta solución 1:10 con agua destilada (0,5 ml+ 4,5 ml H2O) y leer a 415nm (ACo)
Cálculos:
Hb F % = AM x 100 ACo x 20
Factor 20: 2x10
Valores Normales:
Ninos: . Al nacer 50 % 5 meses : 5 % 2 años : 2% Adultos : 0,2 - 1 %.
Bibliografía:
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE β-TALASEMIA
Para diagnosticar el tipo de mutación se utilizan técnicas de biología molecular. Existen cientos de mutaciones descriptas en el gen de globina. Pero existen estudios en donde se han informado que el 80 % de los alelos mutados en población de origen mediterráneo corresponden a cuatro mutaciones puntuales denominadas IVS 1, IVS 1-6 e IVS 1-110, en el intrón 1 y la mutación en el codón 39, en el segundo exón. El análisis consiste en amplificar ADN obtenido de leucocitos por PCR y luego hibridizar los productos de la reacción con sondas alelo- especificas (sondas ASO) que identifican mutaciones en los nucleótidos 1, 6 y 110 como así también la mutación en el codón 39. El análisis de estas mutaciones en la población talasémica de nuestro país nos permite realizar el diagnóstico con una certeza del 90 %.
Ejemplo de un Dot Blot:
GLOSARIO:
Sitios de splice crípticos son motivos o secuencias presentes a lo largo pre-mRNAs. Ellos no son reconocidos en condiciones normales y así normalmente no causan splicing. Mutaciones o deleciones en los elementos naturales pueden causar su activación de sitios de splice cercanos.
Anisocitosis: Este término se utiliza para denotar variaciones del tamaño de los eritrocitos.
Hipocromía: Se refiere a la reducción de la intensidad de la tinción, que puede variar desde un ligero incremento de la zona de palidez central hasta un área de gran tamaño rodeada por un pequeño borde de citoplasma hemoglobinizado.
Microcitosis: Son más pequeños y más pálidos que los eritrocitos normales.
V.C.M. (Volumen Corpuscular Medio):es el valor medio del volumen de cada hematíe .Se calcula a partir del hematocrito y del número de hematíes.
VCM= Ht (l/l) / N° de hematies ( x 1012/ l ) [=] femtolitros (fl) Anasarca: edema intenso generalizado.