Producción de ácido gálico por Aspergillus niger a partir de Caesalpinia spinosa ‘‘tara” utilizando un biorreactor en estado sólido

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA DE POSGRADO. RA. DO. -U. NT. UNIDAD DE POSGRADO DE INGENIERIA QUIMICA. PO SG. Producción de ácido gálico por Aspergillus niger a partir de Caesalpinia spinosa ‘‘tara” utilizando un biorreactor. Tesis. TE CA. DE. en estado sólido. para optar el grado académico de. BL IO. maestro en Ingeniería Química Ambiental. Br. Blas Roeder, Willian Antonio. BI. Autor:. Asesor:. Dr. Robles Castillo, Heber Max. Trujillo – Perú 2019 Nro. Registro: _____________. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. JURADO DICTAMINADOR. Dr. Luis Orlando Moncada Albitres. PO SG. RA. DO. -U. NT. PRESIDENTE. Ms. Jorge Mendoza Bobadilla. BI. BL IO. TE CA. DE. SECRETARIO. Dr. Heber Max Robles Castillo Asesor. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. A mis queridos padres Virginia y Willian, por su amor, paciencia y. BI. BL IO. TE CA. DE. PO SG. RA. DO. -U. NT. comprensión.. A la memoria de mi abuelo Genaro Blas Rodríguez, por haberme brindado sus sabios consejos. A mi abuela Bertha con todo cariño a mi hermana Charito y a mí querida tía Mónica.. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTO. Al Asesor de mi Tesis, Dr. Heber Robles Castillo; por su valioso apoyo y orientación brindada en la realización de la presente investigación.. NT. Al Dr. Juan Wilson Klug, por la donación de la cepa de Aspergillus niger A los profesores, Gina Zavaleta Espejo y Juan Pedro Huamán de la Facultad de Ciencias. DO. -U. Biológicas, por haberme ayudado a cumplir los objetivos planteados. Al Lic.Adm. Wilbbert Valdemar Vigo Alfaro, por su apoyo en las actividades realizadas en el. BI. BL IO. TE CA. DE. PO SG. RA. presente trabajo.. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. Señores Miembros del Jurado Dictaminador:. Dando cumplimiento con lo dispuesto en el Reglamento de la Escuela de Postgrado de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo en consideración el presente informe de tesis. -U. NT. titulada:. DO. Producción de ácido gálico por Aspergillus niger a partir de Caesalpinia spinosa ‘‘tara”. RA. utilizando un biorreactor en estado sólido, para obtener el grado académico de Maestro. PO SG. en Ingeniería Química Ambiental.. Br. Willian Antonio Blas Roeder. BI. BL IO. TE CA. para vuestra aprobación.. DE. El mismo que dejo a su criterio para su dictamen, esperando reunir los requisitos necesarios. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE Pág. ………………………………………………………... ii. Dedicatoria. ………………………………………………………... iii. Agradecimiento. ………………………………………………………... iv. Presentación. ………………………………………………………... v. Índice. ………………………………………………………... vi. Índice de tablas. ………………………………………………………... viii. Índice de figuras. ………………………………………………………... Resumen. ………………………………………………………... xii. Abstract. ………………………………………………………... xiii. RA. DO. -U. NT. Jurado Dictaminador. x. Introducción. ………………………………………………... II.. Material y Métodos. ………………………………………………... 6. 2.1.. Objetivo de estudio ………………………………………………... 6. 2.2.. Métodos y Técnicas ………………………………………………... 6. DE. PO SG. I.. 1. TE CA. 2.2.1 Obtención del sustrato a partir de Caesalpinia spinosa “tara”. ………………………………………………... 6. ……….... 6. ……………………………….... 7. …………………. 7. 2.2.5. Producción de ácido gálico …………………………………. 8. ………………………….. 8. 2.2.7. Diseño Experimental …………………………………………. 8. 2.2.8. Análisis Estadístico …………………………………………. 9. 2.2.2 Reactivación de la Cepa de Aspergillus niger. BL IO. 2.2.3 Preparación del inóculo. BI. 2.2.4 Construcción de los biorreactores FES. 2.2.6. Cuantificación del ácido gálico. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Resultados. ………………………………………………... 10. IV.. Discusión. ………………………………………………... 18. V.. Conclusiones. ………………………………………………... 21. VI.. Recomendaciones. ………………………………………………... 22. VII.. Referencias Bibliográficas ………………………………………………... 23. NT. III.. …………………….………………………………………………... 28. ANEXO 2. …………………….………………………………………………... 29. ANEXO 3. …………………….………………………………………………... 30. ANEXO 4. …………………….………………………………………………... 31. ANEXO 5. …………………….………………………………………………... 32. ANEXO 6. …………………….………………………………………………... ANEXO 7. …………………….………………………………………………... 34. ANEXO 8. …………………….………………………………………………... 35. …………………….………………………………………………... 36. DO. RA. PO SG. DE. TE CA. BL IO. 33. BI. ANEXO 9. -U. ANEXO 1. ANEXO 10. …………………….………………………………………………... 37. ANEXO 11. …………………….………………………………………………... 38. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE DE TABLAS. Tabla 1.. Absorbancias promedio (700 nm) del extracto fermentativo. 10. de Caesalpinia spinosa obtenida por Aspergillus niger utilizando un biorreactor en estado sólido a diferentes. -U. Concentración promedio del ácido gálico (mg/ml) y. 11. DO. Tabla 2.. NT. tiempos de exposición.. coeficiente de variación del extracto fermentativo de. RA. Caesalpinia spinosa obtenida por Aspergillus niger. PO SG. utilizando un biorreactor en estado sólido a diferentes tiempos de exposición. Porcentaje del ácido gálico producido a partir de la. DE. Tabla 3.. 15. TE CA. fermentación de Caesalpinia spinosa obtenida por Aspergillus niger utilizando un biorreactor en estado sólido. Análisis de varianza de la producción de ácido gálico. 16. BI. Tabla 4.. BL IO. a diferentes tiempos de exposición.. (mg/ml.) obtenida a partir de la fermentación de Caesalpinia spinosa obtenida por Aspergillus niger utilizando un biorreactor en estado sólido a diferentes tiempos de exposición.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 5.. Comparación de promedios de Duncan para la producción. 17. de ácido gálico (mg/ml) obtenida a partir de la fermentación de Caesalpinia spinosa obtenida por Aspergillus niger utilizando un biorreactor en estado sólido a diferentes tiempos de exposición. Cuantificación de ácido gálico proporcionado por el. Esquema del Diseño Experimental Completamente al Azar. DO. Tabla 7.. -U. espectrofotómetro para cada muestra y triplicado. 39. BI. BL IO. TE CA. DE. PO SG. RA. (DECA). 38. NT. Tabla 6.. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE DE FIGURAS. Figura 1.. Curva de producción del ácido gálico (mg/ml) según las. 12. absorbancias (700 nm) obtenida del extracto fermentativo de Caesalpinia spinosa obtenida por Aspergillus niger. Figura 2.. -U. DO. seis días de exposición (Primera repetición).. NT. utilizando un biorreactor en estado sólido a los dos, cuatro y. Curva de producción del ácido gálico (mg/ml.) según las. 13. RA. absorbancias (700 nm) obtenida del extracto fermentativo de. PO SG. Caesalpinia spinosa obtenida por Aspergillus niger utilizando un biorreactor en estado sólido a los dos, cuatro y. Curva de producción del ácido gálico (mg/ml.) según las. 14. TE CA. Figura 3.. DE. seis días de exposición (Segunda repetición). absorbancias (700 nm) obtenida del extracto fermentativo de. BL IO. Caesalpinia spinosa obtenida por Aspergillus niger utilizando un biorreactor en estado sólido a los dos, cuatro y. BI. seis días de exposición (Tercera repetición). Figura 4.. Caesalpinia spinosa “tara” recolectada del Jardín Botánico. 29. de la Universidad Nacional de Trujillo. Certificada por el Herbarium Truxillente. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 5.. Cepa. de Aspergillus niger,. proporcionada por el. 30. Laboratorio de Micología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo. Sustrato seco de “tara” después de la exposición a 40°C por. Figura 6.. 31. 36 horas 32. Preparación de inoculo de Aspergillus niger. Figura 9.. Mezcla del inoculo de Aspergillus niger y el sustrato de. 34. 35. RA. Figura 8.. PO SG. DO. cultivo Sabourou a temperatura ambiente. NT. Colonias de Aspergillus niger reactivadas en un medio de. -U. Figura 7.. Caesalpinia spinosa. Biorreactores para la fermentación en estado sólido, antes de. DE. Figura 10.. 33. iniciar el proceso, bajo condiciones de aireación húmeda con. Producto de la fermentación: (A) Fermento en estado sólido. 36. BL IO. Figura 12.. TE CA. solución salina fisiológica. (B) Mezclado y triturado (C) Compresión (D) Extracto. BI. fermentativo. Figura 13.. (A) Muestras producto de la fermentación, antes de la. 37. lectura espectrofotométrica (B) Espectrofotómetro UV-Vis, con lector de microplacas Marca Fisher Scientific. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN. En el presente trabajo de investigación, se logró producir ácido gálico por acción de las enzimas hidrolíticas de Aspergillus niger que degradan los taninos presentes en Caesalpinia spinosa “tara”, utilizando un biorreactor en estado sólido. Las fermentaciones se llevaron a. NT. cabo por 2, 4 y 6 días a temperatura ambiente, con un pH inicial de 7.0 y un inóculo. -U. microbiano de 109 / ml. La producción máxima se obtuvo a los 4 días después del proceso. DO. fermentativo con una pureza del 28.71% de ácido gálico, según las lecturas proporcionadas. RA. por el espectrofotómetro UV-Vis con lector de micro placas. Según el análisis estadístico,. PO SG. los diferentes tiempos de exposición presentan diferencias significativas. Se determinó que. DE. existe una relación directa entre el tiempo de fermentación y la absorbancia.. TE CA. Palabras clave: Acido gálico, Aspergillus niger, Caesalpinia spinosa, biorreactor, estado. BI. BL IO. sólido. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. In the present research work, it was possible to produce gallic acid by the action of the. NT. hydrolytic enzymes of Aspergillus niger that degrade the tannins present in Caesalpinia. -U. spinosa “tara”, using a solid state bioreactor. The fermentations were carried out for 2, 4 and. DO. 6 days at room temperature, with an initial pH of 7.0 and a microbial inoculum of 10 9 / ml. The maximum production was obtained 4 days after the fermentation process with a purity. RA. of 28.71% gallic acid, according to the readings provided by the UV-Vis spectrophotometer. PO SG. with microplate reader. According to the statistical analysis, the different exposure times present significant differences. It was determined that there is a direct relationship between. TE CA. DE. fermentation time and absorbance.. BI. BL IO. Keywords: Gallic acid, Aspergillus niger, Caesalpinia spinosa, bioreactor, solid state. xiii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN Caesalpinia spinosa ‘‘tara” es un vegetal perteneciente a la familia Caesalpiniaceae, oriunda del Perú. Esta planta ha sido utilizada desde la época pre hispánica en medicina tradicional y recientemente en la industria peletera y la producción de goma (De la Cruz, 2004). Nuestro país posee la mayor área de bosques de tara, con 80% de la producción. -U. m.s.n.m. de Cajamarca, Ayacucho y La Libertad (Añanca, 2009).. NT. mundial, la misma que se encuentra en los valles interandinos secos entre 1000 y 3100. DO. La vaina de C. spinosa representa el 62% del peso de los frutos y contiene la mayor. RA. concentración de taninos que se utilizan en la industria, principalmente en la fabricación de. PO SG. plásticos y adhesivos, galvanizados, anticorrosivos, clarificador de vinos, como sustituto de la malta en la producción de cerveza, en la industria farmacéutica por su amplio uso. DE. terapéutico, pero quizás su empleo más importante en la curtiembres, por su capacidad de transformar la estructura dérmica en cuero, al formar enlaces de hidrógeno entre los grupos. TE CA. hidroxilos, fenólicos de los taninos y los grupos pépticos de las regiones amorfas del. BL IO. colágeno (Huarino y Ramos, 2012).. Otro elemento que se obtiene de los taninos de C. spinosa es el ácido gálico (3,4,5-. BI. Trihidroxibenzoico), un polifenol perteneciente al grupo de los taninos hidrolizables, el cual presenta propiedades antimicrobianas y anticancerígenas por su gran capacidad antioxidante, que le permite atrapar fácilmente radicales libres. Esta sustancia orgánica se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza y cuya extracción se realiza por hidrolisis química o enzimática (Añanca, 2009; Botella, 2002).. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El ácido gálico se produce por hidrolisis ácida a partir del ácido tánico, pero problemas de costos relacionados a su bajo rendimiento y pureza ha ocasionado la búsqueda de nuevas alternativas, como es la utilización de las tanasas procedentes de microorganismos. La producción microbiana de tanasas, sobre todo de hongos está bien documentada (Bajpai y Patil, 2008). NT. La tanino acil hidrolasa comúnmente conocida como tanasa, es una de las enzimas. -U. hidroliticas microbianas más importantes, que fue accidentalmente descubiertas por Van. DO. Teighem (1867), quien logró demostrar la formación de ácido gálico durante la fermentación. RA. de taninos por Aspergillus niger (Aboubakr et al., 2013;Treniño et al., 2007).. PO SG. Actualmente se han desarrollado varios sistemas de fermentación para la producción de enzimas procedentes de hongos, entre los cuales se puede mencionar a la fermentación superficial líquida, fermentación sumergida y la fermentación estado sólido (Santis, 2013;. TE CA. DE. Fernández, 2012).. La fermentación estado sólido (FES), consiste en hacer crecer un microorganismo. BL IO. sobre un sustrato, empleando una fuente de nitrógeno y nutrientes minerales bajo ciertas condiciones de humedad, pH, aireación y temperatura. La FES no presenta agua libre en su. BI. estructura, pero existe requerimiento de humedad (Borras et al., 2015).. En los últimos años, el proceso de fermentación sobre sustrato sólido ha recibido gran atención por parte del mundo científico, resultado de ello se han realizado muchas investigaciones para su aplicación en la obtención de enzimas, colorantes, ácidos orgánicos y otras sustancias de interés para la industria de alimentos (Moyano, 2014). Este proceso es capaz de brindar altos rendimientos de conversión de sustrato a producto, con menores costos de inversión y producción comparado con el proceso de fermentación sumergida 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. tradicional. Adicionalmente es una alternativa para el aprovechamiento de desperdicios o subproductos de la agroindustria, ya que la mayoría de sustratos utilizados surgen de ellos (Banerjee et al., 2015).. La FES usa sustratos naturales que sirven como fuentes de nutrientes y soporte físico para los microorganismos, el bajo contenido de humedad restringe que un grupo determinado. NT. de microbios puedan desarrollarse, principalmente levaduras y hongos. La FES involucra. -U. específicamente el cultivo de hongos filamentosos, porque estos presentan ciertas. RA. especie Aspergillus niger (Belmares et al., 2003).. DO. características que los hacen más adecuados para su crecimiento, particularmente de la. PO SG. A. niger, se caracteriza por desarrollarse rápidamente y excretar una gran cantidad de enzimas en un medio fermentativo sólido, además su crecimiento en forma de micelio facilita la separación y extracción del producto. Los productos son en muchos casos ácidos. DE. orgánicos que son utilizados como aditivos alimenticios con función preservante, siendo el. TE CA. ácido cítrico uno de los más utilizados a nivel mundial (Aissam et al., 2005).. BL IO. Diversos estudios demuestran que la producción de ácidos orgánicos por biosíntesis depende de gran medida de la cepa microbiana, así como las condiciones de operación del. BI. proceso. Se ha observado que el nivel de oxígeno en el fermentador es un parámetro clave de producción por FES. Se han realizado investigaciones de la influencia de aireación forzada en este sistema, y se ha concluido que la producción de ácidos orgánicos a partir de A. niger se ve favorecida por una limitada producción de biomasa que ocurre cuando se aplican bajas velocidades de aireación y en consecuencia menor disponibilidad de oxígeno (Parzanese, 2015).. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los procesos de FES se pueden llevar a cabo por varios tipos de biorreactores, los que presentan características determinadas para ciertos fines, y cuyo diseño depende del tipo de proceso. El diseño de un biorreactor para FES presenta ciertos inconvenientes, como la resistencia a la transferencia de cantidad de movimiento, la aparición de gradiente de calor y la concentración de gases en la capa media. Así mismo en estos procesos es difícil comparar parámetros de pH, temperatura, biomasa, humedad. Para superar estas dificultades. NT. se han utilizado sistemas de aireación y agitación, sin embargo se ha logrado afectar. -U. negativamente a la porosidad del medio interrumpiendo el crecimiento de los hongos. DO. filamentosos (Parzanese, 2015; Aboubakr, 2012).. RA. Se han reportado algunos trabajos relacionados tales es el caso de Borras et al.. PO SG. (2015); quienes realizaron estudios en FES como una alternativa biotecnológica para la producción de alimentos no convencionales. Parzanese (2015); hizo estudios de. DE. fermentación en estado sólido, aprovechando los subproductos de la agroindustria empleado. TE CA. Aspergillus niger sobre distintos sustratos. Reyes et al. (2103); analizaron el metabolismo de Aspergillus niger sobre un sustrato sólido utilizando diferentes fuentes de carbono. Aboubakr et al. (2012); aislaron y optimizaron la producción de tanasas de Aspergillus. BL IO. niger. Fernández (2012); trabajó en la producción de xilanasas por cepas de Aspergillus. BI. niger en un cultivo sólido, utilizando como sustrato salvado de avena y trigo. Bajpai y Patil (2008); propusieron un protocolo para la producción de ácido gálico empleando ácido tánico por absorción de Apergillus Fischeri. Aissam et al. (2005); trabajaron en la producción de tanasas por Aspergillus niger HA37. García et al. (2002); obtuvieron ácido gálico a partir de Aspergillus niger en un cultivo sumergido.. Para realizar los procesos de cuantificación de metabolitos secundarios de vegetales, es necesario aplicar operaciones unitarias como; el secado, la molienda, el tamizado, 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. extracción y filtración. El secado favorece la conservación adecuada del material, que consiste en eliminar el agua de su constitución sin deterioro de la calidad, no permitiendo la degradación causada por enzimas de microorganismos y reacciones de oxidación. La molienda se utiliza para homogenizar el tamaño de partículas, aumentando la superficie de contacto. En ocasiones solo interesa obtener partículas con dimensiones determinadas, para ello se trabaja con una serie de tamices de cascada de luz de malla decreciente, logrando. -U. NT. separar las mismas. (Pérez y Pisconte, 2010). DO. La cuantificación de taninos en productos naturales, se realiza mediante análisis volumétrico, colorimétrico, cromatografía liquida de alta resolución y el método de. RA. espectrofotometría ultravioleta de luz visible. Este último permite cuantificar taninos,. PO SG. manteniendo la confiabilidad de los resultados. (Pérez y Pisconte, 2010). Teniendo en cuenta la gran importancia comercial del ácido gálico, la utilización de. DE. Caesalpinia spinosa como fuente de taninos, la capacidad de Aspergillus niger para. TE CA. producir tanasas y el conocimiento de biorreactores para FES. La presente investigación tiene por finalidad determinar la producción de ácido gálico por Aspergillus niger a partir Así como. BL IO. de Caesalpinia spinosa “tara” utilizando un biorreactor en estado sólido.. establecer la relación entre el tiempo de fermentación y la absorbancia y evaluar la. BI. producción de ácido gálico con respecto al tiempo de exposición en un biorreactor para la fermentación en estado sólido.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIAL Y MÉTODOS 2.1.. Objeto de estudio . Caesalpinia spinosa “tara”, recolectada del Jardín Botánico de la Universidad Nacional de Trujillo (Anexo 1).. . Cepa de Aspergillus niger, proporcionada por el Laboratorio de Micología de la. NT. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo (Anexo. DO. Métodos y Técnicas. RA. 2.2.. -U. 2).. PO SG. 2.2.1. Obtención del sustrato a partir de Caesalpinia spinosa “tara” Se obtuvo 6 kg de vainas secas “tara” sin manchas oscuras. Luego se procedió. DE. a extraer las semillas para su posterior eliminación. Las cáscaras de las vainas se colocaron en un horno a una temperatura de 40°C por un periodo de 36. TE CA. horas, con la finalidad de eliminar en forma eficiente la humedad. Se procedió a moler las muestras secas utilizando un mortero hasta conseguir un. BL IO. pulverizado homogéneo, el mismo que fue tamizado y esterilizado. De ello se. BI. tomaron 500 g para cada uno de los biorreactores (Cholán, 2016) (Anexo 3).. 2.2.2. Reactivación de la Cepa de Aspergillus niger La reactivación de la cepa de Aspergillus niger, se llevó a cabo haciéndola crecer hasta la esporulación, en un tubo de ensayo con medio de cultivo sólido de agar sabourou, a temperatura ambiente por cinco días hasta su crecimiento.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Se conservó en refrigeración a 4°C, obteniendo la cepa viable (Reyes et al., 2013) (Anexo 4). 2.2.3. Preparación del inóculo Las esporas de A. niger, fueron separadas de la superficie de las colonias contenidas en dos placas petri, utilizando 30 ml de agua destilada estéril, y se. NT. trasladó a un Baker aforando hasta 600 ml con el mismo disolvente, luego se. -U. agregó 5 ml de una solución de Tween 0.1% (v/v) hasta obtener la suspensión. DO. (Triviño et al., 2007) (Anexo 5). RA. 2.2.4. Construcción de los biorreactores FES. PO SG. Para la construcción de los biorreactores se utilizó nueve botellas plásticas transparentes de 3 litros de capacidad, y en ellas se colocaron 500 g del. DE. sustrato, producto de la molienda de las vainas secas de la “tara”, más 200 ml. TE CA. del inoculo de esporas de A. niger y 200 ml de agua destilada estéril, mezclando hasta una pasta homogénea (Anexo 6). Los biorreactores fueron. BL IO. acondicionados con un sistema de aireación húmeda, con solución salina fisiológica utilizando bombas a 0.5 vvm. Los biorreactores se colocaron en el. BI. laboratorio a temperatura ambiente y fueron herméticamente sellados, dejando un orificio para la salida de CO2 (Moyano, 2015). Se tomaron datos de pH y temperatura durante todo el proceso (Anexo 7).. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.5. Producción de ácido gálico Después de 2, 4 y 6 días, se extrajo de cada biorreactor el fermento en estado sólido para la extracción del ácido gálico. Se agregó 500 mL de agua destilada estéril para disolver los grumos formados durante el bioproceso, la misma que se realizó por trituración en una fuente plástica y luego por compresión. NT. manualmente, utilizando tela de tocuyo previamente humedecida. En un. -U. baker se recepcionó el extracto para luego ser depositados en botellas de vidrio, para su posterior centrifugación a 3000 rpm por 15 minutos (Anexo. DO. 8). El extracto se mantuvo en refrigeración a 4°C hasta su cuantificación, las. RA. mismas que se realizó en el laboratorio multifuncional de la Facultad de. PO SG. Farmacia y Bioquímica, utilizando el espectrofotómetro UV-Vis con lector de microplacas de Marca Fisher Scientific (Banerjee et al., 2005) (Anexo 9).. DE. 2.2.6. Cuantificación del ácido gálico. TE CA. La cuantificación de la producción de Acido Gálico (mg/mL), se utilizó el método de Folin – Ciocalteu empleando el espectrofotómetro UV-Vis por. BL IO. triplicado, empleado un mL de la muestra por cada biorreactor según el. BI. tiempo establecido. (Banerjee et al., 2005) (Anexo 10).. 2.2.7. Diseño experimental El presente estudio se ajusta a un Diseño Experimental completamente al azar (DECA), donde los tratamientos son los diferentes tiempos de fermentación (2, 4 y 6 días) para la producción de ácido gálico, los mismos que tuvieron 3 repeticiones y cada repetición estuvo constituida por 3 biorreactores FES. Así mismo las unidades experimentales fueron representadas por los valores. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. promedio de la producción de ácido gálico en cada repetición por tratamiento (Díaz, 2009). (Anexo 11) 2.2.8. Análisis estadístico Los datos obtenidos en la producción de ácido gálico por Aspergillus niger a partir de Caesalpinia spinosa “tara”, utilizando un biorreactor para. NT. fermentación estado sólido, fueron organizados en tablas y se aplicaron los. -U. métodos estadísticos de Análisis de Varianza y la prueba de Comparación. DO. Múltiple de Medias descritas por Duncan, con una probabilidad de error de. RA. 0.05 (5%), según, Díaz (2009). Los métodos estadísticos se procesaron en el. BI. BL IO. TE CA. DE. PO SG. programa Statgraphic Plus versión 5.1. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III. RESULTADOS Tabla 1.. Absorbancias promedio (700 nm) del extracto fermentativo de Caesalpinia spinosa obtenida por Aspergillus niger utilizando un biorreactor en estado sólido a diferentes tiempos de exposición.. DE. I-4. PO SG. III-2. TE CA. II-4. I-6. BI. BL IO. III-4. II-6. III-6. 0.895. RA. II-2. 0.408. -U. I-2. 0.413 0.404 0.407 0.297 0.302 0.296 0.275 0.286 0.291 0.764 0.779 0.777 0.599 0.587 0.591 0.476 0.473 0.497 0.389 0.393 0.393 0.490 0.520 0.506 0.295 0.307 0.305. NT. Absorbancia Promedio. DO. Tiempo de exposición (días). 0.284. 0.773. 0.592. 0.482. 0.392. 0.505. 0.302. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 2.. Concentración promedio del ácido gálico (mg/ml) y coeficiente de variación del extracto fermentativo de Caesalpinia spinosa obtenida por Aspergillus niger utilizando un biorreactor en estado sólido a diferentes tiempos de exposición. mgEAG/mL Promedio. TE CA. II-4. DE. I-4. BL IO. III-4. BI. I-6. II-6. III-6. NT 1.03. 2.94. 237.08. 1.00. 230.06. 1.00. 287.14. 2.71. 137.89. 0.52. 158.67. 2.73. 177.96. 2.18. 166.84. PO SG. III-2. 122.62. -U. II-2. 0.94. 130.17. DO. I-2. 131.528 129.130 129.861 122.080 124.054 121.714 161.43 168.11 170.97 234.378 238.794 238.063 232.548 227.978 229.660 283.65 281.71 296.05 137.057 138.312 138.312 154.250 162.906 158.842 173.52 180.69 179.66. CV %. RA. Tiempo de exposición (días). 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 300 y = 274.83x + 24.281 R² = 0.9895. 200. NT. 150. 100. -U. Acido Gálico (mg/ml). 250. 0.400. 0.500. 0.600. 0.700. RA. 0 0.300. DO. 50. 0.800. 0.900. Curva de producción del ácido gálico (mg/ml) según las absorbancias (700. DE. Figura 1.. PO SG. Absorbancia (700 nm). por. TE CA. nm) obtenida del extracto fermentativo de Caesalpinia spinosa. Aspergillus niger utilizando un biorreactor en estado sólido a los dos, cuatro. BI. BL IO. y seis días de exposición (Primera repetición).. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 250.000 y = 330.64x + 16.592 R² = 0.8348. NT. 150.000. 100.000. -U. Acido Gálico (mg/ml). 200.000. 0.300. 0.350. 0.400. 0.450. 0.500. 0.550. 0.600. PO SG. 0.000 0.250. RA. DO. 50.000. (Absorbancia (700 nm). Curva de producción del ácido gálico (mg/ml.) según las absorbancias (700. DE. Figura 2.. TE CA. nm) obtenida del extracto fermentativo de Caesalpinia spinosa. por. Aspergillus niger utilizando un biorreactor en estado sólido a los dos, cuatro. BI. BL IO. y seis días de exposición (Segunda repetición). 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 350.000 y = 607.78x - 5.8362 R² = 1. 250.000. NT. 200.000. -U. 150.000 100.000. DO. Acido Gálico (mg/ml). 300.000. 0.000 0.250. 0.300. 0.350. 0.400. RA. 50.000. 0.450. 0.500. 0.550. 0.600. Figura 3.. DE. PO SG. (Absorbancia (700 nm). Curva de producción del ácido gálico (mg/ml.) según las absorbancias (700. TE CA. nm) obtenida del extracto fermentativo de Caesalpinia spinosa. por. Aspergillus niger utilizando un biorreactor en estado sólido a los dos, cuatro. BI. BL IO. y seis días de exposición (Tercera repetición). 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 3.. Porcentaje del ácido gálico producido a partir de la fermentación de Caesalpinia spinosa obtenida por Aspergillus niger utilizando un biorreactor en estado sólido a diferentes tiempos de exposición.. Porcentaje de ácido gálico (%). I–2. 13.02. NT. Tiempos de exposición (días). I–4. -U. 23.71. RA. PO SG. II – 2. DO. I–6. 12.26 23.01. II – 6. 15.87. DE. II – 4. TE CA. III – 2. 16.68. III – 4. 28.71. III – 6. 17.80. BI. BL IO. 13.80. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 4.. Análisis de varianza de la producción de ácido gálico (mg/ml.) obtenida a partir de la fermentación de Caesalpinia spinosa por Aspergillus niger utilizando un biorreactor en estado sólido a diferentes tiempos de exposición.. Grados de libertad. Cuadrado Medio. Entre tratamientos. 214.707. 2. 107.353. Error. 38.4998. 6. 6.41663. Total. 253.207. 8. Valor-P. 16.730. 0.0035*. -U. DO. RA. P.E.1: 0.05. BI. BL IO. TE CA. DE. * Presenta diferencias significativas. Razón-F. NT. Suma de Cuadrados. PO SG. Fuente. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 5.. Comparación de promedios de Duncan para la producción de ácido gálico (mg/ml) obtenida a partir de la fermentación de Caesalpinia spinosa por Aspergillus niger utilizando un biorreactor en estado sólido a diferentes. 2 días. 13.9867. 4 días. 25.1433. 6 días. Grupos Homogéneos. NT. Promedio de ácido gálico. X. RA. DO. X. -U. Tratamiento. PO SG. tiempos de exposición.. X P.E.1: 0.05. BI. BL IO. TE CA. DE. 15.8233. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV. DISCUSIÓN. La validación de un método, es un proceso que se consigue mediante estudios de laboratorio y cuya capacidad se expresa en términos de parámetros de análisis; donde se tiene en cuenta la linealidad, precisión, reproducibilidad, exactitud, especificidad y. NT. sensibilidad, según el objetivo que se persiga. Actualmente la validación de métodos. DO. se trabaja con productos naturales (Gutiérrez et al, 2000).. -U. permiten mayor confiabilidad en los resultados experimentales, fundamentalmente cuando. RA. La espectrofotometría, se ha convertido en una herramienta muy importante para. PO SG. determinar concentraciones de ciertas sustancias, cuyo análisis se aplica según la ley Lambert – Beer. La misma que establece una proporcionalidad directa entre la absorbancia y la concentración de un metabolito secundario, cuya lecturas deben estar comprendidas de. DE. un rango que va de 0.2 y 0.8 (Pérez y Pisconte, 2010). Valores que coinciden con los. TE CA. resultados hallados, cuyas absorbancias se encuentran entre 0.275 y 0.779 (Tabla 1).. BL IO. Pérez y Pisconte (2010), determinaron concentraciones de ácido gálico a partir de taninos en frutos maduros de Caesalpinia spinosa por cuantificación espectrofotométrica,. BI. obteniendo valores que van de 0.631 a 0.648 mgEAG/ml; cantidades muy bajas a las conseguidas en esta experiencia, las que se hayan entre 122.62 y 287.14 mgEAG/ml (Tabla 2). En la misma tabla, se muestran los coeficientes de variación menores al 3% en todas las repeticiones y en cada tratamiento; lo que refleja elevada uniformidad y reproducibilidad según lo reportado por Gutiérrez et al. (2000). La curva de calibración del ácido gálico, se determinó haciendo reaccionar los compuestos fenólicos tugsto – fosfo – molíbdico más carbonato de sodio; obteniéndose así. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. una solución estándar para ácido gálico (Pérez y Pisconte, 2010). Así se consiguieron las lecturas de absorbancia, tanto para las muestras analizadas y un blanco especifico. Los resultados encontrados para las tres repeticiones dentro de cada tratamiento manifiestan un mismo patrón en relación a la concentración más alta de ácido gálico, ocurriendo a los cuatro días después del proceso fermentativo, como se observan en las. NT. figuras 1, 2 y 3; y cuyas líneas de regresión se aprecian de manera diferente a otros trabajos. -U. reportados, en los que realizaron diluciones decrecientes, manejando las respuestas de las variables deliberadamente. Es preciso señalar Aspergillus niger produce enzimas que. DO. degradan los taninos C. spinosa hasta ácido gálico, cuyo comportamiento en los diferentes. RA. tiempos de exposición en cada biorreactor no se puede manipular. En las mismas figuras se. PO SG. indica el valor del coeficiente de determinación (R 2) varía entre 0.835 y 1.0, muy similar a lo informado por Gutiérrez et al. (2000); que reportan 0.980 para el mismo estimador,. DE. corroborando el criterio de linealidad.. TE CA. Para establecer el porcentaje de ácido gálico, producto de la fermentación de C. spinosa por A. niger utilizando un biorreactor en estado sólido a los dos, cuatro y seis días. BL IO. de exposición; se utilizó la ecuación de la recta empleada en la regresión lineal en la curva de calibración, alcanzando su valor máximo de 28.75% (Tabla 3); por debajo de lo señalado. BI. por Pérez y Pisconte (2010); quienes lograron obtener 49.88% de ácido gálico. Es necesario destacar que los valores más altos se encontraron a los cuatro días después del proceso fermentativo, disminuyendo a los seis días; esto se explicaría por el comportamiento nutricional A. niger. A. niger, posee las enzimas para producir ácido gálico a partir del tanino presente en la “tara”, este mecanismo lo realiza para alimentarse, es decir, primero produce el ácido gálico y luego lo utiliza. Lo produce en la etapa trofásica, en la misma, que las enzimas de 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. producción se encuentran en un nivel máximo. Sin embargo, en la etapa idiofásica las enzimas de producción disminuyen su expresión, predominando las enzimas hidrolíticas de digestión; ocasionando que el hongo degrade poco a poco al ácido gálico, utilizándolo como fuente de carbono (Luan et al., 2010). Los distintos resultados en la producción de ácido gálico, indicado por sus promedios. NT. porcentuales fueron confirmados por el análisis de varianza (Tabla 4); el cual se constituye. -U. como un método estadístico muy riguroso, aún sobre la T-student, sin embargo también es genérico. Consecuentemente, se hizo necesario aplicar una prueba más específica, el test de. DO. comparación de promedios de Duncan; para determinar entre que tratamientos existen tales. RA. diferencias, como se muestra en la Tabla 5 (Díaz, 2009). Por lo tanto se hace necesario. PO SG. indicar que al utilizar el ANAVA de Fisher y el T-student, la presente investigación cumple con el parámetro de precisión, el mismo que incluye la repetibilidad y reproducibilidad. DE. (Pérez y Pisconte, 2010).. TE CA. En la actualidad no se han reportado trabajos similares, por lo tanto no es posible contrastar los resultados de ésta investigación con otras investigaciones. Por ello, se ha. BI. los mismos.. BL IO. creído conveniente fundamentar los resultados de los procesos para indicar la valoración de. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V. CONCLUSIONES . Se logró producir ácido gálico por Aspergillus niger a partir de Caesalpinia spinosa ‘‘tara” utilizando un biorreactor en estado sólido.. . La producción máxima de ácido gálico ocurrió a los cuatro días del proceso. Existe una relación directa entre el tiempo de fermentación y la absorbancia. BI. BL IO. TE CA. DE. PO SG. RA. DO. . -U. NT. fermentativo, con una pureza del 28.71%. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. VI. RECOMENDACIONES . Se sugiere incrementar la utilización de biorreactores de fermentación en estado sólido, para su aplicación en la obtención de metabolitos secundarios de interés en la industria y suplementos alimenticios, ya que este proceso es capaz de brindar altos rendimientos de conversión de sustrato a producto, con menores costos de inversión comparado con. NT. otros tipos de biorreactores. Por otro lado, la fermentación en estado sólido se ha. Existe la necesidad de potenciar investigaciones relacionadas con los resultados del. RA. . DO. agroindustria, los cuales se utilizan como sustratos.. -U. convertido en una alternativa para aprovechar desperdicios o subproductos de la. PO SG. presente ensayo, con la finalidad de aprovechar mejor los taninos presentes en las vainas de Caesalpinia spinosa, utilizando al hongo de Aspergillus niger como agente productor. . TE CA. ellos el ácido gálico.. DE. de enzimas hidrolíticas o “tanazas” que degradan a los taninos en varios productos, entre. Se debe desarrollar la producción de ácido gálico por ser una sustancia que presenta. BL IO. propiedades antimicrobianas y con gran capacidad antioxidante que le permite atrapar. . BI. radicales libres, evitando ciertos tipos de cáncer.. La utilización de la “tara” como fuente de taninos, la capacidad de Aspergillus niger para producir tanazas y el conocimiento de biorreactores de fermentación en estado sólido para la producción de ácido gálico, se encuentra dentro del marco de desarrollo sustentable al no producir impactos ambientales negativos, por lo cual se debe iniciar algunas estrategias que permitan implementar normas y políticas para su uso.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. VII. RERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. Aboubakr, H., M. El-Sahn y A. El-Banna. 2012. Tannase-Producing Fungi: Isolation, Screening, Identification and Optimizing the Enzyme Production. Lambert Academic Publishing, Saarbrucken, 188.. NT. Aboubakr, H., M. El-Sahn y A. El-Banna. 2013. Some factors affecting tannase. -U. production by Aspergillus niger Van Tieghem. Brazilian Journal of Microbiology.. DO. 44 (2): 559 - 567.. RA. Aissam, H., F. Errachidi, M. Penninckx, M. Merzouki y M. Benlemlih. 2005.. PO SG. Production of tannase by Aspergillus niger HA37 growing on tannic acid and Olive Mill Waste Waters. W. J. Microbiol, Biotechnol. 21 (4): 609-614.. DE. Añanca, E. 2009. Efecto antibacteriano in vitro del extracto acuoso de vainas y. TE CA. Caesalpinia spinosa (tara) en cepas de Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes.Tesis para obtener el grado de bachiller Universidad nacional Jorge. BL IO. Basadre Grohman. Tacna- Perú. Bajpai, B. y S. Patil. 2008. A new approach to microbial production of gallic acid.. BI. Brazilian Journal of Microbiology.39 (4): 708 - 711. Banerjee, R., G. Mukherjee y K. Patra. (2005) Microbial transformation of tanninrich substrate to gallic acid through co-culture method. Bioresource Technol. 96:949 - 953.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Belmares, R., M. Reyes, J. Contreras, R. Rodríguez y C. Aguilar. 2003. Effect of carbón source on tannase production by two strains of Aspergillus niger. Mexicana de Ingeniería Química. 2: 95 - 100. Borras, l., A. Iglesias y C. Rodríguez. 2015. Fermentación en estado sólido (FES): una alternativa biotecnológica para la producción de alimentos no convencionales en. NT. cerdos. Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia. Bogotá - Colombia.. -U. Botella, C., I. De Ory, D. Cantero, C. Webb y A. Blandino.2002. Producción de. DO. enzimas hidrolíticas por Aspergillus awamori sobre orujo de uva. Universidad de. RA. Cádiz. Cádiz - España.. PO SG. Cholán, K. 2016. Efecto de extracto etanólico de Caesalpinia espinosa “tara o taya” sobre el crecimiento de Salmonella typhi y Escherichia coli en condiciones de. DE. laboratorio. Tesis para obtener el grado de maestro. Universidad Nacional de Trujillo.. TE CA. De la Cruz, P. 2004. Aprovechamiento Integral y racional de la Tara (Caesalpinia spinosa – Caesalpinia tinctoria).Revista del Instituto de Investigación FIGMMG.. BL IO. Universidad Mayor de San Marcos. Lima-Perú. 7 (4): 64 - 73. Díaz, P. 2009. Metodología de la investigación científica y bioestadística. 2da. IRL. BI. Editores. Chile. 586p. Fernández, F. 2012. Producción de xilanasas por cepas de Aspergillus niger en cultivo solido sobre salvado de avena y salvado de trigo. Universidad Autónoma de Querétaro. Querétaro - México.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. García, J., A. Medina, Y. Castro, M. Reyes, L. Prado, R. Rodríguez y C. Aguilar. 2002. Accumulation and Recovery of Gallic Acid in a Submerged Culture of Aspergillus niger Aa-20. IFT Annual Meeting, Anaheim. USA. 1-25. Gutiérrez, Y., M. Miranda, N. Varona y A. Rodríguez. 2000. Valoración de dos métodos espectrofotométrico para la cuantificación de taninos y flavonoides (quersentina) en Psdium guajaba, L. Revista Cubana de Farmacia. Instituto de. -U. NT. Farmacia y Alimentos. Universidad de la Habana. 34(1); 50 – 55.. DO. Harino, M. y D. Ramos. 2012. Efecto antibacteriano de Caesalpinia spinosa (Tara). RA. sobre flora salival mixta. Odontología Sanmarquina. Lima – Perú. 15 (1): 27-30.. PO SG. Luna, M., Y. Lozada y A. Trigos. 2010. Aislamiento de cepas de Aspergillus niger productoras de ocratoxinas en café verde (Cofea arábica) almacenado. Revista. DE. mexicana de micología. 32: 63-68.. TE CA. Moyano, M. 2014. Fermentación en estado sólido (FES) de la papa (solanum tuberosum), como alternativa tecnológica para la alimentación animal. Universidad. BL IO. Nacional Abierta y a Distancia. Bogotá - Colombia. Parzanese, M. 2015. Fermentación en estado sólido: aprovechamiento de. BI. subproductos de la agroindustria. Tecnología para la industria de alimentos. Alimentos Argentinos. Ficha nº27. Buenos - Argentina. 1 - 13.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Pérez, L. y Z. Pisconte. 2010. Cuantificación espectrofotométrica de taninos en el fruto maduro de Caesalpinia spinosa “taya” procedente del distrito del Porvenir – Trujillo. Tesis para optar el grado de bachiller. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad Nacional de Trujillo.. Reyes, I., M. Gonzales y I. López. 2013. Un análisis del metabolismo de Aspergillus. NT. niger creciendo sobre un sustrato sólido. Revista Mexicana de Ingeniería Química.12. DO. -U. (1): 41-56.. RA. Santis, A. 2013. Estudio de la producción de lipasas por fermentación en estado. PO SG. sólido a partir de residuos ricos en grasas. Impacto ambiental y posibles usos. Universidad autónoma de Barcelona. Barcelona - España.. DE. Treviño, l., E. Contreras, R. Rodríguez y N. Aguilar. 2007. Effects of polyurethane. TE CA. matrices on fungal tannase and gallic acid production under solid-state culture.. BI. BL IO. Journal of Zhejiang University Science B.8 (10): 771 - 776.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) DO. -U. NT. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI. BL IO. TE CA. DE. PO SG. RA. ANEXOS. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI. BL IO. TE CA. DE. PO SG. RA. DO. -U. NT. ANEXO 1. Figura 4.. Caesalpinia spinosa “tara” recolectada del Jardín Botánico de la Universidad Nacional de Trujillo. Certificada por el Herbarium Truxillente. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Cepa de Aspergillus niger, proporcionada por el Laboratorio de Micología de. BI. Figura 5.. BL IO. TE CA. DE. PO SG. RA. DO. -U. NT. ANEXO 2. la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI. BL IO TE. CA. DE. PO SG. RA. DO. -U. NT. ANEXO 3. Figura 6.. Sustrato seco de “tara” después de la exposición a 40°C por 36 horas. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(44) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI. BL IO TE. CA. DE. PO SG. RA. DO. -U. NT. ANEXO 4. Figura 7.. Colonias de Aspergillus niger reactivadas en un medio de cultivo Sabourou a temperatura ambiente. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(45) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI. BL IO TE. CA. DE. PO SG. RA. DO. -U. NT. ANEXO 5. Figura 8.. Preparación de inoculo de Aspergillus niger. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(46) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI. BL IO TE. CA. DE. PO SG. RA. DO. -U. NT. ANEXO 6. Figura 9.. Mezcla del inoculo de Aspergillus niger y el sustrato de Caesalpinia spinosa 33. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(47) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI. BL IO TE. CA. DE. PO SG. RA. DO. -U. NT. ANEXO 7. Figura 10.. Biorreactores para la fermentación en estado sólido, antes de iniciar el proceso, bajo condiciones de aireación húmeda con solución salina fisiológica. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(48) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ANEXO 8 B. PO SG. RA. DO. -U. NT. A. C. BI. BL IO TE. CA. DE. D. Figura 12.. Producto de la fermentación: (A) Fermento en estado sólido (B) Mezclado y triturado (C) Compresión (D) Extracto fermentativo. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(49) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ANEXO 9. RA. DO. -U. NT. A. BI. BL IO TE. CA. DE. PO SG. B. Figura 13.. (A) Muestras producto de la fermentación, antes de la lectura espectrofotométrica (B) Espectrofotómetro UV-Vis, con lector de microplacas marca Fisher Scientific. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(50) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ANEXO 10 Tabla 6.. Cuantificación de ácido gálico proporcionado por el espectrofotómetro para cada muestra por triplicado. II-4 días. BL IO TE. CA. I-6 días. II-6 días. -U. NT. Desv Estandar. 130.17. 1.23. 1.26. 237.08. 2.37. 230.06. 2.31. 137.89. 0.72. 158.67. 4.33. 122.62. RA. I-4 días. 131.528 129.130 129.861 122.080 124.054 121.714 234.378 238.794 238.063 232.548 227.978 229.660 137.057 138.312 138.312 154.250 162.906 158.842. PO SG. II-2 días. DE. I-2 días. 0.413 0.404 0.407 0.297 0.302 0.296 0.764 0.779 0.777 0.599 0.587 0.591 0.389 0.393 0.393 0.490 0.520 0.506. Promedio. DO. MUESTRA Absorbancia mgEAG/mL. Tercera Repetición. BI. MUESTRA Absorbancia mgEAG/mL III-2 días. III-4 días. III-6 días. 0.2752 0.2862 0.2909 0.4763 0.4731 0.4967 0.2951 0.3069 0.3052. 161.43 168.11 170.97 283.65 281.71 296.05 173.52 180.69 179.66. Promedio. Desv Estandar. 166.84. 4.90. 287.14. 7.78. 177.96. 3.88. 37 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(51) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ANEXO 11. Esquema del Diseño Experimental Completamente al Azar (DECA). -U. NT. Tabla 7.. Tratamientos Repeticiones. T3 06 días _ X1. _ X2. _ X2. _ X2. _ X3. _ X3. _ X3. DO. T2 04 días _ X1. RA. T1 02 días _ X1. PO SG. R1 R2. DE. R3. BI. BL IO TE. CA. _ X1,2,3 : Unidades Experimentales. 38 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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