Actividad antibiótica y antioxidante de fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. AC. IA. Tesis II. RM. Actividad antibiótica y antioxidante de fracciones del extracto. FA. crudo de Marivirga lumbricoides. CA. DE. PARA OPTAR EL GRADO DE BACHILLER EN. BI BL. IO. TE. FARMACIA Y BIOQUIMICA. AUTORA: CARRION ZAVALETA, Terecita Elizabeth. ASESOR: Mg. GANOZA YUPANQUI, Mayar Luis. TRUJILLO – PERÚ 2019. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA A Dios, por ser la fuente de energía infinita y equilibrio en la naturaleza, aquella motivación en momentos de mayor dificultad.. A mi madre la Sra. Eva Dorliza Zavaleta Rodríguez, por su amor, trabajo y sacrificio. IC A. en todos estos años, gracias a ti he logrado llegar hasta aquí́ y convertirme en lo que. BI. O. Q. UI M. soy.. IA. Y. A toda mi familia en especial a mi abuelita Teresa porque con sus oraciones, consejos. AC. y palabras de aliento hicieron de mí una mejor persona y de una u otra forma me. DE. FA. RM. acompañan en todos mis sueños y metas.. CA. A todo el equipo de investigación de la Facultad de Farmacia y Bioquímica porque con. profesional de la carrera. BI BL. IO. TE. ellos aprendí el trabajo en equipo y me ayudaron a desenvolverme más en el campo. A mis amigos de la universidad y al grandioso grupo humano de investigación que sea formado en el año 2018, gracias a su apoyo trabaje con empeño, dedicación y cariño, y a todos quienes contribuyeron con un granito de arena para culminar con éxito la meta propuesta.. Terecita Elizabeth Carrión Zavaleta i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTO. Quiero expresar mi más grande y sincero agradecimiento a mi asesor el profesor Mayer Luis Ganoza Yupanqui, principal colaborador durante todo este proceso, quien con su dirección, conocimiento, enseñanza y colaboración permitió́ el desarrollo de este proyecto. UI M. IC A. de investigación.. Q. Agradezco al proyecto PIBA-2-P-247-14-FONDECYT: “Biodiversidad mixobacterial. O. marina del Perú: potencial fuente de biomoléculas antibióticas contra patógenos. Y. BI. multidrogo resistentes” financiado con fondos del FONDEYCT/CONCYTEC con. AC. IA. convenio N°092-2014-FONDECYT, por el apoyo de los materiales para la culminación. RM. de la presente tesis.. FA. Finalmente quiero agradecer a los miembros del proyecto PIBA-2-P-247-14-. DE. FONDECYT: “Biodiversidad mixobacterial marina del Perú: potencial fuente de. BI BL. IO. TE. CA. biomoléculas antibióticas contra patógenos multidrogo resistentes”. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN Señores miembros del jurado dictaminador: Dando cumplimiento a lo establecido por el reglamento de trabajos de investigación de. IC A. la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, someto a. UI M. vuestra consideración y elevado criterio profesional el presente informe de Tesis II. Q. intitulado: Actividad antibiótica y antioxidante de fracciones del extracto crudo de. BI. O. Marivirga lumbricoides.. IA. Y. Es propicia esta oportunidad para manifestar mi sincero reconocimiento a mi alma máter. AC. y su plana docente; que con su capacidad y buena voluntad, contribuyen en una formación. RM. profesional sólida. Guardo a su criterio, señores miembros del jurado, la calificación del. DE. FA. presente trabajo de investigación científica.. IO. TE. CA. Trujillo, marzo de 2019. BI BL. CARRION ZAVALETA TERECITA ELIZABETH. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IC A. JURADO DICTAMINADOR. UI M. Dr. CAMPOS FLORIAN, JULIO VÍCTOR. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. PRESIDENTE. FA. _______________________________________. ASESOR. IO. TE. CA. DE. Mg. GANOZA YUPANQUI, MAYAR LUIS. BI BL. ______________________________________ Dr. QUISPE DÍAZ, IVÁN MIGUEL MIEMBRO. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN El objetivo de este trabajo de investigación fue evaluar la actividad antibiótica y antioxidante de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides aislada de origen marino. La biomasa de la bacteria se obtuvo por incubación en agar marino a 30 °C por 7 días, se empleó acetona como solvente extractor, se llevó a sequedad para obtener. IC A. el extracto crudo, se fraccionó por Sephadex LH-20, se obtuvieron fracciones que fueron. UI M. concentradas hasta extracto seco (ES), se evaluó la actividad antioxidante mediante 2,2difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH) y el ensayo ácido 2,2´-azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-. BI. O. Q. sulfónico) (ABTS) expresados en equivalentes de Trolox (ET) y la actividad antibiótica. Y. mediante el método de difusión en disco y microdilución frente a Staphyloccocus aureus. AC. IA. ATCC 25923, Staphyloccocus aureus resistente a meticilina ATCC 43300, Bacillus. RM. subtilis ATCC 6633 y Escherichia coli ATCC 25922. Se obtuvieron 3 fracciones (F1, F2. FA. y F3) con colores diferenciados, con halos de inhibición de crecimiento bacteriano entre. DE. 7,50 y 19,25 mm, con concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) y concentraciones. CA. mínimas bactericidas (CMB) entre 0,62 y 20,00 mg/mL .En la actividad antioxidante se. TE. obtuvieron valores entre 4,34 ± 0,38 y 16,21 ± 3,00 mg ET/g ES (DPPH), y entre 9,74 ±. BI BL. IO. 0,39 y 18,23 ± 1,18 mg ET/g ES (ABTS). Se concluye que la F2 presenta mejor actividad antibiótica como antioxidante. Palabras claves: Marivirga lumbricoides, cromatografía, antioxidante, antibiótico.. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. The objective of this research was to evaluate the antibiotic and antioxidant activity of the fractions of the isolated Marivirga lumbricoides raw extract of marine origin. The biomass of the bacteria was obtained by incubation in marine agar at 30 °C for 7 days, acetone was used as extractor solvent, dried to obtain the crude extract, fractionated by. IC A. Sephadex LH-20, fractions were obtained that were concentrated to dry extract (DE),. UI M. antioxidant activity was evaluated by 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH) and the. Q. 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) assay (ABTS) expressed in Trolox. BI. O. equivalents (TE) and antibiotic activity by disc diffusion and microdilution method. Y. against Staphylococcus aureus ATCC 25923, methicillin-resistant Staphylococcus. AC. IA. aureus ATCC 43300, Bacillus subtilis ATCC 6633 and Escherichia coli ATCC 259223. RM. fractions were obtained ( F1, F2 and F3) with differentiated colors, with halos of. FA. inhibition of bacterial growth between 7.50 and 19.25 mm, with minimum inhibitory. DE. concentrations (MIC) and minimum bactericidal concentrations (CMB) between 0.62 and. CA. 20.00 mg/mL. In the antioxidant activity values were obtained between 4.34 ± 0.38 and. TE. 16.21 ± 3.00 mg TE/g DE (DPPH), and between 9.74 ± 0.39 and 18.23 ± 1.18 mg TE/g. BI BL. IO. DE (ABTS). It is concluded that F2 presents better antibiotic activity as an antioxidant. Key words: Marivirga lumbricoides, chromatography, antioxidant, antibiotic.. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. INDICE. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………..1. II.. MATERIAL Y MÉTODO…………………………………………………..5. III.. RESULTADOS………………………………………………………….…12. IV.. DISCUSIÓN…………………………………………………………..…....17. V.. CONCLUSIONES………………………………………………………….24. VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………..25. VII.. ANEXOS…………………………………………………………………...30. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. I.. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN Los productos naturales han desempeñado un papel fundamental en el descubrimiento de fármacos entre ellos los nichos ecológicos marinos que son un punto de muestreo importante donde se encuentra una amplia diversidad de microorganismos como bacterias, hongos y cianobacterias, estos organismos marinos secretan varios compuestos bioactivos de utilidad farmacéutica que poseen muchas propiedades como actividad antibiótica y antioxidante [1,2].. IC A. Estos microorganismos por su mismo lugar de origen y hábitat han desarrollado una serie. UI M. de estrategias metabólicas y fisiológicas, que les permite sobrevivir en este medio muy extremo, competitivo y agresivo es por ello que se ven obligados a sintetizar biomoléculas. O. Q. activas, en la mayoría de los casos estos poseen genomas más grandes, lo que les. BI. proporciona un repertorio metabólico mayor que les permite acceder a nutrientes escasos. Y. y/o producir metabolitos especializados bioactivos para protegerse de ellos mismos, de. AC. IA. los depredadores o incluso jugar este último papel [3]. Es por ello que cuando se. RM. enfrentan a otro microorganismo como mecanismo de defensa, secretan biomoléculas que. FA. pueden generar cierta toxicidad o inhibición en el otro microorganismo [4].. DE. Marivirga lumbricoides es una especie nueva descubierta en las aguas superficiales del sur del mar de China, aerobia, heterótrofa, con pigmentación anaranjada, Gram positiva,. CA. del Phylum Bacteroidete en forma de bastón y deslizante. Es oxidasa y catalasa positiva,. TE. con una longitud celular más corta y un rango de crecimiento más amplio a diversas. BI BL. sericea [5].. IO. temperaturas y concentraciones salinas que las cepas de Marivirga tractuosa y Marivirga. Actualmente el uso inadecuado de antibióticos tiene una relación establecida, pero compleja, siendo una causa de ello la resistencia bacteriana que es la capacidad de un microorganismo para tolerar o resistir ciertas condiciones fisicoquímicas y biológicas frente a un cambio de susceptibilidad bacteriana provocado por un agente que ha sido poco efectivo en contra de ciertos microorganismos [6]. Es por ello que la Organización Mundial de la Salud (OMS) en el 2015 aprobó un plan de acción mundial sobre la resistencia a los antimicrobianos y propuso a los países miembros mejorar la sensibilización y los conocimientos sobre la resistencia ante estos para reducir la incidencia de las infecciones reforzando la vigilancia y la investigación [7]. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En los últimos años se generó una verdadera revolución en el campo de las investigaciones relacionadas con el estrés oxidativo, permitiendo establecer que la mayoría de las enfermedades crónicas están implicadas con el desequilibrio de procesos metabólicos y bioquímicos como la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), enfermedades cardiovasculares, daño oxidativo al acido desoxirribonucleico, cáncer y alteración de la visión, estos cambios originan el deterioro y muerte celular, es por ello que se busca biomoléculas con cierta capacidad. antioxidante como los. carotenoides o compuesto fenólicos que son sustancias capaces de neutralizar la acción. IC A. oxidativa de los radicales libres manteniendo su estabilidad [8]. Además los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un equilibrio enzimático de nutrientes. UI M. esenciales (como vitaminas y pigmentos) cuya función principal es prevenir la formación. O. Q. de radicales libres e interceptar los que ya han generado oxidación de otras moléculas [9].. BI. Los métodos antioxidantes in vitro más usados son ABTS, DPPH, 5,5-dimetil-1-pirrolina. Y. N-óxido (DMPO) y poder antioxidante reductor del hierro (FRAP) que reaccionan con. AC. IA. las especies reactivas de oxigeno (EROs) [10]. Los métodos más aplicados son ABTS y. RM. DPPH. Ambos presentan una excelente estabilidad en ciertas condiciones, aunque también muestran diferencias. El DPPH es un radical libre que puede obtenerse directa-. FA. mente sin una preparación previa, mientras que el ABTS tiene que ser generado tras una. DE. reacción que puede ser química (persulfato potasio), enzimática (peroxidasa,. CA. mioglobulina), o también electroquímica. Con el ABTS se puede medir la actividad de. TE. compuestos de naturaleza hidrofílica y lipofílica, mientras que el DPPH solo puede. IO. disolverse en medio orgánico [11]. El radical ABTS+ tiene, además, la ventaja de que su. BI BL. espectro presenta máximos de absorbancia entre 414 y 654 nm en medio alcohólico, mientras que el DPPH presenta un pico de absorbancia a 517 nm [12]. Los antioxidantes son moléculas que evitan el consumo de oxigeno por los tejidos humanos, especies que retardan o previenen la oxidación de otra molécula y por lo tanto puede considerarse como un reductor, gran parte de las reacciones químicas antioxidantes primarios ese pueden agrupar en las categorías de transferencia de hidrogeno–átomo un componente antioxidante dona un átomo de hidrogeno a un radical libre inestable y en este proceso se convierte en un libre más estable y/o transferencia de un solo electrón un antioxidante transfiere un solo electrón para ayudar a reducir los posibles compuestos, también se consideran que los compuestos fenólicos funcionan como oxidantes. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. secundarios debido a su capacidad para unirse con iones metálicos potencialmente prooxidativos [13, 14]. Estudios preliminares indican que la microbiota del medio marino posee una interesante fuente potencial de metabolitos antagonistas. Radhakrishnan y sus colaboradores realizaron una investigación sobre la actividad antioxidante y la actividad antimicrobiana de Streptomyces sp. D25 cuyo metabolito pigmentado mostró un 35,63% y un 96,19% de actividad de eliminación de radicales libres en el ensayo DPPH y el ensayo de óxido nítrico, respectivamente [15].. Lo mismo ocurrió en el ensayo antimicrobiano, el. IC A. pigmento mostró una inhibición de 10-20 mm contra bacterias formadoras de biopelículas. UI M. a 25 µg/mL. Otros estudios in vivo sobre este pigmento encuentran el camino para sus. Q. aplicaciones biomédicas [16,17].. BI. O. En otras investigaciones se obtuvieron 2 aislamientos de Streptomyces parvulus de los. Y. cuales cinco presentaron actividad asparraginasa mientras que el décimo aislamiento. IA. VMS-A10 designado como la cepa de Streptomyces parvulus sankarensis-A10 (NCIM-. AC. 5601, GenBank-KT906299) mostró actividad antimicrobiana contra B. subtilis, S. aureus,. RM. E. coli , P. aeruginosa, MRSA, C. albicans y A. niger con 503,33 ± 5,77; 536,66 ± 5,77;. FA. 533,33 ± 5,77; 500,00 ±10,00; 538,33 ± 5,77; 353,33 ± 11,54 y 443,33 ± 15,27 µg/mL. DE. respectivamente [18].. CA. Se han demostrado que se debe tener diversas alternativas de fuentes naturales con. TE. propiedades antioxidantes y antibióticas es por ello que se ha visto a bien buscar en el. IO. medio marino. En el Perú se tiene un litoral extenso y diversificado con una microbiota. BI BL. poco estudiada la cual podría ser productiva para el hallazgo de cepas biológicamente activas, es por ello que se debe aprovechar eficientemente este recurso. Investigaciones preliminares indican que la microbiota del medio marino posee una interesante fuente potencial de metabolitos con actividad antibiótica [19].. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Objetivo general. Determinar la actividad antibiótica y la actividad antioxidante de las fracciones obtenidas del extracto crudo de la bacteria marina Marivirga lumbricoides.. Objetivos específicos. 1. Determinar la actividad antibiótica de las fracciones del extracto crudo de. IC A. Marivirga lumbricoides, mediante el método de difusión en agar por discos sobre. UI M. bacterias patógenas.. O. Q. 2. Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de las fracciones del. BI. extracto crudo de Marivirga lumbricoides, mediante microdilución sobre bacterias. IA. Y. patógenas.. AC. 3. Determinar la concentración mínima bactericida (CMB) de las fracciones del. RM. extracto crudo de Marivirga lumbricoides, en agar Mueller Hinton sobre bacterias. DE. FA. patógenas.. CA. 4. Determinar la actividad antioxidante de las fracciones del extracto crudo de. BI BL. IO. TE. Marivirga lumbricoides mediante ABTS y DPPH.. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II.. MATERIAL Y MÉTODO. 2.1. MATERIAL 2.1.1. Material biológico. Bacteria marina Marivirga lumbricoides que fue proporcionada por el proyecto PIBA-2-P-247-14-FONDECYT: “Biodiversidad mixobacterial marina del Perú:. IC A. potencial fuente de biomoléculas antibióticas contra patógenos multidrogo. UI M. resistentes.. BI. O. Q. 2.1.2. Material de laboratorio. IA. Y. 2.1.2.1. Material microbiológico. AC.  Staphyloccocus aureus resistente a la meticilina (SARM) ATCC. RM. 43300, Escherichia coli ATCC 25922, Staphyloccocus aureus. FA. ATCC 25923 y Bacillus subtilis ATCC 6633.. CA. DE. 2.1.2.2. Material de vidrio y otros. TE.  Algodón 500 g, CKF. IO.  Asa bacteriológica. BI BL.  Balones fondo redondo de 50 mL, 100 mL y 250 mL  Espátulas  Fiolas de 10 mL, 25 mL, 50 mL y 100 mL  Gradillas  Jeringas de 3 mL y 5 mL con ajuga de 21´  Matraces de 100 mL y 250 mL, Pírex  Mechero de vidrio  Micropipetas de 1 mL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, Brand  Microplacas de 96 pocillos, Falcon  Papel de aluminio  Papel filtro 6mm, Macherey-Nagel 12. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación.  Pinzas  Pizetas de plástico  Placas Petri de vidrio de 9 y 10 cm de diámetro  Probetas de 100 mL  Tubos de ensayo  Varillas de vidrio  Vasos de precipitación de 50 mL, 100 mL, 250 mL y 1000 mL. IC A. 2.1.2.3. Equipos de laboratorio. UI M.  Agitador vibratorio, Heidolph. Q.  Balanza analítica, A&D. O.  Baño de ultrasonido con calefacción, JP Selecta. BI.  Baño maría, Memmert. IA. Y.  Cabina de bioseguridad, Biobase. RM.  Estufa, JP Selecta. AC.  Espectrofotómetro, Thermo Scientific. FA.  Micropipetas multicanal de 200 µL, Brand  Micropipetas de 20 µL, 100 µL, 200 µL y 1000 µL, Brand. DE.  Refrigeradora, Coldex. CA.  Rotaevaporador, Heidolph. TE.  Ultrapurificador, Simplicity. BI BL. IO.  Ultracongeladora, Arctiko. 2.1.2.4. Reactivos y solventes  Acetona, J.T. Baker  Agar Mueller-Hinton, Difco  Agar nutritivo, Difco  Agar marino - Difco  Caldo Mueller-Hinton, Difco  Cloruro de sodio, Merck  Resazurina, Sigma-Aldrich  Sephadex LH-20, Sigma-Aldrich 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación.  2,2-difenil-1-picrilhidracilo, Sigma-Aldrich  Acetato de sodio, Merck  Ácido(±)-6-Hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilico (Trolox), Sigma-Aldrich  Ácido acético glacial, J.T. Baker  Ácido clorhídrico, J.T. Baker  Cloruro de hierro (III) hexahidratado, Sigma-Aldrich  Agua destilada  Etanol 96° G.L, CKF. UI M. IC A.  Metanol, J.T. Baker. BI. O. Q. 2.2. MÉTODO. IA. Y. 2.2.1. Preparación de los extractos. AC. La biomasa de Marivirga lumbricoides se obtuvo en agar marino sobre placas. RM. estériles por 7 días de incubación a 30 ºC. El extracto fue obtenido por el método. FA. de extracción liquido-solido; primero se sónico por 10 minutos a temperatura ambiente, luego se agregó acetona (1:1) y se centrifugó por 15 minutos a 5000. DE. rpm, posteriormente se extrajo el sobrenadante, se colocó en un balón de fondo. CA. redondo de 250 mL y se concentró en un rotaevaporador bajo presión reducida. IO. TE. a 40 ºC hasta sequedad para obtener el extracto crudo.. BI BL. 2.2.2. Fraccionamiento del extracto crudo por Sephadex LH-20. Al extracto crudo se le agregó metanol y se sónico por 5 minutos, se eluyó a través de una fase estacionaria de Sephadex LH-20, utilizando metanol como fase móvil. El criterio para obtener las fracciones fue evaluar las tonalidades de colores por la separación. Las fracciones fueron concentradas al vacío hasta. obtener. extractos secos. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.3. Determinación de la actividad antibiótica por difusión en agar y microdilución de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides. 2.2.3.1. Reactivación de las cepas patógenas y preparación del inóculo. Se reactivó SARM ATCC 43300, E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923 y B. subtilis ATCC 6633; en agar nutritivo sobre placas estériles. Se incubó a 37 °C por 18 a 24 horas hasta su crecimiento. Luego de 24 horas, se preparó la. IC A. suspensión bacteriana en 10 mL de solución salina fisiológica estéril a 0,85% de. UI M. cloruro de sodio ajustando a una turbidez entre 0,09 y 0,10 de absorbancia [19].. BI. O. Q. 2.2.3.2. Prueba de actividad antibiótica mediante difusión en agar. IA. Y. Se preparó placas Petri con agar Mueller-Hinton y se realizó el sembrado de la. AC. suspensión bacteriana previamente preparada. Luego se colocó discos de papel. RM. filtro de 6 mm de diámetro, como control positivo se utilizó seis antibióticos (ciprofloxacino, oxacilina, gentamicina, amikacina, penicilina y ampicilina) y. FA. como control negativo se utilizó DMSO agregándole 10 µL a cada disco, luego. DE. cada fracción obtenida se resuspendió en dimetilsulfóxido. Posteriormente se. CA. llevó a la incubadora por 24 horas a una temperatura constante de 37 ºC.. TE. Finalmente, se realizó la lectura utilizando una regla para medir los halos de. IO. inhibición por la parte reversa de la placa determinando así la fracción con mayor. BI BL. actividad antibiótica [19].. 2.2.3.3. Determinación de la concentración mínima inhibitoria mediante. microdilución. En una placa estéril de poliestireno para microdilución se colocó 50 µL de caldo Mueller-Hinton, luego se agregó 50 µL de cada fracción obtenida y se procedió a realizar las diluciones a la mitad a partir de 100 µL hasta el pocillo 7. Después se añadió 50 µL de la suspensión del inóculo de cada cepa patógena. Además emplearon dos controles: el primero fue el control positivo (caldo MuellerHinton más la suspensión bacteriana) y el segundo, el control negativo (caldo 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Mueller-Hinton más la fracción del extracto).Las placas fueron incubadas a 37 °C entre 18 a 24 horas. Posteriormente, se añadió 10 µL de resazurina para la lectura, y se volvió a incubar por una 1 a 2 horas a 37 °C. Finalmente se tomó lectura de la placa teniendo como criterio la coloración por el indicador resazurina (positiva la inhibición cuando se observó el color azul (no hubo crecimiento) y, negativo, el color rosado (si hubo crecimiento) [19].. IC A. 2.2.3.4. Determinación de la concentración mínima bactericida.. Para determinar la concentración mínima bactericida se dividió la placa con. UI M. medio agar Muller-Hinton en 4 cuadrantes y se tomaron 5 µL de los tres últimos. Q. pocillos que se observaron de color azul y el primer pocillo se observó una. BI. O. coloración rosada, una vez sembrado ello se dejaron incubar entre 18 a 24 horas. Y. a 37 °C y finalmente se realizó la lectura para observar si hubo crecimiento de. IA. las bacterias patógenas en cuadrantes positivos de esta manera se conoce la. RM. AC. concentración mínima bactericida [19].. DE. Marivirga lumbricoides. FA. 2.2.4. Determinación de la actividad antioxidante de las fracciones del extracto de. CA. La evaluación de la actividad antioxidante se determinó mediante los métodos. TE. de DPPH y ABTS los cuales se fundamentan en la cuantificación de la. IO. decoloración de los radicales, debido a la interacción con especies donantes de. BI BL. hidrógeno o de electrones. Son radicales cromóforos que absorben a ciertas longitudes de onda generando así una reacción de oxidación [21].. 2.2.4.1. Determinación de la actividad antioxidante mediante la eliminación del. radical DPPH. Se preparó una disolución patrón de Trolox 10 mM en etanol. El ensayo se realizó con las diluciones de cada fracción obtenida del extracto crudo de Marivirga lumbricoides. Se tomó 10 µL de las diluciones con 300 µL de DPPH (0,039 mg/mL en etanol), se protegió de la luz con papel aluminio y se dejó en reposo durante 15 minutos. Luego se realizó las lecturas de absorbancias en el 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. espectrofotómetro a 517 nm, las determinaciones se realizaron por triplicado para cada una de las soluciones. Posteriormente se enfrentaron las concentraciones de Trolox con sus respectivas absorbancias para obtener la ecuación de la curva de calibración con Trolox. Se comparó trolox a concentraciones de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 y 1 mg/mL. Se procedió con el procedimiento descrito anteriormente, los valores se expresaron en equivalentes de Trolox (ET) por gramo de extracto seco, las mediciones se hicieron por. IC A. triplicado [20].. UI M. 2.2.4.2. Determinación de la actividad antioxidante mediante ABTS. Q. Mediante este método se evalúa la decoloración de cationes radicales libres. BI. O. ABTS. La monocalización radical preformada de ABTS, se genera por. Y. oxidación de ABTS con persulfato de potasio y se reduce en presencia de tales. IA. antioxidantes donadores de hidrógeno [15].. AC. La reacción de ABTS con persulfato potásico incubados a temperatura ambiente. RM. 25 °C y en la oscuridad durante 16 horas. Una vez formado el radical ABTS+, se. FA. diluyeron con etanol hasta obtener un valor de absorbancia comprendiendo entre 0,70 ± 0,1 a 734 nm (longitud de onda de máxima absorbancia). Las fracciones. DE. del extracto crudo de la bacteria marina se diluyeron con etanol, para luego tomar. CA. 10 µL de las diluciones con 300 µL del radical ABTS+, luego de 4 minutos se. TE. realizaron las lecturas de las absorbancias en el espectrofotómetro a 734 nm.. IO. Para la curva de calibración se tomaron como antioxidante estándar Trolox a. BI BL. diferentes concentraciones entre 0,013-0,2 mg/mL en etanol, en las mismas condiciones. Los valores se expresaran en equivalente de Trolox por gramo de extracto seco (ET/g), las mediciones se realizaron por triplicado [14].. 2.2.5. Análisis de datos Se realizó el análisis de varianza (ANOVA) para verificar la diferencia entre los diámetros generados por las fracciones, su efecto antibiótico y antioxidante, luego se realizó la comparación múltiple (Test de Tukey) utilizando un nivel de significancia del 95% (p < 0,05). Los datos fueron procesados en el software IBM SPSS Statistics versión 23. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III.. RESULTADOS. F2. F3. Y. F1. BI. O. Diámetro de halos (mm) Ampicilina Gentamicina Amikacina Penicilina Ciprofloxacino Oxaciclina DMSO 1,066 8,256 33,332 0,5 2,052 mg/mL 2,132mg/mL 20% mg/mL mg/mL mg/mL mg/mL. AC IA. Cepa bacteriana. Q. UI. M. IC. A. Tabla 1. Diámetros de los halos de inhibición de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides frente a bacterias patógenas. -. NH. 0. NH. 0. 28,75. NH. 0. -. -. -. BI B. LI O. TE CA. DE. FA RM. Staphylococcus aureus 18,50 19,25 8,00 31,00 17,50 11,75 ATCC 25923 Staphylococcus aureus resistente a la 15,75 16,75 7,50 30,00 12,00 10,00 meticilina ATCC 43300 Bacillus subtilis 16,75 18,75 8,00 24,50 ATCC 6633 Escherichia coli NH 8,00 NH ATCC 25922 F1: Fracción 1; F2: Fracción 2; F3: Fracción 3; NH: no se observó halo; (-): no se realizo. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/. -.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 2. Concentración mínima inhibitoria de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides frente a bacterias patógenas. CMI (mg/mL) S. aureus ATCC 25923. SARM ATCC 43300. B. subtilis ATCC 6633. E. coli ATCC 25922. F1. 2,50. 5,00. 2,50. 20,00. F2. 0,63. 2,50. 1,25. F3. 10,00. 10,00. 10,00. 10.00. 20,00. BI. O. Q. UI M. IC A. FRACCIÓN. aureus. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. F1: Fracción 1; F2: Fracción 2; F3: Fracción 3; SARM: Staphylococcus resistente a la meticilina. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 3. Concentración mínima bactericida de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides.. CMB (mg/mL) S. aureus ATCC 25923. SARM ATCC 43300. B. subtilis ATCC 6633. E. coli ATCC 25922. F1. 2,50. 10,00. 1,25. NH. F2. 0.63. 2,50. 1,25. F3. 10,00. 20,00. Q. UI M. IC A. FRACCIÓN. NH. BI. O. 20,00. 20,00. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. F1: Fracción 1; F2: Fracción 2; F3: Fracción 3, SARM: Staphyloccocus aureus resistente a la meticilina. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 5 Actividad antioxidante de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides por DPPH. Actividad antioxidante (mg ET/g ES) Fracciones ր2. ր3. F1. 6,24. 5,90. 4,82. F2. 18,33. 17,52. 12,78. F3. 4,72. 4,32. 3,61. ± D.E. 5,65a ± 0,74 16,21b ± 2,99 4,33a ± 0,38. BI. O. Q. UI M. IC A. ր1. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. ET: Equivalente trolox, ES: extracto seco; ր1, ր2, ր3: muestras : promedio; D.E: desviación estándar; a, b= grupos con diferencias significativas (p<0,05). 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 6. Actividad antioxidante de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides por ABTS. Actividad antioxidante (mg ET/g ES) Fracciones ր2. ր3. X ± D.E. F1. 9,35. 9,74. 10,12. 9,74c ± 0,38. F2. 19,54. 17,90. 17,24. 18,22d ± 1,18. F3. 10,60. 10,33. 10,20. 10,37c ± 0,20. O. Q. UI M. IC A. ր1. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. ET: Equivalente trolox, ES: extracto seco; ր1, ր2, ր3: muestras : promedio; D.E: desviación estándar; c, d = grupos con diferencias significativas (p<0,05). 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV. DISCUSIÓN En la tabla 1 se presentó la actividad antibacteriana realizada a las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides frente a las especies bacterianas S. aureus, S. aureus resistente a la meticilina, B. subtilis y E. coli, usando como controles positivos los antibióticos ciprofloxacino, oxaciclina, ampicilina, gentamicina, amikacina y penicilina y como control negativo DMSO al 20% utilizado como sustancia tensioactiva para la total. IC A. disolución de las fracciones. Se observó que la fracción 1 y 2 a concentración de 80. UI M. mg/mL tuvieron una mejor actividad antibiótica frente S. aureus, SARM y B. subtilis,. O. Q. todas ellas del tipo Gram (+). Los valores promedio de diámetro de halos frente a S.. Y. BI. aureus estuvieron entre 18,5 mm, generado por la fracción 1, y 19,25 mm generado por. IA. la fracción 2; estos resultados comparándolos con los halos formados por los antibióticos. RM. AC. presentan diámetros similares especialmente con oxacilina que se encuentra a una. FA. concentración de 2,132 mg/mL, de acuerdo con diámetros de inhibición expresados en. DE. mm, estandarizados para cada antimicrobiano las lecturas se interpretan como sensible. CA. (S),>= 13 mm; intermedia (I) entre 11-12 mm y resistente(R),<= 10 mm según las. TE. categorías establecidas NCCLS, por lo que se afirma que los resultados se encuentran. BI BL. IO. dentro de la categoría sensible [22]. El análisis de varianza entre actividad antibacteriana y el extracto fue menor a 0,05 por lo que existen diferencia significativa de los halos de inhibición de las bacterias, además de presentar un efecto significativo de inhibición de las fracciones, la prueba de comparación de medias de Tukey que entre la fracción 1 y 2 no existe diferencia significativa por lo que se puede observar que generaron similares efectos sobre las cepas patógenas. Por otro lado las fracciones 1 y 2 frente SARM generaron diámetros de halos 15,75 y 16,75 mm respectivamente, por lo que al ser comparados con los controles positivos tiene un mayor efecto inhibitorio que oxacilina, ampicilina, gentamicina y amikacina pero 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. se acerca a los valores. de diámetro de ciprofloxacino, sin embargo la categorías. establecidas por la NCCLS para ciprofloxacino son sensible (S),>= 21 mm; intermedia (I) entre 16-20 mm y resistente(R),<= 15 mm, determinando así que el efecto inhibitorio de las fases se encuentra dentro de la categoría intermedia [22]. Con referencia a los análisis estadísticos entre estas dos fracciones no existe diferencia significativa. Se observó que las fracciones 1 y 2 también tienen efecto inhibitorio sobre B. subtilis. IC A. formando halos de 16,75 y 18,75 mm respectivamente, mostrando mejor actividad que. UI M. las penicilinas, y acercándose a los valores de diámetro de gentamicina y amikacina que. Q. de acuerdo con la categorías establecidas por la NCCLS, los diámetros para amikacina. BI. O. son: sensible (S),>= 17 mm; intermedia (I) entre 14-16 mm y resistente(R), <= 13. Y. determinando así que el efecto inhibitorio de ambas fases se encuentra dentro de la. AC. IA. categoría sensible [22].. RM. La actividad antibacteriana de las fracciones de Marivirga lumbricoides dependen de los ciertas bacterias. marina. Una investigación. DE. FA. metabolitos bioactivos generados por. CA. realizada por Linares y colaboradores reportan actividad antibacteriana de bacterias. TE. marinas contra MRSA clínicamente relevante y contra tres cepas entero hemorrágicas de. IO. Escherichia coli (ECEH) donde se investigó la filogenia y las características fisiológicas. BI BL. de las cepas activas indicando la producción biosintética de los compuestos conocidos como ariakemicina, kocurina, naftiridinomicina, pumilacidinas, resistomicina y surfactina productos del comportamiento depredador o incluso como mecanismo de defensa, entre los filos bacterianos con estas capacidades encontraron las actinobacterias, proteobacterias y bacteroidetes que potencialmente podrían ofrecer nuevas moléculas antimicrobianas [23]. En la tabla 2 se presentó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de las fases 1, 2 y 3, donde se observó que fase 2 a concentración 0,625; 2,5; 1,25 y 10 mg/mL tiene 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. actividad antibiótica contra S. aureus, SARM, B. subtilis y E. coli respectivamente. Según los rangos aceptables de CMI (mg/mL) para cepas utilizadas en el control de los antibiogramas mediante la técnica de dilución como por ejemplo gentamicina (0,125- 1) y oxacilina (0,125-0,5) presenta actividad frente S. aureus; por lo que los resultados obtenidos se encuentran dentro del rango a concentraciones similares de estos fármacos. Por lo que puede determinar que la fracción 2 presenta actividad bactericida (tabla 4). IC A. frente a las bacterias gran positivas que han sido utilizadas [24, 25].. UI M. Se evaluó la actividad antioxidante de las 3 fases a concentraciones de 6,25 mg/mL; 12,5. O. Q. mg/mL; 6,25 mg/mL respectivamente. Los resultados fueron comparados con Trolox a. BI. 10 mM, usando diluciones entre 0,2 a 1 mM En la tabla 5 y 6 se observó la actividad. IA. Y. antioxidante de las fases de Marivirga lumbricoides mediante el método DPPH donde la. AC. fracción 2 presentaron una mayor captación de radicales libres referente a trolox con un. RM. promedio de 16,2149 mg de equivalente Trolox/g de extracto crudo; resultados similares. DE. FA. se obtuvieron al ensayar con ABTS+ con un promedio de 18,2278 mg de equivalente Trolox/g de extracto crudo, según el estudio realizado la actividad antioxidante puede. TE. CA. deberse a los pigmentos amarillo – naranja producidos por la bacteria marina. Otros. IO. estudios similares han reportado que los pigmentos amarillos extraídos de bacterias,. BI BL. como es el caso de Streptomyces sp aislada de la rizosfera Curcumae longae mostró un 28,29% de eliminación de radicales a 500 µg/mL según el método de DPPH [26]. También datan que metabolitos pigmentados aislados de Virgibacillus sp asociada a la esponja Callyspongia difusa presentaron actividad antioxidante con el radical DPPH a una concentración 2000 μg /ml [27]. La coloración observada hace suponer la presencia de carotenoides, debido a que esta familia de isoprenoides contienen una serie de dobles enlaces conjugados lo que constituye el grupo cromóforo de la molécula, responsable del color y de las propiedades 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. de absorción de estos compuestos. La mayoría de carotenoides son sintetizados por organismos fotosintéticos y por algunas bacterias y hongos. Estos se localizan en los centros de reacción de los fotosistemas y en los complejos de antena unidos a proteínas integrales de membrana donde participan en la absorción de luz y protección del aparto fotosintético frente a daños foto oxidativos con una amplia variedad de funciones fisiológicas [28].. IC A. Además Devihalli logro extraer carotenoides aislados de Micrococcus luteus que muestra. UI M. una significativa actividad protectora contra los UV, junto con propiedades antioxidantes. O. Q. a una concentración de 3,5 a 4,5 mg/ mL Otros estudios demostraron que algunos. BI. microorganismos producen carotenoides como por ejemplo Nannochloropsis gaditana. IA. Y. (astaxantina, b-caroteno), Dietzia natronolimnaea HS-1 y Chlorella zofingiensis. Ashbya. gossypi. (riboflavina),. RM. monascorubramina),. AC. (cantaxantina), Rhodoturula glutinis (b-caroteno), Monascus sp. (Ankaflavina, y. Penicillium. oxalicum. DE. FA. (antraquinona) [29]. Por lo que juegan un papel vital por que poseen diversas actividades. CA. farmacológicas como antioxidantes, actividad anticancerígena y antimicrobiana, también. TE. sirven como agentes colorantes alternativos este debido a su ventaja sobre las plantas en. IO. términos de disponibilidad, estabilidad y fácil proceso de transmisión. Estos productores. BI BL. de pigmentos amarillos- naranja tienen estructuras de nitrógeno heterocíclicas variados filogenéticamente, por lo que su producción depende de la ubicación de microorganismos aislados asociados con el suelo y el agua [30]. Estos metabolitos se dividen en dos grupos, carotenos y xantofilas. Los carotenos son hidrocarburos linéales o cíclicos siendo el más abundante, alfa caroteno y beta caroteno responsable del color naranja y las xantofilas son derivados oxigenados de los carotenos. Las microalgas y otros microorganismos producen algunas xantofilas que actualmente. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. se comercializan debido a su color y capacidad antioxidante como es el caso de la astaxantina. [31]. En otros estudios se han encontrado bacterias fotosintéticas como Agrobacterium aurantiacum y algunos hongos capaces de sintetizar astaxantina (3,3′-hidroxi-4,4′-cetoβ-caroteno) a partir de β-caroteno, mediante dos reacciones, una de oxigenación catalizada por la β-caroteno cetolasa (β-caroteno-C4-oxigenasa, BKT) y otra de. IC A. hidroxilación catalizada por la hidroxilasa CHYb. Se han descrito dos rutas diferentes de. UI M. biosíntesis de la astaxantina: una que comienza con la oxigenación del β-caroteno. Q. pasando por equinona, cantaxantina y adonirubina y otra que empieza con la hidroxilación. Y. BI. O. del β-caroteno con β-criptoxantina, zeaxantina y adonixantina como intermediarios [31].. AC. IA. La primera ruta ha sido demostrada mediante análisis funcional de las cetolasas tipo. RM. CrtW/BKT de la bacteria marina A. aurantiacum y la microalga H. pluvialis, que sólo. FA. aceptan β-caroteno como sustrato [32]. Además, mediante análisis de la cetolasa de C.. DE. zofingiensis se confirmó una segunda ruta, demostrándose que el producto del gen bkt de. CA. esta microalga puede actuar tanto sobre β-caroteno como sobre zeaxantina [33]. IO. TE. La capacidad antioxidante de los carotenoides es actualmente objeto de gran interés. BI BL. debido a sus aplicaciones en la salud humana y nutrición. El estrés oxidativo parece ser la base de distintas enfermedades como la degeneración macular de la retina asociada a la edad, otras retinopatías como cataratas, carcinogénesis, aterosclerosis o enfermedad de Alzheimer, entre otras. Antioxidantes, tales como las vitaminas A, C y D, así como los carotenoides, se están investigando para determinar sus funciones en la prevención y/o tratamiento de estas enfermedades [34]. La ingesta de carotenoides ha demostrado ofrecer protección frente a la degeneración macular, los daños inducidos en la piel por la luz UV y algunas enfermedades degenerativas asociadas a la edad avanzada [34]. Diversos estudios sugieren que las propiedades antioxidantes y otras funciones biológicas 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. inesperadas de los carotenoides, relacionadas con la regulación génica y la comunicación intercelular, pueden proporcionar beneficios adicionales para la salud, como actividad anticancerígena, estimuladora del sistema inmunitario o antiinflamatorio [35]. La degeneración macular asociada a la edad (AMD) es producida por la degeneración de la retina y mácula, y finalmente culmina en la pérdida de la visión. Esta enfermedad afecta mundialmente a más de 14 millones de personas, y se ha establecido una clara conexión. IC A. entre AMD y los carotenoides luteína y zeaxantina. Estas xantofilas se encuentran a altas. UI M. concentraciones en el material ocular, incluyendo la región mácula de la retina y sus. O. Q. niveles se han relacionado directamente con la enfermedad y su prevención [36]. La. BI. luteína y zeaxantina tienen capacidad antioxidante y como pigmentos absorben luz, de. IA. Y. esta manera pueden proteger, por tanto, el ojo tiene daños oxidativos inducidos por la luz. AC. azul de alta energía, ya que la luteína y zeaxantina absorben predominantemente luz azul. RM. de baja longitud de onda. Determinando así que las especies reactivas de oxígeno inducen. DE. FA. apoptosis de fotorreceptores y la luteína es capaz de bloquear la apoptosis inducida por. CA. H2O2 de células fotorreceptores de la retina cultivadas [37]. Recientes evidencias nos. TE. indican que antioxidantes como las vitamina A, E y C han revelado que no existe una. IO. relación entre su consumo y la reducción de AMD. La luteína también presenta efectos. BI BL. beneficiosos sobre otras enfermedades oculares, incluyendo cataratas [38]. Estudios in vitro con células humanas e in vivo en ratas y pollos han revelado que la luteína y astaxantina inhiben procesos inflamatorios bloqueando genes proinflamatorios, en consecuencia de la supresión del factor nuclear NF-kB. También inhiben la producción de óxido nítrico y prostaglandina E2, así como las citoquinas pro-inflamatorias TNF alfa (factor de necrosis tumoral alfa), y la interleuquina-1B e interleuquina-6, quimioquina (motivo C-C) ligando 2 (CCL2) y quimioquina (motivo C-X-C) ligando 2 (CXCL2) [39]. El efecto inhibidor de la luteína y astaxantina sobre los efectos pro inflamatorios 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. mediados por NF-kB también estarían relacionado con la neutralización de especies reactivas de oxígeno que activan la ruta NF-kB. Otros estudios han mostrado que la luteína y la astaxantina en la dieta de ratas, redujeron la incidencia de carcinogénesis inducida en vejiga, cavidad oral o colon, entre otros. Este efecto podría estar relacionado con la capacidad de neutralizar especies reactivas, de los procesos de iniciación y. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. propagación de diversas formas de cáncer. [40]. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. CONCLUSIONES 1. La actividad antibiótica de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides, evaluado con el método difusión en agar por discos determino que fracción 2 presenta una mayor actividad con halos de 19,25; 16,25; 18.25 y 8 mm contra S. aureus, SARM; B. suptilis, E. coli respectivamente.. 2. La fracción 2 presenta mayor actividad antibiótica con una concentración mínima inhibitoria de 0,63 2,54; 1,25; 10,00 mg/mL frente a S. aureus, SARM; B. suptilis, E.. UI M. IC A. coli respectivamente.. O. Q. 3. La fracción 2 presenta actividad bactericida frente a S. aureus, SARM; B. suptilis y. AC. IA. Y. BI. actividad bacteriostática frente a E. coli.. RM. 4. La fracción 2 presenta una mayor actividad antioxidante con 16,21 ± 3,00 g de /gramo de. DE. FA. extracto mediante el método de DPPH.. CA. 5. La fracción 2 presenta una mejor capacidad de reducción de radicales libres mediante el. BI BL. IO. TE. ensayo de ABTS con 18,23 ± 1,18mg de ET/gramo de extracto.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1. Linares-Otoya L, Linares-Otoya V, Armas-Mantilla L, Blanco-Olano C, Crüsemann M, Ganoza-Yupanqui ML, Campos-Florian J, König GM, Schäberle TF. Identificación and. heterologous expression of the kocurin biosynthetic gene clúster. Microbiology. 2017; 163(10): 1409-1410. 2. Prasanna H, Vijayanand W, Rajesh S, Smita M, Venkatrao H, Kulkarni M,. IC A. Metabolitos antimicrobianos de microorganismos marinos. Diario chino de. UI M. medicamentos naturales. 2016; 14(2): 101-116.. O. Q. 3. Leon J, Liza L, Soto I. Marine bacteria producing antibacterial compounds. Y. BI. isolated from inter-tidal invertebrates. Perú Med. 2010; 27(2): 251-21.. IA. 4. Kazutoshi S, Norihiko M. Carotenoides nuevos y raros aislados de bacterias. RM. AC. marinas y sus actividades antioxidantes. Mar Drugs. 2014; 12 (3): 1690-169.. FA. 5. Xu Y, Zhang R, Li Q, Liu K, Jiao N. Marivirga lumbricoides sp. Noviembre, una. CA. 2015; 65 (2): 452-6.. DE. bacteria marina aislada del Mar de China Meridional. Int J Syst Evol Microbiol.. TE. 6. Ángeles E. Uso racional de antimicrobianos y resistencia bacteriana. Hacia dónde. BI BL. IO. vamos. Revista Médica Herediana. 2018; 29(1): 3-4 7. Organización Mundial de la Salud (OMS). Guía para el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Ginebra: OMS; 2004. 8. Claira A, Laurent D, Wan A. Perspectiva actual de los pigmentos amarillo-naranja de los microorganismos: una revisión. Diario de producción más limpia. 2018; 180: 168-182. 9. Kim M, Packo L, Dick M, René W. Producción de pigmentos fototróficos con microalgas: limitaciones y oportunidades biológicas. Journal of Phycology. 2014; 50(2): 229-242. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 10. Manikkam R, Gopikrishnan V, Ganesan V, Vanaja. Actividad antioxidante in vitro y actividad antimicrobiana contra las bacterias formadoras de biopelículas por el pigmento del suelo del desierto Streptomyces sp D25.Journal of Applied Pharmaceutical Science. 2016; 18(6): 957-959. 11. Kuskoski E, Agustín G, Asuero A. Troncoso J. Aplicación de diversos métodos químicos para determinar actividad antioxidante en pulpa de frutos. Cienc. Tecnol. IC A. Aliment. 2005; 25(4): 726-732.. UI M. 12. Londoño J, Antioxidantes: importancia biológicay métodos para medir su. Q. actividad. La sallista. 2012; 3(2): 12-13.. BI. O. 13. Kuskoski m, troncoso a. Aplicación de diversos métodos químicos para. Y. determinar actividad antioxidante en pulpa de frutos. Cienc Tecnol. 2005; 25(4):. AC. IA. 726-732.. RM. 14. Radhakrishnan M, Gopikrishnan V, Vijayalakshmi G, Kumar V. Actividad. FA. antioxidante in vitro y actividad antimicrobiana contra bacterias formadoras de. DE. biopelículas por el pigmento del suelo del Desierto Streptomyces sp D25. J App. CA. Pharm Sci. 2016; 6 (6): 148-150.. IO. TE. 15. Devihalli M, Sreerangegowda T, Rayasandra A. Propiedades antioxidantes,. BI BL. antibacterianas y de protección ultravioleta de los carotenoides aislados de Micrococcus spp. Indian Association for radiation and protection. 2013; 36(4): 168-174. 16. Kaliappan U, Marimuthu K. Actividad antibacteriana del pigmento producido a partir de Micrococcus luteus KF532949. Revista Internacional de Ciencias Químicas y Analíticas. 2013; 4(3): 149-152. 17. Mobeen S, Girija S, Iswarya M, Rajitha P Aislamiento y caracterización de metabolitos bioactivos que producen la cepa sankarensis-a10 marina de. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. streptomyces parvulus. Revista de ingeniería genética y biotecnología. 2017; 15(1): 87-94. 18. Blanco C. Caracterización morfo-fisiológica y genética de bacterias marinas de laguna grande, con actividad antibiótica sobre Staphylococcus aureus resistente a meticilina. [Tesis de Maestría].Trujillo: Universidad Nacional de Trujillo, Perú, 2016.. IC A. 19. Polo M, Velasquez S. Determinación del contenido de compuestos fenólicos y. UI M. evaluación de la actividad antioxidante de Myrcianthes myrsinoides (H.B.K.). Q. Grifo, procedente del Distrito de Cachicadan- La Libertad, Perú. [Tesis de. BI. O. Bachiller].Trujillo: Universidad Nacional de Trujillo, Perú, 2016.. IA. Y. 20. Craft BD, Kerrihard AL, Amarowicz R, Pegg RB. Phenol‐Based Antioxidants and. AC. the In Vitro Methods Used for Their Assessment Comprehensive Reviews in Food. RM. science and Food Safety.2012; 11(2): 166.. FA. 21. García J. Métodos básicos para el estudio de la sensibilidad a los antimicrobianos.. DE. Sociedad Española de Infecciones y Microbiologia.2000; 1(1): 10-15.. CA. 22. Linares-Otoya L, Linares-Otoya V, Armas-Mantilla L, Blanco-Olano C,. IO. TE. Crüsemann M, Ganoza-Yupanqui ML, Campos-Florian J, König GM, Schäberle. BI BL. TF.Diversity and Antimicrobial Potential of Predatory Bacteria from the Peruvian Coastline. Marine Drugs. 2017; 15(10): 308. 23. Rossi A. Método de determinación de sensibilidad antimicrobiana por dilución. 2012; 32(2): 15-20. 24. Carocho M, Ferreira ICFR. A review on antioxidant, prooxidants and related controversy; Natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives. Food Chem Toxicol. 2012; 51(1): 15-25.. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 25. Kandhasamy S, Sun C. Evaluation of in vitro free radical scavenging potential of Streptomyces sp. AM-S1 culture filtrate. Saudi Journal of Biological Sciences. 2013; 20(3): 227-233 26. Kalirajan A, Ranjitsingh A. Jacob A. Potencial antioxidante y evaluación bioquímica de metabolitos de las bacterias marinas Virgibacillus sp. asociada a la esponja Callyspongia diffusa. Radicales libres y antioxidantes. 2013; 3(1): 47-51. IC A. 27. Croteau, R, Kutchan, T, Lewis N. Productos naturales (metabolitos secundarios).. UI M. Bioquímica y biología molecular de plantas. 2000; 24(1): 1250-1319.. Q. 28. Devihalli C, Mohana S Thippeswamy R, Umesh. Antioxidant, antibacterial, and. BI. O. ultraviolet‑ protective properties of carotenoids isolated from Micrococcus spp.. IA. Y. Wolters Kluwer Health. 2013; 1(19): 168-169. AC. 29. Rodríguez A. Biosíntesis de carotenoides en Echerichia coli y tejidos no. RM. fotosintéticos de Arabidopsis thaliana. 2010;1(1):6-11. FA. 30. Fernández B. Producción de carotenoides por microalgas y caracterización de la. DE. ruta carotenogénica en Chlorella zofingiensis. Sevilla. [Tesis Doctoral]:. CA. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular. España, 2013.. IO. TE. 31. Lotan T, Hirschberg J. Cloning and expression in E. coli of the gene encoding β-. BI BL. C-4-oxygenase that converts βcarotene to the ketocarotenoid canthaxanthin in Haematococcus pluvialis. FEBS Lett. 1995, 364(2): 125-8. 32. Huang J, Wang Y, Sandmann G, Chen F. Aislamiento y caracterización de un gen de la carotenoide oxigenasa de Chlorella zofingiensis (Chlorophyta). Appl Microbiol Biotechnol. 2006, 71 (4): 473-9.. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 33. Zhao DY, Wintch SW, Ermakov IV, Gellermann W, Bernstein PS. Resonance Raman measurement of macular carotenoids in retinal, choroidal, and macular dystrophies. Archives of Ophthalmology. 2003; 121(1): 967-972. 34. Stahl W, Sies H. Bioactivity and protective effects of natural carotenoids. Biochim Biophys Acta. 2005; 1740(2): 101-107. 35. Landrum J, Bone R, Moore L, Gomez C. Analysis of zeaxanthin distribution. IC A. within individual human retinas. Methods Enzymol. 1999; 299(1): 457-467.. UI M. 36. Kijlstra A, Tian Y, Kelly ER, Berendschot TJM. Lutein: More than just a filter. Q. for blue light. Progress in Retinal and Eye Research. 2012; 31(1): 303-315.. BI. O. 37. Mares J, Millen A, Ficek T, Hankinson S. The body of evidence to support a. Y. protective role for lutein and zeaxanthin in delaying chronic disease. Overview.. AC. IA. 2002, 132(3): 518-524.. RM. 38. Hussein G, Goto H, Oda S, Sankawa U, Matsumoto K, Watanabe H.. FA. Antihypertensive potential and mechanism of action of astaxanthin: III.. DE. Antioxidant and histopathological effects in spontaneously hypertensive rats. Biol. CA. Pharm Bull.2007; 29(12): 684-688.. IO. TE. 39. Guerin M, Huntley ME, Olaizola M. Haematococcus astaxanthin: applications for. .. BI BL. human health and nutrition. Trends Biotechnol. 2003; 21(5): 210-216.. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. VI. ANEXOS. Anexo 1. : Curva de DPPH vs. Trolox que fue usado como estándar. DPPH - TROLOX. Concentración Absorbancia 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000. IC A. y = -0.6963x + 0.9849 R² = 0.9998. 0. UI M. 0,989 0,843 0,706 0,563 0,425 0,294. Absorbancia. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1. 0.2. 0.4. 0.6. 0.8. 1. 1.2. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. Concentracion. BI BL. IO. TE. Concentración Absorbancia 0,0 0,859 0,05 0,819 0,1 0,781 0,2 0,705 0,3 0,626 0,4 0,551 0,5 0,472 0,6 0,399 0,7 0,320 0,8 0,242. ABTS - TROLOX. 1.000. y = -0.7696x + 0.8559 R² = 0.9991. 0.800 absorvancia. CA. DE. FA. Anexo 2. : Curva de ABTS vs. Trolox que fue usado como estándar. 0.600 0.400 0.200 0.000 0.0. 0.2. 0.4 0.6 concentraciòn. 0.8. 1.0. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 3.Actividad antibacteriana de los fármacos utilizados como controles. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. positivos frente a bacterias patógenas.. BI BL. IO. TE. CA. DE. DMSO: Dimetilsulfoxido; SARM: S. aureus resistente a meticilina. 37 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 4. Actividad antibiótica de las fracciones del extracto de Marivirga lumbricoides mediante discos en agar. S.A. MRSA. F2. F2. F3. F1. F3. F2. E.C. BI. F1. F1. F3 F2. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. F3. O. Q. B.S. UI M. IC A. F1. 38 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 5. Concentraciones Mínimas Inhibitorias de las fracciones del extracto crudo de Marivirga lumbricoides. Fracción 2. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. Fracción 1. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Fracción 3. Azul: muestras que presentan actividad antibiotica conta las cepas patogenas; Rosado: muestras que no presenta activida antibiotica; F1: Fraccion 1; F2: Fraccion 2; F3: Fraccion 3. 39 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 6. Análisis de varianza (ANOVA) de los diámetros de halos generados por las fracciones de Marivirga lumbricoides frente a Staphylococcus aureus expresados en milímetros. Suma de cuadrados. gl. Media cuadrática. F. Sig.. Entre grupos. 351,167. 2. 175,583. 421,400. ,000. Dentro de grupos. 3,750. 9. ,417. Total. 354,917. 11. IC A UI M. Q O BI. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. Diámetro de los halos(mm). Variable. 40 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 7. Análisis de comparación múltiple (test HSD Tukey) de los diámetros de halos formado por las fracciones del extracto de Marivirga lumbricoides frente a Staphylococcus aureus.. HSD Tukey. Diámetros de halos (mm) Subconjunto para alfa = 0,05 N a. 4. Fracción 2. 4. UI M. Fracción 1. 7,0000. Q. 4. c. 17,5000. 19,2500. IA. Y. BI. O. Fracción 3. b. IC A. Fracciones. 1,000. 1,000. 1,000. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. Sig.. 41 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 8. Análisis de varianza (ANOVA) de los diámetros de halos generados por las fracciones de Marivirga lumbricoides frente a Staphylococcus aureus resistente a meticilina expresados en milímetros.. gl. Media cuadrática. F. Sig.. Entre grupos. 230,167. 2. 115,083. 690,500. ,000. Dentro de grupos. 1,500. 9. ,167. Total. 231,667. 11. UI M. Q. O BI. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. Diámetro de los halos(mm). IC A. Suma de cuadrados. Variable. 42 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(44) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 9. Análisis de comparación múltiple (test HSD Tukey) de los diámetros de halos formado por las fracciones del extracto de Marivirga lumbricoides frente a Staphylococcus aureus.. HSD. Diámetros de halos (mm) Subconjunto para alfa = 0.05 N. Fracciones. Fracción 2. 4. UI M. 4. 15,7500. Q. Fracción 1. 7,0000. O. 4. c. BI. Fracción 3. b. IC A. a. 1,000. 1,000. 1,000. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. Sig.. 16,7500. 43 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(45) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 10. Análisis de varianza (ANOVA) de los diámetros de halos generados por las fracciones de Marivirga lumbricoides frente a Bacillus suptilis expresados en milímetros.. gl. Media cuadrática. F. Sig.. Entre grupos. 882,000. 2. 441,000. 661,500. ,000. Dentro de grupos. 6,000. 9. 0,667. Total. 888,000. 11. UI M. Q O. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. Diámetro de los halos(mm). IC A. Suma de cuadrados. Variable. 44 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(46) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 11. Análisis de comparación múltiple (test HSD Tukey) de los diámetros de halos formado por las fracciones del extracto de Marivirga lumbricoides frente a Bacillus suptilis. HSD Tukey. Diámetros de halos (mm) Subconjunto para alfa = 0.05. FRACCIONES. N. Fracción 3. 4. 16,5000. 4. 19,5000. BI. O. Fracción 2. 0,0000. Q. Fracción 1. 3. UI M. 4. 2. IC A. 1. 1,000. 1,000. 1,000. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. Sig.. 45 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(47) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 12. Actividad antioxidante de las fracciones del extracto de Marivirga. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. lumbricoides mediante DPPH y ABTS. 46 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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