Relación entre infecciones quiescentes de colletotrichum gloeosporioides (Penz) y los diferentes estados fenológicos del fruto de mango (magnifera indica L) variedad hilacha

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RELACION ENTRE INFECCIONES QUIESCENTES DE Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Y LOS DIFERENTES ESTADOS FENOLÓGICOS

DEL FRUTO DE MANGO (Magnifera indica L) VARIEDAD HILACHA

LORENA PARRA AYA

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial Para optar al título de

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NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de julio de 1946

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RELACION ENTRE INFECCIONES QUIESCENTES DE Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Y LOS DIFERENTES ESTADOS FENOLÓGICOS

DEL FRUTO DE MANGO (Magnifera indica L) VARIEDAD HILACHA

LORENA PARRA AYA

APROBADO

____________________________ Mª Clemencia Forero de la Rotta

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RELACION ENTRE INFECCIONES QUIESCENTES DE Colletotrichum gloeosporioides (Penz) Y LOS DIFERENTES ESTADOS FENOLÓGICOS

DEL FRUTO DE MANGO (Magnifera indica L) VARIEDAD HILACHA

LORENA PARRA AYA

APROBADO

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Agradecimientos

A Dios.

A mis padres Arnulfo Parra y Betty de Parra por darme la oportunidad de estudiar y ser una persona de bien, a mis hermanas Johana, Natalia y Maria Camila por el apoyo que me brindaron.

A mi novio Julian por todo el tiempo, colaboración, dedicación y apoyo para poder realizar con éxito este proyecto.

Maria Clemencia Forero de la Rotta, por la confianza, por su colaboración, por sus enseñanzas y por guiarme en este proyecto.

A Jairo Osorio por la oportunidad y la confianza de dejarme realizar este trabajo.

A Juan Clímaco Hío y Erika Patricia Martínez. Laboratorio de Fitopatología. CORPOICA. Por su apoyo y colaboración.

A Carlos y Dimas. Laboratorio de Fitopatología. CORPOICA Nataima. Por sus colaboraciones.

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RESUMEN

La antracnosis cuyo agente causal es Colletotrichum gloeosporioides, es

considerada la enfermedad mas limitante en cultivos de mango variedad hilacha ocasionando numerosas pérdidas en su producción, incitando a la búsqueda de alternativas de manejo iniciando por un conocimiento pleno del agente causal y su relación parasítica con el hospedero. Se obtuvieron aislamientos de Colletotrichum gloeosporioides de frutos aparentemente

sanos de Mango variedad Hilacha, en los diferentes estados fenológicos (E1, E2, E3 y E4) desde fruto en desarrollo hasta fruto maduro.

Las infecciones quiescentes se presentaron con mayor frecuencia en estados fenológicos iniciales (E1 y E2), comparados con los estados de desarrollo avanzado, debido probablemente al efecto del pH del fruto.

Se realizaron pruebas biológicas para determinar la patogenicidad del hongo y confirmar la especie de Colletotrichum que se presenta en los frutos de

esta especie. Las pruebas de sensibilidad al Benomyl, la prueba cualitativa

de la proteaza y el medio selectivo para Colletotrichum spp. determinaron la

presencia de la especie C. gloeosporioides como el agente causal de la

antracnosis. La patogenicidad de los aislamientos se evaluó inoculando bloques de agar sobre los frutos. Se demostró que todos los aislamientos causan infección en los frutos.

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ABSTRACT

The anthracnose whose causative agent is Colletotrichum gloeosporioides, is

considered the most limiting disease in mango crops causing numerous losses in their production, prompting the search for alternative management by initiating full knowledge of the causative agent and its parasitic relationship with the accommodation provider. The Insulation of Colletotrichum gloeosporioides earned of fruits apparently of healthy Mango variety stringless, at different phenological stages (E1, E2, E3 and E4) from developing fruit until ripe fruit. The results showed that quiescent infections were presented with greater frequency in phenological stages initials (E1 and E2), compared with the advanced stages of development, probably due to the effect of pH of the fruit.

Biological tests were conducted to determine the pathogenicity of the fungus and confirm the kind of Colletotrichum occurring in the fruits of this kind.

Evidence of sensitivity to Benomyl, the qualitative evidence from the proteaza and selective medium for Colletotrichum spp. determined the presence of the species C. gloeosporioides as the causal agent of anthracnose. The pathogenicity of the isolates were evaluated by inoculating agar blocks on the fruits. It showed that all isolates cause infection in the fruits.

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CONTENIDO

Pag

1. INTRODUCCIÓN 14

2. MARCO TEORICO 16

2.1 Mango común o Hilacha (Mangifera indica L.) 16

2.1.1 Botánica y Descripción 16

2.1.2 Condiciones Agroecológicas 18

2.1.3 Plagas y Enfermedades 19

2.2 Agente Causal 19

2.2.1 Taxonomía 20

2.2.1.1 Estado Telemorfo 20

2.2.1.2 Estado Anamorfo 20

2.3 Generalidades 21

2.4 Desarrollo de la Enfermedad 22

2.4.1 Infecciones quiescentes 24

2.5 Síntomas 28

2.6 Condiciones Epidemiológicas 29

2.7 Métodos de Diagnóstico 31

2.8 Control 32

3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION 33

4. OBTETIVOS 35

4.1. Objetivo general 35

4.2. Objetivos específicos 35

5. MATERIALES Y METODOS 36

5.1. Localización de la Investigación 36

5.2. Muestreos de frutos. 37

5.3. Detección de infecciones quiescentes 39 5.4. Aislamiento de Colletotrichum sp. 39

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5.5. Pruebas Biológicas 41 5.5.1. Medio selectivo para Colletotrichum sp. 41

5.5.2 Pruebas de Patogenicidad 42

5.5.3 Prueba de tolerancia al Benomyl 44

5.5.4. Prueba de la Proteasa 44

5.6. Determinación del pH en los diferentes estados del fruto de

Mango. 45

6. RESULTADOS Y DISCUSION 47

6.1 Aislamientos de Colletotrichum sp. 47

6.2 Detección de Infecciones Latentes en frutos asintomáticos de

Mango. 49 6.3 Medio selectivo para Colletotrichum sp. 52

6.4 Prueba de Benomyl 53

6.5 Prueba de la Proteasa. 54

6.6 Pruebas de Patogenicidad 56

6.7 Determinación de pH en Frutos sanos y Enfermos de Mango. 57

7. CONCLUSIONES 63

8 RECOMENDACIONES 65

9. REFERENCIAS 66

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TABLA DE FIGURAS

Pag Figura 1. Ciclo de vida de la enfermedad de Antracnosis causada por

Glomerella cingulata y Colletotrichum gloeosporioides. 22

Figura 2. Proceso de las infecciones quiescentes en Mango. 24 Figura 3. Eventos entre el patógeno y el hospedero dentro de la

infección quiescente en frutos por C. gloeosporioides. 27

Figura 4. Frutos de Mango. 28

Figura 5. Estados Fenológicos de Mango. E1, E2, E3 y E4. 37 Figura 6. Frutos de Mango sanos con y sin bloques de agar con

micelio del microorganismo. 42

Figura 7. Características microscópicas de C. gloeosporioides. 46

Figura 8. Aislamientos de Colletotrichum sp. 47

Figura 9. Porcentaje de infección quiescente de C. gloeosporioides

en los diferentes estados fenológicos de frutos de mango. 49

Figura 10. Prueba de Benomyl. 52

Figura 11. Prueba de la Proteasa. 54

Figura 12. Frutos de Mango con síntomas de antracnosis iniciales y

avanzadas. 55 Figura 13. Efecto de Antracnosis sobre el pH en mesocarpio y

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LISTA DE TABLAS

Pag Tabla 1. . Etapas fenológicas de los frutos de Mango, de acuerdo con

la edad, dimensiones, peso y otras características.

37

Tabla 2. Clasificación de las especies según los medios de evaluación biológica.

41

Tabla 3. Periodo de Incubación de los Diferentes Estados Fenológicos de Frutos de Mango.

48

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LISTA DE ANEXOS

Pag

ANEXO 1. Preparación de Agar Agua. 73

ANEXO 2. Preparación de PDA. 74

ANEXO 3. Protocolo de Cámaras Húmedas. 75

ANEXO 4. Protocolo Monospóricos. 77

ANEXO 5. Medio para evaluar la reacción de la proteasa producida por Colletotrichum acutatum.

80

ANEXO 6. Protocolo Medio Suplementado con base Benomyl. 81

ANEXO 7. Protocolo Medio Suplementado con Hidróxido de Cobre y

Estreptomicina. 83

ANEXO 8. Incidencia de Infecciones Quiescentes en los estados

fenológicos de frutos de Mango. 85

ANEXO 9. Pruebas de Validación, Normalidad y comparación de promedios en la incidencia de infecciones quiescentes en los estados fenológicos de frutos de mango.

88

ANEXO 10. Características Morfológicas de los Aislamientos. 91

ANEXO 11. Prueba de Benomyl con 2 repeticiones. 92

ANEXO 12. Prueba de la Proteasa con 2 repeticiones. 93

ANEXO 13. Prueba de medio selectivo para Colletotrichum sp. 94

ANEXO 14. Presencia de síntomas iniciales de Antracnosis en los

tratamientos de Patogenicidad. 96

ANEXO 15. Efecto de la Enfermedad sobre el pH en áreas sanas y

enfermas de frutos enfermos y en frutos sanos. 97

ANEXO 16. Pruebas de Validación, Normalidad y comparación de

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1. INTRODUCCIÓN

El mango es una de las frutas tropicales considerada de gran importancia socioeconómica en Colombia junto con el banano y los cítricos, ya que constituye una alternativa productiva de alto potencial en el mercado nacional y de exportación.

En Colombia existen alrededor de 13.900 hectáreas sembradas con este frutal, que producen aproximadamente 170.000 toneladas de frutas al año. Los departamentos de mayor producción son Tolima y Cundinamarca. Debido a la expansión del mercado interno y a las posibilidades de exportación se requiere la utilización de tecnología para optimizar y mejorar los rendimientos. Dentro de la tecnología demandada el mayor interés se centra en el manejo de la antracnosis, por ser el problema fitosanitario más limitante de la producción de mango.

La antracnosis es causada por el hongo Colletotrichum gloeosporioides

(Penz), afecta frutos y otras estructuras de la planta. Las pérdidas por esta enfermedad durante la cosecha se han calculado aproximadamente en un 40%; no obstante, los daños en poscosecha como consecuencia de infecciones quiescentes hacen de la enfermedad una verdadera amenaza para la competitividad de los sistemas productivos.

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2. MARCO TEORICO

2.1. Mango común o Hilacha (Mangifera indica L.)

El mango es una de las frutas más importantes en el trópico, se cultiva en todos los países que se encuentran en esta área. Se conoce hace mas de 4000 años en la India, donde en la actualidad existen mas de 800.000 hectáreas cultivadas con este frutal. (Salazar, 1992).

Es originario de la India, de donde se distribuyó por todo el suroeste de Asia y el archipiélago malayo. A América llegó por dos vías: de Asia fue llevado por los portugueses al sur de África y luego a las costas brasileñas, en el siglo XVI. Los españoles lo introdujeron a México en los siglos XV y XVI, mediante el comercio que se estableció con Filipinas. (Salazar, 1992).

Colombia cuenta con extensas zonas aptas para su cultivo: la costa Atlántica, los Llanos Orientales, todo el valle del Magdalena, Cauca (Patía), Guajira, Tolima y Huila. La gran aceptación de esta fruta tanto en el mercado nacional como en el internacional, hace que el cultivo a escala comercial en Colombia sea una empresa rentable y de gran porvenir para el país (Páez, 2006).

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Es un árbol de gran porte que puede llegar a medir 30 m de altura y de gran longevidad. El tronco es grueso con una corteza parda oscura, áspera, de ramas separadas; la forma del árbol depende de varios factores: propagación, podas, variedad y medio ambiente. El sistema radicular presenta un amplio desarrollo pudiendo penetrar las raíces principales de 6 a 8 metros, mientras que se extienden en un radio de 10 metros, esta distribución le permite resistir épocas de baja humedad. (Salazar, 1992).

Las hojas al principio tienen un color rojizo o púrpura, que del cual cambian a verde claro y luego a verde oscuro. Durante estos estados su actividad fotosintética cambia dado a la acumulación de clorofila en los tejidos. Las ramas de un mismo árbol no crecen al tiempo por lo cual es corriente ver el árbol en diferentes estados de desarrollo y florecido todos los años. (Salazar, 1992).

La flor se presenta en paniculas ramificadas, provenientes de yemas terminales; el número de flores por panicula puede variar de 300 a 2.000, dependiendo de la variedad. Las flores tienen un pedúnculo muy corto: el cáliz se forma de 5 sépalos libres, verdosos, de 2 a 4 mm de largo y de 1 a 2 mm de ancho; los pétalos también libres y caedizos miden de 3 a 6 mm de largo por 1 a 2 mm de ancho y tienen ápice agudo y curvo. Los árboles provenientes de semilla florecen de 6 a 8 años después de sembrados, mientras que los injertados florecen en la mitad del tiempo. La floración en mango tiende a ser alterna o bianual. (Cartagena, 2001).

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exquisito sabor, su color varía de amarillo cremoso a naranja oscuro. (Cartagena, 2001).

El mango se caracteriza por una elevada caída de flores completas y frutos jóvenes, llegando a ser hasta del 99%. Algunos autores aseguran que solo el 0.1% de las flores bisexuales llegan a producir fruto maduro. La mayor caída de frutos se presenta en las tres primeras semanas. (Cartagena. 2001). El mango común o hilacha tiene un fruto alargado que se caracteriza por tener la pulpa fibrosa. Es conocido también como Hilaza, brechoso, mango de puerco, dependiendo de la zona de producción. (ICONTEC, 2002).

2.1.2. Condiciones Agroecológicas

El mango puede prosperar en zonas subtropicales, donde la temperatura promedio es de 15°C, es muy sensible a bajas temperaturas mostrando una reducción de crecimiento. Los suelos muy alcalinos dañan el cultivo, los límites del pH para el cultivo de mango están entre 5.5 y 7.5. Por tener un sistema radicular profundo, las características del subsuelo y el nivel freático se deben tener en cuenta. (Salazar, 1992).

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Los suelos de Tolima y Huila sembrados con mango son arenosos con un pH que oscila entre 6.5 y 7.2 y su fertilidad es medianamente alta. Estas regiones se encuentran ubicadas entre los 380 y 600 m.s.n.m., la temperatura promedio es de 28°C y la humedad relativa promedio es de 68%, el promedio de lluvias está entre 1000 y 1300 mm anuales. (Cartagena, 2001).

2.1.3. Plagas y Enfermedades

En la actualidad el cultivo de mango se ve afectado por innumerables plagas y enfermedades, las plagas mas importantes que afectan el cultivo de mango son: Mosca de la fruta Anastrepha sp., el falso piojo blanco Aulacaspis

tubercularis, la escama articulada Selenaspidus articulatus y los comedores

de hoja Megalopyge lanata. Entre las enfermedades fungosas se encuentra

la antracnosis que es la principal enfermedad que ataca los mangos en Colombia y el agente causal es C. gloeosporioides (ICA, 1996).

2.2. Agente Causal de la Antracnosis

Colletotrichum sp., es considerando el principal agente causal del deterioro

en precosecha y poscosecha de muchos frutales tropicales y subtropicales (Bernstein et al., 1995); de acuerdo con numerosas investigaciones, la gran

mayoría de estas enfermedades se atribuyen a ataques del hongo C. gloeosporioides (Zulfiqar et al, 1996), sin desconocer que también causa

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2.2.1. Taxonomía

Según Arauz, (2000) la antracnosis en mango es causada por el hongo

Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc (anaformo), Glomerella cingulata (Telemorfo) Spauld. & H. Schrenk.

2.2.1.1. Estado Telemorfo

REINO Fungi

SUBDIVISION Ascomicotyna CLASE Pyrenomicetos

ORDEN Sphaeriales

GENERO Glomerella

ESPECIE cingulata

2.2.1.2. Estado Anamorfo

REINO Fungi

SUBDIVISION Deuteromicotina CLASE Deuteromycetes

ORDEN Melanconiales

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2.3. Generalidades

Colletotrichum es un habitante muy común en cultivos y con frecuencia no

ocasiona síntomas de enfermedad en los órganos de la planta; en los frutos de algunas especies frutales solo se manifiesta cuando el pericarpio es debilitado, o cuando ocurren aumentos en los niveles de etileno como resultado de procesos de maduración de los frutos. (Adoskaveg y and Hartin, 1997).

Este hongo presenta un micelio septado de coloración hialina o castaña clara, los acérvulos separados tienen forma de disco o cojín, de textura cerosa y puede ubicarse en forma subepidermal, epidermal o subcuticular. Típicamente presenta setas o espinas negras en los bordes o entre el conidióforo; los acérvulos están formados por pseudoparénquima con paredes delgadas o gruesas, conidióforos simples, elongados con numerosas conidias. Las conidias son hialinas, curvadas y fusiformes, y por lo general un acérvulo setoso. Las conidias son producidas en estructuras especializadas llamadas acérvulos, que se forman en la superficie de los tejidos infectados. (Barnett ,1998 y Holliday, 1995). El género Colletotrichum

tiene enorme variación ecológica, morfológica y patológica, las diferentes formas en la naturaleza varían desde saprofito a cepas parasíticas con un estrecho rango de hospederos (Mena, 1999).

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Una característica de algunas especies de Colletotrichum, es que pueden

causar infecciones latentes o quiescentes sobre los frutos, que posteriormente se desarrollan durante la fase de maduración. Las diferentes especies sobreviven por largos periodos sobre los desechos vegetales o en el suelo; el patógeno mas común en los trópicos es Colletorichum

gloeosporioides. (Holliday, 1995).

Las infecciones quiescentes en el contexto de enfermedades de poscosecha involucra la inhibición del desarrollo del patógeno a través de condiciones fisiológicas impuestas por el hospedero hasta que se lleva a cabo el estado de maduración. Una vez el hongo penetra la capa exterior del fruto, este permanece allí en estado de quiescencia o dormancia hasta que ocurren cambios en la superficie del fruto los cuales proporcionan las condiciones adecuadas para permitir una infección (Contreras, 2006).

2.4. Desarrollo de la enfermedad

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Figura 1. Ciclo de vida de la enfermedad de Antracnosis causada por Glomerella cingulata y Colletotrichum gloeosporioides. Tomado de Agrios 2002.

La infección se puede desarrollar casi en cualquier tejido de la planta. Una vez el microorganismo penetra la cutícula, se pueden presentar dos estrategias de infección: la primera es conocida hemibiotrofía intracelular y la segunda necrotrofía subcuticular e intramural. (Agrios, 2002).

Muchas especies de Colletotrichum presentan procesos infectivos en dos

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subcuticular e intramural), donde el patógeno crece bajo la cutícula y disuelve extensamente la matriz péptica de las células epidermales (Bailey, 1992). El desarrollo intramular se asocia a la hinchazón y disolución de las paredes celulares (O´Connell et al., 2000).

En condiciones favorables, el hongo puede crecer rápidamente en la planta y causar diversos síntomas muy rápidamente, pero en otras circunstancias el hongo puede permanecer quiescente dentro de los tejidos por un largo periodo, que en algunos casos solo se evidencia después de la cosecha (Figura 2.). Pero también durante periodos de condiciones ambientales extremas, puede permanecer en latencia por algún tiempo en el suelo o permanecer por largos periodos sobre tejido vegetal muerto (CABI-EPPO, 1996).

2.4.1. Infecciones quiescentes

Una de las características destacadas de Colletotrichum sp., es su capacidad

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Según Yerhoeff (1974), una relación parasítica latente o quiescente, se define como una condición en la cual el patógeno reduce su actividad metabólica, deteniendo el proceso de infección por un periodo considerable durante la vida del hospedero, que se reactiva cuando las circunstancias fisiológicas o ambientales específicas lo permitan. De Lapeyre (2000), define el estado quiescente del hongo como la circunstancia en la cual una espora que entra en contacto con la superficie del fruto, germina y forma un apresorio que se melaniza y permanece inactivo hasta la maduración del fruto.

Según Swimburne (1983), un organismo se puede tornar quiescente en cualquiera de las siguientes etapas de su vida: en germinación, elongación del tubo germinativo, formación del apresorio y penetración. Un punto de infección se desarrolla cuando la hifa penetra la cutícula y la pared celular del hospedero, con la ayuda de enzimas cutinasas y celulolíticas. La fase latente puede ser corta como ocurre en las enfermedades de floración, y de dos o tres semanas a varios meses, como ocurre en frutos. (Bailey, 1992). En la permanencia de la latencia del patógeno dentro del hospedero hay una dinámica de equilibrio entre el hospedero, el patógeno y el ambiente; de tal manera que los cambios fenológicos y fisiológicos en el hospedero, en el ambiente o en ambos, conllevan a la pérdida del equilibrio establecido y permiten que el patógeno continué su ataque. (Jarvis, 1994).

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INFECCIONES QUIESCENTES

PATÓGENO INTERACCIÓN HOSPEDERO

Infección Desarrollo del

Invasión RESISTENCIA fruto

Quiescencia

Fruto en maduración

Estimulo Periodo

Reactivación del Climatérico

Patógeno

Fruto maduro

Invasión ENFERMEDAD

Figura 3. Eventos entre el patógeno y el hospedero dentro de la infección quiescente en frutos por C. gloeosporioides. Adaptación de Arauz, 2000.

Existen varias condiciones que promueven la quiescencia como condiciones físicas adversas como el inapropiado almacenamiento de frutos, daños físicos, mecánicos, plagas, estrés y cambios climáticos bruscos en campo; y condiciones fisiológicas como deficiencia nutricional y cambios fisiológicos en la maduración del fruto. (Swinburne, 1983). Las infecciones latentes han sido reportadas en frutas como cítricos (Zulfigar et al, 1996), en tomate de árbol

(Rondón, 2003) y en mora de castilla (Forero de la Rotta, 2001). C. gloeosporioides, ha sido asociado con infecciones quiescentes y de

poscosecha sobre frutos como mango, aguacate, papaya, maracuyá, guayaba, cítricos, uva, granadilla, manzana y mora. (ICA, 1996).

Reducción en Compuestos Antifungoso

Etileno

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2.5. Síntomas

Colletotrichum sp. causa numerosas enfermedades en un amplio rango de

plantas a nivel mundial, tanto en precosecha como en poscosecha. En poscosecha predomina en los trópicos, donde es un factor limitante en la calidad de los frutos ocasionando grandes pérdidas en la comercialización interna y en los mercados internacionales. El efecto del hongo en el rendimiento radica en el hecho que afecta frutos en todos los estados de desarrollo, los cuales se desechan en el momento de comercialización (Cartagena & Vega, 2001).

En plantas de mango (M. indica), se presentan primero en las panículas

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Figura 4. Frutos de Mango. A: Fruto sano, B: Fruto con lesiones de antracnosis. (Foto L.Parra).

En los frutos jóvenes se producen pequeñas lesiones hundidas, mientras en los grandes (4-5 cm), por lo general no hay desarrollo de la enfermedad, pero el hongo permanece en estado de quiescencia hasta que los frutos maduran y aparecen las lesiones oscuras, necróticas, angulares o de forma irregular. En todos los casos el desarrollo de la enfermedad va acompañado de masas de conidias de color salmón como consecuencia de la maduración del acérvulo.

2.6. Condiciones epidemiológicas

Aunque se han realizado varias investigaciones acerca de la epidemiología de esta enfermedad en mango, dichos estudios se han concentrado en las relaciones entre variables del clima y la cantidad de la enfermedad en el cultivo. La infección ocurre cuando el fruto se desarrolla o durante los periodos de cosecha, pero por lo general permanece en estado de quiescencia hasta la maduración del fruto. En el cultivo, el desarrollo del hongo se ve favorecido por condiciones ambientales como humedad relativa

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del 96% con temperaturas entre 10-30°C, ocasionando lesiones sobre hojas, ramas e inflorescencia momificadas. (Bailey, 1992).

Existe una correlación importante entre la precipitación en todo el año y el desarrollo de la enfermedad, demostrando que el hongo es dependiente de la precipitación y la humedad relativa para su germinación, desarrollo y dispersión. (Álvarez, 1996). Para el desarrollo de la enfermedad se requiere agua durante todas las etapas, de esta manera la esporulación no solo necesita altos niveles de humedad (95%), sino que la liberación y dispersión de las esporas es dependiente del agua libre y se requiere de aproximadamente cuatro horas mas de humedad a temperaturas óptimas de 20-25°C; la ubicuidad de la fuente de inóculo tiende a sobrepasar cualquier restricción en el desarrollo de la enfermedad que pueda imponer el agua. (Álvarez, 1996).

La variabilidad en la latencia del patógeno representa una adaptación muy importante a las condiciones fisiológicas de los tejidos y los patrones climáticos que ocurren durante el ciclo de cultivos perennes. Debido a esta variabilidad el impedimento para tomar medidas de control exitosas se dificulta. (Waller, 1992).

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2.7. Métodos de Diagnóstico

Las herramientas moleculares han ganado gran aceptación en los últimos años, siendo empleados para diferenciar entre poblaciones de Colletotrichum

en diferentes hospederos y también para diferencias entre especies y subespecies que no se permite con las técnicas tradicionales. Las técnicas moleculares más utilizadas son: análisis de las regiones codificadoras del DNA ribosomal (ITS), realizando amplificaciones vía PCR (Polymerase Chain Reaction) con cebadores o primers específicos. Análisis de polimorfismo en DNA nuclear con marcadores moleculares RAPD (Random Amplified Polymorphic DNAs) y AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) al

interior de la especie, para determinar la posible existencia y los niveles aparentes de variabilidad genética en la población, además del análisis de enriquecimiento de A+T-rich DNA asociado con (mt) DNA (Freeman et al.,

1998).

Los métodos tradicionales son empleados aunque en algunos casos no permiten diferenciar entre especies y subespecies de Colletotrichum. Para

las especies C. acutatum y C. gloeosporioides, algunas características como

la velocidad de crecimiento y color predominante de la colonia en medios selectivos, la susceptibilidad o la tolerancia que presenta el patógeno en el medio suplementado con el fungicida benomyl y la prueba cualitativa de la proteasa (Martín & García-Figueres, 1999), por la producción de enzimas extracelulares que hidrolizan la caseina de la leche generando halos transparentes de 3 a 4 mm sobre el medio de cultivo, permitiendo diferenciar entre C. acutatum y C. gloeosporioides (Freeman et al., 1998; Peres, et al;

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2.9. Control

El control químico es el más común debido a la importancia económica del cultivo. Se disponen de muchos químicos, entre los más utilizados se encuentran compuestos como: dithiocarbamato, benzamidazoles y triazoles; y otros fungicidas como chlorothalonil, imazalil y prochloraz. Los fungicidas sistémicos son útiles y ampliamente utilizados, pero es mejor alternarlos con aplicaciones de productos de acción protectante (Páez, 2006).

Es necesario planificar las aspersiones con los fungicidas que por lo general inician antes de la floración y continua hasta que el fruto este en procesos de maduración. Las aplicaciones se hacen con intervalos de 7, 14, 21 o 30 días dependiendo de la frecuencia de la lluvia. Los productos comerciales mas empleados son benlate 07 (1g/L), dithane M45 y oxicloruro de cobre (2-3g/L), mezclados con un adherente (sulfatante HA o superstiker), para asegurar la cobertura apropiada de la superficie cerosa del follaje y fruto. (Sena, 2006).

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3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION

El área dedicada al cultivo del mango, es mayor año tras año a nivel mundial y nacional es así como en el año 2005, según cifras del Ministerio de Agricultura, existen aproximadamente 13.900 has de mango cultivado en 14 departamentos, las cuales producían alrededor de 170.000 toneladas anuales de diferentes variedades. Los departamentos en los que se concentra la mayor producción de mango son Tolima y Cundinamarca, seguidos de Antioquia, Bolívar y Magdalena. En el periodo de 1992 al 2003 en conjunto, estos 4 departamentos, han cultivado entre el 70 y el 80% del área cultivada a nivel nacional; mientras que la producción en el mismo periodo fue entre el 62 y el 83%. (Ministerio de Agricultura 2005).

El cultivo de mango presenta múltiples problemas fitosanitarios, la antracnosis es una de las enfermedades más importantes y la mas frecuente, sobre todo en regiones con temperaturas y humedades relativas elevadas. (Fitzell y Peak, 1984).

En Colombia la antracnosis se encuentra diseminada en todas las zonas productoras de mango, afectando la mayoría de variedades de mango cultivadas. En la actualidad las variedades criollas, azúcar e hilacha, son las que ofrecen grandes ventajas en comparación con variedades mejoradas y que si son bien utilizadas por los cultivadores, pueden liderar el mercado, la comercialización y el precio del mango a nivel nacional; ya que poseen resistencia a plagas y enfermedades, no exigen un manejo agronómico estricto y presentan características óptimas para la obtención de pulpa (Cartagena & Vega, 2001).

El estudio de infecciones quiescentes causadas por Colletotrichum sp. es de

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los diferentes estados de desarrollo del fruto, permite desarrollar las estrategias de control. A pesar de que estas infecciones se inician en el campo y solo se desarrollan cuando el fruto madura, ocasionan grandes pérdidas en el momento de su comercialización.

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4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GENERAL

Determinar la relación entre el estado de desarrollo de frutos de mango variedad hilacha y la incidencia de infecciones quiescentes de Colletotrichum gloeosporioides.

4.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS

4.2.1. Determinar la incidencia de infecciones quiescentes de Colletotrichum gloeosporioides en cada uno de los estados fenológicos del fruto.

4.2.2. Confirmar mediante pruebas biológicas la patogenicidad del agente causal de las infecciones quiescentes encontradas en los frutos recolectados.

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5. MATERIALES Y METODOS

5.1. Localización de la investigación

El estudio se adelantó entre los meses de noviembre 2007 y febrero 2008, analizando la presencia y cantidad de infecciones quiescentes en frutos de mango variedad hilacha en los estados fenológicos, muestreados cada 25 días en los lotes del Centro de Investigación Nataima de la Corporación Colombiana de Investigación, CORPOICA que se encuentra ubicado en el departamento del Tolima, municipio de Espinal, donde la temperatura promedio anual está en 28 ºC, con una precipitación de 1300 mm al año, una humedad relativa del 70%, 430 m.s.n.m de altitud y presenta una ubicación de 4° 12´ de latitud norte y 74° 56´ longitud oeste. (IDEAM, 2006).

La investigación se desarrolló en las instalaciones de Fitopatología del Programa Manejo Integrado de Plagas de CORPOICA, Tibaitatá, ubicado en el municipio de Mosquera (Cundinamarca), km 14 de Bogotá, D. C. (N 4° 42',

(36)

5.2. Muestreos de frutos

Los frutos se seleccionaron en un lote de árboles de mango variedad hilacha, de 15 años de edad, al los que generalmente se les realiza podas de formación y un control periódico de malezas.

El número de frutos que fueron muestreados corresponden al tamaño mínimo de muestra que permite un análisis estadístico adecuado con un error experimental de 0.05. Se realizaron 4 muestreos entre los meses de Noviembre 2007 y Febrero 2008, con intervalos de 25 días para facilitar la selección de los frutos en el campo, y de acuerdo con la metodología sugerida por Medilicott et al (1986), con algunas modificaciones, en cada

muestreo se colectaron al azar 112 frutos (aparentemente sanos) en diferentes estados de desarrollo, (Tabla 1.); para el muestreo se tomaron frutos de los estados E1, E2, E3 y E4. (Figura 5.).

(37)

Tabla 1. Etapas fenológicas de los frutos de Mango, de acuerdo con la edad, dimensiones, peso y otras características. Modificación de Medilicott, Mohinder, y Reynolds, 1986.

ETAPAS DIAS LARGO (cm.) ANCHO (cm.) PESO (g) CARACTERISTICAS ESTADO FENOLOGICO

I 0-10 1.9 1.5 1-3

II 10-21 3.1 2.3 3-10

Altas tasas de respiración y crecimiento, máximo coontenido

de agua y rápido aumento de nitrógeno y ácidos, baja relación

carbohidratos/nitrógeno.

E1 Fruto pequeño verde

III 21-35 4.1 3.1 10-20

IV 35-49 5.6 4.1 30-40

Desarrollo de aromas y sabores, tasas medias de respiración, aumento de la presión osmótica,

disminución del contenido de humedad y caída rápida de glucosa y aumento de sacarosa.

E2 Fruto verde oscuro

V 49-60 6.4 4.8 88

VI 60-72 8.9 6 92

Disminución del contenido de ácidos, mínima respiración y disminuye contenido de nitrógeno.

E3 Fruto verde claro

VII 72- 90 9.5 6.5 100

VIII 120 90- 10 6.5 100

Aumento de tasa de respiración, bajo contenido de humedad y disminución del crecimiento del

fruto

E4 Amarillamiento

(38)

5.3 Detección de infecciones quiescentes

Los frutos recolectados fueron lavados en tres oportunidades con agua corriente, luego se desinfestaron por un minuto con hipoclorito de sodio al 2.6% y se lavaron dos veces con agua destilada; por último se trataron con alcohol al 70% y se lavaron nuevamente con agua destilada. Una vez secos se llevaron a incubar en cámaras húmedas a temperatura ambiente. (Cedeño, et al., 1993; Dhingra, et al., 1995).

Para el montaje de las cámaras se utilizaron contenedores plásticos transparentes de 30 cm de ancho, 45 cm de largo y 17 cm de alto, con rejillas plásticas previamente lavadas con detergente y agua, desinfestadas con hipoclorito de sodio al 2.6% y asperjadas con alcohol antiséptico. (Anexo 3). La presencia de las infecciones quiescentes se evaluó diariamente, observando el tiempo de aparición de los primeros síntomas de la enfermedad (Reyes, A,. 2007).

El diseño experimental que se utilizó en el ensayo fue un diseño de bloques completos al azar BCA, con cuatro repeticiones y cuatro tratamientos correspondientes a los estados fenológico. La unidad experimental estuvo representada por una cámara húmeda con 7 frutos. Por cada tratamiento se colectaron 28 frutos, para un total de 112 frutos.

5.4. Aislamientos de Colletotrichum sp.

(39)

Petri con (PDA) papa-dextrosa-agar (Anexo 2); se realizaron 2 repeticiones por fruto, colocando cuatro fragmentos de tejido en la placa de agar. (Cedeño, et al., 1993; Dhingra, et al., 1995).

Las cajas sembradas se incubaron a temperatura ambiente (± 20°C), durante 6 días, luego cada uno de los aislamientos obtenidos se le asignó un número consecutivo y con el fin de purificar el hongo, se resembraron por separado en placas de PDA; simultáneamente se realizaron observaciones microscópicas coloreadas con azul de lactofenol para verificar las características del hongo (Contreras, 2006). La taxonomía del hongo se realizó con base a la clave para la identificación de hongos imperfectos de Barnett (2003) y las características registradas por Bailey (1992).

5.4.1 Purificación de Aislamientos

(40)

Se tomaron cajas con agar agua (Anexo 1) y en la base con un marcador de vidrio se dividieron en 18 círculos aproximadamente de 7mm de diámetro cada uno, para que una vez obtenidas las soluciones para cada aislamiento, sembrar 1.7 µl de la solución en cada uno de los pozos. Las placas con agar agua fueron incubadas por 24 horas a 27°C en penumbra. Transcurridas las 24 horas se observó bajo el microscopio (40X) la superficie de la placa de agar agua buscando una única espora germinada, la cual se sembró en PDA y se incubó a 27°C en penumbra, hasta obtener la colonia pura (Manual de procedimientos CORPOICA, 2001).

5.5. Pruebas biológicas

Las pruebas biológicas se realizaron con el objeto de establecer la etiología del agente causante de las infecciones quiescentes observadas en los frutos de Mango y su patogenicidad sobre frutos sanos.

5.5.1. Medio selectivo para Colletotrichum sp.

El medio selectivo para Colletotrichum sp., se compone de Hidróxido de

Cobre (CuOH2) como ingrediente activo (42mg /L Cu) y 300 mg/L de

estreptomicina (Anexo 7). El CuOH2 es un fungistático que actúa

desnaturalizando las proteínas, a través de la reactivación de los grupos sulfhídricos (Ware y Whitaker, 2000). Este medio permite una aproximación para clasificar los aislamientos obtenidos y visualizar algunas características que pueden diferenciar estas dos especies de Colletotrichum sp., dentro de

(41)

Algunos investigadores plantean que la velocidad de crecimiento de la colonia que se evalúa en este medio, puede ser rápida (fast) o lenta (slow) y los colores predominantes de las cepas pueden ser naranja (orange), verde (olive), gris (gray) y salmón (salmón). A partir de estos criterios de evaluación se pueden obtener las clasificaciones: FGG (Fast growing gray), SGG (Slow growing gray), FGS (Fast growing salmon), SGO (Slow growing orange) y FGO (Fast growing olive) (Abang, et al; 2003).

Estas características se utilizan para diferenciar al patógeno, entre las especies C. acutatum y C. gloeosporioides. Los criterios que permiten

clasificar a las cepas como C. gloeosporioides son: SGG, FGG, FGS y FGO

y la clasificación SGO orienta hacia la especie C. acutatum (Tabla 2).

Tabla 2. Clasificación de las especies según los medios de evaluación biológica. (Abang et al., 2003).

Medio Selectivo Medio Benomyl Clasificación

FGG Susceptible C. gloeosporioides

FGO Susceptible C. gloeosporioides

SGO Tolerante C. acutatum

SGG Susceptible C. gloeosporioides

(42)

controles; en todos los casos se realizó el proceso de desinfestación de frutos descrito anteriormente.

Posteriormente, sobre la parte media y superior de cada uno de los frutos se les coloco un disco de agar con el aislamiento (Figura 6.), ya que mediante las observaciones preliminares es la zona donde con mayor presencia se presentan las infecciones quiescentes. Sobre los frutos usados como controles se colocaron discos de agar estéril, luego de la inoculación se colocaron en cámaras húmedas estas se mantuvieron a una temperatura de ± 18 C° por un periodo de 10 días y diariamente se revisaron para observar el momento en que se evidenciaran los primeros síntomas de la enfermedad. A partir de las primeras lesiones se realizaron los aislamientos del microorganismo para comprobar los postulados de Koch. (Cedeño et al..

1993).

Figura 6. Frutos de Mango sanos. A. Fruto sin bloques de agar y B, Fruto con bloques de agar con micelio del microorganismo. (Foto, L. Parra).

(43)

5.5.3. Prueba de susceptibilidad al Benomyl

De acuerdo a las metodología que usaron (Péres, et al., 2005) para

identificar y conocer la susceptibilidad o la tolerancia que presentan las especies de Colletotrichum sp. a este producto. Se utilizó la concentración

del fungicida Benomyl (PDA + Benomyl 2µg/ml), ya que las mínimas concentraciones del fungicida fueron efectivas. Con base en la susceptibilidad que presenta C. gloeosporiodes y la tolerancia de C. acutatum. (Anexo 6) se diferenciaron las especies del patógeno. Para cada

aislamiento se realizaron dos repeticiones, una vez inoculadas las cajas se incubaron por 72 horas en penumbra a una temperatura de 27°C.

En este medio se evaluó el diámetro de crecimiento de cada colonia tomando como parámetro de comparación el diámetro de crecimiento que presentó el hongo en el medio PDA. Esto se hace con el fin de determinar el porcentaje de inhibición del microorganismo, al crecer en contacto con este fungicida, respecto al control en PDA (Alvis, 2007).

5.5.4 Prueba de la Proteasa

Esta prueba ha sido utilizada para diferenciar las especies de de C. acutatum

y C. gloeosporioides. El medio hidrólisis de la caseína (MHC) (Anexo 5),

(44)

Una vez preparado el medio de la hidrólisis de la caseína (MHC) (Anexo 5) y servido en las cajas de Petri estériles, se tomaron bloques de PDA con el crecimiento micelial de cada aislamiento y se colocaron sobre la superficie del medio MHC. Se realizaron 4 repeticiones por cada aislamiento (Martín & García-Figueres, 1999); las lecturas se realizaron 24 horas después de iniciada la prueba. Para asegurar que el medio funcionaba se tomo como control positivo una cepa de C. acutatum (c-852) y un control negativo con

una cepa de C. gloeosporioides (c-1042) caracterizadas molecularmente, que

se encuentran en la Colección Nacional de Colletotrichum del Laboratorio de

Fitopatología de CORPOICA

5.6. Determinación del pH en frutos sanos y enfermos de Mango.

De acuerdo con Prusky, Keen (1993), la transición de una etapa biotrófica a una necrotrófica en este grupo de microorganismos, parece estar relacionada con factores que son modulados intracelularmente y son afectados por los contenidos de nutrientes y el pH presente en el sustrato; por esta razón es necesario conocer las variaciones de los niveles de pH en los diferentes estados fenológicos de los frutos, para de esta manera comprender la dinámica de las infecciones quiescentes en la medida que se va desarrollando el fruto.

(45)

Para esta prueba se colectaron para cada estado fenológico, 4 frutos de mango sanos y 4 enfermos, se lavaron tres veces con agua destilada (pH 7), durante 10 minutos, luego se colocaron sobre papel periódico y se dejaron secar a temperatura ambiente por un periodo de 30 minutos, para garantizar un completo secado.

Luego con ayuda de un bisturí, se removieron 0.5 mm. del exocarpio de los frutos, en los enfermos por antracnosis se separó el exocarpio y mesocarpio enfermo del sano; para evitar alteraciones de las lecturas, se dejo una distancia de 3 cm. entre el tejido sano del afectado. El exocarpio se maceró en un mortero y una vez se obtuvo una pasta pura se realizó la lectura directa del pH con ayuda de un potenciómetro de (Beckam).

Para determinar el pH del mesocarpio tanto de área enferma como sana, se realizó un orificio de 2 cm de diámetro, en el cual se maceró el tejido circunvecino con ayuda de un cuchillo estéril y una vez macerado el tejido se introdujo el electrodo para la lectura del pH. En este caso los frutos evaluados presentaron lesiones aceitosas de color negro, con bordes definidos y centro deprimido.

(46)

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Aislamientos de Colletotrichum sp.

En este estudio se obtuvieron varios aislamientos del hongo y se agruparon según su color y crecimiento, obteniendo un total de 20 aislamientos (Anexo 10), que fueron clasificados dentro del género Colletotrichum de acuerdo a

las observaciones microscópicas realizadas, donde se identificaron las estructuras del hongo (Figura 7). Los aislamientos se obtuvieron de diferentes partes del fruto, confirmando lo encontrado en otros cultivos como aguacate, guanábana, tomate de árbol, en donde el hongo fue aislado de diferentes tejidos de la planta (Agostin, et al., 1992). Todos los aislamientos

tuvieron un buen crecimiento en PDA (Figura 8), lo cual concuerda con lo propuesto por Agostin (1992), quien manifiesta que las especies de

Colletotrichum sp. no requieren de medios selectivos para su crecimiento.

Figura 7. Características microscópicas de C. gloeosporioides. A: Micelio y conidias del

hongo formadas en PDA, B: Conidias típicas del microorganismo. (Foto L. Parra).

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El crecimiento de las colonias se presentó en forma radial y de aspecto algodonoso, el color predominante fue el gris y el oliva lo que indica según Contreras (2006) que pertenecen al género Colletotrichum sp. y a la especie

C. gloeosporioides (Figura 8); sin embargo se han demostrado incoherencias

entre las descripciones morfológicas y los estudios moleculares para la identificación de especies de Colletotrichum sp. (Afanador, et al., 2003).

Figura 8. Aislamientos de Colletotrichum sp. En PDA. A y B Colonias obtenidas directamente

a partir de frutos enfermos, C y D colonias obtenidas de cultivos monospóricos. (Foto L. Parra).

A

B

C

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6.2 Detección de Infecciones Latentes en frutos asintomáticos de Mango

Transcurrido el periodo de incubación para cada estado fenológico, se observó sobre la superficie de los frutos, la presencia de lesiones de color negro y hundidas, características de antracnosis tal como lo afirma (Allende-Molar y Cols, 2003) (Tabla 3.).

Tabla 3. Días Transcurridos hasta que aparecieron las lesiones en los Diferentes Estados Fenológicos de Frutos de Mango.

Estado Fenológico Tamaño de Muestra Periodo de Incubación (Días)

E1 28 10 E2 28 10 E3 28 15 E4 28 15

Se observaron infecciones quiescentes en todos los estados fenológicos del fruto de mango; en los estado fenológico E1 y E2, el porcentaje de incidencia fue superior al 75%, es decir que de un total de 112 frutos incubados en todo el estudio, 84 frutos mostraron lesiones de infecciones quiescentes, mientras que para los estados fenológicos E3 y E4 la incidencia de las infecciones estuvo por encima del 60%. (Figura 9). Estos resultados ratifican la presencia de infecciones quiescentes de C. gloeosporioides en frutos aparentemente

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81,13 79,05 64,75 60,68 0 20 40 60 80 100

E1 E2 E3 E4

Estados Fenológicos P o rcen ta je In ci d en cia

Figura 9. Porcentaje de infección quiescente de Colletotrichum gloeosporioides. en los

diferentes estados fenológicos de frutos de mango.

Las diferencias en la incidencia de infecciones quiescentes de C. gloeosporioides entre los cuatro estados fenológicos no fueron

estadísticamente significativas (P>0.05); sin embargo biológicamente se evidenció mayor presencia de estas infecciones en los estados iniciales de desarrollo del fruto. Se realizaron pruebas de validación, normalidad y comparación de promedios para corroborar que no se presentaron errores y las varianzas fueran homogéneas. (Anexo 8 y 9).

El estado de quiescencia en varias frutas se debe a que las conidias de

Colletotrichum sp., germinan, forman el apresorio y penetran la cutícula;

(50)

Se podría sugerir que la fenología del fruto tiene un efecto en la incidencia de las infecciones quiescentes, siendo los frutos maduros menos susceptibles a adquirir estas infecciones. Cuatro mecanismos han sido postulados para explicar la presencia de Colletotrichum sp. como infección quiescente en

frutos inmaduros: a) Requerimientos nutricionales del patógeno, b) Compuestos antifungales preformados presentes en frutos verdes que disminuyen a medida que el fruto madura por un aumento en la actividad de la enzima lipoxigenasa, cuya actividad es regulada por la presencia de flavan-3-ol, epicatequin (compuesto fenológico). Estos compuestos son el 1-acetoxi-2-hidroxi-4-oxo-henicosa-12, 15-dieno y el 1-acetoxi-2,4-dihidroxi-n-heptadeca-16-eno., c) Presencia de fitoalexinas y compuestos preformados y d) Factores de patogenicidad que pueden ser activados solamente en frutos maduros. (Prusky, et al,. 1996).

Para que el hongo pueda penetrar la cutícula del fruto requiere de un complejo enzimático que le permita macerar la cutícula y penetrar en exocarpio. Según Wattad y Prusky (1994), la secreción de enzimas pectolíticas responsables de la maceración de la pared celular durante el ataque de C. gloeosporioides, es un factor limitante durante la patogénesis y

las condiciones que afectan la secreción de estas enzimas, pueden evitar la activación del Colletotrichum sp. en la colonización de frutos inmaduros.

Otro factor que determina la relación parasítica hospedero-patogeno es el pH del hospedero, que puede ser concluyente en la dinámica de las infecciones quiescentes en los diferentes estados fenológicos de los frutos de mango. Yakoby et al,. (2000), sugieren que la secreción de pectinasas están

(51)

variación en los niveles de pH explica el comportamiento de las infecciones quiescentes en frutos de mango. (Reyes, 2007).

Las pectinasas de C. gloeosporioides son secretadas con valores de pH

mayores a 5.8, aunque también puede ser producida con valores de 5.1 (Prusky, et al,. 2001), lo que indica que cuando los niveles de pH del

hospedero son adecuados se puede iniciar el proceso de infección. A medida que maduran los frutos de mango se van reduciendo los niveles de pH, lo que sugiere que los inicios del proceso de infección ocurren en los primeros estados de desarrollo del fruto.

La temperatura promedio semanal durante los muestreos fluctuó entre 27°C y 28°C, las cuales fueron favorables para el establecimiento de las infecciones quiescentes, según Arauz, (2000), temperaturas entre 20°C y 30°C, han sido reportadas como óptimas para la infección de C.

gloeosporioides. El hongo requiere una humedad relativa superior a 95%

para que las conidias germinen y se presente la formación del apresorio (Arauz, 2000). En este estudio la humedad relativa durante los muestreos, estuvo entre 67% y 79%.

6.3 Medio Selectivo para Colletotrichum sp.

En esta prueba se obtuvieron colonias con crecimiento rápido y coloración gris y verde oliva (Anexo 13). Este medio permite clasificar los diferentes C

(52)

Las diferentes clasificaciones se utilizan para diferenciar al patógeno entre las especies C. acutatum y C. gloeosporioides. Los criterios que permiten

clasificar a las cepas como C. gloeosporioides son: SGG, FGG, FGS y FGO

y la clasificación SGO orienta hacia la especie C. acutatum (Figura 10).

Figura 10. Desarrollo de las colonias de Colletotrichum en los diferentes medios de cultivo:

A, Crecimiento sobre PDA, B, Medio selectivo para Colletotrichum sp.(CuOH2) y C, Medio Benomyl (2µl/ml) (Foto L. Parra).

6.4 Prueba de Benomyl

En esta prueba que permite diferenciar especies de C. acutatum y C.

gloeosporioides (Freeman, et al,.1998; Bernstein, et al,. 1995), se encontró

que todos los aislamientos fueron susceptibles al Benomyl (Anexo 11), por lo tanto se considera que pertenecen a la especie C. gloeosporioides (Figura

10).

Estos resultados son similares a encontrados por Cerón et al (2006) en

trabajos de investigación realizados con aislamientos de las dos especies de

Colletotrichum que afectan los cultivos de lulo (Solanum quitoense L.).

(53)

El mecanismo de acción de los benzimidasoles consiste en inhibir el proceso mitótico fungoso, bloqueando al mismo tiempo la síntesis de ácido desoxirribonucleico (De la Isla, 1994). Los fungicidas sistémicos como el benomyl son convertidos en las plantas al compuesto metil benzimidazol carbamato, el cual interfiere en la división nuclear de los hongos que son sensibles a sus componentes (Agrios, 2002).

En nuestro país dentro de las prácticas de manejo de la antracnosis, se utiliza con frecuencia el producto, el cual sólo es efectivo en el control de la enfermedad cuando el agente causal es C. gloeosporioides (Páez, 2006), por

lo cual es necesario que en el país se inicie su manejo mediante diferentes alternativas de control.

6.5 Prueba de la Proteasa

En las lecturas realizadas en el medio MHC se observó que todos los aislamientos presentaron una reacción negativa (-), que corresponden a C.

glooesporioides (Anexo 12). Esta prueba ha mostrado ser una forma rápida y

útil para diferenciar entre especies de C. gloeosporioides y C. acutatum

(54)

Figura 11. Prueba de la Proteasa. A. Respuesta negativa sin halo transparente característica, de la especie gloeosporiodes. B. Respuesta con halo transparente, típica de acutatum. (Foto, L. Parra).

Los hongos patógenos de plantas utilizan diferentes enzimas capaces de destruir los componentes estructurales de los tejidos vegetales ocasionando la muerte celular. Estas enzimas degradan carbohidratos que disuelven la pared celular e hidrolizan la cutícula. Existen otras enzimas que degradan la pared celular como las pectinliasas y proteasas que son consideradas indispensables para la colonización de las plantas por parte del patógeno (Bailey, et al,. 1992). En el caso de las proteasas, cuando el patógeno

secreta estas enzimas, inactiva los componentes proteínicos de respuesta de defensa de las plantas tales como las quitinas y la ß- 1,3 glucanasa. (Cerón, 2004).

(55)

6.6 Pruebas de Patogenicidad

De los frutos evaluados cuando se emplearon discos de agar con el crecimiento del microorganismo, el 100% mostraron los síntomas característicos de antracnosis. Los primeros síntomas se identificaron como puntos superficiales necróticos de color café oscuro y negro, que posteriormente ocasionaron el hundimiento en la zona central, como se puede observar en la Figura 12 (A y B). El reaislamiento del patógeno a partir de los frutos con síntomas confirmó la presencia del mismo comprobando los postulados de Koch.

En los aislamientos caracterizados como C. gloeosporioides según las

pruebas de Benomyl, proteasa y medio selectivo para Colletotrichum spp.

causaron en los frutos los síntomas inicialies de antracnosis a los 4 días en su gran mayoría y algunos con 7, 5 y 9 días. (Anexo 14)

(56)

6.7 Determinación de pH en frutos sanos y enfermos de Mango

Según Lakshminarayana et al (1970) los frutos de mango en sus primeros

estados son ácidos y altamente astringentes, con mayor desarrollo presentan un contenido alto de polifenol y conservan la astringencia, sin embargo alrededor de las ocho semanas presenta una reducción de polifenoles y luego permanece estable. El ácido ascórbico aumenta rápidamente alcanzando su máximo a las cinco semanas, declina a las ocho semanas y permanece estable hasta cosecha, pero al colocar en condiciones de maduración frutos cosechados con seis, ocho, once y trece semanas de desarrollo, se encontró que con mayor tiempo se tornaban altamente ácidos. (Lakshminarayana et al 1970).

Coincidiendo con los resultados obtenidos en este estudio, ya que mostraron que a medida que el fruto madura, los niveles de pH tanto en el exocarpio como en el mesocarpio, disminuyen haciéndose mas ácidos (Tabla 4.). Al comparar estos resultados, con los obtenidos por Lagos et al (1989), en un

estudio sobre mango de la variedad Kent, encontramos que son similares, indicando que los valores de pH disminuyen en los frutos maduros.

Tabla 4. Valores de pH de Frutos Sanos de Mango en los diferentes Estados Fenológicos, en Exocarpio y en Mesocarpio.

FRUTOS SANOS

pH Exocarpio pH Mesocarpio

(57)

Algunos factores como el pH juegan un papel importante en el desarrollo de la enfermedad, ya que sus variaciones de acuerdo con la fenología del fruto sirve como una barrera y un mecanismo de defensa contra patógenos. De esta manera el patógeno supera la barrera del exocarpio y las esporas germinadas melanizan el apresorio, no solo por la reducción del pH que se observa en el mesocarpio (Tabla 4), sino por la alta concentración de compuestos antifungosos presentes en los frutos inmaduros (Prusky, et al

2001). Esta condición de quiescencia permanece hasta la maduración del fruto, donde los contenidos nutricionales y su fisiología le permiten al patógeno activar sus mecanismos de patogenicidad.

El pH tanto del exocarpio como del mesocarpio de los frutos enfermos con antracnosis, muestran valores mayores comparados con los frutos sanos (Tabla 5), tal como lo describe Prusky et al (2001) en frutos de aguacate,

donde los niveles de pH aumentan por la secreción local de amonio corroborando que C. gloeosporioides tiene la capacidad de aumentar los

niveles de pH.

Tabla 5. Valores de pH de Frutos Enfermos de Mango en los diferentes Estados fenológicos, en Exocarpio y Mesocarpio en áreas sanas y enfermas.

FRUTOS ENFERMOS pH EXOCARPIO FRUTOS ENFERMOS pH MESOCARPIO

SANO ENFERMO SANO ENFERMO

FRUTOS E1 E2 E3 E4 E1 E2 E3 E4 E1 E2 E3 E4 E1 E2 E3 E4

(58)

Con los resultados obtenidos tanto para el diseño factorial como en el diseño de bloques al azar, hubo diferencia significativa mínima (Anexo 15 y 16), entre el estado fenológico y el área donde se midió el pH (p<0.05) y diferencia significativa entre el área donde se midió el pH y el tejido (Mesocarpio y Exocarpio). En la figura 13 A. se observa el comportamiento de los valores de pH en frutos sanos y enfermos en áreas sanas y enfermas, tanto en exocarpio como en mesocarpio de frutos enfermos.

Los resultados muestran que el pH de frutos enfermos es superior a 6.0, y el valor mínimo para que se active la secreción de pectinasas y por ende la degradación de la cutícula, es de mínimo 5.1 (Yakoby et al 1999) situación

que puede estar influyendo en la actividad del microorganismo. También se puede observar que los valores de pH del exocarpio en áreas sanas de frutos enfermos, se ve alterada por la presencia de C. gloeosporioides aumentando

el valor de pH con respecto al de un fruto completamente sano sin haber diferencia estadísticamente significativa (p>0.05); en el mesocarpio esta tendencia no se ve tan marcada. Las variaciones en los valores del pH en áreas sanas con respecto a enfermas, indican que el patógeno necesita alterar el pH para poder superar barreras fisiológicas impuestas por el hospedero (Prusky, et al. 2001).

(59)
(60)

Figura 13. Efecto de Antracnosis sobre el pH. A, Te: tejido enfermo, ts: tejido sano. Ts-fe: tejido sano en fruto enfermo, exo: exocarpio y meso: mesocarpio. B, efecto sobre el pH en mesocarpio y exocarpio. C, efecto sobre tejido tomado en el fruto. Te: tejido enfermo, ts-fe: tejido sano en fruto enfermo y ts: tejido sano.

Con lo resultados obtenidos en este estudio se puede decir que a medida que el fruto se desarrolla los valores de pH disminuyen dificultando la penetración del patógeno durante la maduración del fruto; por lo tanto se sugiere que los síntomas observados en los estados fenológicos E3 y E4 son el resultado de infecciones quiescentes que se formaron cuando el fruto se encontraba en los estados fenológicos E1 y E2.

(61)
(62)

7. CONCLUSIONES

La incidencia de infecciones quiescentes en frutos de mango variedad hilacha fue mayor en estados de desarrollo iniciales, y el periodo de incubación de las infecciones quiescentes fue en los estados E1 y E2 de 10 días y en los estados E3 y E4 fue de 15 días.

El color de las colonias obtenidas de los aislamientos en PDA fue de un aspecto característico reportados para el género Colletotrichum.

Los sistemas tradicionales de clasificación con base en las características morfológicas, deben complementarse con otras pruebas para poder determinar la especie dentro del género.

Las pruebas de la proteasa, sensibilidad al benomyl y crecimiento en medio selectivo para Colletotrichum sp. permitieron establecer que los aislamientos

obtenidos de las infecciones quiescentes en los diferentes estados fenológicos correspondieron a la especie C. gloeosporioides.

Mediante las pruebas de patogenicidad se comprobó que los 20 aislamientos fueron patogénicos en frutos de mango variedad hilacha y su presencia se determinó mediante la observación de la expresión de síntomas sobre los frutos.

(63)

El efecto que ejerce C. gloeosporioides sobre el pH es un factor de

(64)

8. RECOMENDACIONES

Se debe investigar la incidencia de infecciones quiescentes sobre otros tejidos o estructuras de la planta para saber si el microorganismo sobrevive de forma quiescente ocasionando infecciones tempranas en frutos. También se debe evaluar durante los doce meses del año para observar el tiempo en donde ocurren los mayores porcentajes de enfermedad.

Realizar investigaciones relacionadas con el pH, ya que puede ser un factor de patogenicidad importante para el control de la antracnosis.

(65)

9. REFERENCIAS

Abang, M., Winter, S., Mignouna, H., Green, K., Asiedu, R, 2003. Molecular taxonomic, epidemiological and population genetic approaches to understanding yam anthracnose disease. African Journal of Biothechnology

Vol. 2 (12): 486 – 496.

Adaskaveg, J & Hartin, R. 1997. Characterization of Colletotrichum acutatum

causing annthracnose of almond and peach in California. Phytopatology 87 (9): 979-987.

Afanador, K. L., Minz, D., Maymon, M & Freeman, S. 2003. Characterization of Colletotrichum isolates from Tamarillo, Passiflora, and Mango in Colombia

and Identification of a Unique Species from de Genus. The American Phytopathologycal Society. 93 (5): 579-587.

Agostin, J. P, Timer, L. W., y Michell, D. J. 1992. Morphological and pathological characteristics of strains of Colletotrichum gloesporioides from

citrus. Phytopathology 82: 1377-1382.

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Figure

Figura 1. Ciclo de vida de la enfermedad de Antracnosis causada por Glomerella cingulataColletotrichum gloeosporioides y

Figura 1.

Ciclo de vida de la enfermedad de Antracnosis causada por Glomerella cingulataColletotrichum gloeosporioides y . View in document p.22
Figura 2. Proceso de las infecciones quiescentes en Mango. Tomado de (Arauz, 2000).

Figura 2.

Proceso de las infecciones quiescentes en Mango Tomado de Arauz 2000 . View in document p.24
Figura 4. Frutos de Mango. A: Fruto sano, B: Fruto con lesiones de antracnosis. (Foto  L.Parra)

Figura 4.

Frutos de Mango A Fruto sano B Fruto con lesiones de antracnosis Foto L Parra . View in document p.28
Tabla 1. Etapas fenológicas de los frutos de Mango, de acuerdo con la edad, dimensiones, peso y otras características

Tabla 1.

Etapas fenol gicas de los frutos de Mango de acuerdo con la edad dimensiones peso y otras caracter sticas. View in document p.37
Figura 5. Estados Fenológicos de Mango. E1, E2, E3 y E4. (Foto L. Parra).

Figura 5.

Estados Fenol gicos de Mango E1 E2 E3 y E4 Foto L Parra . View in document p.37
Tabla 2. Clasificación de las especies según los medios de evaluación biológica. (Abang et al., 2003)

Tabla 2.

Clasificaci n de las especies seg n los medios de evaluaci n biol gica Abang et al 2003 . View in document p.41
Figura 6. Frutos de Mango sanos. A. Fruto sin bloques de agar y B, Fruto con bloques de agar con micelio del microorganismo

Figura 6.

Frutos de Mango sanos A Fruto sin bloques de agar y B Fruto con bloques de agar con micelio del microorganismo. View in document p.42
Figura 7. Características microscópicas de C. gloeosporioides. A: Micelio y conidias del hongo formadas en PDA, B: Conidias típicas del microorganismo

Figura 7.

Caracter sticas microsc picas de C gloeosporioides A Micelio y conidias del hongo formadas en PDA B Conidias t picas del microorganismo. View in document p.46
Figura 8. Aislamientos de Colletotrichum sp. En PDA. A y B Colonias obtenidas directamente a partir de frutos enfermos, C y D colonias obtenidas de cultivos monospóricos

Figura 8.

Aislamientos de Colletotrichum sp En PDA A y B Colonias obtenidas directamente a partir de frutos enfermos C y D colonias obtenidas de cultivos monosp ricos. View in document p.47
Tabla 3. Días Transcurridos hasta que aparecieron las lesiones en los Diferentes Estados Fenológicos de Frutos de Mango

Tabla 3.

D as Transcurridos hasta que aparecieron las lesiones en los Diferentes Estados Fenol gicos de Frutos de Mango. View in document p.48
Figura 9. Porcentaje de infección quiescente de Colletotrichum gloeosporioidesdiferentes estados fenológicos de frutos de mango

Figura 9.

Porcentaje de infecci n quiescente de Colletotrichum gloeosporioidesdiferentes estados fenol gicos de frutos de mango. View in document p.49
Figura 10. Desarrollo de las colonias de Colletotrichum en los diferentes medios de cultivo: A, Crecimiento sobre PDA, B, Medio selectivo para Colletotrichum sp.(CuOH2) y C, Medio Benomyl (2µl/ml) (Foto L

Figura 10.

Desarrollo de las colonias de Colletotrichum en los diferentes medios de cultivo A Crecimiento sobre PDA B Medio selectivo para Colletotrichum sp CuOH2 y C Medio Benomyl 2 l ml Foto L. View in document p.52
Figura 11. Prueba de la Proteasa. A. Respuesta negativa sin halo transparente característica, de la especie gloeosporiodes

Figura 11.

Prueba de la Proteasa A Respuesta negativa sin halo transparente caracter stica de la especie gloeosporiodes. View in document p.54
Figura 12. Frutos de Mango con lesiones de antracnosis. A, Lesiones primarias y B, Lesiones avanzadas

Figura 12.

Frutos de Mango con lesiones de antracnosis A Lesiones primarias y B Lesiones avanzadas. View in document p.55
Tabla 4. Valores de pH de Frutos Sanos de Mango en los diferentes Estados Fenológicos, en Exocarpio y en Mesocarpio

Tabla 4.

Valores de pH de Frutos Sanos de Mango en los diferentes Estados Fenol gicos en Exocarpio y en Mesocarpio. View in document p.56
Tabla 5. Valores de pH de Frutos Enfermos de Mango en los diferentes Estados fenológicos, en Exocarpio y Mesocarpio en áreas sanas y enfermas

Tabla 5.

Valores de pH de Frutos Enfermos de Mango en los diferentes Estados fenol gicos en Exocarpio y Mesocarpio en reas sanas y enfermas. View in document p.57
Figura 13. Efecto de Antracnosis sobre el pH. A, Te: tejido enfermo, ts: tejido sano. Ts-fe: tejido sano en fruto enfermo, exo: exocarpio y meso: mesocarpio

Figura 13.

Efecto de Antracnosis sobre el pH A Te tejido enfermo ts tejido sano Ts fe tejido sano en fruto enfermo exo exocarpio y meso mesocarpio. View in document p.60

Referencias

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