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Estudio fitoquímico de las hojas de artemisia absinthium y su actividad antimalárica

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Academic year: 2020

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(1)Universidad Nacional de Trujillo ESCUELA DE POST GRADO PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS. ESTUDIO FITOQUÍMICO DE LAS HOJAS DE Artemisia absinthium Y SU ACTIVIDAD ANTIMALÁRICA.. TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOMÉDICAS. Autor: MSc. William Antonio Sagástegui Guarniz Asesor: Dr. José Llanos Quevedo. TRUJILLO – PERÚ 2009 Nº Registro …...

(2) JURADO EVALUADOR. Esta tesis ha sido revisada, analizada y aprobada por:. Dr. Ramón Piminchumo Carranza Profesor de Farmacotecnia. Dra. Miriam Gutierrez Ramos Profesora de Bioquímica. Dr. José Llanos Quevedo Profesor de Química Biológica y Fisiología. Fecha: 05/02/2010. 2.

(3) William Antonio Sagástegui Guarniz. Químico Farmacéutico. cqfp 2431. Maestro en Ciencias Químicas Docente en la cátedra de Farmacoquímica Domicilio: Av. 29 de Diciembre Nº 499 – Trujillo Teléfono: 044 – 254036 Email: williamsag@hotmail.com. 3.

(4) DEDICATORIA. Con mucho amor a mi esposa Mary y a mis hijos Andy, Gimena y Bruno, a quienes adoro y admiro, ellos son mi fuente de inspiración y motivación para nuestra realización personal y profesional.. A la memoria de mi madre Margarita, fuente inagotable de bondad, amor y sencillez.. A mí querido padre Octavio, por su fortaleza, ejemplo de perseverancia y honradez.. 4.

(5) AGRADECIMIENTO. Al Dr. JOSÉ LLANOS QUEVEDO Verdadero MAESTRO, mi reconocimiento y gratitud, por su invalorable apoyo y orientación en la realización del presente trabajo de tesis.. Al Dr. LIZARDO CRUZADO RAZCO, Reconocido MAESTRO e investigador incansable en la búsqueda por encontrar el remedio para calmar el dolor y la desesperanza de los que padecen de epidemias que azotan a la humanidad. Su invalorable contribución y participación fue muy importante para la realización del presente trabajo.. Mi sincero agradecimiento al Dr. CARLOS SABANA GAMARRA, por el apoyo brindado en la realización del presente estudio, y por promover la investigación que permiten que la Universidad cumpla con su misión de generar nuevo conocimiento y proyectarse a la comunidad contribuyendo en la solución de sus problemas de salud.. Al Q:F. FRANK LEÓN VARGAS Mi eterno agradecimiento por su invalorable y desinteresado apoyo para la realización de este estudio. 5.

(6) INDICE Página HOJA DE APROBACIÓN. ii. DEDICATORIAS. iv. AGRADECIMIENTO. v. ÍNDICE. vi. RESUMEN. ix. ABSTRACT. x. I.. 1. INTRODUCCIÓN. II. MATERIAL Y MÉTODOS. 6. 2.1 Material de biológico. 6. 2.2 Métodos y técnicas. 6. 2.2.1. Preparación de los extractos de las hojas de Artemisia absinthium 6 2.2.2. Análisis fitoquímico de los extractos de Artemisia absinthium. 7. 2.2.3. Evaluación del efecto antiplasmódico in vitro. 7. 2.2.4. Determinación de la parasitemia y del % de inhibición “in vitro” 8 2.2.5. Evaluación del efecto antiplasmódico “in vivo”. 9. 2.2.6. Análisis estadístico. 10. III. RESULTADOS. 11. 3.1. Metabolitos secundarios en extractos de hojas de A. absinthium 3.2. Porcentaje de parasitemia en los cultivos blanco y experimental después del tratamiento con los extractos de A. absinthium a concentraciones. 6. 13.

(7) de 10 y 100 g/mL en cultivos de Plasmodium. vivax y P. falciparum 14 3.3. PI de la parasitemia por cada extracto de A. absinthium a las concentraciones de 10 y 100 g/mL, en cultivos de P. vivax y P. falciparum. 15. 3.4. Relación entre el PI y el tipo de actividad antiplasmodium de los extractos de A. absinthium a las concentraciones de 10 y 100 ug/mL aplicadas a cultivos de P. vivax y P. falciparum. 16. 3.5. Resultados del tratamiento con extracto de A. absinthium por vía oral e intramuscular y con Artesunato a especimenes A. nancimae infectados experimentalmente con P. falciparum. 17. 3.6. Análisis de Varianza (ANOVA) del PI de P. vivax a la dosis de 10 g/mL de cada extracto de A. absinthium.. 18. 3.7. Prueba post hoc para comparaciones múltiples del PI de P. vivax a la dosis de 10 g/mL de cada extracto de A. absinthium. 18. 3.8. Análisis de Varianza (ANOVA) del PI de P. vivax a la dosis de 100 g/mL de cada extracto de A. absinthium. 19. 3.9. Prueba post hoc para comparaciones múltiples del PI de P. vivax a la dosis de 100 g/mL de cada extracto de A. absinthium. 19. 3.10. Análisis de Varianza (ANOVA) del PI de P. falciparum a la dosis de 10 g/mL de cada extracto de A. absinthium. 20. 3.11. Prueba post hoc para comparaciones múltiples del PI de P. falciparum a la dosis de 10 g/mL de cada extracto de A. absinthium.. 20. 3.12. Análisis de Varianza (ANOVA) del PI de P. falciparum a la dosis de 100 g/mL de cada extracto de A. absinthium.. 7. 21.

(8) 3.13. Prueba post hoc para comparaciones múltiples del PI de P. falciparum a la dosis de 100 g/mL de cada extracto de A. absinthium. 21. IV. DISCUSIÓN. 22. V. PROPUESTA. 27. VI. CONCLUSIONES. 28. VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 29. VIII. ANEXOS. 35. ÍNDICE DE ILUSTRACIONES Figura Anexo 1: Microfotografía con presencia de Trofozoitos de P. vivax en medio Waymouth MB 752/1, Blanco, a las 72 horas.. 36. Figura Anexo 2: Microfotografía con presencia de trofozoitos y gametocitos de P. falciparum en medio Waymouth MB 752/1, Blanco, a las 72 horas.. 36. Figura Anexo 3: Administración de la droga extracto acetato de etilo 50 mg/mL, por via oral a especimenes Aotus nancimae.. 37. Figura Anexo 4: Administración de la droga 50 mg/mL de extracto acetato de etilo, por via intramuscular a especímenes Aotus nancimae.. 8. 37.

(9) RESUMEN El presente trabajo, estuvo orientado a determinar los componentes fitoquímicos de las hojas de la Artemisia absinthium y evaluar el efecto “in vitro” de cada uno de ellos sobre cultivos de Plasmodi um vi vax y P. f alciparum, agentes causantes del paludismo en el Perú, a fin de cont r ibuir con nuevos principios activos para el tratamiento y control alternativo de la malaria. El efecto “in vivo” se realizó en especímenes Aotus nancimae previamente infectados con cultivos de Plamodium falciparum. Se recolect aron muest ras de plant as de Artemisia absinthium, familia Asteraceae, “ajenjo”, de la Provincia de Contumazá, Departamento de Cajamarca; sus hojas fueron desecadas, pulverizadas y extractadas con los solventes: Hexano, cloroformo, acetato de etilo, metanol y agua; en estos extractos se identificó mediante reacciones de coloración y precipitación los siguientes fitoconstituyentes: alcaloides, antraquinonas, terpenos y terpenoides, flavonoides, lactonas, taninos, esteroles y cumarinas. Luego los extractos fueron diluidos a las dosis de 10 y 100 g/mL y se administraron a cultivos de Plasmodium vi vax y P. f alciparum, y se evaluó la par asit emia a las 72 horas de incubación, encontrándose una significativa disminución del porcentaje de parasitemia. El porcentaje de inhibición antiplasmodium fue de buena a excelente, siendo los extractos de acetato de etilo y el metanólico los que presentaron mayor porcentaje de inhibición de P. vivax, 92.0562 % y de 94.5840 %, respectivamente, y para P. f alciparum fue de 89.9146 y 91.5607 % de inhibición, en contraste con el grupo control que un desarrollo normal de la parasitemia. Para el ensayo “in vivo” se preparó dosis de 50.0 mg/mL y se administró por vía oral y parenteral a especímenes Aotus nancimae previamente infectados con cepas de Plasmodium falciparum, encontrándose un 75 % de eficacia en cada caso, semejante al grupo control al que se administró 10.0 mg de Artesunato sódico. Palabras Claves: Fitoconstituyentes, Plasmodium, actividad antiplasmodium.. 9.

(10) ABSTRACT The present work was designed to determine the phytochemical components of the leaves of Artemisia absinthium and evaluate the effect in vitro of each crop of Plasmodium vivax and P. falciparum, the causative agents of malaria in Peru to help with new active substances for the treatment and alternative malaria control. The effect in vivo was performed on specimens previously infected Aotus nancimae crops Plasmodium falciparum. Samples were collected from plants of Artemisia absinthium, family Asteraceae, "ajenjo" Contumazá Province, Cajamarca Department, its leaves were dried, pulverized and extracted with solvents: hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol and water; in these extracts was identified by color and precipitation reactions following fitoconstituyentes: alkaloids, anthraquinones and terpenes, terpenoids, flavonoids, lactones, tannins, sterols, and coumarins. Then the extracts were diluted doses of 10 and 100 µg/mL and administered to cultures Plasmodium vivax and P. falciparum, and parasitemia was assessed after 72 h of incubation, found a significant decrease in the percentage of parasitemia. The percentage inhibition antiplasmodium was good to excellent, with extracts of ethyl acetate and methanol which had a higher percentage of inhibition of P. vivax, 92.0562% and 94.5840%, respectively, and for P. falciparum malaria was 89.9146 and 91.5607% inhibition, compared with the control group than normal development of parasitemia. For testing in vivo dose was prepared from 50.0 mg/mL and was administered orally e intramuscular to Aotus nancimae specimens previously infected with strains of Plamodium falciparum, being 75% effective in each case, which to be similar to control group that was administered to 10.0 mg sodium artesunate. Keywords: Phytoconstituyents, Plasmodium, activity antiplasmodium. 10.

(11) 1. INTRODUCCIÓN. La malaria o paludismo es la infección parasitaria causada por protozoarios del género Plasmodium, que en pleno siglo XXI sigue existiendo a pesar de los esfuerzos que se realizan para su control; se ha estimado que alrededor del 45% de la población mundial corre el riesgo de contraer esta enfermedad, estos son alrededor de 3 200 millones de personas que viven en 107 países; el 80% de los cuales se presentarán en el África sub-sahariana2. Según información de el Special Programme and Training in Tropical Diseases (TDR), Plasmodium falciparum causa más 500 millones de casos, de los que mueren entre dos y tres millones de enfermos al año, el 90 % de ellas en África, mientras que Plasmodium vivax, afecta a unos 80 millones de enfermos de América Latina, Asia, Oriente Próximo y el Pacífico Occidental; siendo los más afectados los niños, representando la primera causa de muerte infantil; se calcula que cada 30 segundos muere un niño menor de 5 años; los otros grupos más vulnerables son las madres gestantes y ancianos 8, 14, 21, 37. Los niveles de mortalidad y morbilidad por malaria se han visto aumentados en los últimos tiempos como reflejo del deterioro de la situación socio-política en África desde los años 90, aumento que se ha relacionado también con el incremento de los viajes internacionales y el flujo de migración hacia y desde los países con malaria endémica26. Además de este flujo migratorio se han descrito formas peculiares de transmisión, como la malaria en los aeropuertos, la malaria transfusional y malaria en adictos a las drogas por vía endovenosa 30, 32, 34. En el Perú, si bien la morbi mortalidad no alcanza las alarmantes cifras de países africanos y sud asiáticos, su incidencia es también preocupante; habiéndose. 11.

(12) registrado en el año 1997, 180 338 casos de malaria; incrementándose a 247 229 el año 1998; 81 155 en el año 2004; el 2005, 87 772; el 2006, 60 884 y en el 2007 las cifras alcanzaron a 50 958 casos de Malaria, según el informe del Instituto Nacional de Estadística e Informática INEI10. Siendo los Departamentos de Loreto y San Martin los que registran la mayor incidencia desde 1995. La incidencia de malaria en Loreto, por P. vivax y P. falciparum, aumentó desde el año 1994, en que se reportaba 16 332 casos a mas de 121 224, en el año 1997; disminuyendo a 30 357 en el año 2000; para luego incrementarse en el 2005 a 54 364 casos y luego disminuir en el 2006 a 42 607 casos registrados, siendo el departamento con el mayor porcentaje de casos en el Perú, registrándose en el año 2008 el 66.4 % de los casos de malaria 3,6, 10. En el año 2007, se registró casos de pacientes infectados con P. vivax y P. falciparum, en el departamento de Tumbes (1 145 casos), Piura ( 606 casos) y La Libertad (250 casos), por citar algunos ejemplos, este último en la Provincia de Sánchez Carrión y valle de Chao-Virú 4, 26,. 28. .. Otro factor que influye notablemente en el aumento de la morbi mortalidad del paludismo, es la resistencia desarrollada por el parásito a los medicamentos antimaláricos utilizados a lo largo de los años, a consecuencia del uso inadecuado en monoterapia12, 15, 18. Recientemente se ha informado en The New England Journal of Medicine (2008)19, la aparición de resistencia al medicamento Artemisinina extraída de la planta Artemisa annua. En base a estas consideraciones, la Organización Mundial de la Salud (OMS), en su afán de mejorar la efectividad y calidad de los esquemas de tratamiento antimalárico, ha reconocido oficialmente al fitofármarco Artemisinina, como una nueva sustancia antimalárica y recomienda que se utilice como nueva Terapia Combinada Basada en Artemisinina (TCA), en los países con un alto grado de 12.

(13) resistencia a los tratamientos con fármacos convencionales como: Cloroquina, Quinina, Primaquina, Mefloquina, y Antifolatos como Sulfadoxinas y Pirimetamina, que generan una serie de reacciones adversas para el paciente 12, 18, 20, 31, 34.. Naturalmente, estos nuevos medicamentos a base de Artemisinina son aproximadamente 10 veces más caros que los actuales antipalúdicos, lo que agrava el problema. A pesar de estos inconvenientes y la falta de una vacuna efectiva para combatir este antiguo flagelo de la humanidad, la quimioterapia sigue siendo el método relativamente más eficaz y económico para contrarrestar esta parasitosis, pero es necesario nuevos o mejores productos para anular la aparición de fármacoresistencia, que surge sobre todo por los diferentes estadios que sufre el parásito 9, 38,39.. La artemisinina es una sustancia extraída de la planta, Artemisia annua, que crece al sudeste de China y en Vietnam, pero ha sido adaptada en Europa. Esta sustancia se emplea actualmente en cuatro combinaciones diferentes, como tratamiento de primera línea contra la malaria en aquellos países en que el parásito se ha mostrado resistente a los tratamientos convencionales; el Perú lo incorporó en su nuevo esquema terapéutico desde el 200111, 15, 16.. Las investigaciones realizadas a la Artemisia annua, se iniciaron en 1973, con la utilización del extracto natural, administrado por vía oral a 2 099 enfermos con malaria, bajo un estricto control médico en 12 hospitales: el 98 % de los pacientes se curó. En base a estos contundentes resultados se aisló la Artemisinina y cuatro años después se conoció su mecanismo de acción. Esta sustancia sirvió de prototipo para obtener derivados más eficaces, como la Dihidroartemisinina, Arthemeter,. 13.

(14) Artesunato, y en Agosto del 2004, la Revista Nature, publicó los resultados de un grupo de especialistas en Química, Parasitología, Toxicología y Farmacología, quienes anunciaron la producción sintética de la molécula codificada como OZ 277, quien demostró una eficacia superior al principio activo natural, incluso para curar la malaria cerebral por vía intravenosa 1, 2, 35, 36,.. La Artemisia annua es una planta perteneciente a la División Angiospermae, Orden Campanulales, del género Compositae y familia de las Asteraceaes; crece principalmente en terrenos áridos, en climas secos, con inviernos relativamente fríos, al igual la Artemisia vulagaris, en la que se han encontrado principios activos como aceites esenciales (0,02-0,3%): cineol, alcanfor, linalol o tuyona como componentes mayoritarios; pero además contiene, borneol, alfa-cadinol, espatulenol, monoterpenos y lactonas sesquiterpénicas. Flavonoides: rutósido, isorramnetósido, quercetósido. Cumarinas: esculetina, esculina, escopoletina, umbeliferona. Poliacetilenos, triterpenos pentacíclicos. Fitosteroles: sitosterol, estigmasterol. Carotenoides. Siendo sus acciones farmacológicas más conocidas: orexígeno,. eupéptica,. colerética,. antimicrobiana,. antihelmíntica,. antifúngica,. estrogénica, astringente, regula la menstruación y calma los dolores post parto 7, 13.. En el Perú, se encuentra la especie Artemisia absinthium, que pertenece también a la familia Asteraceae descritas anteriormente; es también de origen Europea y fue introducida posiblemente por los Españoles en el S. XVI. Crece generalmente en condiciones semejantes a la Artemisia annua, y se le encuentra en zonas de la Sierra del Departamento de Cajamarca, aunque también se desarrolla en algunas zonas de la Costa norte del Perú. En el aceite esencial de esta planta se ha encontrado componentes como: tuyonas a y b y el alcohol tuyílico libre o combinado 14.

(15) con ácido acético e isovaleriánico, la absintina (sustancia amarga), y algunas vitaminas, sin embargo no se ha realizado un estudio fitoquímico detallado. Sus sumidades floridas se usan como tónico estomacal y como vermífugo, pero aún hay controversias en cuanto a su posible toxicidad a grandes dosis 7,. 23, 27. .. En los años 2001 y 2003, se realizaron investigaciones preliminares, sobre actividad antimalárica “in vitro” de extractos de hojas de Artemisia absinthium “ajenjo”, recolectadas en la Prov. de Otuzco, Dpto de La Libertad, reportándose resultados divergentes. 5, 7. . Pero, no se han realizado estudios de identificación que. determinen la presencia de Artemisinina u otros principios activos semejantes con actividad antimalárica en esta especie.. Es nuestro propósito contribuir con nuevos estudios que permitan determinar nuevos principios activos en una variedad de Artemisia que crece en el territorio Peruano, y que sirvan como principios activos o prototipos que permitan obtener nuevos derivados contra esta enfermedad que aflige también a un gran sector de nuestra población. Por lo que se infiere que, si la Artemisia absinthium que se desarrolla en el Perú, en terrenos y climas semejantes a la Artemisia annua, que tiene las mismas características fenotípicas, entonces ésta tiene componentes químicos estructuralmente semejantes con actividad antipalúdica.. Para tal fin se plantearon como objetivos, identificar los componentes fitoquímicos de la planta Artemisia absinthium que crece en zonas andinas del departamento de Cajamarca y determinar la actividad antimalárica de sus extractos tanto “in vitro e in vivo”.. 15.

(16) Los resultados obtenidos permiten tener la esperanza de obtener nuevos medicamentos económicamente accesibles, y contribuir a mejorar la calidad de vida de poblaciones que padecen de paludismo en Perú, en donde esta enfermedad ataca endémicamente a habitantes de zonas rurales, de bajos recursos económicos, sin respetar edad ni sexo, siendo los más vulnerables los niños menores de 5 años, madres gestantes y ancianos.. 16.

(17) 2. MATERIAL Y MÉTODOS. 2.1. MATERIAL BIOLOGICO: 2.1.1. Muestra de estudio Hojas de Artemisia absinthium (Asteraceae) “Ajenjo” recolectada entre los meses de Abril y Mayo de zonas áridas de la Sierra del departamento de Cajamarca; identificada taxonómicamente en el Herbarium Truxillensis de la Universidad Nacional de Trujillo. 2.1.2. Material biológico Cultivos de P. vivax y P. falciparum, donados por el Laboratorio de Toxicología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica, en los cuales se realizó en ensayo “in vitro” e “in vivo” del efecto antiparasitario de los extractos de Artemisia absinthium. 2.1.3. Animales de experi mentación 16 primates de la especie Aotus nancimae “Musmuqui”, capturados de zonas boscosas de los ríos Nanay e Itaya, afluentes del Río Amazonas de la Provincia de Iquitos; estas especies fueron infectadas con cepas de P. falciparum, para la determinación del efecto antiparasitario “in vivo” de los extractos secos obtenidos de la Artemisia absinthium.. 2.2. MÉTODOS Y TÉCNICAS : 2.2.1. Preparación de los extractos de las hoj as de Artemisia absinthium Para la obt enció n de lo s ext ract os, l as ho jas de Artemisia absinthium, (Asteraceae) “ajenjo”, fueron previamente secadas y pulverizadas, luego 17.

(18) se pesó cuatro porciones de 200 gramos cada una, y se colocaron en 4 frascos de boca ancha, se agregó en cada uno 500 mL de hexano, cloroformo, acetato de etilo y metanol respectivamente, y dejó macerar por 7 días, con agitación periódica; luego se filtraron y en el marco obtenido se realizó la maceración 2 veces más con el respectivo solvente. Los extractos fueron concentrados en equipo rotavapor Heidolph® a 37ºC y 5 bar de presión constante y luego llevados a desecación por 24 horas a 37 ºC en frascos previamente pesados, a fin de determinar el porcentaje de rendimiento de cada maceración; cada extracto seco se guardó a una temperatura de 0º C hasta el momento de su uso. El extracto acuoso se obtuvo el mismo día del ensayo in vitro. Los extractos así obtenidos de Artemisia absinthium fueron disueltos en una solución de TWEEN 80 al 0.1%, (a excepción del extracto acuoso que fue disuelto en agua destilada estéril), hasta obtener concentraciones de 0.11mg/mL y 1.1mg/mL; luego fueron homogenizados con ayuda del Sonicador Ultrasonic Bath Instruments® X10 a temperatura de 37º C, para la marcha fitoquímica y el ensayo in vitro e in vivo 1 3 ,. 27. .. 2.2.2. Análisis fitoquímico de los extractos de Artemisia absinthium Los extractos secos obtenidos en el paso anterior se colocaron en cantidades pequeñas, aproximadamente 0.1g y se diluyeron con el solvente y medio apropiado para la respectiva identificación de sus metabolitos secundarios según la técnica descrita por Lock, O13 y Sakamoto, H. (2005)29 2.2.3. Evaluación del efecto antiplasmódico in vitro Se realizó en cult ivo s de las formas asexuales de los parásitos P. vivax, P. f alciparum. , siguiendo la metodología de Trager & Jensen (1976)32. Se utilizó 5 mL de medio Waymouth MB 752/1 (Sigma-Aldrich® Corporation) suplementado. 18.

(19) con bicarbonato de sodio (2.1g/L), sulfato de gentamicina (50mg/L), 10% de suero humano de grupo sanguíneo O, y llevado a pH 7.4 17, 27. De cada uno de los extractos obtenidos en el paso 2.2.1, se extrajo una alícuota de 0.5 mL y se adicionó a tubos de ensayo que contenían 5 mL del cultivo, obteniéndose así, una concentración final de 10 µg/mL y de 100 ug/mL respectivamente. Esta operación se realizó en 4 tubos para cada extracto y para cada concentración. 22, 27. .. Para los controles se procedió de la misma forma, agregándose a cada cultivo 0.5 mL del vehículo empleado en reemplazo de los 0.5 mL del extracto respectivo. Luego estos cultivos fueron sincronizados a una parasitemia y un hematocrito del 1% y 2% respectivamente, y luego incubados a 37 ºC en un medio anaerobio por 72 horas. 2.2.4. Determinación de la parasitemia y del porcentaje de inhibición “in vitro” Pasado este tiempo de incubación, se realizó un frotis de las muestras de cada tubo de ensayo, utilizando láminas portaobjetos, se fijó con metanol y se tiñó con colorante Giemsa. La lectura de inhibición del crecimiento se realizó de acuerdo a la metodología recomendada por Schilchtherle et al (2000)31, contando glóbulos rojos no infectados (GRL) y glóbulos rojos infectados (GRI), para obtener el porcentaje de parasitemia (%P) el cual se calculó mediante la siguiente fórmula:. GRI   %P     100  GRL  GRI . Luego de calcular la parasitemia en grupos control y ensayo, se procedió a calcular el Porcentaje de Inhibición del Crecimiento (PI) mediante la siguiente fórmula:.  % Pcontrol  % Pensayo    100 PI    % Pcontrol  . 19.

(20) El criterio de evaluación de la actividad antiplasmódica fue el siguiente: si a la dosis de 10 µg/mL del extracto, el PI es mayor o igual que 90%, la actividad antiplasmódica se considera excelente, si es mayor o igual que 50%, la actividad antiplasmódica se considera muy buena. Si a la dosis de 100 µg/mL del extracto, y el PI es mayor o igual que 90, la actividad antiplasmódica se considera buena, si es mayor o igual que 50, la actividad antiplasmódica se considera débil, según el criterio adoptado por Muñoz et al. (2000)17. Se determinó también la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), que se define como la menor concentración del extracto que inhibió más del 90% del crecimiento del parásito27.. 2.2.5. Evaluación del efecto antiplasmódico “in vivo” El efecto antiplasmódico in vivo se realizó en 16 primates de las especie Aotus nancymae, a los que se dividió en 4 grupos, de 4 especímenes cada uno. Grupo 1, Testigo; grupo 2 y 3, Problema; y grupo 4, control. Se utilizó el extracto seco de acetato de etilo que fue el que mejor PI desarrolló en el ensayo “in vitro”, éste fue diluido con TWEEN 80 al 0.1%, hasta obtener una dosis de 50 mg/mL, luego fue filtrado en Millipore S.A. 67120 Molsheim, de FH 0.45 m, para obtener compuestos estériles. Los 4 grupos de animales fueron infectados previamente con cepas de P. f alciparum, y luego de 72 horas, se realizó el control de la parasitemia y e inmediatamente se administró a los especímenes del grupo Problema 2, una dosis de 50 mg de extracto microfiltrado de acetato de etilo, por vía oral, cada 12 horas por 6 días; al grupo Problema 3 en la misma forma, pero por vía intramuscular; y al grupo. 20.

(21) 4, control, se les administró 10 mg de Artesunato por vía intramuscular cada 24 horas por 6 días; el grupo 1 (testigo) no se administró tratamiento. La evaluación de la parasitemia se realizó a los 3, 5 y 9 días de cada tratamiento, en el Laboratorio Regional de Referencia de Enfermedades Tropicales de la ciudad de Iquitos.. 2.2.6. Análisis estadístico Se realizó en el ensayo in vitro, para determinar si la diferencia existente en la media de los Porcentajes de Inhibición de cada extracto es significativa, a fin de determinar la relación entre la naturaleza del extracto y la actividad antiplasmódica. Las diferencias entre los grupos ensayo son consideradas estadísticamente significativas si el valor de P asociado a la prueba de Análisis de Varianza (ANOVA) fue menor de 0.05. Se utilizó la prueba de comparaciones múltiples mediante la prueba de Mínima Diferencia Significativa (MDS), prueba post hoc, con la finalidad de determinar si la diferencia entre la actividad antiplasmódica de cada uno de los extractos era estadísticamente significativa. El análisis se desarrolló empleando el programa SPSS® ver.12 (2003) para Microsoft® Windows.. 21.

(22) 3. RESULTADOS. Las diferentes pruebas de identificación química realizadas en los 5 tipos de extractos obtenidos de las hojas de Artemisia absinthium, permitieron mostrar la presencia de lactonas en todos los extractos, pero en alguno de ellos se encontró la presencia de otros metabolitos como: terpenos, terpenoides, alcaloides, flavonoides, taninos y esteroles (Tabla 1). En la Parasitemia encontrada en cada uno de los cultivos tratados con los extractos de Artemisia absinthium se observa una clara disminución, luego del tratamiento en relación con el respectivo blanco (sin tratamiento), al considerar el número de eritrocitos infectados y el número de eritrocitos totales, siendo esta disminución más notoria en el extracto de Acetato de etilo (Tabla 2). En la evaluación del porcentaje de inhibición antiplasmodium (PI) de cada extracto, a las concentraciones de 10 y 100 ug/mL, se observa que el extracto de Acetato de etilo y el metanólico son los que presentan mayor porcentaje de inhibición, lo que podría indicar que esta actividad se podría deber a algún metabolito de naturaleza terpénica o lactónica (Tabla 3). Teniendo en cuenta los criterios adoptados para clasificar. la actividad. antiplasmodium “in vitro” en base a los valores del Porcentaje de inhibición de crecimiento (PI) por los extractos de Artemisia absinthium, encontramos que los extractos de Acetato de etilo y metanólico mostraron mayor actividad, siendo excelente a la concentración de 10 ug/mL frente a P. vivax y muy buena frente a cultivos de P. falciparum; sin embargo a la dosis de 100 ug/mL la actividad es considerada como buena tanto en de P. vivax y P. falciparum, a excepción del 22.

(23) extracto metanólico que dio actividad débil frente a P. falciparum de acuerdo a la clasificación adoptada por Muñoz et al. (2000)17 (tabla 4). En relación al tratamiento “in vivo” a especimenes Aotus nancimae previamente infectados con P. falciparum, a quienes se les aplicó extractos estériles de A. absinthium a la dosis de 50 mg por vía oral e intradérmica (2 grupos), se observa una curación del 75 % en ambos casos, siendo el resultado semejante en el grupo control 4, al que se le aplicó el medicamento Artesunato en ampolla por vía intradérmica (Tabla 5). El análisis estadístico de la actividad antiplasmodium “in vitro” indica diferencias significativas entre el PI de los extractos de Acetato de etilo y metanólico (que presentan mayor actividad) y los demás extractos a la dosis de 10 µg/mL frente a P. vivax, para la prueba Post hoc, pero no así para ANOVA que indica que no hay diferencias significativas entre los extractos a esta dosis. Sin embargo a la dosis de 100 µg/mL, indica diferencias significativas entre el extracto acuoso y los demás extractos, (Tablas 6, 7, 8 y 9). El PI entre los extractos frente a P. falciparum a las dosis de 10 µg/mL, indican resultados semejantes al PI frente a P. vivax, sin embargo a la dosis 100 µg/mL se observa que existen diferencias estadísticamente significativas entre los extractos hexánico, clorofórmico y acetato de etilo, frente a los extractos metanólico y acuoso (Tablas 10, 11, 12 y 13).. 23.

(24) Tabla 1: Metabolitos secundarios encontrados en extractos de hojas de Artemisia absinthium “ajenjo”, identificadas con reacciones de coloración.. Metabolitos. Prueba. Extracto. Extracto. Extracto. hexano. clorofórmico. metanólico. Mayer Dragendorf. Alcaloides. -. +. ++. +++. ++. +. -. -. -. +++. ++. -. ++. ++. ++. ++. +. FeCl3. -. ++. -. -. Gelatina. -. +. -. -. -. -. terpenoides. Burchard. Leyenda:. +. -. Lieberman –. Cumarinas. +. -. Terpenos y. Esteroles. +. -. Bortranger. Taninos. acuoso. -. Antraquinonas. Lactonas. acetato etilo. Extracto. -. Hager. Flavonoides. Extracto. Shinoda Rosenheim Baljet. +. Keller – Killiani. ++. -. -. Fluorescencia. -. -. -. ( - ) Resultado negativo. (+). Intensidad débil ( + ). Intensidad intermedia ( ++ ). +. Resultado positivo. 24. Mayor intensidad ( +++) ..

(25) Tabla 2: Porcentaje de parasitemia encontradas en los cultivos blanco y experimental después del tratamiento con los extractos de Artemisia absinthium a concentraciones de 10 y 100 g/mL en cultivos de Plasmodium. vivax y P. falciparum.. Material biológico. Dosis [ug/mL ]. Blanco hexano. 10 10 P. vivax. Blanco cloroformo. 1.7450 8.6281. 1.6878. Extracto Cloroformo. Blanco Acetato et. 2.8882 7.7586. Extracto Acetato Et.. Blanco metanol. 0.7365. 1.9231. 9.1417. 0.8763. Extracto Metanol. Blanco acuoso. 0.4902 7.7447. 0.4878. Extracto Acuoso 0.8065. 9.2528. 0.9780. 10. 1.5000. 1.7850. 0.7024. 0.8299. 1.0543. 10. 1.6194 0.7520. 0.4878 0.5051. 0.5896 0.5051. 0.4673 0.3500. 3.9682. 100 100. 8.6281. 0.6740. 7.7586. 0.8038. 9.1417. 0.4926. 7.7447. 0.8740. 1.7037 9.2528. 1.3580. 100. 0.5000. 0.7167. 0.4902. 0.7890. 1.2785. 100. 0.8368. 0.6423. 0.4926. 0.6980. 1.2481. 10. 1.7451. 5.3510. 0.4748. 1.3576. 0.3887. 10 P. falciparum. Extracto Hexano. 11.3214. 3.8666. 10.2358. 4.1963. 12.9887. 1.0634. 13.5252. 1.3070. 10.4785. 0.6189. 10. 4.6331. 6.7458. 2.6436. 1.9805. 5.9524. 10. 4.9935. 7.1429. 1.0581. 3.3654. 6.0592. 100. 1.2116. 1.7417. 1.3150. 5.4009. 3.3333. 100. 11.3214. 3.9248. 10.2358. 12.9887. 1.2114. 0.8516. 13.5252. 5.8827. 10.4785. 2.9259. 100. 1.0425. 2.5929. 0.9193. 4.1522. 3.0348. 100. 1.2078. 1.8335. 1.2987. 4.0980. 1.6995. 25.

(26) Tabla 3: Porcentaje de inhibición (PI) de la parasitemia por cada extracto de Artemisia absinthium a las concentraciones de 10 y 100 g/mL, en cultivos de P. vivax y P. falciparum.. Material biológico. Dosis [ug/ml]. PI Extracto Hexano. PI Extracto Cloroformo. PI Extracto Acetato Et.. PI Extracto Metanol. PI Extracto Agua. 10.0 10.0 10.0 10.0 Promedio. 79.77539 80.43876 82.61494 81.23071 81.01495. 62.77474 75.21361 76.99327 93.71272 77.17359. 91.94337 90.41396 92.31664 93.55087 92.05621. 93.67056 93.70144 89.28460 93.96633 92.65573. 91.28424 89.43023 88.60601 57.11319 81.60842. 100.0 100.0 100.0 100.0 Promedio. 91.28429 92.18831 94.20498 90.30122 91.99470. 93.49044 89.64010 90.76312 91.72144 91.40378. 94.47531 94.61139 94.63780 94.61139 94.58397. 95.48078 88.71486 89.81239 90.98738 91.24885. 81.58716 85.32336 86.18256 86.51111 84.90105. 10.0. 84.58583. 51.72290. 96.34457. 89.96270. 96.29012. 10.0 10.0 10.0 Promedio. 65.84698 59.07703 55.89358 66.35085. 59.00321 48.15430 49.34560 52.05650. 91.81326 79.64699 91.85370 89.91463. 90.33632 85.35671 75.11767 85.19335. 94.09322 43.19434 46.17495 69.93816. 100.0 100.0 100.0 100.0 Promedio. 89.29815 65.33259 90.79177 89.33171 83.68856. 82.98423 88.16464 84.66852 82.08725 84.47616. 89.87558 93.44368 92.92229 90.00130 91.56071. 60.06780 46.50548 69.30064 69.70111 61.39376. 68.18883 72.07686 74.03785 83.78086 74.52110. P. vivax. P. falciparum. 26.

(27) Tabla 4: Relación entre porcentaje de inhibición de crecimiento y el tipo de actividad antiplasmodium de los extractos de Artemisia absinthium a las concentraciones de 10 y 100 ug/mL aplicadas a cultivos de P. vivax y P. falciparum.. Material. Hexano. Cloroformo. Acetato Et.. Metanol. Agua. Dosis. biológico [ug/mL]. 10. PI. Tipo actividad Muy. 81.0149. buena. PI. 77.1736. Tipo. PI. actividad Muy buena. Tipo actividad. PI. Tipo actividad. PI. 92.0562. Excelente. 92.6557. Excelente. 81.6084. 94.5840. Buena. 91.2489. Buena. 84.9010. Tipo actividad Muy buena. P. vivax. 100. 10. 91.9947. 66.3509. P. falciparum. 100. Buena Muy buena. 83.6886. Débil. 91.4038. 52.05650. 84.4762. Buena Muy buena Débil. 89.9146. 91.5607. PI: Porcentaje de inhibición del crecimiento.. 27. Muy buena Buena. 85.1933. 61.3938. Muy buena Débil. 69.9382. 74.5211. Débil Muy buena Débil.

(28) Tabla 5: Resultados del tratamiento con extracto de Artemisia absinthium por vía oral e intramuscular y con Artesunato por vía intramuscular a especimenes Aotus nancimae. Nº de Grupo. espe címen. Dosis de Extracto. 1º. 2º. 3º. 4º. Control. Control. Control. Control. %. Basal. d3. d5. d9. curación. d0. 1. 0. +. +. +. +. Grupo 1. 2. 0. +. +. +. +. Testigo. 3. 0. +. +. +. +. 4. 0. +. +. +. +. 1. 50. +. -. -. -. 2. 50. +. +. +. +. 3. 50. +. -. -. -. 4. 50. +. -. -. -. 1. 50. +. -. -. -. 2. 50. +. -. -. -. 3. 50. +. -. -. -. 4. 50. +. +. +. +. Grupo 4. 1. 10. +. +. +. +. Control. 2. 10. +. -. -. -. Artesunato. 3. 10. +. -. -. -. (VIM). 4. 10. +. -. -. -. Grupo 2 Problema (V.O.). Grupo 3 Problema (VIM). infectados experimentalmente con P. falciparum.. Leyenda: V.O. = vía oral. d. VIM. = vía intramuscular (-). Resultado negativo. (+). Resultado positivo. 22. = día. 0. 75. 75. 75.

(29) Tabla 6: Análisis de Varianza (ANOVA) del Porcentaje de Inhibición (PI) de P. vivax a la dosis de 10 g/mL de cada extracto de Artemisia absinthium. Fuente de variación. SC. Media cuadrática. gl. Inter-grupos. 787,953. 4. 196,988. Intra-grupos. 1313,221. 15. 87,548. Total. 2101,174. 19. F. F crít. Sig.. 2,250. ,112. 3.0556. Donde: SC: Suma de cuadrados; gl: grados de libertad; F: factor calculado; F: Factor crítico.. Tabla 7: Prueba post hoc para comparaciones múltiples del Porcentaje de Inhibición (PI) de P. vivax a la dosis de 10 g/mL de cada extracto de Artemisia absinthium.. (I) Extracto. (J) Extracto Clorofór. Hexánico. Sig.. Límite inferior. Límite superior. 6,616193911 ,570 -10,26071850 17,94344850. -11,041260000. 6,616193911 ,116 -25,14334350. 3,06082350. Metanól. -11,640782500. 6,616193911 ,099 -25,74286600. 2,46130100. Acuoso. -,593467500. 6,616193911 ,930 -14,69555100 13,50861600. Hexáni. -3,841365000. 6,616193911 ,570 -17,94344850 10,26071850. Acetatoetilo. 14,882625000(*). 6,616193911 ,040 -28,98470850. Metanól. 15,482147500(*). 6,616193911 ,034 -29,58423100 -1,38006400. Acuoso DMS Hexáni (Diferencia Mínima Clorofór Significa Acetato etilo Metanól tiva) Acuoso Hexánico Clorofórm Acetatoetilo Acuoso Hexánico Acuoso. 3,841365000. Error típico. Intervalo de confianza al 95%. Acetatoetilo. Clorofórmico. Metanólico. Diferencia de medias (I-J). Clorofórm. -,78054150. -4,434832500. 6,616193911 ,513 -18,53691600. 11,041260000. 6,616193911 ,116. -3,06082350 25,14334350. 14,882625000(*). 6,616193911 ,040. ,78054150 28,98470850. -,599522500. 9,66725100. 6,616193911 ,929 -14,70160600 13,50256100. 10,447792500. 6,616193911 ,135. -3,65429100 24,54987600. 11,640782500. 6,616193911 ,099. -2,46130100 25,74286600. 15,482147500(*). 6,616193911 ,034. 1,38006400 29,58423100. ,599522500 11,047315000 ,593467500 4,434832500. 6,616193911 ,929 -13,50256100 14,70160600 6,616193911 ,116. -3,05476850 25,14939850. 6,616193911 ,930 -13,50861600 6,616193911 ,513. 14,69555100. -9,66725100 18,53691600. Acetatoetilo. -10,447792500. 6,616193911 ,135 -24,54987600. 3,65429100. Metanól. -11,047315000. 6,616193911 ,116 -25,14939850. 3,05476850. * La diferencia entre las medias es significativa al nivel .05. a Las pruebas t de Dunnett tratan un grupo como control y lo comparan con todos los demás grupos.. 23.

(30) Tabla 8: Análisis de Varianza (ANOVA) del Porcentaje de Inhibición (PI) de P. vivax a la dosis de 100 g/mL de cada extracto de Artemisia absinthium. Fuente de variación Inter-grupos Intra-grupos Total. SC. gl. 204,198 58,144 262,342. 4 15 19. Media cuadrática 51,050 3,876. F. Sig.. F crít. 13,170. ,000. 3.0556. Donde: SC: Suma de cuadrados; gl: grados de libertad; F: factor calculado; F: Factor crítico.. Tabla 9: Prueba post hoc para comparaciones múltiples del Porcentaje de Inhibición (PI) de P. vivax a la dosis de 100 g/mL de cada extracto de Artemisia absinthium. (I) Extracto Hexánico. Clorofórm ico. DMS (Diferencia Mínima Significa tiva). Acetato de etilo. Metanólico. (J) Extracto. Diferencia de medias (I-J). Error típico. Sig.. Clorofór Acetatoet Metanól Acuoso Hexán Acetatoet Metanól Acuoso Hexán Clorofór Metanól Acuoso Hexán. ,590925000 -2,581772500 ,745847500 7,093652500(*) -,590925000 -3,172697500(*) ,154922500 6,502727500(*) 2,581772500 3,172697500(*) 3,327620000(*) 9,675425000(*) -,745847500. 1,392163573 1,392163573 1,392163573 1,392163573 1,392163573 1,392163573 1,392163573 1,392163573 1,392163573 1,392163573 1,392163573 1,392163573 1,392163573. ,677 ,083 ,600 ,000 ,677 ,038 ,913 ,000 ,083 ,038 ,030 ,000 ,600. Clorofór Acetatoet Acuoso Hexáni. -,154922500 -3,327620000(*) 6,347805000(*) -7,093652500(*). 1,392163573 1,392163573 1,392163573 1,392163573. ,913 ,030 ,000 ,000. Clorofór Acetatoet. -6,502727500(*) -9,675425000(*). 1,392163573 1,392163573. ,000 ,000. Acuoso. Intervalo de confianza al 95% Límite Límite inferior superior -2,37640141 3,55825141 -5,54909891 ,38555391 -2,22147891 3,71317391 4,12632609 10,06097891 -3,55825141 2,37640141 -6,14002391 -,20537109 -2,81240391 3,12224891 3,53540109 9,47005391 -,38555391 5,54909891 ,20537109 6,14002391 ,36029359 6,29494641 6,70809859 12,64275141 -3,71317391 2,22147891 -3,12224891 -6,29494641 3,38047859 10,06097891 -9,47005391 12,64275141 -9,31513141. 2,81240391 -,36029359 9,31513141 -4,12632609 -3,53540109 -6,70809859. Metanóli -6,347805000(*) 1,392163573 ,000 -3,38047859 * La diferencia entre las medias es significativa al nivel .05. a Las pruebas t de Dunnett tratan un grupo como control y lo comparan con todos los demás grupos.. 24.

(31) Tabla 10: Análisis de Varianza (ANOVA) del Porcentaje de Inhibición (PI) de P. falciparum a la dosis de 10 g/mL de cada extracto de Artemisia absinthium. Fuente de variación. SC. Media cuadrática. gl. Inter-grupos. 3706,081. 4. 926,520. Intra-grupos. 3428,667. 15. 228,578. Total. 7134,748. 19. F. F crít. Sig.. 4,053. ,020 3.0556. Donde: SC: Suma de cuadrados; gl: grados de libertad; F: factor calculado; F: Factor crítico.. Tabla 11: Prueba post hoc para comparaciones múltiples del Porcentaje de Inhibición (PI) de P. falciparum a la dosis de 10 g/mL de cada extracto de Artemisia absinthium.. (I) Extracto. (J) Extracto Clorofór. Hexánico. DMS (Diferencia Acetato de Mínima etilo Significa tiva). -,77730489. Metanól. -18,842495000 10,690597933 ,098 -41,62896511. 3,94397511. Acuoso. -3,587302500 10,690597933 ,742 -26,37377261. 19,19916761. -14,294352500 10,690597933 ,201 -37,08082261. 8,49211761. Acetatoetilo. -37,858127500(*) 10,690597933 ,003 -60,64459761. -15,07165739. Metanól. -33,136847500(*) 10,690597933 ,007 -55,92331761. -10,35037739. Acuoso. -17,881655000 10,690597933 ,115 -40,66812511. 4,90481511. Hexána. 23,563775000(*) 10,690597933 ,044. ,77730489. 46,35024511. Clorofór. 37,858127500(*) 10,690597933 ,003. 15,07165739. 60,64459761. 4,721280000 10,690597933 ,665 -18,06519011. 27,50775011. Metanól Acuoso. -2,80999761. 42,76294261. 18,842495000 10,690597933 ,098. -3,94397511. 41,62896511. 33,136847500(*) 10,690597933 ,007. 10,35037739. 55,92331761. Acetatoetilo. -4,721280000 10,690597933 ,665 -27,50775011. 18,06519011. Acuoso. 15,255192500 10,690597933 ,174. -7,53127761. 38,04166261. 3,587302500 10,690597933 ,742 -19,19916761. 26,37377261. Clorofór. Hexáni Acuoso. Límite superior. -23,563775000(*) 10,690597933 ,044 -46,35024511. Acetatoetilo. 14,294352500 10,690597933 ,201. Límite inferior. 37,08082261. Hexáno Metanólico. Intervalo de confianza al 95% Error típico Sig.. -8,49211761. Hexán Clorofórmico. Diferencia de medias (I-J). Clorofór. 19,976472500 10,690597933 ,081. 17,881655000 10,690597933 ,115. -4,90481511. 40,66812511. Acetatoetilo. -19,976472500 10,690597933 ,081 -42,76294261. 2,80999761. Metanól. -15,255192500 10,690597933 ,174 -38,04166261. 7,53127761. * La diferencia entre las medias es significativa al nivel .05. Las pruebas t de Dunnett tratan un grupo como control y lo comparan con todos los demás grupos.. 25.

(32) Tabla 12: Análisis de Varianza (ANOVA) del Porcentaje de Inhibición (PI) de P. falciparum a la dosis de 100 g/mL de cada extracto de Artemisia absinthium. SC. gl. Media cuadrática. 2158,803. 4. 539,701. Intra-grupos. 969,954. 15. 64,664. Total. 3128,757. 19. Fuente de variación Inter-grupos. F 8,346. Sig.. F crít. ,001 3.0556. Donde: SC: Suma de cuadrados; gl: grados de libertad; F: factor calculado; F: Factor crítico.. Tabla 13: Prueba post hoc para comparaciones múltiples del Porcentaje de Inhibición (PI) de P. falciparum a la dosis de 100 g/mL de cada extracto de Artemisia absinthium.. (I) Extracto. (J) Extracto Clorofór. Hexánico. Clorofórmico. DMS (Diferencia Acetato de Mínima etilo Significa Tiva). Metanólico. Acuoso. Diferencia de medias (I-J). Intervalo de confianza al 95% Error típico Sig.. Límite inferior. Límite superior. -,787605000 5,686105597 ,892. -12,90725219. 11,33204219. -7,872157500 5,686105597 ,186. -19,99180469. 4,24748969. Metanól. 22,294797500(*) 5,686105597 ,001. 10,17515031. 34,41444469. Acuoso. 9,167455000 5,686105597 ,128. -2,95219219. 21,28710219. Hexáno. ,787605000 5,686105597 ,892. -11,33204219. 12,90725219. -7,084552500 5,686105597 ,232. -19,20419969. 5,03509469. Metanól. 23,082402500(*) 5,686105597 ,001. 10,96275531. 35,20204969. Acuoso. 9,955060000 5,686105597 ,100. -2,16458719. 22,07470719. Hexáno. 7,872157500 5,686105597 ,186. -4,24748969. 19,99180469. Clorofór. 7,084552500 5,686105597 ,232. -5,03509469. 19,20419969. Metanól. 30,166955000(*) 5,686105597 ,000. 18,04730781. 42,28660219. Acuoso. 17,039612500(*) 5,686105597 ,009. 4,91996531. 29,15925969. Hexáno. -22,294797500(*) 5,686105597 ,001. -34,41444469. -10,17515031. Clorofór. -23,082402500(*) 5,686105597 ,001. -35,20204969. -10,96275531. Acetatoetil -30,166955000(*) 5,686105597 ,000. -42,28660219. -18,04730781. Acuoso. -13,127342500(*) 5,686105597 ,036. -25,24698969. -1,00769531. Hexáni. -9,167455000 5,686105597 ,128. -21,28710219. 2,95219219. Clorofór. -9,955060000 5,686105597 ,100. -22,07470719. 2,16458719. Acetatoetil -17,039612500(*) 5,686105597 ,009. -29,15925969. -4,91996531. 1,00769531. 25,24698969. Acetatoetil. Acetatoetil. Metanól. 13,127342500(*) 5,686105597 ,036. * La diferencia entre las medias es significativa al nivel .05. Las pruebas t de Dunnett tratan un grupo como control y lo comparan con todos los demás grupos.. 26.

(33) 4.. DISCUSIÓN. En este estudio se realizó el análisis fitoquímico, y la aplicación de los 5 extractos de las hojas Artemisia absinthium a 96 medios de cultivo de P. vivax y P. f alciparum a las concentraciones de 10 y 100 ug/mL, con la finalidad de determinar y comparar el efecto antiplasmodium “in vitro” y la dosis de mayor eficacia de los respectivos extractos. El ensayo in vivo, se realizó 16 especímenes Aotus nancimae divididos en 4 grupos a los que previamente se les infectó con Plasmodium falciparum y posteriormente se les aplicó a dos grupos los mismos extractos est er ilizados de A. absinthium por vía oral e intradérmica; al grupo testigo. infectado no se le aplicó tratamiento y al grupo control se le aplicó. Artesunato en ampolla a fin de comparar el desarrollo del parásito y determinar el efecto antimalárico de la droga. Los resultados obtenidos de la marcha analítica fitoquímica aplicada, mediante reacciones de coloración y precipitación indican la presencia de alcaloides, terpenos, terpenoides, flavonoides, taninos, lactonas y esteroles (Tabla 1). Estos resultados contrastan con los obtenidos en otros estudios en extractos de hojas de Artemisia absinthium “Ajenjo”, recolectadas en la Prov. de Otuzco, Dpto de La Libertad, reportándose los mismo componentes químicos pero además resinas 5, 7. Sin embargo, no se han realizado estudios de identificación que determinen la presencia de algún componente como Artemisinina u otros principios activos semejantes con actividad antimalárica en esta especie. Es importante señalar que de acuerdo a otros estudios realizados en plantas del mismo género pero de especies diferentes como Artemisia annua, se han encontrado fitoconstituyentes lactónicos como la Artemisinina, que a demostrado una actividad antimalárica importante34, 27. 36, 37. . Por esta razón consideramos la.

(34) posibilidad de que esta planta tenga algún principio activo o derivado estructural del grupo de lactonas, con actividad antiplasmódica que es extraída con el acetato de etilo y por ello en el ensayo “in vitro” este extracto presentó mayor PI frente a P. vivax y P. f alciparum. La actividad antiplasmódica “in vitro” de los extractos obtenidos de las hojas de A. absinthium frente a cultivos de P. vi vax y P. f alciparum, que se determinó considerando el número de eritrocitos infectados y el número de eritrocitos totales, según el criterio adoptado por Muñoz et al. 2000a17, se puede notar una evidente disminución del porcentaje de parasitemia en cada uno de los cultivos después de la administración de los extractos en relación con el respectivo porcentaje de parasitemia de los cultivo blanco, a los que no se les administró ningún extracto, solo el vehículo utilizado para la preparación de la droga (Tabla 2). Estos resultados son semejantes a los obtenidos por un grupo de investigadores de la Universidad de Antioquia, Colombia quienes encontraron actividad antiplasmódica en extractos de especies de la familia Annonaceae, sobre cepas de P. f alciparum 2 2 , así mismo Rodríguez-Pérez y col. (2006)2 7 , demostraron actividad antiplasmódica in vitro con extractos de seis plantas cubanas frente a cepas de P. falciparum a dosis de 3.1 a 50 ug/mL. Al analizar el Porcentaje de inhibición (PI) antiplasmodium “in vitro” de los extractos, a las concentraciones de 10 y 100 g/mL respectivamente, se observa que a la dosis de 10 g/mL el extracto de acetato de etilo presenta un PI de 92.05621 %, y el extracto metanólico un PI de 92.65573 %, frente a cepas P. vivax, siendo la respuesta clasificada como excelente para ambos casos, de acuerdo al criterio adoptado por Muñoz et al. 2000a17 y por Rodríguez – Pérez26. 28.

(35) (Tablas 3 y 4); sin embargo la respuesta con los demás extractos, Hexano, Cloroformo y Acuoso, fueron clasificadas como muy buena, debido a que sus PI promedio fueron de 81.0150%, 77.1736% y de 81.6084%, respectivamente. Al hacer el análisis estadístico de estos resultados se obtiene que no existe diferencias significativas entre estos 5 extractos, para un P = 0.05, según el test de ANOVA, (Tabla 06). Sin embargo al aplicar prueba post hoc de Diferencial Mínima Significativa (DMS), indica que existe diferencia estadísticamente significativa entre los extractos de acetato de etilo y metanólico frente a los demás extractos (hexánico, clorofórmico y acuoso) (Tabla 7). Estos resultados muestran las potencialidades antimaláricas de algunas plantas medicinales y orientan el camino para estudios posteriores que permitan determinar sus constituyentes químicos activos. Los resultados del porcentaje de inhibición de la parasitemia (PI) de cada extracto a la concentración de 100 g/mL sobre cultivos de P. vivax, fluctuaron entre 84.90105 % para el extracto acuoso, a 94.58397% para el extracto acetato de etilo, que fue el PI más alto, siendo esta respuesta clasificada como buena (Tabla 3), no existiendo diferencias significativas entre los tratamientos a excepción del extracto acuoso que tuvo el PI más bajo, según las pruebas de ANOVA y DMS (Tablas 8 y 9). Respecto al ensayo in vitro sobre P. falciparum con los extractos a la concentración 10 g/mL, se obtuvo también mayor respuesta del PI en el extracto de acetato de etilo (89.91463 %), seguido del extracto metanólico cuyo PI fue de 85.19335 %, siendo la menor respuesta para el extracto clorofórmico con un PI de 52.05650 %; existiendo diferencias significativas entre los tratamientos de cada extracto, según ANOVA, para un P= 0.05 (Tabla 10) y la prueba DMS; pero cuando se compara el. 29.

(36) PI entre del extracto acetato de etilo y metanólico con la prueba DMS no presentan diferencias significativas (Tabla 11). Según el PI a esta dosis la clasificación del tipo de actividad antiplasmódica está considerada como muy buena (Tabla 4). Sin embargo, a la dosis de 100 g/mL se obtuvo el mayor PI en el extracto de acetato de etilo, 91.5607 %, seguido del extracto clorofórmico, 84.4762 %, siendo el menor PI a esta dosis el correspondiente al extracto metanólico, 61.3938 %; este valor mínimo junto al alcanzado por el extracto acuoso permiten encontrar diferencias estadísticas significativas respecto a los demás extractos según ANOVA y DMS (Tablas 12 y 13). Las respuestas de estos extractos a esta dosis se clasifican como débiles, a excepción del extracto de acetato de etilo que su respuesta se clasifica como buena, (Tabla 4). Estos resultados contrastan con los obtenidos por un grupo de investigadores dirigidos por Rodríguez–P erez (2006) 2 7 , quien demostró actividad antiplasmódica in vitro de 4 extractos alcohólicos de plantas utilizadas en medicina tradicional Cubana, dentro de ellas de A. absinthium sobre cepas Plasmodium berghei. 27. ; es importante considerar como. referencia puesto que se trata extractos obtenidos con otro solvente y cuya actividad se ensayó en un plasmodio no patógeno para el hombre, pero puede ser también una referencia importante para estudios posteriores que permitan la identificación de un compuesto químico nuevo con actividad antiplasmódica. El análisis estadístico de comparación de medias y desviación estándar, ANOVA, entre las dosis de 10 y 100 g/ mL, referente al PI entre ambas especies de plasmodium no se observa diferencias significativas entre ellas, para un P de 0.05, en consecuencia podemos inferir que la concentración mínima efectiva es de 10 g/mL. Esto quiere decir que si bien es cierto se observa una mayor respuesta a la. 30.

(37) concentración de 100 g/mL, respecto a la de 10 g/mL, esta no es determinante para indicar que a mayor dosis la actividad es mejor. Esta inferencia se puede hacer a pesar que el extracto de acetato de etilo presenta un mayor promedio de PI (94.5840) pero a la dosis de 100 ug/mL, seguido del extracto metanólico con un PI de 92.6557, el hexánico con un PI de 91.9947, el clorofórmico con un PI de 91.4038 y finalmente del extracto acuoso con un PI de 84.9010, siendo estos valores muy cercanos entre sí, de allí que no se observa diferencias significativas estos extractos, hecho que demuestra también la eficacia de estos 3 extractos de la planta en estudio a la concentración de 10 g/mL, por esta razón el tipo de actividad antiplasmodium de estos extractos frente a estas cepas patógenas se clasifican dentro del rango de excelentes a muy buena. Estos hallazgos indican la presencia de un componente químico que en su estructura contiene grupos polares y apolares con naturaleza sesquiterpenlactona29 a que le permiten estar en solventes de naturaleza semejante, que sería de mucha importancia purificar para elucidar su estructura química. El ensayo in vivo se realizó en 16 primates de la especie Aotus nancimae previamente infectados con P. falciparum a 4 de los cuales se le administró por vía oral una dosis 50 mg de extractos estériles de A. absynthium por vía oral (grupo 2) y al los otros 4 (grupo 3) se les administró la misma dosis pero por vía parenteral. Después de las observaciones microscópicas realizadas a los 3, 5 y 9 días post tratamiento, los resultados indican ausencia de infección (curación) en un 75 % de los especímenes del grupo problema 2 y 3, este resultado semejante se obtuvo en el grupo control al que se le administró una dosis de 10 mg de Artesunato en ampolla por vía intramuscular con la finalidad de contrastar los resultados de los grupos. 31.

(38) ensayo (Tabla 5). Además podemos observar que en el grupo testigo al cual no se le administro tratamiento alguno después de la infección experimental, el desarrollo de la parasitemia continuó en forma normal. Estos resultados confirman el hallazgo del estudio “in vitro”, sobre la eficacia de los extractos de esta planta, puesto que sus respuestas frente a cepas patógenas de P. vivax y P. falciparum, fueron clasificadas de muy buena a excelente; resultados que contrastan con los estudios “in vitro e in vivo” realizados por Rodríguez – Perez, en Cuba27, quien obtiene un 65 % del Porcentaje de inhibición de la actividad antiplasmódica con un extracto alcohólico de A. absinthium en ratones infectados con cepas de Plasmodium berghei que es una cepa no patógena para el hombre.. PROPUESTA: Estos resultados demuestran las potencialidades antimaláricas de esta planta de A. absinthium y abre la posibilidad para la realización de estudios posteriores a nivel de químico para la elucidación estructural del componente activo y a nivel pre clínico, como es nuestro siguiente propósito para reafirmar estos hallazgos. Es importante también realizar ensayos que permitan determinar el mecanismo de acción de este posible componente sobre el parásito y además su probable toxicidad. Este estudio orienta el camino para encontrar nuevos principios activos o prototipos que contribuyan al tratamiento más eficaz y control de la malaria en nuestra región y el país. Se espera que estas nuevas alternativas de tratamiento, sean más accesibles económicamente a las poblaciones que la padecen, sin que generen resistencia y efectos adversos al paciente, como si lo hacen los fármacos usados en el tratamiento farmacológico convencional de la malaria o paludismo.. 32.

(39) 5.. CONCLUSIONES. Estos resultados demuestran la existencia de un metabolito con actividad antiplasmodium en las hojas de Artemisia absinthium cultivada en el Perú, cuya naturaleza química le permite tener una relativa afinidad con los solventes extractivos utilizados en el presente estudio. Se determinó también que a la dosis de 10 µg/mL de los extractos de acetato de etilo y metanólico presentan una actividad excelente y muy buena frente a la dosis de 100 µg/mL en cultivos de P. vivax y P. falciparum respectivamente.. 33.

(40) 6.. 1.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. AVENDAÑO, C. (2004.) Introducción a la Química Farmacéutica. (2º ed,) España. Ed. McGraw Hill. Pág. 26-37.. 2.. BENDIG, M. (2004). Graduate of the TDR. “Malperox” programme reaches the clinics. TDR NEWS. UNICEF/UNDP/WORLD BANK/WHO. Nº 73. Nature, October.430:838.. 3.. CELIS J., MONTENEGRO R., CASTILLO A., CHE E., MUÑOZ E. (2003). Evolución de la Malaria en la Región Loreto. Anales de la Facultad de Medicina de UNMSM-Perú. Vol. 64, Nº 4 - Pág. 261 – 266.. 4.. CÓRDOVA D., LISBOA, E. (2005). Efecto de la Infección Natural por P. falciparum o P. vivax sobre el Sistema Immune de Pobladores de Áreas Endémicas del Distrito de Sartimbamba, Prov. De Sánchez Carrión. Tesis de Bachiller, UNT... 5.. CRUZADO,. L.;. SAGÁSTEGUI,. W.;. MIRANDA,. M.. (2003).. Fitoconstituyentes con actividad antipalúdica sobre P. falciparum y P. vivax en plantas del norte Peruano. Informe de Investigación OGPRODEIN- UNT. Trujillo, Perú. 6.. DIRECCIÓN GENERAL DE SALUD. (2007). Informe de malaria en el Perú. Lima Perú: MINSA; pp.: 24-26.. 7.. ESQUIVES, S.; HUACCHA, A. (2001). Fitoconstituyentes con actividad antipalúdica sobre P. falciparum y P. vivax en fracciones de plantas usadas en medicina Tradicional en el Perú. Tesis de bachiller UNT. Trujillo, Perú.. 8.. GUERIN P., OLLIARO P., NOSTEN F., DRUILHE P., LAXMINARAYAN R., BINKA F. (2002). Malaria: Current status of Control, Diagnosis, 34.

(41) Treatment, and a Proposed agenda for Research and Development. Lancet Infect Dis. 2; 564-73. 9.. HERRERA S., ARÉVALO-HERRERA, M. (2004). The Road Towards a P. vivax malaria vaccine. Special Programme and Training in Tropical Diseases (TDR), Nº 72 – June.. 10.. INSTITUTO. NACIONAL. DE. ESTADÍSTICA. E. INFORMÁTICA.. INFORMACIÓN SOCIO DEMOGRÁFICA. Indicadores de Salud. INEI perú. (Monografía en Internet) Perú. 2008. (Acceso 8 de Febrero 2009). Disponible en www.inei.gob.pe. 11.. LA-SCALEA M., COSTA SILVA H., FERREIRA E. (2007). Redução voltamétrica de artemisinina e sua interação com grupo heme (hemina). Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. Brazilian Journal Of Farmaceutical Sciences. Jul/set; 43 (3).. 12.. LECA L, LLANOS –ZAVALAGA F, HUAYTA E. (2002).. Criterios. clínicos y epidemiológicos de los prestadores en el diagnóstico presuntivo y elección de tratamiento en paciente con malaria, Piura – Perú. Rev Perú Med Exp Salud Pública. 19 (2): 68-73. 13.. LOCK O. (1994).. Investigación Fitoquímica, Métodos de Estudio de. Productos Naturales. (2ª ed.).Lima. Editorial Pontificia Universidad Católica del Perú. Pág. 7,9, 68, 183-210. 14.. MANSI. M.;. DICKSON. T.;. RODRÍGUEZ-MORALES. A.. (2007).. Influencia de la Parasitemia sobre los valores de Hemoglobina y anemia en niños con malaria por Plasmodium falciparum. no complicada:. Experiencia en un hospital de Tanzania. Rev Perú Med Exp Salud Pública. 24 (1): 27-34. 35.

(42) 15.. MINISTERIO DE SALUD DEL PERÚ. (2003). Política de Medicamentos Contra la Malaria. MINSA. Lima-Perú... 16.. MINISTERIO. DE. SALUD. DEL. PERÚ.. (2003).. Protocolo. de. Investigación: Evaluación de la Implementación de Terapias de combinación de Mefloquina-Artesunato y sulfadoxina/PirimetaminaArtesunato para Infecciones por Plasmodium Falciparum en el Perú. MINSA.Perú. 17.. MUÑOZ V. et al. (2000). A search for natural bioactive compounds in Bolivia traugh a multidisciplinary approach part I. Evaluation of the antimalarial activity of plants used by the Chocobo Indians. J Ethnopharmacol. 69: 127-37.. 18.. NABARRO D. (1999). Rolling Back Malaria TDR mews. No.58, 12.Febrero.. 19.. NIGHTINGALE K. (2008). Resistance to key malaria drug emerges. The New England Journal of Medicine. N Engl J Med. 359, 2619.. 20.. NOSTEN F, VAN VUGT M, PRICE R, LUXEMBURGER C, THWAY KL, BROCKMAN A, et al. (2000). Effects of artesunate-mefloquine combination on incidence of Plasmodium falciparum malaria and mefloquine resistance in western Thailand: a prospective study. Lancet. 356: 297-302.. 21.. ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE SALUD/ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. (2007). Malaria en las Américas: Informe sobre los progresos realizados. 27º Conferencia Sanitaria Panamericana. 59º Sesión del Comité Regional. Washington D.C. EUA. Del 1 al 15 de Octubre del 2007. (Monografía en Internet). 2007. (Acceso 10 de Enero 2009). Disponible en http://www.paho.org.Spanish/AD/DPC/CD/ravreda. 36.

(43) 22.. OSORIO, E.; ARANGO, G.; GARCIA, E.; MUÑOZ, C. (2005). Actividad antiplasmódica in vitro e inhibición de la formación de la β-hematina de plantas colombianas de la familia Annonaceae. Acta Farmaceútica Bonaerense, 24(4), 527-532.. 23.. PILOTO, J.; RAMOS, A.; VIZOSO, Á. (2000). Evaluación del potencial genotóxico de un extracto fluido de incienso (artemisia Absinthium L.). Rev Cubana Plant Med, Mayo-ago. vol.5, no.2, p.64-67. ISSN 1028-4796.. 24.. PILLAY, P.; VLEGAR, R.; MAHARAJ, V. (2007). Isolation and identification of antiplasmodial sesquiterpene lactones from Oncosiphon piluliferum. Journal of Ethnofarmacology, 112, 71-76.. 25.. RODRÍGUEZ C; RIVERA M; REBAZA H. (2007). Factores de riesgo para malaria pro Plasmodium vivax en una población rural de Trujillo, Perú. Rev Perú Med Exp Salud Pública. 24 (1): 35-39.. 26.. RODRÍGUEZ- MORALES A; LÓPEZ-ZAMBRANO M; HARTER-GRIEP R; VILCA-YENGLE L; CÁRDENAS R. (2008). Aspectos sociales de la Malaria importada en Latinoamérica.. Perú. Rev Perú Med Exp Salud. Pública. 25 (2): 208-16. 27.. RODRÍGUEZ-PÉREZ, M,; MARTINEZ, M.; RIVERO, L.; ALVAREZ, H.; VALDEZ, A.; RODRÍGUEZ, D. (2006). Evaluación de la actividad antimalárica de algunas plantas utilizadas en la medicina tradicional cubana. Revista de Ciencias Farmaceúticas Básica y Aplicada. 197-205.. 28.. RODRIGUEZ R., VICUÑA J. (2005). Determinación de la Respuesta Immune en Muestras Sanguíneas de Pobladores Infectados por P. falciparum o P. vivax que habitan en la localidad de Alianza – Lamas. Tesis de Bachiller, UNT. 37.

(44) 29.. SAKAMOTO, H.; GOBBO-NETO, L.; CAVALHEIRO, A. (2005). Quantitative HPLC analysis of sesquiterpene lactones and determination of chemotypes in Eremanthus seidelii macleish & schumacher (asteraceae). Journal Brazilian Chemical Society. 16, 1396-1401.. 30.. SACHS J, MALANEY P. (2002). The Economic and Social Burden of Malaria. Nature; 415: 680-5.. 31.. SCHLICHTHERLE M, WAHLGREN M, PERLMANN, SCHERF A. (2000). Methods in malaria research. (3º ed.) Virginia: Malaria Research and Refernece Reagent Resource Center. 88p.. 32.. STEFFEN R., BEHRENS R. (2001). Travellers Malaria. Parasitoly Today 8 No.2, 61-66.. 33:. TRAGER W. y JENSEN J. (1976). Human malaria parasites in continuous culture. Science; 193:673-5.. 34.. UNDP/WORLD BANK/WHO. (1999-2000). Special Programme for Research and Training in Tropical Disease. 25 years of Progress.. 35.. UNDP/WORLD BANK/WHO. (2002). Special Programme for Research and Training in Tropical Disease.. 36.. WORLD HEALTH ORGANIZATION. (2007). The safety and efficacy of antimalarial therapy with artemisinin compounds in pregnancy. Special programme for research and training in tropical disease (TDR). WHO/CDS/MAL/20903-1094. France. 07.1: 11-19.. 37.. WORLD HEALTH ORGANIZATION. (2008). Global malaria control and elimination. Report of a meeting on containment of artemisinin tolerance. 19 January, 2008. (Monografia internet). WHO. Geneva,. 38.

(45) Switzerland.. (Acceso. 24. de. Enero. 2009).. Disponible. en:. http:www.who.intmalaria.docscdrugresistance malaria genotyping. 38.. WORLD HEALTH ORGANIZATION. (2008). Guidelines for the treatment of malaria. 19 January. (Monografia internet). WHO. Geneva, Switzerland. WHO/HTM/MAL/. (Acceso 24 de Enero 2009). Disponible en: http:www.who.intmalaria.doc drugresistancemalaria.. 39.. WORLD HEALTH ORGANIZATION. (2008). Containmente of malaria Multi-drug Resistence on the Cambodia-Thailand border. Report of an informal consultation Phnom Penh, 29-30 January. (Monografia internet). WHO. Geneva, Switzerland. WHO/HTM/MAL/. (Acceso 27 de Enero 2009). Disponible en: http:www.who.intmalaria.docdrug resistancemalaria.pdf.. 40.. WORLD. HEALTH. ORGANIZATION.. (2001).. Antimalarial. drug. combination therapy. (Monografia internet). WHO. Geneva, Switzerland. WHO.. (Acceso. 10. de. Enero. http://www.who.intmalaria.rbm. Who. Int.. 39. 2008).. Disponible. en:.

(46) ANEXOS. 40.

(47) Anexo 1: Microfotografia con presencia de Trofozoitos de Plasmodium vivax en medio Waymouth MB 752/1, Blanco, a las 72 horas a 1000 A.. Gametocitos squizonte. Anexo 2: Microfotografia con presencia de trofozoitos y gametocitos de P. falciparum en medio Waymouth MB 752/1, Blanco, a las 72 horas a 1000 A.. 41.

(48) Anexo 3: Administración de la droga extracto acetato de etilo 50 mg/mL, por via oral a especimenes Aotus nancimae.. Anexo 4: Administración de la droga 50 mg/mL de extracto acetato de etilo, por via intramuscular a especímenes Aotus nancimae.. 42.

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Figure

Tabla 1:  Metabolitos secundarios encontrados en extractos de hojas de Artemisia absinthium “ajenjo”, identificadas   con reacciones de coloración
Tabla 2:  Porcentaje de parasitemia encontradas en los cultivos blanco y experimental después del tratamiento con los extractos de Artemisia absinthium  a concentraciones de 10 y 100   g/mL en cultivos de  Plasmodium
Tabla 3:  Porcentaje de inhibición (PI) de la parasitemia por cada extracto de Artemisia absinthium a las concentraciones   de 10 y 100   g/mL, en cultivos de P
Tabla 4:  Relación entre porcentaje de inhibición de crecimiento y el tipo de actividad antiplasmodium de los extractos de Artemisia absinthium a las  concentraciones de 10 y 100 ug/mL aplicadas a cultivos de  P
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