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Expresión como proteína recombinante de dos fragmentos de alta unión a células b de la glicoproteina 350 (gp350) del virus de epstein-barr en escherichia coli

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EXPRESIÓ COMO PROTEÍ A RECOMBI A TE DE DOS

FRAGME TOS DE ALTA U IO A CELULAS B DE LA GLICOPROTEI A

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TABLA DE CO

TE

IDOS

1. Introducción ... 11

2. Marco teórico y revisión de literatura ... 13

2.1. Epidemiología ... 15

2.2. Tipos de VEB ... 17

2.3. Biología de VEB ... 18

2.4. Interacción virus – células hospederas ... 19

2.4.1. Receptor de complemento 2 (CD21) ... 21

2.4.2. Glicoproteína 350 (gp 350)…. ... 23

2.5. Latencia ... 23

2.5.1. Tipos de latencia ... 24

2.6. Respuesta inmune ... 27

2.6.1. Respuesta inmune celular ... 27

2.6.2. Antígenos de VEB ... 28

2.7. Antecedentes 29 3. Formulación del problema y justificación

...

33

3.1. Formulación del problema 33 3.2. Justificación de la investigación 33 4. Objetivos

...

35

4.1. Objetivo general 35 4.2. Objetivos específicos 35 5. Materiales y métodos

...

36

5.1. Diseño de la investigación 36

5.2. Métodos 36

5.2.1. Secuencia nucleotídica genómica del virus de Epstein-Barr 36

5.2.2. Diseño de los cebadores 37

(9)

5.2.4. Electroforesis en gel de agarosa 38

5.2.5. Purificación del fragmento amplificado 38

5.2.6. Inserción del fragmento purificado en el vector de expresión 38

5.2.7. Transformación en E. coli 40

5.2.8. PCR de colonia 41

5.2.9. Purificación del ADN plasmídico 42

5.2.10. Digestión con enzimas de restricción 42

5.2.11. Secuenciación 43

5.2.12. Transformación del vector recombinante en las células de expresión 43

5.2.13. Expresión 44

5.2.14. Identificación proteínas recombinantes por electroforesis y Western Blot 45 5.2.15. Identificación de las proteínas recombinantes por electroforesis: Western blot

y tinción con azul de coomassie 47

5.2.16. Purificación de proteínas recombinantes obtenidas para cada fragmento 48

5.2.17. Cuantificación de la proteína 49

5.3. Análisis bioinformático 49

5.3.1. Diseño de cebadores 49

5.3.2. Clonación del inserto codificante para VEB I y II 49 5.3.3. Secuencia de los fragmentos del gen gp 350 en pEXP5 50

5.3.4. Índice de adaptación de codones (CAI) 50

5.3.5. Determinación del punto isoeléctrico de los fragmentos expresados 50

5.3.6. Predicción de glicosilación 51

5.3.7. Predicción de la secuencia señal y localización subcelular 51

5.3.8. Predicción de sitios de glicosilación 52

6. Resultados

...

54

7. Discusión

...

68

Conclusiones

...

74

Recomendaciones

...

75

Referencias

...

76

(10)

RESUMEN

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Abstract

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1. Introducción

Los herpesvirus son un grupo bien definido de virus que tienen gran importancia médica. De todos ellos, el virus de Epstein Barr (VEB) es uno de los más conocido y mejor estudiado debido a sus características infectivas, las cuales lo vinculan con muchos casos de importancia clínica y oncológica; siendo éste el causante de infecciones agudas y crónicas, tanto en personas inmunocompetentes como en inmunosuprimidas.

Este virus se encuentra aproximadamente en el 90% de los humanos adultos y se adquiere, principalmente en la niñez, por medio de la saliva; en esta época, la infección es asintomática y no difiere de los resfriados comunes. Estudios epidemiológicos realizados a comienzos de la década de los 70, demostraron que la infección primaria de VEB ocurre a muy temprana edad en países no industrializados y en grupos socioeconómicos bajos, en los cuales es frecuente la propagación intrafamiliar; mientras que en sociedades pudientes, es más probable que el contagio ocurra sólo hasta la adolescencia.

Las infecciones causadas por el VEB ocurren a muy temprana edad y la mayoría de la población se encuentra expuesta, por lo tanto, los esfuerzos actuales para vacunación terapéutica se enfocan principalmente en reforzar la respuesta inmune celular hacia antígenos expresados en estadíos de latencia del VEB, tales como antígenos nucleares y proteínas de membrana.

(13)

12

este reconocimiento, otras glicoproteínas de membrana intervienen en la infección. Por lo tanto se abre la posibilidad que al inhibir la interacción receptor ligando entre estas dos moléculas se pueda lograr el desarrollo de técnicas terapéuticas para tratar los casos severos de infección causados por este virus.

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13

2. Marco teórico y revisión de literatura

[image:14.612.166.514.294.512.2]

Los Herpesvirus son una familia diversa de virus que presentan comportamientos similares, tales como una alta incidencia asintomática de la infección y el establecimiento de infecciones latentes. Los viriones están compuestos por ADN contenido en una cápside icosaédrica, cubierta por una capa de proteínas (tegumento) y una envoltura con más de una docena de proteínas virales y glicoproteínas ancladas a la bicapa lipídica (Deleclusey Hammerschmidt, 2000)(Figura 1).

Figura 1Esquema de un herpesvirus. Tomado de

http://www.expasy.ch/viralzone/all_by_species.

(15)

14

Alphaherpesvirinae: Incluye los herpes virus simples 1 y 2 (HSV 1 y HSV 2) y

el virus de varicela zoster (VZV). Los dos primeros son responsables, la mayoría de las veces, de lesiones cutáneas localizadas, pero también pueden causar meningitis y encefalitis. VZV causa enfermedad sistémica con lesiones de piel durante la infección primaria (varicela) y zoster (erupción causada por la activación del VZV latente) (Cohen, 2000).

Betaherpesvirinae: Esta subfamilia encierra cytomegalovirus y herpesvirus humanos 6 y 7. Causan principalmente infecciones asintomáticas en individuos inmunocompetentes y pueden establecer infecciones latentes en muchos tipos celulares, incluyendo leucocitos de varios linajes (Deleclusey Hammerschmidt, 2000).

Gammaherpesvirinae: Incluye el virus de Epstein Barr (VEB) y el herpes virus humano 8 (HHV 8 / KSHV) causante del sarcoma de Kaposi (Deleclusey Hammerschmidt, 2000). Los gammaherpesvirus, a diferencia de las otras subfamilias, presentan restricción con respecto al hospedero (humanos) y el tipo de célula que infectan. La entrada de éstos a su célula blanco involucra interacciones de varias glicoproteínas virales con múltiples determinantes de superficie celular (Speary Longnecker, 2003).

(16)
[image:16.612.165.476.76.291.2]

15

Figura 2 Mecanismos involucrados en la entrada de los herpesvirus y su fusión

celular. Tomado de (Spear and Longnecker 2003)

2.1.

Epidemiología

El VEB puede infectar, entrar en latencia, inducir proliferación en los linfocitos B y aumentar la producción de inmunoglobulinas (Thorley Lawsony Gross, 2004). Este virus es uno de los más exitosos, infectando a más del 90% de la población mundial. La mayoría de los individuos entran en contacto con el virus en la niñez o adolescencia y éste permanece latente durante toda la vida del hospedero, en una pequeña proporción de linfocitos B y en células epiteliales de la orofaringe y de glándulas salivares (Macsweeny Crawford, 2003). Está altamente relacionado con virus presentes en primates no humanos del Viejo Mundo, incluyendo virus tipo VEB de Chimpancés o monos rhesus, por lo que se ha insinuado su posible evolución a partir de estos (Cohen, 2000).

El VEB se transmite a través de la saliva por contacto bucal, en la mayoría de los casos ocurre de manera subclínica durante la infancia, principalmente por contagio salival directo entre la familia (Macsweeny Crawford, 2003). Estudios de transmisión natural o experimental, especialmente de mononucleosis infecciosa, documentan un periodo de incubación de 3 a 7 semanas. Existen reportes asilados

(17)

16

donde se ha detectado VEB en secreciones genitales de individuos de ambos sexos, sugiriendo así la posibilidad de transmisión sexual. También puede ser transmitido a hospederos susceptibles por transfusión sanguínea o trasplantes de órganos (Straus et al., 1993). Serológicamente se ha comprobado que del 50% al 74% de pacientes jóvenes con muestras positivas para infección primaria de VEB desarrollan esta enfermedad, cuyos síntomas y signos incluyen malestar general, fiebre, faringitis, disfunción hepatocelular, esplenomegalia, entre otros, que pueden durar de 1 a 2 meses. A pesar de ser poco usual, del 3% al 4% de pacientes con mononucleosis infecciosa pueden morir debido a complicaciones neurológicas, cardiacas o inmunológicas (Cohen, 2000).

VEB ha sido señalado como el agente causal de Linfoma de Burkitt (tumor de células B con alta incidencia en África Central) y juega un rol importante en la patogénesis del carcinoma nasofaríngeo (ampliamente distribuido en el sureste Asiático). En los últimos años ha sido potencialmente asociado con gran variedad de síndromes clínicos adicionales como: mononucleosis clínica fatal (Síndrome Linfoproliferativo ligado al cromosoma X [XLPS]/ Síndrome de Duncan), trastornos linfoproliferativos después de trasplantes (especialmente de hígado y corazón) y otros linfomas del sistema nervioso central por células B. En pacientes inmunodeficientes, el VEB ocasiona diversos síndromes complejos en enfermedades linfoproliferativas y epiteliales tales como leucopatía oral vellosa y carcinoma de glándulas parótidas. También se ha postulado que este virus está presente en la enfermedad de Hodgkin y se ha encontrado asociado a linfomas No Hodgkin (Martín, 2001; Macsweeny Crawford, 2003).

Fue descubierto hace 40 años por Epstein, Achong y Barr, quienes lo identificaron empleando microscopía electrónica, a partir de células cultivadas

(18)

17

adquirida (SIDA) (Greenspan et al., 1985). Desde entonces, el ADN de VEB ha sido encontrado en tejidos de otros tipos de cáncer, incluyendo linfomas de células T y en la enfermedad de Hodgkin (Revisado en ).

Para 1990 se estimó que la incidencia de cáncer atribuible a infecciones por hepatitis B, C, VPH y VEB fue de 15,6%, de éste porcentaje el 21% de los casos nuevos ocurren en ciudades en vía de desarrollo (Pisani et al., 1997). En el año 2002 el estimado total de cáncer atribuible a infección fue de 1.9 millones de casos (17,8%), los principales agentes determinados fueron

con el 5,5% de todos los casos, HPV en un 5,2%, Hepatitis B y C con 4,9%, y Epstein Barr representó el 1% (Parkin, 2006). En Colombia para el año 2000, se estimó que la mortalidad por linfoma Hodking fue de 0,3/100000 habitantes (habs.) (0,4%) este tipo de linfoma fue principalmente encontrado en pacientes con edades entre 10 a 14 años y constituyó el 53,6% de las muertes en este grupo de edad; con respecto a muertes por linfoma no Hodking la relación fue de 1,6/100000 habs. (2,4%) (Ochoay Montoya, 2003; Pardo , 2003).

2.2.

Tipos de VEB

Existen dos tipos de virus que se diferencian en las secuencias de los genes implicados en la infección latente: VEB tipo 1 (VEB 1, también denominado VEB A) y VEB tipo 2 (VEB 2 o VEB B). La mayor diferencia se encuentra en el gen el cual codifica para EBNA 2 (Epstein Barr Nuclear Antigen 2) idéntica en un 56% de su secuencia. El tamaño de esta proteína es diferente en los dos tipos de VEB, en el tipo 1 pesa 90 kDa y en el tipo 2 pesa 78 kDa. También puede identificarse el tipo de virus estudiando las variaciones en las secuencias de los genes EBNA 3A, 3B y 3C. La detección simultánea de ambos tipos de virus en el mismo paciente indica que la infección por un tipo de VEB no excluye la infección por el otro tipo (Martín, 2001).

(19)

18

papel oncogénico según las diferencias del sistema inmune en el hospedero infectado, por ejemplo la coinfección con ambos tipos ha sido observada en pacientes con enfermedad de Hodgkin pediátrica. Los sujetos positivos para VIH pueden infectarse por cualquier tipo de VEB, aunque en pacientes con linfomas asociados al SIDA existe un mayor porcentaje de infección por VEB 2 (Macsweeny Crawford, 2003), ( (Martín, 2001)).

2.3.

Biología VEB

El VEB está formado por ADN unido a proteínas, presenta una envoltura icosaédrica de 150 nm de diámetro compuesta por 162 capsómeros, rodeada a su vez por una envoltura externa que contiene abundantes glicoproteínas. Entre las proteínas que constituyen la cápside del VEB las de mayor tamaño pesan 160, 47 y 28 kDa. La envoltura externa presenta 4 glicoproteínas y 2 proteínas no glicosiladas: gp350/300 (gp350), gp220/200 (gp220), gp115, gp85, p160 y p140 (Thorley Lawsony Poodry, 1982; Nemerow , 1987).

El genoma viral consiste en una molécula de ADN de doble cadena compuesto por 172 kb y un porcentaje de Guanina+Citosina del 60% (Khanna et al., 1995a). Contiene elementos únicos repetidos en tándem; el número de las repeticiones varía a través de los diferentes virus aislados y entre las moléculas de cada aislamiento, por lo que resulta útil considerar la organización del genoma de la siguiente manera: TR (del inglés “terminal repeat” de 0.5 kb (Baer et al., 1984) U1 (secuencia corta única de 10 kb del inglés “unique” region 1) IR1 (secuencia de repeticiones internas de 40 kb, del inglés “internal repeat” 1) U2 IR2 U3 IR3 U4 IR4 U5 TR (Figura 3). Como cada virus difiere en la frecuencia de la repetición de estas secuencias y mantiene sus características en las sucesivas replicaciones, esta propiedad puede ser usada para identificar los diferentes tipos de virus (Okano et al., 1988).

(20)

19

constituyendo un episoma localizado en el núcleo donde pueden encontrarse entre 10 y 30 copias episomales. No es usual que el ADN del virus se integre al ADN de las células hospederas (Martín, 2001).

Figura3 Representación esquemática del mapa genómico del VEB realizado con

endonucleasas de restricción. TR, Terminal repeat; IR internal repeat; U, unique region.

Tomado de (Okano, Thiele et al. 1988)

El genoma del VEB puede producir entre 100 y 150 productos génicos; durante la replicación del virus, estas proteínas son importantes pues regulan la expresión de los genes virales, intervienen en la replicación de su ADN, forman componentes estructurales del virión y modulan la respuesta inmune del hospedero (Cohen, 2000).

2.4.

Interacción virus células hospederas

La infección inicial ocurre en las células epiteliales de la orofaringe. El virus infecta dos tipos de células, los linfocitos B y las células epiteliales; sin embargo, la entrada de VEB en cada una de las líneas celulares implica rutas diferentes (Millery Hutt Fletcher, 1992). La infección de células epiteliales produce una replicación activa con producción de virus y lisis de la célula hospedera; por otra parte, la infección de células B conlleva a una infección latente con inmortalización de las células (Figura 4) (Cohen, 2000).

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(21)

20

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ocasionalmente, el virus entra en ciclo replicativo durante el cual puede infectar otros linfocitos o reinfectar células epiteliales. El reservorio predominante del VEB es el sistema linfoide (Pagano et al., 1992).

Figura 4 Esquema de infección de VEB durante las etapas primaria y persistente.

Tomado de Cohen 2000.

En 1982, Wells y colaboradores encontraron que la presencia simultánea de la glicoproteína principal de membrana gp350/300 (gp350) y una proteína relacionada, gp220/200 (gp220), era necesaria para que vesículas lipídicas artificiales que contenían antígenos del VEB se unieran a células B (Nemerow et al., 1987).

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21

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expuestas por Nemerow y colaboradores en 1989, a partir de cinco sistemas de ensayo independientes, indican que la región N terminal de gp350/220 es la que permite la unión de VEB a CR2 y esta unión es la que da inicio a la infección de los linfocitos B (Nemerow et al., 1989).

Figura 5 Representación esquemática de los ligandos y la biología del receptor de complemeto 2(CR2) de los linfocitos B. (Tomado de (Cooper et al., 1990).

Luego de esta unión se da lugar a la endocitosis del virus, la pérdida de su envoltura y la transformación en la célula B, a partir de la unión de la proteína viral gp42 con un segundo receptor, HLA DR.

2.4.1. Receptor de complemento 2 (CD21)

(23)

22

consensus repeats”, y numeradas de la SCR1 a la SCR16; este dominio consta de 60 75 residuos caracterizados por ser altamente conservados (Prota et al., 2002). Esta estructura ubica al CR2 dentro de una familia de más de 20 proteínas de membrana celular y plasma (algunas de las cuales están relacionadas con el sistema de complemento). Al dominio extracelular le sigue un dominio transmembranal de probablemente 28 aa y una cola citoplásmatica de 34 aa al C terminal (Figura 5) (Cooper et al., 1990).

CR2 se ha identificado como un receptor de células B crucial para la respuesta humoral en contra de antígenos foráneos, mediante la interacción con el ligando celular C3d. Por otra parte cuando CR2 se une al VEB a través de la gp350, la interacción con C3d se bloquea y con esto la respuesta humoral que conlleva dicha unión. Por lo tanto la interacción del VEB con CR2 representa dos beneficios para el virus: la unión superficial que conlleva a la entrada del virus a la célula y el bloqueo de la respuesta inmune humoral (Szakonyi et al., 2006).

(24)

23 2.4.2. Glicoproteína 350 (gp 350)

VEB posee un rango restringido de hospederos y presenta dos glicoproteínas predominantes en su superficie exterior gp350 y gp220 (Tanner et al., 1988), las cuales son codificadas por el mismo gen y generadas con diferentes tamaños debido a un evento de splicing alternativo (Hummel et al., 1984).

Gp350/220 se sintetiza en el retículo endoplásmico de la célula infectada, donde sufre rápidas glicosilaciones y es transportada al aparato de Golgi, en donde se adicionan oligosacáridos ricos en manosa unidos a N y O, finalmente esta proteína puede ser adicionada a la envoltura viral durante el paso del virus por el citoplasma de la célula infectada o durante su salida a través de la membrana plasmática (Gongy Kieff, 1990).

En el VEB gp350 es la mayor glicoproteína de membrana, está compuesta de 907 residuos, de los cuales, un grupo de 18 residuos localizados al C terminal se encuentran dentro de la membrana viral, mientras que el segmento N Terminal (860 residuos) se encuentra expuesto (Szakonyi et al., 2006). En este segmento se ha demostrado que se encuentra el principal dominio de unión al receptor CR2 (extremo soluble, residuos 1 470) (Tanner , 1988; Nemerow , 1989). Por lo tanto gp350 es el blanco principal de anticuerpos neutralizantes en hospederos humanos y la inmunización con esta glicoproteína ha mostrado protección contra el VEB en modelos animales (Thorley Lawsony Poodry, 1982).

2.5.

Latencia

(25)

24

Los genes esenciales son aquellos que codifican para los antígenos nucleares del VEB, EBNAs 1, 2, 3A, 3C y las proteínas de membrana de latencia (LMP´s). En las LCL´s, los 6 EBNAs son codificados por un ARN originado a partir de cualquiera de los dos promotores localizados en el extremo izquierdo (corriente abajo) del genoma viral lineal, BamHI C o BamHI W (Cp o Wp) (Figura 3) (Murrayy Young, 2001; Elliott , 2004). Se determinó que la proteína EBNA 1 del VEB es la única proteína necesaria para la replicación del ADN viral en la fase latente (Rowe, 1999). Se han identificado también dos ARNs cortos denominados EBER 1 y 2 por sus siglas en inglés (EBV encoded RNA), los cuales se encuentran en grandes proporciones en las células B inmortalizadas, varios estudios han sugerido que estos influyen en procesamiento de ARN y bloqueo de la inhibición mediada por interferones en los estadíos tempranos del proceso de inmortalización de las células, aunque todavía existen dudas en cuanto a su función específica (Rowe, 1999).

2.5.1. Tipos de Latencia

Estudios sobre la expresión génica del VEB en cultivos celulares y muestras de biopsias de tumores humanos han identificado tres formas distintas de infección latente (Tabla 1) (Rowe et al., 1992). Actualmente se ha agregado un cuarto tipo, denominado Latencia Tipo 0. Éste encierra la población de individuos sanos infectados con VEB en el pasado, infección estrictamente confinada a células B de memoria; en estas células sólo se ha detectado la expresión de LMP2 y en otros estudios sólo se ha detectado ARN de EBNA 1 (Cohen, 2000; Zetterberg et al., 2002).

(26)

25

[image:26.612.132.505.174.354.2]

cromosomales suplantan la necesidad de expresar genes adicionales de latencia (Straus et al., 1993).

Tabla 1 Tabla de correspondencia entre el tipo de latencia del VEB, las proteínas que expresa y las enfermedades con las que se encuentra relacionado.

Patrón de

Latencia EB A 1 EB A 2 EB A 3

LMP 1

LMP

2 EBER E FERMEDAD

Tipo 0 + + + Portador saludable

Tipo 1 + + Linfoma de Burkitt

Tipo 2 + + + +

Carcinoma Nasofaringeo, Enfermedad de Hodgkin, linfomas periféricos de célulasT

Tipo 3 + + + + + +

Enfermedad linfoprolifertaiva (EL), EL ligada a X, mononucleosis

infecciosa

La expresión de EBNA 1 y combinaciones de LMPs, constituye la forma de latencia Tipo II. Esta forma de latencia se expresa en un carcinomas de nasofaringe y también en los casos de Linfomas Hodgkin asociados al VEB y linfomas de células T (Rowe, 1999).

(27)
[image:27.612.134.506.78.553.2]

26

Figura 6 Mapa del genoma del virus de Epstein-Barr (VEB). A. Genes de latencia del virus. B. Marcos de lectura abiertos para las proteinas de latencia de VEB. Tomado de

(28)

27

2.6.

Respuesta Inmune

La respuesta inmunológica frente a la infección por VEB incluye tanto inmunidad celular, dirigida hacia los linfocitos infectados, como respuesta de anticuerpos neutralizantes dirigidos hacia la cubierta viral.

2.6.1. Respuesta Inmune Celular

Una vez iniciada la infección por el VEB las células asesinas naturales (NK:Natural killer) y las células T citotóxicas (CD8+) controlan la proliferación de las células B infectadas. Este proceso lo realizan debido a que reconocen los antígenos virales asociados a moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad clase I (MHC: Major Histocompatibility Complex class I), provocando la lisis de las células infectadas (Cohen, 2000). Se ha demostrado que las células T inhiben la proliferación de las células B infectadas y que tal efecto puede ser mediado por la liberación de Interferón Gamma (INFγ) producido por las células T CD4+ (Callan, 2004).

Durante la infección aguda (mononucleosis infecciosa), células CD8+ específicas de VEB eliminan un gran número de células B infectadas, más del 40% de las CD8+ están dirigidas hacia una proteína de secuencia involucrada en la replicación viral, mientras que sólo un 2% tienen como blanco la secuencia de una proteína de latencia (Khanna et al., 1995a). Esta respuesta es principalmente la responsable por los síntomas de fiebre, linfoadenopatía y esplecnomegalia (Okano et al., 1988).

(29)

28

la respuesta mediada por células (Th1) y aumenta la proliferación de anticuerpos (Wang et al., 1990).

2.6.2. Antígenos de VEB

Se sabe que durante la generación de una respuesta inmune humoral el linfocito B, mediante su receptor (B cell receptor BCR) reconoce antígenos, los cuales internaliza y procesa hasta presentar los péptidos resultantes a sus moléculas MHC (I o II), formando el complejo: péptido MHC. Una vez el complejo sale a la superficie celular, es reconocido por el receptor del linfocito T (T cell Receptor:TCR). La interacción BCR:TCR envía señales al linfocito B, con las que se produce la diferenciación hasta células plasmáticas secretoras de anticuerpos (Roitt et al., 2001).

Los antígenos principales de VEB incluye las 6 EBNA´s (1,2,3a,3b,3c Leader Protein [LP]), Antígeno temprano (early antigen [EA]), antígeno de cápside viral (VCA), Antígenos de membrana (MA) y proteínas latentes de membrana (LMP) (Khanna et al., 1995b).

Las seis proteínas de EBNAs constituyen una familia de antígenos nucleares asociados a VEB. EBNA 1 interviene en la activación de la transcripción, replicación de ADN viral y conservación del mismo. Interactua con oriP y funciona como un iniciador y finalizador de la replicación del ADN (Sugdeny Warren, 1989). EBNA 2 es una proteína fosforilada, esencial para que se produzca la inmortalización de los linfocitos B. Es el primer gen expresado junto con EBNA LP y sirve como iniciador principal de aquellos genes tanto celulares como virales, involucrados en la transformación (Hammerschmidty Sugden, 1989). EBNA 3A, 3B y 3C se encuentran involucrados en la transformación de linfocitos B primarios (Khanna et al., 1995b).

(30)

29

linfocitos B, en forma activa (Pagano , 1992; Cohen, 2000). La proteína LMP 2 previene la reactivación del VEB en estado latente, localizado en células infectadas (Cohen, 2000).

Se conoce que los mayores componentes de la cubierta viral (MA), provenientes tanto de los viriones intactos como de las membranas plasmáticas de líneas celulares (infectadas con VEB) producidas , son al menos tres glicoproteínas gp350, gp220 y gp85 y una proteína no glicosilada p140. Al aislar gp350/220 de la funda viral, se demostró que eran proteínas antigénicamente activas, siendo a su vez de los mayores componentes contra los que se generan anticuerpos durante infección (Thorley Lawsony Poodry, 1982).

2.7.

Antecedentes

En los últimos años se han adelantado sistemas genéticos orientados a obtener modificaciones en el genoma viral que ayuden a contrarrestar o impedir la infección (Deleclusey Hammerschmidt, 2000).

A medida que incrementan las investigaciones y aumenta la relación de este virus con diversas enfermedades cancerígenas, los esfuerzos se han enfocado en encontrar tratamiento o una posible vacunación terapéutica contra VEB. Aunque el hecho de que la mayoría de la población se encuentre infectada con VEB desde muy temprana edad, hace más difícil la vacunación.

(31)

30

[image:31.612.212.427.195.525.2]

Estudios realizados por Urquiza y colaboradores (2005) reportaron la existencia de tres péptidos pertenecientes a gp350, involucrados directamente en la unión del VEB con los linfocitos B. Estas tres secuencias presentan homología con regiones de C3dg, molécula del complemento que actúa sobre las células B por medio de su unión a CR2 (Figura 7).

Figura 7 Estructura del complejo C3dg-CR2 y las regiones de C3dg que presentan homología con los péptidos de gp350: 11382, 11389 y 11416. En amarillo y ocre la estructura original de C3dg-CR2, excepto para las regiones de C3dg que son similares a

11382 (blanco), 11389 (morado) y 11416 (azul claro). En verde y anaranjado el complejo quimérico CR2-C3dg, excepto por las regiones C3dg cambiadas por las secuencias de alta unión (11382 gris, 11389 rojo y 11416 en azul) Tomado de (Urquiza

et al., 2005).

(32)

31

11382, 11389 y 11416 (secuencias conservadas) inhibieron la invasión de VEB a los linfocitos B, probablemente bloqueando el sector de inserción de VEB a las células hospederas (Figura 8). Dos de estos péptidos (11382 y 11416) unidos a linfocitos de sangre periférica y cordón umbilical, indujeron la síntesis de Interleuquina 6, mientras que los anticuerpos policlonales específicos para cada uno de ellos inhibieron la unión de VEB con los linfocitos B (Urquiza et al., 2005).

Los péptidos 11382 y 11389, se localizan al extremo N terminal de gp350, extremo soluble, ampliamente estudiado desde hace más de 20 años, pues ha sido determinado como altamente antigénico, mientras que el péptido restante se encuentra hacia el extremo C terminal.

Szakonyi y colaboradores, en el 2006, publicaron la estructura cristalizada de 470 aminoácidos ubicados al extremo N terminal de la gp350. Este segmento se encuentra libre de glicosilaciones y cargado negativamente lo cual facilita la unión a CR2, en las regiones denominadas SCR1 y SCR2, las cuales se encuentran cargadas positivamente. En este artículo demostraron que tanto la forma glicosilada como no glicosilada de este segmento de gp350 se une de manera similar a CR2 por lo que sugirieron que la glicosilación no es indispensable en la unión al receptor de células B (Szakonyi et al., 2006).

(33)
[image:33.612.133.520.76.395.2]

32

Figura 8 Actividad de unión celular de péptidos correspondientes a la gp350/220 en líneas celulares Raji, Ramos y P3HR-1. La 1ª columna muestra los números de los

péptidos utilizados en este estudio, La 2ª columna muestra las secuencias de los péptidos de gp350/220. Las barras negras representan la actividad de unión celular evaluada. Tomado de (Urquiza, Lopez et al. 2005). Los cuadros en rojo son los péptidos

objeto de este estudio en este trabajo, los cuales (como se observa en el segmento encerrado por los óvalos) fueron los que presentaron mayor capacidad de unión a

células B representadas por cada una de las líneas celulares.

(34)

33

3. Formulación del problema y justificación

3.1.

Formulación del problema

Las estrategias exitosas de infección que presenta VEB, han sido limitantes en el desarrollo de métodos que intervengan de manera eficaz e impidan su proliferación y permanencia en el hospedero. Existe un proteína importante en la interacción del virus con la célula hospedera, denominada gp350, cuya acción permite que el virus se una al receptor (CR2) presente en la superficie del linfocito B.

La gp350 ha sido estudiada como posible candidato a vacuna. A partir de fragmentos sintéticos provenientes de la misma se han identificado los péptidos con mayor capacidad de unión a la célula hospedera, los cuales han inducido respuestas celulares y humorales; el hecho de ser sintetizados artificialmente no ha permitido corroborar que esto se presente de igual manera en la interacción natural entre el virus y la célula en el organismo, por lo tanto se requieren técnicas moleculares que permitan obtener las regiones de interés en sistemas de expresión biológicos, permitiendo de esta manera, conseguir conformaciones protéicas más cercanas a las que existen de forma natural en el virus del Epstein Barr.

3.2.

Justificación de la investigación

(35)

34

Dentro de este contexto la utilización de proteínas recombinantes que contengan los fragmentos de alta unión, provenientes de la proteína obtenida a partir del genoma viral, permiten verificar los resultados obtenidos con los péptidos sintéticos y realizar otro tipo de ensayos biológicos, con el fin de conocer los mecanismos moleculares utilizados por el virus (VEB) al infectar las células hospederas y así adelantar estudios que permitan contrarrestar la infección.

(36)

35

4. Objetivos

4.1.

Objetivo general.

Obtener las proteínas recombinantes que contengan los tres fragmentos de alta unión a células B de la Glicoproteína 350 del virus Epstein Barr.

4.2.

Objetivos específicos

Amplificar la secuencia codificante para cada uno de los fragmentos de alta afinidad de unión a receptores de linfocitos B de la gp350 de VEB.

Clonar cada uno de los fragmentos obtenidos en un vector de expresión bacteriano.

Expresar la proteína recombinante para cada uno de los fragmentos en .

Identificar la expresión en de los fragmentos recombinantes.

(37)

36

5. Materiales y métodos

5.1.

Diseño de la investigación

Esta investigación obedece a un diseño experimental estándar de clonación de un gen en un vector de expresión bacteriano, en donde los siguientes factores se encuentran controlados (según la indicación propia de cada procedimiento): Parámetros de PCR, cantidades de muestra de ADN para ligación, transformación, concentraciones de soluciones, tiempos de incubación y expresión de proteína recombinante para purificación. En este tipo de diseño, se siguen exactamente los protocolos ya estandarizados para cada uno de los procedimientos.

Las unidades experimentales son las colonias positivas que contengan el inserto correctamente dirigido en el vector, escogidas para la expresión de cada fragmento de gp350 como proteína recombinante. También se toma como unidad experimental las fracciones puras de cada uno de los fragmentos.

5.2.

Métodos

A continuación se enuncian las técnicas y procedimientos básicos empleados para llevar a cabo la realización de este trabajo de grado.

5.2.1. Secuencia nucleotídica genómica del virus de Epstein Barr

(38)

37 5.2.2. Diseño de los cebadores

Se diseñaron cebadores para amplificar las dos regiones de interés del gen !"

de VEB: La primera codifica un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de los péptidos 11382 y 11389 y la segunda contiene el polipéptido 11416; los cuales han sido reportados como de alta capacidad de unión a los receptores CR2 de linfocitos B (Urquiza et al., 2005).

Para la creación de ambos cebadores Directos se agregó el codón de iniciación ATG, con el fin de incorporar la Metionina inicial, mientras que los cebadores reversos se diseñaron sin adicionar el codón de terminación, pues el vector bacteriano escogido para su clonación, adiciona al 3´ la secuencia codificante para un grupo de 6 Histidinas. Según esto, los cebadores diseñados fueron: Para el Fragmento I (5´ ATGATCCAGAGCCTGATCCATC 3´ Directo y 5´ GGTGTTTGTCGGCATGTC 3´ Reverso) y para el Fragmento II (5´

ATGAAGGCCAATTCTACCACCG 3´ Directo y 5´

TACATAGGTCTCGGCGTCA 3´ Reverso).

5.2.3. Amplificación por PCR

Se utilizó ADN genómico de la línea celular Raji CCL 86 (ATCC, Virginia, USA) infectada con VEB como molde para la reacción. Este ADN genómico fue provisto por el Grupo Funcional de Virología de la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia (FIDIC). Se amplificaron las dos regiones seleccionadas a partir de los cebadores previamente diseñados. Las reacciones de PCR (polymerase chain reaction) se realizaron a un volumen final de 50 µL y las concentraciones finales de reactivos fueron: 1X PCR Buffer, 1,5 mM de MgCl2,

(39)

38 Condiciones de la PCR:

5.2.4. Electroforesis en gel de Agarosa

En términos generales la electroforesis en gel de agarosa permite la visualización de fragmentos de ADN. Para esto, se realizaron geles al 1% de Agarosa en 1X de Buffer TAE (Anexo I) teñidos con de Bromuro de Etidio.

5.2.5. Purificación del fragmento amplificado

La purificación de cada fragmento amplificado se realizó directamente a partir del

producto de PCR, utilizando el kit Wizard PCR prep (Promega, Wisconsin,

USA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

5.2.6. Inserción del fragmento purificado en el vector de Expresión

Ligación del producto de PCR purificado en el vector de expresión bacteriano

Se utilizó el kit de ligación para producto de PCR, pEXP5 CT/TOPO

(Invitrogen, California, USA). Se escogió este vector de expresión ya que permite fusionar al fragmento clonado una cola de 6 Histidinas (Figura 9), con el fin de facilitar la purificación de la proteína recombinante obtenida y su identificación por Western Blot, utilizando un anticuerpo anti His (Sigma, Missouri, USA). Otra de las ventajas al utilizar este vector es que presenta un sitio de clonación TOPO con lo cual el producto amplificado de PCR es directamente clonado en el vector

Ciclos Temperatura Tiempo

1 95°C 5 min

35

Tm para cada Fragmento

I: 57°C II: 58°C

1 min

(40)

39

[image:40.612.177.463.273.556.2]

y el procedimiento se realiza de una manera rápida y sencilla. Además su síntesis está controlada por el promotor T7, lo que representa una ventaja para la posterior expresión exponencial pues al realizar la transformación en células BL 21 AI (tal y como se hizo en este trabajo) se puede reprimir o inducir la transcripción del gen codificante para la proteína de interés y de esta manera controlar su expresión. Estas células presentan un regulador transcripcional que forma un complejo con la L Arabinosa y de esta manera se induce la transcripción de la T7 RNA polimerasa, la cual reconoce el promotor T7 y sólo así se da la producción de la proteína a expresar.

Figura 9 Mapa del vector de expresión tomado de www.invitrogen.com

(41)
[image:41.612.203.435.132.284.2]

40

Tabla 1 Reactivos y cantidades ligación. Inserto: pEXP5-NT/TOPO and pEXP5-CT/TOPO

TA Expression Kits (PDF) version: Version C 02/15/06.

Reactivos Cantidades

Producto de PCR (0.5 1 µg/µL) 4 µL

Solucion Salina (Provista por el kit) 1 µL

Agua (Provista por el kit) 0,5 µL

TOPO® Vector 0,5 µL

Volumen Total 6 µL

5.2.7. Transformación en E.coli

Antes de realizar la transformación en las células competentes, se realizó un ensayo con el plásmido control pUC19, provisto en el kit del vector a utilizar. Esto con el fin de estandarizar el tiempo de choque térmico más efectivo; según el protocolo debía ser de 30 s, así que se realizaron transformaciones independientes para probar tres tiempos diferentes: Una con 30 s de choque térmico, otra con 1 min y la última con 2 min.

La transformación se realizó utilizando 1x108 cfu (Unidades formadoras de colonia), de la siguiente forma:

1. El inserto ligado fue incubado con las células termocompetentes TOP10 (para la clonación) y KCM (KCl 100 mM, CaCl2 30mM y MgCl2 50 mM)

(Anexo I) durante 20 min en hielo.

(42)

41

3. Para cada fragmento, todo el contenido de mezcla fue sembrado en una caja de medio LBA (Anexo I) (Luria Bertani agar + ampicilina 100 µg/mL). Posteriormente las cajas fueron incubadas 16 h a 37oC, preferiblemente durante la noche.

5.2.8. PCR de colonia

(43)

42

Secuencia complementaria del cebador reverso

[image:43.612.132.521.79.278.2]

Secuencia complementaria del cebador reverso

Figura 10 Diagrama del sitio de múltiple clonaje. Resaltado en azul el sitio de inserción

del producto de PCR. Cebadores correspondientes al promotor T7 y el cebador reverso

diseñado en la FIDIC (la secuencia complementaria a aquella encerrada en el óvalo rojo

corresponde al cebador sintetizado) Tomado de www.invitrogen.com. Versión: C

02/15/06.

Del total de colonias positivas para la PCR de colonia se seleccionaron tres para cada fragmento, las cuales se sembraron en 3mL de medio TB (Anexo I) (Terrific Broth + ampicilina 100 µg/mL) y se incubaron en agitación constante (175rpm) durante toda la noche (16 hs aprox.) a 37°C, para purificación del ADN plasmídico

5.2.9. Purificación del AD plasmídico

La purificación del ADN plasmídico se llevó a cabo utilizando el kit Wizard plus minipreps ADN purification System (Promega, Wisconsin, USA) con la finalidad de aislar el ADN para secuenciar el segmento clonado.

5.2.10.Digestión con enzimas de restricción

(44)

43

plasmídico de cada una de las colonias escogidas para cada fracción junto con las enzimas de restricción XbaI y PstI (Fermentas, Maryland, USA). La reacción se realizó a un volumen final de 15 µL utilizando 1X de Buffer Tango, 1U de Enzima PstI, 1U de Enzima XbaI (Fermentas, Maryland, USA) y 10 µL de ADN plasmídico y se incubó durante 3 h a 37°C. El resultado se analizó en gel de Agarosa al 1% (p/v) teñido con Bromuro de Etidio, utilizando el patrón de talla molecular de 1Kb HypperLadder I (Fermentas, Maryland, USA).

5.2.11.Secuenciación

Al secuenciar el fragmento insertado, se puede determinar el nivel de variación que éste presenta y si el inserto se clonó en marco de lectura con la cola de 6 Histidinas. Para enviar a secuenciar se utiliza el producto obtenido en la purificación del ADN plasmídico (plásmido recombinante) en concentraciones que oscilen entre 50 y 100 ng/µL). Se purificaron para secuenciar dos clones de cada fragmento de VEB; esto se realizó a través del servicio que presta Macrogen® en Corea y las muestras se enviaron para secuenciación de extensión simple según las indicaciones establecidas en su página web: http://www.macrogen.com/eng/sequencing/extension.jsp.

5.2.12.Transformación del vector recombinante en las células de expresión

(45)

44

Para transformar el plásmido en estas células se llevó a cabo el mismo procedimiento descrito para la transformación en TOP10.

Luego que las cajas fueron incubadas durante toda la noche, se tomaron 5 colonias pertenecientes a cada una de las construcciones recombinantes y se inocularon independientemente en 5 mL de medio TB (Terrific Broth + ampicilina 100 µg/mL), las cuales se incubaron a 37°C en agitación constante durante toda la noche.

5.2.13.Expresión

Para la expresión se inoculó 25 mL de medio TB (Terrific Broth + ampicilina 100 µg/mL + 125 µL del inhibidor D glucosa al 20% p/v) con 1.25 mL (5% del total a expresar) del cultivo de la noche anterior. Este procedimiento se realizó por separado para cada una de las 5 colonias pertenecientes al Fragmento I y II (10 colonias en total). El cultivo se dejó incubando hasta que se alcanzó un valor de densidad óptica de 0.6, medida a una Longitud de Onda (λ) de 600nm. El tiempo de incubación para alcanzar esta densidad óptica fue de aproximadamente 1 h. 30 min.

A continuación se menciona el procedimiento que se hizo para cada una de las 10 colonias en estudio.

1. Se tomó una alícuota de 5mL de muestra no inducida y luego, se siguió el protocolo ya estandarizado para este tipo de células de expresión.

2. Los 20 mL restantes se indujeron con L Arabinosa a una concentración de 0,2% (p/v). Luego se incubó a 37°C en agitación constante (175rpm) durante 5 h.

(46)

45

4. En cada una de las muestras se descartó el sobrenadante y el sedimento celular (pellet) se resuspendió en Urea 6M. El volumen de Urea utilizado fue calculado según la cantidad de biomasa obtenida (aproximadamente 1 mL por cada mg de biomasa).

Para las muestras inducidas se agregaron 300 µL de Urea y 24 µL de lisozima (100 µg/µL), mientras que las cantidades para las muestras no inducidas fueron de 50 µL de Urea y 4 µL de lisozima. Todas las muestras se dejaron en agitación constante durante 30 min a temperatura ambiente.

5. Las células fueron lisadas por sonicación utilizando un sonicador digital Branson (Digital sonifier W450D®, BRANSON, Laboratorios G.Heinemann, Schwäbisch Gmünd, Alemania) durante 45 s, a una amplitud de 10% y con impulso de encendido de 1 s y de apagado de 0,5 s. 6. Las muestras se dejaron a 4°C en agitación constante por 16h.

7. Luego de esto, se centrifugaron a 4°C durante 10 min a 13,000rpm y de allí en adelante se trabajó con el sobrenadante obtenido en esta etapa.

5.2.14.Identificación de las proteínas recombinantes por electroforesis y

Western Blot

El gel de electroforesis bajo condiciones desnaturalizantes separa las proteínas según su peso molecular, éstas se mueven a través de la matriz de gel, bajo un campo de corriente.

(47)

46

puentes disulfuro de la misma. Cada mezcla se sometió a ebullición durante 5 min. y se centrifugó a 13,000 rpm durante 5 min, con el fin de evitar precipitaciones en el gel.

Luego de separar las proteínas según peso molecular, se realizó la transferencia (Anexo I) a una membrana de nitrocelulosa en una cámara para este fin (Trans Blot SD Semidry Electrophoretic Transfer cell, Bio Rad, California, USA).

Luego de la transferencia, se bloqueó la membrana durante 1 h a temperatura ambiente con 5% (p/v) de leche descremada en PBS y 0,05% (v/v) de Tween 20, se lavó tres veces (durante 5 min cada lavado) con PBS y 0,05% (v/v) de Tween 20.

Se incubó la membrana a temperatura ambiente con un anticuerpo monoclonal Anti His(6) acoplado a peroxidasa (Sigma, Missouri, USA) diluido en 5% (p/v) de leche descremada en PBS y 0,05% (v/v) de Tween 20, a razón de 1:4,500, durante 1 h. 30 min. El exceso de anticuerpo fue removido lavando tres veces durante 5 min. con PBS y 0,05% (v/v) de Tween 20.

El revelado se realizó empleando el kit Vector® VIP SK 4600 (Vector Lab, California, USA) según las recomendaciones del fabricante.

(48)

47

5.2.15.Identificación de las proteínas recombinantes por electroforesis: Western Blot y tinción con Azul de Coomassie

Con el fin de identificar la colonia escogida para las construcciones recombinantes VEBI pEXP5 CT (Fragmento I) y VEBII pEXP5 CT (Fragmento II) se realizaron dos geles para cada una de ellas, uno para teñir en Azul de Coomassie (con el fin de evidenciar todas las proteínas existentes en cada lisado) y otro para realizar Western Blot. Para cada uno de los fragmentos se hicieron geles de poliacrilamida a porcentajes diferentes, de acuerdo con el peso esperado de la proteína correspondiente, por lo tanto para el Fragmento I se hizo un gel de poliacrilamida al 10%, mientras que el Fragmento II se corrió en un gel de poliacrilamida al 14% (Anexo I).

Antes de sembrar las muestras en los geles, éstas se prepararon de la siguiente forma: se realizó una dilución del lisado celular a razón de 1.5:30 para cada colonia recombinante y éste se mezcló con Buffer Laemmli a razón de 1:4 con el fin de dar densidad a la muestra. Cada tubo conteniendo la mezcla antes mencionada, se sumergió en agua a temperatura de ebullición durante 5 min. y se centrifugó a 13,000 rpm durante 5 min, con el fin de evitar precipitaciones de muestra en el gel. En cada uno de los geles de poliacrilamida se sembraron muestras inducidas y la muestra no inducida para cada fragmento (I y II).

(49)

48

5.2.16. Purificación de las proteínas recombinantes obtenidas para cada fragmento

Las proteínas recombinantes fueron purificadas por medio de cromatografía por afinidad, en condiciones desnaturalizantes utilizando Urea 6M en una columna

con resina Ni+2 NTA (Qiagen, California, USA), de acuerdo con las

recomendaciones del fabricante.

Luego de escoger las colonias a expresar (una para cada fragmento) y de hacer el ensayo de expresión para 100 mL de medio TB, se utilizó el lisado que se dejó en agitación a 4°C durante 16 h y se centrifugó a esa misma temperatura durante 15 min a 12,000 rpm. El sobrenadante se dejó en agitación constante con la resina utilizada para la purificación durante 1 h a temperatura ambiente para asegurar el acoplamiento de ésta con la proteína. Posteriormente, se pasó por una columna de separación (Econo column chromatography columns 1x20cm, Bio Rad, California, USA). Para remover los residuos que no se acoplaron a la resina, se hizo una primera extracción con solución de Urea 6M; a medida que se agregaba la solución de Urea, se monitoreó la densidad óptica de las fracciones obtenidas a 280nm, de tal forma que cuando las fracciones estuvieran muy cerca al valor de la muestra blanco (Urea 6M a OD ~0.04), se comenzó la elución de la proteína con Imidazol a una concentración de 50 mM, extrayendo fracciones de aproximadamente 4 mL.

(50)

49 5.2.17.Cuantificación de Proteína

Se tomaron 4 fracciones purificadas de cada proteína recombinante para realizar la cuantificación. Esto se realizó por medio del ensayo del ácido bicinconínico (Smith, Krohn et al. 1985) utilizando el BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce Biotechnology, Illinois, USA).

Las reacciones se realizaron en placas de 96 pozos, 96 U shaped multi well plate (Linbro) y leídas a λ570 nm en un escáner Labsystems Multiskan MS (Labsystems).

5.3.

Análisis bioinformático

5.3.1. Diseño de cebadores

Los cebadores para VEB I y VEB II en pEXP5 fueron diseñados utilizando el software Gene Runner 3.05 (Hastings software, Inc.) confirmando la ausencia de estructuras secundarias como horquillas (hairpins), dímeros ó lazos (loops).

5.3.2. Clonación del inserto codificante para VEB I y II

(51)

50

5.3.3. Secuencia de los fragmentos del gen gp350 en pEXP5

Las secuencias fueron corregidas, ensambladas y editadas usando el software Vector NTI Suite 9 (Invitrogen, California, USA).

5.3.4. Índice de Adaptación de Codones (CAI)

Se empleó el Índice de Adaptación de Codones (CAI) con el fin de determinar la eficacia de en la expresión de los fragmentos del gen !" El CAI es una medida de la adaptabilidad relativa del uso de codones de un gen con respecto al uso de codones en genes de alta expresión. La adaptabilidad relativa (w) de cada codón es una relación entre la frecuencia con que cada codón es usado y la frecuencia del codón más abundante para el mismo amino acido (Sharpy Li, 1987). Los valores de este índice oscilan entre 0 y 1, siendo valores menores a 0.2 los de genes con codones poco utilizados, lo cual representa una mínima expresión de la proteína en cuestión, valores entre 0.2 0.4 se dan comúnmente en genes con un bajo nivel de expresión, aquellos que van entre 0.4 0.8 para genes de expresión moderada, y valores mayores a 0.8 representan niveles de expresión elevados. En este trabajo se utilizaron como referencia las cepas ( ) CFT 073 con 5,379 codones identificados y la 536 con 4,629 codones.

5.3.5. Determinación del Punto Isoeléctrico de los Fragmentos expresados

(52)

51

5.3.6. Importancia de la Predicción de glicosilación

La mayoría de proteínas en la naturaleza presentan modificaciones post transduccionales, dentro de las cuales la glicosilación es la más común pues permite una mayor diversificación estructural (Julenius et al., 2005) y se encuentra principalmente involucrada en reconocimientos en la superficie celular, debido a que influye en la estructura tridimensional de las proteínas. Expresar fragmentos altamente glicosilados en puede no ser adecuado ya que, a pesar de ser una bacteria de uso frecuente en biología molecular debido al total conocimiento de su genoma y su fácil y rápida replicación, este evento es muy raro en bacterias, pues en sólo se conocen hasta el momento dos proteínas glicosiladas, las cuales intervienen en la virulencia de la cepa (Sherlock , 2006).

Al obtener la recombinante de los dos fragmentos en estudio, es importante conocer si en su estructura nativa existen residuos glicosilados, de ser así, el haber realizado esta expresión en no permitiría tener ese acercamiento a la estructura real de la proteína.

5.3.7. Predicción de secuencia señal y localización subcelular

Con el objetivo de predecir la existencia de una secuencia señal en la proteína nativa, se utilizó la herramienta SignalP 3.0 disponible en la página web http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/. Con esta herramienta se pretende identificar proteínas que presentan mecanismos de secreción por via clásica. El funcionamiento de este predictor se basa en dos modelos: redes neuronales (NN) y modelo oculto de Markov (HMM), donde el primero realiza la clasificación de las secuencias en cuanto a si presentan o no sitio de clivaje y la segunda permite corroborar si las clasificadas dentro de las que no presentan sitio de clivaje, tienen un sitio de anclaje.

(53)

52

http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/, la cual, entiende como un indicativo de secreción, un valor superior al umbral que es de 0.5. Este programa trabaja a partir del modelo de redes neuronales y fue entrenado para identificar proteínas (pertenecientes a células eucarióticas y bacterias) con ubicación extracelular cuya secuencia no presenta péptido señal (Bendtsen , 2004).

Con respecto a la localización subcelular se utilizó un predictor desarrollado para identificar la ubicación en la célula de las secuencias virales exclusivamente. Este predictor se denomina Virus PcelLoc, disponible en la página http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/virus/. El cual ha sido desarrollado a partir de la fusión de diversas características de varios clasificadores básicos ajustados por medio de una regla de los k vecinos más cercanos (Sheny Chou, 2007).

5.3.8. Predicción Sitios de Glicosilación

Los residuos a los cuales se une un grupo carbohidrato alterando la estructura tridimensional de la proteína son conocidos como los sitios de glicosilación (Vigerusty Shepherd, 2007). En este trabajo se realizaron predicciones tanto para para N glicosilación como para O glicosilación. Para el primer proceso se utilizó la herramienta NetNGlyc 1.0 Server, disponible en la página web http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/, la cual infiere a partir de la secuencia los sitios donde es más probable que se de la adición del radical de manosa. La secuencia consenso para esta modificación es Asn Xaa Ser/Thr (donde Xaa puede ser cualquier aa menos Pro), sin embargo, no siempre este tipo de secuencias son modificadas. Esta herramienta fue entrenada a partir de un modelo de redes neuronales para discriminar entre secuencias aceptoras y no aceptoras (Guptay Brunak, 2002).

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proteolítica, solubilidad, propiedades inmunológicas, uniones a ligandos, entre otras (Gupta , 1999).

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6. Resultados

[image:55.612.152.483.246.451.2]

Como primer paso se amplificaron las secuencias correspondientes a cada uno de los fragmentos del gen !" , a partir de ADN genómico del virus. El tamaño teórico esperado para el fragmento I luego de la 1ª PCR fue de 927 pb y para el fragmento II de 393 pb. Este resultado se pudo evidenciar en un gel de agarosa, en donde claramente se observaron las bandas a la altura de la talla molecular esperada (Figura 11).

Figura 11 Gel de agarosa al 1% evidenciando la amplificación de ambos fragmentos

a partir de células Raji. Carriles: 1: VEB I, 2: VEB II, TM: Patrón de talla molecular de

2000pb.

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[image:56.612.171.468.96.402.2]

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Figura 12 Evaluación de transformación en células de clonación con diferentes tiempos de choque térmico

Luego de la transformación de cada uno de los fragmentos de gp350 en las células de clonación, se escogieron 10 colonias al azar y se realizó una PCR de colonia confirmatoria con el fin de verificar si el inserto se clonó en la dirección correcta. Esto se hizo empleando el cebador directo sintetizado para cada fragmento y el reverso del plásmido.

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[image:57.612.135.501.159.359.2]

la figura se observa que las colonias 4, 6 y 8 presentan una banda con talla semejante, pero con menor intensidad, así que éstas no se tomaron en cuenta (figura 13.B).

Figura 13 PCR de colonia (E.coli TOP10) a partir de colonias transformadas con cada fragmento purificado y ligado en pEXP5, utilizando el cebador directo del fragmento en pEXP5 y el reverso del plásmido. A. VEBI - Carriles 2, 6 y 7: Se observan las colonias con el producto insertado correctamente a una altura de aprox. 1000pb. B. VEBII – Carriles 2 al 10: Se observan las colonias con el producto insertado correctamente a una altura de

aprox. 480pb. TM patrón de talla molecular.

Del total de las colonias a las que se les confirmó la presencia del inserto correctamente orientado, se escogieron 3 colonias de cada fragmento con el fin de verificar la integridad del gen mediante digestión con las enzimas de restricción XbaI y PstI; cada una de estas enzimas corta una sola vez: la primera en el plásmido (pEXP5) y la segunda dentro de cada uno de los insertos (VEBI y VEBII).

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[image:58.612.176.461.155.371.2]

VEB y las colonias 5, 9 y 10 para el fragmento II. En la figura 14 se observa la digestión de las colonias 7 (VEBI) y 9 (VEBII), las cuales presentan las bandas a las alturas esperadas.

Figura 14 Patrón de digestión con XbaI y PstI. Carril 1. VEB I colonia 7; Carril 2. VEB II colonia 5; Carril 2 y 3. VEB II colonias 7 y 9; TM patrón de talla molecular.

Luego de este procedimiento, se analizaron las secuencias de dos de las colonias positivas para cada uno de los fragmentos. Con esto se confirmó que los fragmentos clonados en las colonias 2 y 7 para VEB I y las colonias 5 y 9 para VEBII, se encontraban en correctas condiciones, especialmente en marco de lectura con el grupo de 6 histidinas adicionado por el vector. El fragmento I, presentó una longitud de 954pb dada por la secuencia producto de la extracción de la 1ª PCR (927pb) más los 27 nucleótidos codificantes para las 6 Histidinas y el codón de finalización que le adiciona el vector. Para el fragmento II la secuencia es de 420pb, pues la PCR inicial es de 393pb y luego de la ligación se encuentran los 27 nucleótidos adicionados por el vector.

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Fragmento VEB I: Las dos colonias escogidas presentaron 8 cambios nucleotídicos en común; éstos se dieron en las posiciones 186, 381, 417, 420, 426, 492, 537 y 840. Tomando la secuencia reportada como referencia, en la posición 381 se reemplazó una Citosina por una Adenina, en la 417 una Adenina por una Citosina y en todas las otras posiciones, el reemplazo fue de Adenina por Guanina (Anexo II.I). Al traducirse esta secuencia, se observó que todos los cambios anteriores dieron lugar a substituciones sinónimas.

En la colonia 2 se observó un cambio adicional en la posición 68 de la secuencia nucleotídica, donde se reemplazó la Timina presente en la secuencia teórica por una Citosina, esto repercutió en la secuencia de aminoácidos reemplazando una Fenilalanina por una Serina (F23S).

Teniendo en cuenta la secuencia de aminoácidos, la colonia 7 presenta mayor identidad con la secuencia reportada para esta proteína (99,68%) (Anexo II.I.2).

Fragmento VEB II: Las dos colonias escogidas presentaron 5 cambios

nucleotídicos en común en las posiciones 106, 151, 282, 327 y 342. Los cambios en las posiciones 282, 327 y 342 fueron sinónimos mientras que los otros dos cambios fueron no sinónimos y tuvieron repercusión en la secuencia de aminoácidos al ser traducidos: 106 (P36T) y 151 (K51E); sin embargo, sólo uno de los cambios (K51E) se dio dentro de la secuencia del péptido 11416, el cual es de importancia en la unión a células B.

La colonia 9 presentó un cambio adicional en la posición 84, cambio que al ser traducido se convirtió en una sustitución sinónima. La identidad entre la secuencia de las colonias escogidas y la secuencia teórica fue del 98,57%.

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encontró que los dos cambios encontrados en cada uno de las colonias del Fragmento II, coincidían con la cepa GD1 (N° de Acceso GenBank: AY961628).

Se evaluó el índice de adaptación de codones (CAI) para estimar la idoneidad de para transcribir los fragmentos de interés en este trabajo. Se realizaron dos análisis utilizando dos cepas diferentes de , las cuales difieren en la cantidad de genes estudiados en cada una. El valor de CAI para VEB I (309 codones), utilizando la cepa CFT 073 con 5379 genes identificados, es de 0.615 y para VEBII (131 codones) de 0.595. Se obtuvo otro valor de CAI para ambos fragmentos, esta vez utilizando la cepa 536 con 4629 genes identificados; el valor para VEB I fue de 0.606 y para VEB II fue de 0.582.

Con estos resultados, se observa que los valores obtenidos para los dos fragmentos con ambas cepas de son similares y se encuentran dentro del rango normal de expresión de genes.

Adicionalmente, se calculó el punto isoeléctrico (pI) teórico de cada uno de los fragmentos (Anexo III). El Fragmento I tuvo un pI de 4.71, mientras que el pI del Fragmento II fue de 9.49.

Para cada uno de los Fragmentos, se escogió una colonia en TOP10 previamente confirmada por secuenciación, y se transformó en las células de expresión (BL21 AI). Se escogió el ADN plasmídico correspondiente a la colonia 7 para expresar el Fragmento I y el ADN plasmídico de la colonia 9 para expresar el Fragmento II. Para corroborar la expresión de cada proteína recombinante, se obtuvieron los pesos teóricos a partir de la secuencia de aminoácidos (con el programa Gene Runner 3.05). Para VEBI el valor esperado es de 34.6 kDa y para VEBII, de 15.27 kDa.

Figure

Figura 1 Esquema de un herpesvirus. Tomado de
Figura 2 Mecanismos involucrados en la entrada de los herpesvirus y su   fusión celular
Figura endonucleasas de restricción. TR, Terminal repeat; IR internal repeat; U, unique region
Figura 4 Esquema de infección de VEB durante las etapas primaria y persistente.  Tomado de Cohen 2000
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Referencias

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