Caracterización molecular del gen 16s en la especie Atractus Crassicaudatus y análisis de la relación filogenética del género Atractus (serpentes: dipsadidae)

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(1)CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL GEN 16S EN LA ESPECIE Atractus crassicaudatus Y ANÁLISIS DE LA RELACIÓN FILOGENÉTICA DEL GÉNERO Atractus (Serpentes: Dipsadidae). MARÍA CAMILA GÓMEZ ÁVILA LUIS ALEJANDRO YATE SÁNCHEZ. UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA BOGOTA D.C. 2019.

(2) CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL GEN 16S EN LA ESPECIE Atractus crassicaudatus Y ANÁLISIS DE LA RELACIÓN FILOGENÉTICA DEL GÉNERO Atractus (Serpentes: Dipsadidae). MARÍA CAMILA GÓMEZ ÁVILA LUIS ALEJANDRO YATE SÁNCHEZ. Proyecto de Trabajo de Grado para optar al título de Licenciado en Biología. Dr. LUIS FRANCISCO BECERRA GALINDO Licenciado en Biología. Msc. Ciencias Biológicas. Grupo de investigación: Biología molecular BIOMOL Director. UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA BOGOTA D.C. 2019. 2.

(3) Nota de la Universidad ―La universidad no se hace responsable de las ideas, ni del contenido del presente trabajo, debido a que estas hacen parte única y exclusivamente de los autores‖. Capítulo XV, Artículo 117, Acuerdo NÚMERO 029 DE 1988 del Consejo Superior de la Universidad Distrital Francisco José de Calda. 3.

(4) AGRADECIMIENTOS. Agradecemos a la Universidad Distrital Francisco José de Caldas nuestra alma mater, al proyecto Curricular de Licenciatura en Biología, por ser pilares en la construcción de esta investigación. De nuestra formación como Docentes, profesionales enfocados en la enseñanza e investigación, sujetos en pro al desarrollo de conocimientos que puedan implementarse y generen cambios significativos en sociedades futuras.. 4.

(5) Al finalizar este trabajo de grado y pese a las dificultades inevitables de una investigación, es de suma importancia reconocer que sin la participación de personas e instituciones que contribuyan en la construcción de este, no sería posible culminar la tesis. Por lo cual quiero expresar mis agradecimientos más profundos. Gracias infinitas a la mujer de mi vida, mi mamá Aurora Angélica del Carmen, por ser un ejemplo de lucha, por enseñarme que el amor que se otorga viene de la mano con sabias palabras, sus palabras me enseñaron que sin importar los momentos de tribulación o los momentos en los que las fuerzas se comienzan agotar, el cuerpo se niega andar, el alma sucumbe ante la aflicción y se vive en sombras, siempre existe la esperanza de ver la vida más allá de una ausencia de color o una absorción de todos ellos, la vida es la percepción visual que se decida usar llena de múltiples posibilidades que pueden generen cambios significativos. A mi hermano Roy Alejandro por enseñarme que la paciencia es necesaria y una virtud de pocos, que sin importar lo complejo que sea el camino siempre puede encontrase una solución en diversas proposiciones. A mi viejo, mi querido viejo, desde cualquier lugar del universo seguirá inspirándome siendo el capitán de este navío, este Título siempre será por ti y para ti!. A mi querida amiga Alejandra Beltrán que sin su mano amiga que siempre están para levantarme ante alguna caída, a sus palabras llenas de cariño y conocimiento que te hacen ver y sentir la vida en una forma extensa así como los multiversos. A mi compañero Luis Alejandro por ser un cimiento ante los momentos de adversidad durante este proyecto. Gracias por persistir y creer en nuestra investigación. Camila Avila.. 5.

(6) La formación profesional y personal que he vivido los últimos años no habría sido posible sin los aportes de un gran número de personas que han creido en mí y en este proyecto de vida, les ruego que me perdonen si su nombre se me escapa en estas cortas líneas, se que en su espíritu vive la satisfacción de haber sido esa ayuda, guía, apoyo y comprensión en cada una de las trivialidades que representa una formación profesional y el desarrollo del presente proyecto de investigación. Quiero agradecer a mis padres, Patricia y Luis por su inmensa paciencia, por su apoyo económico, por sus regaños, por su atención y en general por su crianza, en la cual he aprendido que vale la pena luchar por ser cada dia mejor y que todo buen proceder tiene su recompensa, deseo que esta meta que se culmina con esta tesis los llene de orgullo y sirva como medio de pago para la deuda que tengo con ustedes, la deuda de la vida. A Gabriel por ser el motor de la inspiración para embaracar este viaje, este triunfo es por ti. A las personas maravillosas que conoci en todo este proceso, a Sandra Rios por ser esa ayuda divina en el momento más difícil de mi vida y mi carrera, a Andres Berbeo por su amistad incondicional y por enseñarme que con disciplina todo es posible. A Diego, David, Matias, Sergio, Cristian y Julián, gracias por las grandes anécdotas, siempre recordare las vivencias con nostalgia. A mi compañera Camila Avila, por luchar junto conmigo en el difícil camino de la investigación. A Angie por los bonitos recuerdos de estos últimos años en la universidad y el lugar que siempre tendrá en mi corazón. Finalmente a la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, mi gloriosa UD, Por ser la institución que transformo mi vida, por ser mi segundo hogar, por hacer parte de los mejores años de mi vida, gracias, ¡MUCHAS GRACIAS! Alejandro Yate. 6.

(7) RESUMEN. Actualmente Colombia cuenta con alrededor de 270 especies de serpientes, cerca de un 8% de la diversidad mundial de este grupo, con una amplia distribución sobre el territorio nacional, exceptuando la costa Caribe y alturas mayores a los 3.500m, estos animales cumplen papeles fundamentales en los ecosistemas, sin embargo es importante efectuar cambios en las concepciones de estudios de la ofidiofauna colombiana y contribuir en investigaciones que representen un enfoque genético. El objetivo principal de esta investigación fue secuenciar un segmento del gen 16s mtDNA de la especie Atractus crassicaudatus y construir mediante análisis bioinformáticas las posibles relaciones filogenéticas con el género Atractus, esto tras el estudio de la secuencia obtenida junto con 29 secuencias de ADN, recuperadas de la base de datos genómica Genbank. Como resultado se obtuvo una secuencia de 364 pb, con un total de 3 regiones conservadas en 65 posiciones, además se propone la construcción de un árbol filogenético del género. Lo anterior permite inferir cercanía filogenética con especies descritas para el sur de Colombia y Ecuador. Estos resultados constituyen un aporte al conocimiento molecular de las especies colombianas, al ser la primer descripción de un gen para Atractus crassicaudatus, lo que a su vez ofrece una aproximación a la resolución del interrogante de las relaciones filogenéticas dentro del género perteneciente a la familia Colubridae. Palabras claves: Serpientes, Atractus, secuencias, molecular, máxima verosimilitud.. 7.

(8) ABSTRACT. Currently Colombia has around 270 species of snakes, about 8% of the world's diversity of this group, with a wide distribution over the national territory, except the Caribbean coast and heights greater than 3,500m, these animals fulfill fundamental roles In ecosystems, however, it is important to make changes in the conceptions of Colombian ophidian studies and contribute to research that represents a genetic approach. The main objective of this investigation was to sequence a segment of the 16s mtDNA gene of the species Atractus crassicaudatus and to construct by bioinformatic analysis the possible phylogenetic relationships with the genus Atractus, this after the analysis of the sequence obtained together with 29 DNA sequences recovered from the genbank Genbank database. As a result, a sequence of 364 bp was obtained, with a total of 3 regions conserved in 65 positions. It is also proposed the construction of a phylogenetic tree of the genus, which allows inferring phylogenetic proximity with species described for southern Colombia and Ecuador. These results constitute a contribution to the molecular knowledge of Colombian species, being the first description of a gene for Atractus crassicaudatus, which in turn offers an approach to the resolution of the question of phylogenetic relationships within the genus belonging to the Colubridae family.. Keywords: Snakes, Atractus, sequences, molecular, maximum likelihood.. 8.

(9) ÍNDICE DE CONTENIDO. RESUMEN………………………………………………………………….….…VII ABSTRACT…………………………………………………………………..… VIII ÍNDICE DE CONTENIDO …………………………… …………………….…...IX LISTA DE FIGURAS……………………………… …………………..…….....XIII LISTA DE TABLAS………………………………………………………...……XV LISTA DE ANEXOS ….………………………………………………………...XVI. Pag. INTRODUCCIÓN....…………………………………………………………………17 1.PLANTEAMIENT ..…….……………....................................................................19 1.1 DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA………………………… 1.1.2 PREGUNTA PROBLEMA………………………. …….…...……....19. …………………...……....20. 1.1.2 HIPOTESIS…………………………………………………………………….20 1.3JUSTIFICACIÓN…………………………………………………….…...…...…..21 1.4OBJETIVOS………………………………………………………………………..23. 9.

(10) 2. MARCO TEÓRICO……………………………………………………...……......24 2.1 ANTECEDENTES ……………………………………………………………......24 2.2GENERALIDADES DE ATRACTUS CRASSICAUDATUS……………..….........27 2.3TAXONOMÍA…………………………………………… ……….…….……….29 2.4 GENBANK……………………………………………… ………………… …...31 2.5MARCADORES MOLECULARES…………………………………………... ...32. 2.6GEN 16S …………………………………………..…………..…………..………..34 2.7 HOMOLOGÍA DE SECUENCIAS …………………………………….… …......35 2.8 ALINEAMIENTOS ……………………………………………………….............35 2.9ALINEAMIENTOS MÚLTIPLES………………………………………….. …....36 2.10DISTANCIA GENÉTICA ………………….……..…………………..…… …..36 2.11 ESTIMACIÓN DE ÁRBOLES FILOGENÉTICOS ………………………..…37 2.12 ÁRBOL CONSENSO………………………………………………………...…37. 3. MATERIALES Y MÉTODOS…………………...……………………………….39 3.1FASE DE CAMPO ……………………………………………………………….39 3.1.1 UBICACIÓN DEL ÁREA………………………………………..……………..39 3.1.2 DESCRIPCIÓN DE ÁREA DE COLECTA……………………………………40. 10.

(11) 3.1.3 DESCRIPCIÓN DE INDIVIDUOS CAPTURADOS …………………………40 3.2FASE DE LABORATORIO ……………………………………………………41 3.2.1 ÁREA DE LABORATORIO……………………..……………………………41 3.2.2 EQUIPOS Y REACTIVOS ……………...……………………………………41. 4. PROCEDIMIENTOS ……………………………………………………………43 4.1 PROTOCOLO DE DISECCIÓN…………………………………………………43 4.2PROTOCOLO DE ESTANDARIZACIÓN EXTRACCIÓN ADN Y CUANTIFICACIÓN………………..............................................................................45 4.3 PROTOCOLO EXTRACCIÓN mt DNA BAENA. PROTOCOLO EXTRACCIÓN MT DNA A PARTIR DE MUESTRAS DE TEJIDO ( HÍGADO, CORAZÓN, RIÑÓN)……………………………….…..…………………………………………46. 4.4 PROTOCOLO CONDICIONES DE LA ESTANDARIZACIÓN PARA POLYMERASE. CHAIN REACTION (PCR) …………………….……..…….47. 4.4.1 CURVAS DE CLORURO DE MAGNESIO……………………………………48 4.4.2 CONCENTRACIÓN DE PRIMER´S…………………………………………….........49 4.4.3 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA ( PCR)………………… 50. 11.

(12) 4.5 PROTOCOLO PARA ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 1%...................................................................................................................................50 4.6 PROCESO DE SECUENCIAS……………………………………………...….…51 4.7 ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO -.....................……………………………….…51 4.7.1 ALINEAMIENTOS MÚLTIPLES……………………………………………54 4.7.2 MODELO EVOLUTIVO………………………………………………….........55 4.7.3 ÁRBOL FILOGENÉTICO……………………………………………………55. 5.RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………… .57 5.1 CUANTIFICACIONES DE MUESTRAS DE ADN EXTRAÍDO ………….…..57 5.2 CUANTIFICACIONES DE DILUCIONES DE ADN PARA PCR………………59 5.3REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA ……………………………60 5.4SECUENCIACIÓN DEL GEN 16S………………………………………………61 5.5DISTANCIAS GENETICAS……………………………………… ……………62 5.6ANÁLISIS FILOGENÉTICO……………………………………………………...67. 6. CONCLUSIONES…………………………………………………………….....71. 12.

(13) 7. RECOMENDACIONES………………………………………………………..73 8. ANEXOS ………………………………………………………………………...74 9. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………….............87. 13.

(14) LISTA DE FIGURAS. Figura 1.. Imagen tomada de GOOGLE MAPS de ubicación geográfica del Parque. Ecológico Cantarrana……………………………………………………………………....39 Figura 2. Imagen satelital del Parque Ecológico Cantarrana, encerrada en una figura azul el área exacta de trabajo………………………………………………………………………40 Figura 3. Fotografía de especímenes de Atractus con longitud de 17cm………….….....41 Figura 4. Escamas del espécimen dorsales y ventrales…………………………….……43 Figura 5.En la imagen se observa tejido epitelial, tejido muscular y órganos cubiertos por mesenterio…………………………………………………………………………….…... 43 Figura 6. Se observa epitelio escamoso, una capa muscular y la columna vertebral….…44 Figura 7. La imagen muestra Intestino grueso………………………………………..….44 Figura 8. Debido al desarrollo morfológico de las serpientes se observa una bolsa alargada de color claro corresponde al pulmón más desarrollado, el hígado de un color más oscuro y el corazón ………………………………………………………………………………….45 Figura 9. Termociclador THERMO SCIENTIFIC® Esco Swift Max Pro para ajustar las condiciones de temperatura y tiempo de la PCR…………………………………………..47 Figura 10 . Fragmento del gen 16s secuenciado…………………………………………..62 Figura 11. En el gráfico de barras se observa la distancia genética de las diferentes especies del género Atractus y del outgroup en relación al gen 16S , se emplea el algoritmo filogenético UPGMA para su análisis. …………………………………………………….63. 14.

(15) Figura 12. Topología de filogenia molecular de 30 especies del género Atractus y el outgroup (Sibon nebulata), el árbol es inferido con el método de máxima verosimilitud, modelo GTR. ………………………………………………………………………...69. 15.

(16) LISTA DE TABLAS Tabla 1. Taxonomía de la especie Atractus crassicaudatus…………………………………31 Tabla 2.. Relación de marcadores moleculares teóricos tomados de artículos. publicados…………………………………………………………………………………34 Tabla 3. Concentración y volumen para la elaboración de la PCR para un MIX de 4 tubos Nota: tomado de ―Guía práctica sobre la técnica de PCR,‖ L. Espinosa, 2009, Ecología Molecular, p. 525………………………………………………………………………..…48 Tabla 4. Relación de la concentración y volumen del MgCl 2 para la mezcla maestra de la PCR……………………………………………………………………………………………………49 Tabla5. Matriz de voucher y números de accesos del GenBank…………………………..52 Tabla 6. Concentración de la muestra de ADN en longitud de onda de 260nm y relación de la absorbancia(grado de pureza) medido en A260/280 y A260/230……………………….58 Tabla 7. Cuantificación concentración inicial de extracción de ADN y concentración final con diluciones………………………………………………………………………………59 Tabla 8. Información de concentración de muestras enviadas a Macrogen Korea®..61 Tabla 9. Matriz de distancias genéticas usando el gen 16S………………………………64 Tabla 10. En la matriz se analiza la relación 8 especies pertenecientes a los dos nodos principales marcados en la figura del árbol………………………………………….…..70. 16.

(17) LISTA DE ANEXOS Anexo 1. Procedimiento para la elaboración de electroforesis…………………………..74 Anexo 2. Grafica de cuantificaciones……………………………………………………..75 Anexo3. Alineaciones de las secuencias del género Atractus y un Outgroup (Sibon Nebulata), la alineación se realiza con el software ClustalX………………………………76 Anexo 4. En las siguientes dos tablas se observan las secuencias obtenidas a partir de las muestras de tejido tomadas de los especímenes del género Atractus (H:Hígado, M:Músculo, R:Riñón).................................................................................................77 Anexo5. A continuación se realiza la descripción de características generales de cada especie consultada en la investigación. Se consigna Autor y fecha de descripción……....79. 17.

(18) INTRODUCCIÓN. Atractus es un género perteneciente a la familia Colubridae (Oppel, 1811), que cuenta con una amplia distribución neotropical de gran abundancia en Sudamérica y parte de Centroamérica, este grupo taxonómico cuenta con una dispersión abundante, es así que se reportan avistamientos desde el Norte de la República Argentina con representantes como, A. paraguayensis, A. reticulatus y A. taeniatus, hasta el Noroccidente de Panamá (Myers,2003) con especies tales como, A. darienensis, A. hostilitractus, A. imperfectus, A. depressiocellus y A. clarki. Para Colombia, se describe la presencia de especies del género a lo largo de la cordillera de los Andes (Lynch, 2012). El género Atractus se caracteriza por sus hábitos fosoriales o semi fosoriales, su alimentación es a base de pequeños artrópodos y otros invertebrados como lombrices (Fraga, 2017), su dentición es aglifa, es decir carecen de glándulas y conductos de inoculación de veneno (Sierra, 2011). A pesar de la abundancia en estudios de este género enfocados en características de distribución, ecología y morfología, las investigaciones donde el objetivo de desarrollo está centrado en análisis genéticos son escasos, teniendo apenas unas cuantas publicaciones en los últimos años con investigaciones como las de Oliveira y Fernández (2016), Arteaga et al. (2017) y Mejía (2018), Anterior a dichas publicaciones se datan estudios de Vidal et al. (2000) y Zaher et al. (2009). A pesar de los esfuerzos de dichos autores, las contribuciones al conocimiento genético del género solo presentan soluciones parciales a los interrogantes como la composición genética de las especies y las relaciones filogenéticas que estas puedan tener.. 18.

(19) Posso (2013) menciona que en las últimas décadas se ha expresado un auge exponencial en estudios moleculares, en este sentido la presente investigación ofrece una aproximación al conocimiento molecular de la especie Atractus crassicaudatus y el género Atractus, centrándose en el uso de diferentes metodologías del laboratorio de biología molecular, que permitan la extracción, cuantificación, amplificación y secuenciación de un fragmento del gen 16s de ADN mitocondrial, el cual abre espacios a la elaboración de análisis de construcciones filogenéticas con las cuales se puede fundamentar, identificar y reconocer las posibles relaciones evolutivas de la especie, con base en la variabilidad genética que exhiben regiones del gen en comparación con secuencias disponibles de organismos pertenecientes al género y con ayuda de. software especializado que permiten el. modelamiento de los datos, mediante el uso de algoritmos bioinformáticos, donde se realiza la comparación de secuencias de ADN, lo que se convierte en un paso más encaminado a comprender la estructura, función y organización del código genético de la especie, así como la construcción y la conservación de bases de datos biológicas. (Escobar, 2011).. 19.

(20) 1.. PLANTEAMIENTO. 1.1 DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA. La serpiente Atractus crassicaudatus (Dumeril y Dibron, 1854), o serpiente sabanera, conocida comúnmente bajo este nombre, fue clasificada en el género Atractus por Boulenger (1894). En la actualidad los estudios para dicha especie están centrados en aspectos ecológicos y biológicos, A pesar de los grandes avances en estudios de biología molecular en el país, esta especie no presenta investigaciones en el campo de la genética molecular. Si bien, en la actualidad se evidencian los avances en investigaciones en el campo de las relaciones filogenéticas en las diferentes especies de reptiles, es conveniente mencionar que a pesar de esto, no es amplia la información consignada en bases de datos genómicas, para interés particular, en secuencias genéticas del género Atractus, que permitan esclarecer las historias evolutivas de este grupo.. Partiendo de la premisa anterior, la investigación corresponde a un estudio de secuencias particulares de ADN. Por medio de la amplificación y secuenciación de un fragmento del gen 16s mtDNA, en el cual la información genética reduce considerablemente la tasa de mutaciones y recombinaciones, es así que mediante protocolos de disección de material biológico de tejidos cardíaco, muscular. y conectivo, se. extrajo. material genético. mediante método Salting Out, por el cual se obtuvo ADN mitocondrial, el cual se cuantificó para su posterior amplificación por PCR, para analizar fragmentos de pares de bases (pb).. 20.

(21) Se plantea la necesidad de secuenciar el gen 16s mtDNA y efectuar el alineamiento de secuencias múltiples frente a secuencias obtenidas de la base de datos genómica GenBank, lo que permite sistematizar la información de secuencias, para caso particular del gen 16s mtDNA, en programas bioinformáticas cuyos algoritmos reconstruyen historias evolutivas.. 1.1.2 PREGUNTA PROBLEMA ¿Es posible obtener un árbol filogenético de la especie Atractus crassicaudatus, con relación al género, a partir de la secuenciación y análisis bioinformático del gen 16S mtDNA?. 1.1.2 HIPOTESIS A partir de la pregunta problema se plantea la siguiente. hipótesis: Las relaciones. filogenéticas de la especie Atractus crassicaudatus con respecto al genero. Atractus,. pueden deberse a especiación por procesos geográficos.. 21.

(22) 1.3 JUSTIFICACIÓN. En colombia se estiman un aproximado de 270 especies de fauna ofídica, el cual constituye el 8% de la diversidad del planeta, categorizando a Colombia entre los 10. países con. mayor cantidad de serpientes, entre ellas encontramos a la familia Leptotyphlopidae con un solo género, 30 para Elapidae, 19 para Viperidae y al menos 48 géneros para Colubridae, entre otros. (Lynch, 2012). La serpientes son animales que suscitan un gran interés para la humanidad, es así que se genera la importancia de ampliar el conocimiento científico sobre dichas especies , en este caso el género Atractus y la especie Atractus crassicaudatus (Dumeril y Dibron, 1854), partiendo de esta premisa y al existir una ausencia de información genética de la especie mencionada, se constituye una investigación con el objetivo de describir un segmento del gen 16s mtDNA, a partir de extracción y amplificación PCR, que conlleven a la obtención del fragmento de dicho gen. El segmento de gen descrito permite la elaboración árboles filogenéticos mediante análisis bioinformáticos, con los cuales se ofrece una hipótesis sobre las relaciones de parentesco y los cambios acumulados, entendiéndose como eventos evolutivos.. Con este proyecto de investigación se amplía el conocimiento molecular del grupo de los ofidios y se representa la primera descripción molecular para la especie, al estandarizar y protocolizar métodos de extracción de ADN de tejidos y de PCR del gen 16S, dicho fragmento será comparado con otras secuencias pertenecientes a bases de datos del género. A partir de una reconstrucción filogenética basada en el criterio de máxima verosimilitud. 22.

(23) sustentada en el modelo evolutivo acorde a la estructura de las secuencias, el cual propiciará la información sobre posibles relaciones filogenéticas entre las especies, lo que permite determinar si los resultados son o no relevantes para el conocimiento molecular.. 23.

(24) 1.4 OBJETIVOS 1.4.1 OBJETIVO GENERAL ● Secuenciar un segmento del gen 16s mtDNA de la especie Atractus crassicaudatus con el fin de obtener información molecular que permita establecer posibles relaciones filogenéticas dentro del género Atractus.. 1.4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ● Amplificar y secuenciar el gen 16s mitocondrial (mtDNA) de la especie Atractus crassicaudatus mediante técnicas y protocolos de laboratorio de biología molecular.. ● Determinar las relaciones filogenéticas de la especie Atractus crassicaudatus, con respecto al género Atractus a partir de la comparación de secuencias del gen 16s.. ● Construir un árbol filogenético en base a secuencias genéticas dispuestas en el Genbank, con el fin de ubicar a la especie Atractus crassicaudatus en relación con el género Atractus.. 24.

(25) 2. MARCO TEÓRICO. 2.1 ANTECEDENTES Al partir de los estudios de Linneo en el siglo XV acerca de las categorías taxonómicas, el cual abre paso a los fundamentos taxonómicos de las especies (Lanteri, 1995). Reig (1979) propone tres conceptos que aluden a las categorías de especie, taxones especie y bioespecie, de los cuales se puede distinguir que el concepto especie se encuentra en una jerarquía linneana, por la cual los taxónomos se rigen y proponen las clasificaciones de las especies, de lo que se deriva la disciplina sistemática filogenética o cladismo, formulada por los principios de Henning (1968) y que en la década de los 80 predominó en el campo de la escuela clasificatoria de las especies (Lanteri, 1989). Cole (1985) describe que los análisis de secuencias moleculares permiten reconocer linajes partenogenéticos, en algunos casos poliploides, grupos monofiléticos de organismos de reproducción sexual o asexual caracterizados en secuencias particulares de ADN; lo que permite deducir que la reconstrucción de filogenias ofrece la posibilidad de obtener cladogramas con hipótesis filogenéticas más simples, es decir, con menos homoplasias, en comparación a las reconstrucciones filogenéticas con base a caracteres morfológicos, a su vez, los cladogramas basados en caracteres moleculares pueden ser reforzados por análisis morfológicos; además se resalta que los estudios basados en caracteres moleculares permite tener nociones más amplias sobre la resolución de problemas de clasificación taxonómica, evolución y filogenia de las especies (Lanteri, 1995). Los análisis de secuencias para filogenias tomaron fuerza con la llegada de técnicas de secuenciamiento rápido (PCR) a finales de los 80 (Mullis y Falloona, 1987), lo que ha permitido una comparación más útil de los genomas desde ese momento, Sanz (2005) menciona que los bancos de datos. 25.

(26) genéticos no han parado de crecer. Churchill et al., (1992) enuncian que “Para el trabajo comparativo de secuencias moleculares se suelen usar genes (o regiones) y proteínas universales, como los ARNr o los genes (ADNr) que los codifican” (Tomado de Sanz, 2005), Manhart (1994) describe que los genes o regiones moderadamente conservados son los más convenientes para resolver parentescos en los niveles medios de la jerarquía taxonómica (orden, familia, género). Sanz (2005) postula que el genoma mitocondrial (ADNmt) es uno de los más viables para ser usado en animales donde se presenta compacto y con pocos genes e intrones, además de una relación paralela con el desarrollo de “más y más potentes programas de ordenador para el alineamiento de secuencias homólogas lo que permiten detectar las posiciones en las que se han producido cambios, modelizar la evolución molecular, encontrar el árbol que mejor describa las relaciones filogenéticas de la secuencias (criterios de optimización), para dibujar los árboles, para comprobar la robustez (estadística) de la posición de las ramas en el árbol (como los procedimientos bootstrap)” (Sanz, 2005). Los estudios filogenéticos en serpientes datan desde el siglo XIX con los aportes de obras clásicas como las de Dumeril (1854), Jan (1863) y Cope (1895) y que posteriormente permitieron ampliar la información sobre los clados de Caenophidie (Xenophidia), en cuanto a las definiciones de algunas unidades monofiléticas como familias y sub-familias en los estudios de McDowell (1987) (Grazziotin, 2012). Después, en la década de los 90 aparecen los estudios filogenéticos basados en evidencia molecular que permitieron corroborar algunos puntos de vista sugeridos en análisis morfológicos y sugiriendo nuevas hipótesis de clasificación (Alfaro et al., 2008), Zaher (1999) sintetizó la evidencia morfológica disponible, principalmente de hemipenes, y asignó todos los géneros. 26.

(27) "colubridos" a subfamilias, basados en parte en listas publicadas por Dowling y Duellman (1978), McDowell (1987), Williams y Walach (1989) y Meirte (1992). Zaher (1999) reconoció el supuesto origen monofilético a las familias Atractaspididae y Colubridae ostensiblemente parafilético incluyendo doce subfamilias: Xenodermatinae, Pareatinae, Calamariinae,. Homalopsinae,. Boodontinae,. Psammophiinae,. Pseudoxyrhophiinae,. Natricinae, Dipsadinae y Xenodontinae. Lawson et al. (2005) revisó la asignación de muchos géneros en función de la filogenia molecular de 100 Xenophidias que representa todas las subfamilias reconocidas por Zaher (1999), allí se reconocieron a las familias Colubridae, Elapidae, Homalopsidae, Pareatidae y Viperidae, y acomodaron al grupo Acrochordus como el taxón hermano de todos los demás xenophidios. Sin embargo, su análisis máximo de parsimonia (MP) no se resolvió bien, apoyó nodos más profundos entre las cinco familias de colubridos, además de Pareatidae, que era el taxón hermano de un clado, incluidos los cuatro restantes (Grazziotin, 2012). Vidal et al. (2007, 2008) estudiaron patrones amplios de relaciones filogenéticas entre xenophidios basado en un análisis de secuencias de aproximadamente 25-30 taxa, principalmente de África, donde revisó parte de la taxonomía de las serpientes en función de su análisis. Zaher et al., (2009) Presentan un análisis filogenético molecular de serpientes xenophidias, usando secuencias de dos genes mitocondriales (ARNr 12S y 16S) y uno nuclear (c-mos), (1681 pares de bases totales) y con 131 taxa terminales muestreados de todas partes del planeta, principalmente linajes xenophidios, pero se centra en xenodontinas neotropicales. Grazziotin et al., (2012) describen un análisis filogenético de los dipsadidos del Nuevo Mundo basado en una matriz de datos ampliada que incluye 246 taxones terminales, de los cuales 196 son dipsadidos, muestreados para ocho genes (12S, 16S, cytb, nd2, nd4, bdnf, c-mos, rag2 ) Los datos se. 27.

(28) exploran utilizando dos procedimientos de búsqueda distintos: máxima parsimonia y máxima verosimilitud y dos estrategias de alineación: homología dinámica y homología estática. Arteaga et al., (2017) presentan una filogenia molecular del género serpiente Atractus, con un muestreo taxonómico mejorado que incluye 29 de las 140 especies actualmente reconocidas. El árbol filogenético apoya la existencia de al menos tres nuevas especies en las tierras bajas del Pacífico y las laderas andinas adyacentes de los Andes ecuatorianos.. 2.2 GENERALIDADES DE ATRACTUS CRASSICAUDATUS La especie Atractus crassicaudatus (Dumeril y Dibron, 1854), cuyo nombre original fue Rhabdosoma crassicaudatum y posteriormente clasificada en el género Atractus por Boulenger en 1894, basado en la característica de ausencia de escamas preoculares (Savage, 1960). La especie se caracteriza por presentar una longitud total entre 400 y 440 mm (Lynch y Rengifo, 2001), además con dimorfismo sexual notable al tener machos con longitud de cola y número de escamas subcaudales mayor al de las hembras (Passos y Arredondo, 2009), El cuerpo es cilíndrico y la cabeza es pequeña y escasamente distinguible del cuello (Boulenger, 1894); posee seis escamas supralabiales, siete infralabiales y generalmente cuatro líneas de escamas gulares (Passos y Lynch, 2010). Es frecuente la presencia de una banda postorbital de color crema muy evidente (Pérez-Santos y Moreno, 1988), 17 hileras de escamas dorsales sin reducción, de 140 a 170 escamas ventrales; escama anal entera y subcaudales divididas (21 a 33 en machos y 14 a 26 en hembras), las escamas corporales son lisas y sin fosetas apicales (Passos y Arredondo,. 28.

(29) 2009). ―Maxila con 8 a 11 dientes, de longitud similar y con tendencia decreciente hacia la parte posterior de la boca. Los hemipenes presentan un surco espermático bifurcado de manera distal, ligeramente bilobulado, semicapitado y semicaliculado, y sin proyecciones lobulares laterales” (Paternina y Capera, 2017). Enorme variabilidad en patrones de coloración, de dorso negro con algunas líneas generalmente transversales distribuidas irregularmente de color amarillo claro, rojo, ocre, gris o naranja, con el vientre en una mezcla equilibrada de amarillo y negro, o sin el patrón de diferenciación dorso– ventral, llegando a ser monocromáticos con el pigmento negro muy difuso o totalmente ausente, la región vertebral se mantiene siempre más oscura (Paternina y Capera, 2017). Especie terrestre y excavadora, de movimientos lentos (Lynch y Rengifo 2001), que al sentirse amenazada puede moverse rápidamente (amplias ondulaciones laterales del cuerpo) durante la. huida entrando bajo rizomas de pastos, excavando en sustratos suaves y. disgregados (Lynch y Rengifo 2001), o levantando alternadamente o al tiempo la cabeza y la cola. Los periodos de actividad son variables, prefiriendo la noche o el crepúsculo (Sánchez et al. 1995), siendo las horas de mayor movilidad entre 19:00 y 22:00 horas. Habita generalmente en. ambientes húmedos en cercanías a cuerpos de agua como. humedales, quebradas y principalmente pastizales (Lynch y Rengifo 2001). Se puede encontrar debajo de piedras o estructuras de concreto, bajo material vegetal acumulado y en descomposición, troncos caídos, y maderas abandonadas. Es común encontrarlas cuando se está removiendo tierra en obras civiles o cuando se está preparando la tierra en cultivos y jardines (DAMA 2003). No representa peligro para el hombre ya que no posee veneno; cuando es manipulada libera un almizcle de olor desagradable acompañado de un movimiento errático. A. crassicaudatus se alimenta de lombrices de tierra (Lynch y Rengifo. 29.

(30) 2001), aunque datos para otras especies del género sugieren que también puede consumir artrópodos como opiliones y otros invertebrados que se encuentren en su microhábitat. Según Dunn (1944), los dientes del maxilar son de longitud uniforme o decreciente posteriormente, indicando una dieta conformada principalmente por invertebrados. La especie es ovípara y las hembras depositan los huevos debajo de piedras, troncos caídos o bajo tierra (Lynch y Rengifo 2001). De acuerdo con estos autores, los nacimientos de las crías tienen lugar durante los meses de octubre a diciembre. Entre los factores que amenazan el equilibrio de las poblaciones de A. crassicaudatus se encuentran: 1) destrucción del hábitat, principalmente en localidades dentro de la ciudad de Bogotá o cerca de asentamientos humanos (humedales y sus alrededores); 2) potenciales cambios. en su nicho térmico debido al cambio climático, ya que al ser especies. ectotérmicas de alta montaña son susceptibles a este tipo de alteraciones en la temperatura; 3) la tradicional percepción negativa que las personas tienen de este tipo de organismos y que termina en el sacrificio injustificado de las serpientes.( Paternina 2016). 2.3 TAXONOMÍA Atractus crassicaudatus fue inicialmente descrita por Duméril, Bibron y Duméril (1854) como Rhabdosoma crassicaudatum con base en una serie de ejemplares colectados en los alrededores de Bogotá, dichos ejemplares actualmente se encuentra en París,. Sin embargo, Dunn (1944) sugirió que los especímenes pudieron haber sido colectados por Humboldt y Bonpland en 1801, o por Lozano o Goudot unos pocos años después. Posteriormente, en 1865 Jan llamó a la especie Rabdosoma crassicaudatum y para el año de 1894 Boulenger la. 30.

(31) incluyó dentro del género Atractus (Tabla1); como característica de este género,. se. presenta la ausencia de escamas preoculares y la loreal (más larga que la 19 postnasal, revisar Figura3) entrando en contacto con el ojo (Savage 1960). Passos y Lynch (2010), a partir 20 de análisis de caracteres cuantitativos y cualitativos colocaron, a Atractus longimaculatus (Prado, 21 1940) y Atractus colombianus (Prado, 1940) bajo la sinonimia de A. crassicaudatus. Atractus crassicaudatus pertenece a la subfamilia Dipsadinae, familia Dipsadidae, un clado monofilético de serpientes soportado por diversos estudios (Vidal et al. 2007; Zaher et al. 2009) cuya. diversidad se encuentra principalmente en Centro. América y norte de Sur América (Vidal et al. 25 2007; Zaher et al. 2009; Pyron 2011). Atractus crassicaudatus es fácilmente distinguible de sus. especies más cercanas. geográficamente A. wagleri y A. werneri por la siguiente combinación de caracteres: A. crassicaudatus presenta 147-170 escamas ventrales (♀), 14-26 escamas subcaudales (2133 ♂) y la cola representa el 8-13,7% (11-17% ♂) de la longitud de cuerpo, mientras que A. wagleri presenta 174-180 ventrales (♀), 43-44 subcaudales (46-56 ♂) y la cola representa el 13,6-15,3% (21,61% ♂) del cuerpo, por su parte A. werneri : presenta 158-174 31 ventrales (♀), 21-36 subcaudales (27-37 ♂) y la cola representa el 8,7-15,2% (13,2-17,1% ♂) del cuerpo (Passos y Arredondo, 2009; Passos y Lynch, 2011); de manera que A. crassicaudatus tiene el cuerpo y la cola, proporcionalmente más corta de las tres especies.. 31.

(32) .Reino. Animalia. Phylum. Chordata. Clase. Reptilia. Orden. Squamata. Suborden. Serpentes. Familia. Colubridae. Subfamilia. Dipsadidae. Género. Atractus. Especie. Atractus crassicaudatus (Duméril, Bibron & Duméril, 1854). Tabla 1. Taxonomía de la especie Atractus crassicaudatus 2.4 GENBANK La investigación en genética molecular de los últimos años ha tomado cada vez más fuerza en los centros de investigación biológica del mundo, marcando la necesidad de establecer una base de datos que contenga la mayor cantidad de información posible en cuanto a estudios moleculares, es así como el. National Center for Biotechnology Information. (NCBI) diseña el proyecto Genbank (Benson et al, 2008), que corresponde a la principal. 32.

(33) base de datos que comienza a recopilar secuencias de ADN, el GenBank es la colaboración de DNA Data Bank de Japón (DDBJ) (Sugawara et al., 2007), European Nucleotide Archive (ENA) (Kulikova et al., 2006) y GenBank en NCBI (estas tres organizaciones intercambian datos diariamente en las que se incluye secuencias de ARN con regiones codificantes, ADN genómico correspondiente a uno o varios genes y ARN ribosómico. Además se presente la existencia de varias secuencias para un mismo gen.. 2.5 MARCADORES MOLECULARES El principal argumento en pro a emplear caracteres moleculares para los diversos tipos de investigaciones en poblaciones, es que cuentan con la premisa de su universalidad (Simpson, 1997). Por consiguiente se adopta que los marcadores moleculares son definidos como una herramienta necesaria en muchos campos de la biología como evolución, ecología, bio-medicina, ciencias forenses y estudios de diversidad, utilizándose. para. localizar y aislar genes de interés. Además Simpson (1997) expresa que existen varias técnicas moleculares que nos permiten conocer cómo se encuentran las proporciones de genes en las poblaciones naturales de manera indirecta, como con los análisis de proteínas, o de manera directa con estudios de ADN. Los diferentes tipos de marcadores se distinguen por su capacidad de detectar polimorfismos en loci únicos o múltiples y son de tipo dominante o co-dominante. Marcadores moleculares bibliográficos Se realizó la revisión bibliográfica relacionada con el gen a amplificar, de estos artículos se sintetizaron los cebadores utilizados por los autores (Tabla 2). 33.

(34) AUTORES GEN. TÍTULO ARTÍCULO. AF158487,. Phylogenetic relationships of. AF158471,. xenodontine snakes inferred Vidal et al., 2000. AF158485,. from 12S and 16S ribosomal. AF158486. RNA sequences Molecular phylogeny of advanced snakes (Serpentes,. GQ457726. Caenophidia) with an emphasis. Zaher et al., (2009). on South American Xenodontines KY610046, KY610047, KY610051, Molecular phylogeny of KY610052, Atractus (Serpentes, KY610053,. Arteaga et al., Dipsadidae), with emphasis on. KY610057,. (2017) Ecuadorian species and the. KY610058, description of three new taxa KY610059, KY610060, KY610061,. 34.

(35) KY610062, KY610064, KY610065, KY610066, KY610067, KY610069, KY610070, KY610071, KY610072.. Tabla 2. Relación de marcadores moleculares teóricos tomados de artículos publicados. Cebador encontrado solo para las descripciones de Arteaga et al., (2017). L— CGCCTGTTTATCAAAAACAT HR-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT. 2.6 GEN 16S En la Actualidad se utilizan para estudios de árboles filogenéticos y esquemas evolutivos, el gen 16S, puesto que sus secuencias permite la adjudicación de relaciones naturales, debido a que este gen ha logrado mantenerse uniforme a lo largo de la evolución y por eso se ve claramente las diferencias entre las distintas especies. (Cuadra, 2017). Debido a que la molécula del 16S contiene regiones altamente variables, es usualmente posible el encontrar regiones de 20 a 30 bases que son completamente exclusivas de una sola especie. (Cuadra, 2017). 35.

(36) 2.7 HOMOLOGÍA DE SECUENCIAS González, d. (1996) menciona que en los análisis filogenético basados en secuencias génicas, con correspondencia histórica y relación mecánica si dos secuencias son similares estas provienen de un ancestro común, es así que, se considera que estas son homólogas. A partir de una secuencia ancestral y en el transcurso de las generaciones, las mutaciones entre las copias acumulan algunos cambios en los nucleótidos (Mindel,1991) . 2.8 ALINEAMIENTOS Pinzón (2010), afirma que un alineamiento es un procedimiento mediante el cual se organizan dos secuencias con la finalidad de medir el grado de homología y divergencia entre ellas. El resultado de un alineamiento indica la cantidad de bases nitrogenadas (en ADN o ARN) o aminoácidos (en proteínas) que se conservan entre las secuencias. Sin embargo, más informativo, es la cantidad de sitios que no se conservan. La manera en que dos secuencias pueden divergir, es mediante (a) procesos de sustitución (mutaciones) o (b) procesos de inserción o eliminación (indels). Los procesos de mutación, pueden dar cierta información sobre la evolución de la secuencia. Sin embargo para poder extraer de manera significativa esta información, es necesario considerar que cada base nitrogenada o aminoácido tiene un comportamiento similar al modelo de segregación de los alelos, los cuales se segregan de manera independiente (Madrigal 2017). 2.9 ALINEAMIENTOS MÚLTIPLES El alineamiento de secuencias permite que a partir de secuencias almacenadas en bases de datos y con ayuda de algoritmos computacionales basados en propiedades matemáticas y estadísticas, permitan optimizar la distribución y así descubrir patrones y. relaciones. 36.

(37) evolutivas, la formación y la comparación de genomas (Escobar,2011).El alineamiento de pares es fundamental en la búsqueda de similitudes de características para lograr un perfil de alineamiento múltiples (Xion,2006)(Anexo3) 2.10 DISTANCIA GENÉTICA Las distancias genéticas nos permiten observar el rango de similitud entre las poblaciones que son reflejadas por las frecuencias alélicas que expresan una composición genética sin conjeturas de posibles historias evolutivas, no obstante por otro lado las distancias pueden basarse en acciones. causadas por mutaciones construyendo hipótesis evolutivas.. (Demarchi,2009).Matriz de distancias (Tabla9) Para poder identificar algún tipo de proceso evolutivo, es necesario proveer al dendrograma con una medida cuantitativa. Consideremos los procesos evolutivos de sustitución, en donde cada base puede ser sustituida por otra con una frecuencia. Los modelos de evolución molecular. explican la acumulación de mutaciones en términos de la tasa. mutacional y el tiempo (Anexo6). De hecho, la cantidad se denomina distancia genética. Esta distancia, en general es una función logarítmica de las probabilidades de cambio p. Este caso es el más sencillo, que es el de transiciones del tipo Jukes-Cantor (Vargas, 2018). 2.11 ESTIMACIÓN DE ÁRBOLES FILOGENÉTICOS. Un árbol filogenético es una representación de algunas relaciones biológicas entre algunas formas de vida. En la representación topológica de un árbol, la longitud de las ramas son proporcionales o bien a la distancia evolutiva entre las secuencias, o el tiempo de divergencia entre las secuencias. Los nodos corresponden a la secuencia ancestral. 37.

(38) hipotética a partir de la cual derivaron las secuencias en los grupos incluidos a partir de ese punto. Los grupos que cumplen con esto, se denominan monofiléticos y cada uno de ellos se denomina taxa o clado (Maher, 2002). Si el árbol tiene raíz, entonces este nodo general representa un ancestro común para todas los clados incluidos. El concepto de ―árbol filogenético‖ es una visión algo limitada: un grupo monofilético, es equivalente a suponer que las secuencias que conforman un clado descendieron directamente del ancestro común, y. se. diferencian. de. él. solo. por. procesos. mutacionales. que. acumularon. sustituciones.(Figura12). En otras palabras, los procesos biológicos como recombinación, duplicación y evolución paralela, transferencia horizontal, o selección natural, no se reflejan claramente en este tipo de representaciones (Caballero, 1999). 2.12 ÁRBOL CONSENSO En general, un árbol filogenético es una perspectiva de la historia evolutiva de las especies, de un conjunto de secuencias determinado, se pueden derivar distintas árboles, y por tanto distintos procesos ecológicos o biológicos. Una metodología que sirve para resumir estas posibles historias es la construcción de un árbol consenso. Este incluye una cantidad de árboles plausibles biológicamente que son congruentes, estos corresponden a una síntesis de la posible filogenia ( Luna,2005) .. 38.

(39) 3. MATERIALES Y MÉTODOS. la investigación realizada es de orden cuantitativo, en la cual para la obtención de un fragmento de secuencia del gen 16s en la especie Atractus crassiudatus se establecieron tres fases de abordaje, denominadas fase de campo, fase de laboratorio y. análisis. bioinformático.. 3.1 FASE DE CAMPO 3.1.1 UBICACIÓN DEL ÁREA. Para el desarrollo de esta fase se realizó un trabajo de campo en el Parque Ecológico Cantarrana, un atractivo ambiental ubicado en la localidad (5) Usme de la ciudad de Bogotá D.C. Se encuentra situado geográficamente en la carrera 1A No.100-11 sur, entre los barrios Monteblanco y Brazuelos, en la subcuenca del río Tunjuelito.. Figura 1 Imagen tomada de GOOGLE MAPS de ubicación geográfica del Parque Ecológico Cantarrana. 39.

(40) Figura 2. Imagen satelital del Parque Ecológico Cantarrana, encerrada en una figura azul el área exacta de trabajo.. 3.1.2 DESCRIPCIÓN DE ÁREA DE COLECTA. El Parque Ecológico Cantarrana ubicado en la zona suroriental de la ciudad cuenta con unas colinas bajas y un paisaje de montaña el cual aglomera una franja de transición urbano-rural con el desarrollo de reservas hídricas como el de la cuenca media y alta del Río Tunjuelito con alturas que van desde 2.600 hasta 3.800 msnm.. 3.1.3 DESCRIPCIÓN DE INDIVIDUOS CAPTURADOS Se estudia un total de 2 individuos de la especie mencionada con anterioridad, caracterizadas por tener escamas lisas, de un tamaño corto y cuello sin definición, los ejemplares se caracterizan por tener patrones de coloración amarillo en forma longitudinal y algunos transversales.. 40.

(41) Yate-Avila 2019. Figura 3. Fotografía de especímenes de Atractus con longitud de 17cm. 3.2 FASE DE LABORATORIO 3.2.1 ÁREA DE LABORATORIO. La extracción de material genético, cuantificación, diseño de primers, estandarización de las condiciones de la PCR y la verificación de los productos se realizó en los laboratorios de Biología Molecular y Genética de la Conservación (BIOMOL- C) de la Facultad Ciencias y Educación, de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, ubicada en la sede Macarena B Cra. 4 No. 26B – 54 de la ciudad de Bogotá.. 3.2.2 EQUIPOS Y REACTIVOS. para el desarrollo de protocolos de biología molecular se utilizaron Equipos, instrumentación y reactivos situados en las instalaciones de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, para el desarrollo de dichos protocolos se mencionan los equipos usados a continuación: Balanza Adventure OHAUS® AL0640, Cámara de electroforesis BIORAD® Mini Sub Cell GT, Cámara de flujo laminar AIR CLEAN® System 600 PCR Work Station, Cámara de flujo laminar AIR CLEAN® System 600 PCR Work Station, Cámara de revelado BIORAD® Molecular Imager Gel Doc ™, Centrífuga – 4°C. 41.

(42) Eppendorf® 5010R, Micropipeta electrónica BRAND® de 100 a 1000 µl,Micropipeta electrónica BRAND® de 10 a 100 µl, Micropipeta electrónica BRAND® de 1 a 20 µl, Micropipeta electrónica BRAND® de 0,5 a 1 µl, Nanodrop THERMO SCIENTIFIC® 2000C, Nevera – 4°C HACEB®, Nevera – 80°C THERMO SCIENTIFIC® Forma 900 Series, Nevera – 20°C THERMO SCIENTIFIC®, Plancha de calentamiento THOMAS SCIENTIFIC ® hot late – stirrer, Termociclador THERMO SCIENTIFIC® Esco Swift Max Pro (Figura9) y Vortex THOMAS SCIENTIFIC®. Los reactivos e insumos de laboratorio empleados en esta investigación serán nombrados a continuación: Agarosa, Azul de Bromofenol, Colorante SYBR Safe®, Kit para extracción de DNA MO BIO®, Kit para PCR BIOLASE™ DNA Polymerase, BIOLINE®, Marcador de peso molecular HyperLadder IV, BIOLINE®, TRIS BORATO EDTA: TBE al 1%, Batas de laboratorio color blanco, Guantes, Puntas para micropipeta de 0,5 a 10 µl, Puntas para micropipeta de 10 a 100 µl, Puntas para micropipeta de 10 a 100 µl, Tapabocas, Tubos eppendorf de 2ml y Tubos eppendorf para PCR.(Tabla 3) (Tabla4).. 42.

(43) 4. PROCEDIMIENTOS. 4.1 PROTOCOLO DE DISECCIÓN Este protocolo se realizó con el fin de obtener material biológico necesario para la extracción de material genético -Los especímenes son refrigerados a -20° por 15 minutos para su sacrificio. Yate-Avila 2019. Figura 4. Escamas del espécimen dorsal y ventral. -Se realiza una incisión con las tijeras o con un bisturí, la apertura se traza desde la zona cloacal hasta la cabeza, es necesario que la incisión sea lo más superficialmente posible para evitar el daño de los órganos.. Yate-Avila 2019. Figura 5.En la imagen se observa tejido epitelial, tejido muscular y órganos cubiertos por mesenterio.. 43.

(44) Yate-Avila 2019. Figura 6. Se observa epitelio escamoso, una capa muscular y la columna vertebral.. -Se observa un conducto alargado de color rosa oscuro que corresponde tracto digestivo final y una serie de protuberancias blanquecinas que corresponde al sistema reproductor.. Yate-Avila 2019. Figura 7. La imagen muestra Intestino grueso. -A medida que se aproxima a la zona anterior se observará el pulmón, el hígado bilobulado a la altura aproximada del estómago y el corazón.. 44.

(45) Yate-Avila 2019. Figura 8. Debido al desarrollo morfológico de las serpientes se observa una bolsa alargada de color claro corresponde al pulmón más desarrollado, el hígado de un color más oscuro y el corazón.. -Los demás órganos no son tenidos en cuenta, debido a la necesidad de la investigación, los restos son depositados como muestras para coleccion. 4.2. PROTOCOLO. DE. ESTANDARIZACIÓN. EXTRACCIÓN. ADN. Y. CUANTIFICACIÓN La extracción del ADN se realizó por medio del Kit de extracción DNA biomolc, se seleccionaron protocolos de extracción DNA-mt a partir de tejido, para que las muestras sean óptimas el coeficiente de absorción 280 nm debe encontrarse dentro del rango cociente A260/A280 el cual se presenta de 1,8 y 2,0 ng/μl; mientras que la absorción de 230 nm es indicativo de muestras de cociente A260/A230 se deben un rango de 2,2 ng/μl aproximadamente (Poms, 2001).. 45.

(46) 4.3 PROTOCOLO EXTRACCIÓN mt DNA BAENA. a partir de muestras de tejido ( hígado, corazón y músculo) -Se seleccionaron muestras de tejido de hígado, músculo, corazón y riñón, los cuales fueron extraídos mediante técnica de disección de tejido fresco de especímenes capturados y depositados los especímenes en la colección del Museo de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas. El fragmento del. tejido se lava con etanol (70%) y agua. destilada (2 lavados de 20 minutos para cada uno) -Se coloca la muestra en un tubo de microcentrífuga nuevo y estéril, se le agregan 0.5 ml de buffer de digestión ( 0.05 tris HCL: 0.01 M EDTA; 0.1 M NaCl, pH= 8.0), y 0.04M DTT, 10% de SDS y 2mg/ml de proteinaza K. La muestra se incuba por 12-18 horas a 37 OC Para la digestión del tejido. -La muestra es extraída dos veces con igual volumen de Alcohol 25:24:1 y una vez con nbutanol (La centrifugación se hizo a 11.000 rpm en microcentrífuga) -El ADN se precipita agregando 0.1% del volumen de acetato de sodio saturado (6M) y 1.1 volumen de etanol absoluto (-20 OC). La mezcla se coloca a –20ºC durante 45 minutos y posteriormente se centrifuga a 13.000 rpm por 10 minutos y el sobrenadante se elimina -El botón se lava con etanol 70% y se seca al vacío por 16 horas. La muestra se resuspende en 100µ de TE 1X y se guarda a 4 OC para su análisis posterior.. 46.

(47) 4.4. PROTOCOLO. CONDICIONES. DE. LA. ESTANDARIZACIÓN. PARA. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR).. Este procedimiento se realizará utilizando el termociclador, THERMO SCIENTIFIC® Esco Swift Max Pro, el cual permitirá ajustar las condiciones de temperatura, número de ciclos, tiempo y volumen del contenido para cada tubo Eppendorf® en la PCR (Sharrocks, 2004). Yate-Avila 2019. Figura 9. Termociclador THERMO SCIENTIFIC® Esco Swift Max Pro Para la elaboración de la mezcla maestra se sugiere usar las diferentes concentraciones y volúmenes de los reactivos (Espinosa, 2009). 47.

(48) Cantidad µl de Concentración. Concentración. reactivo por. inicial. por reacción. tubo. Componentes. MIX para 4 muestras. DNTP’s. 40 mM.. 5 µl.. 2 mM.. 8µl.. MgCl2. 50 mM.. 15 µl.. 0,75 mM.. 3µl.. 10X. 5 X.. 10µl.. 40µl.. 50 mM.. 0,6 µl.. 1 µl.. 4µl.. foward. 50 mM.. 0,6 µl.. 1 µl.. 4µl.. Enzima Taq. 1x.. 1x. 1/µl.. 4µl.. DNA. 35ng/mL. 12ng/mL .. 5µl.. ______. H2O. ________. _______. 0.25µl.. 37µl.. Buffer de reacción Primer reverse Primer. Volumen total 100µl.. 25µl.. Tabla 3. Concentración y volumen para la elaboración de la PCR para un MIX de 4 tubos Nota: tomado de ―Guía práctica sobre la técnica de PCR,‖ L. Espinosa, 2009, Ecología Molecular, p. 525.. 4.4.1 CURVAS DE CLORURO DE MAGNESIO. 48.

(49) Este procedimiento generará la concentración óptima de MgCl 2, el cual generalmente se encuentra en el rango de 1.5 a 3.0 mM (Erlich, 1990), dependiendo del grado de la concentración de dicha sal incidirá directamente en la incorporación de los desoxirribonucleótidos dNTP´s, (dATP, dCTP, dTTP y dGTP) en la actividad de la polimerasa y en la Tm de los primer’s. Se usará la relación de concentración y volumen del cloruro de magnesio.. Mezcla. Mezcla. Mezcla. Mezcla. Mezcla. Mezcla. Mezcla. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Concentración. 1,5. 1,75. 2. 2,25. 2,5. 2,75. 3. de MgCl2. mM.. mM.. mM.. mM.. mM.. mM.. mM.. 1,5 µl.. 1,74 µl.. 2 µl.. 2,24 µl.. 2,5 µl.. 2,74 µl.. 3 µl.. Volumen de MgCl2 Tabla 4. Relación de la concentración y volumen del MgCl 2 para la mezcla maestra de la PCR.. 4.4.2 CONCENTRACIÓN DE PRIMER´S. Nos permite generar los datos cuantitativos de la dilución de las alícuotas de los primer´s, de modo que se usará la siguiente ecuación aritmética (es importante tener en cuenta que aplica para los primer´s foward y reverse):. 49.

(50) Es decir: Alicuota de Alicuota de Alicuota de En donde la alícuota del primer a utilizar en la mezcla maestra para la PCR será de 5 µl.. 4.4.3 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA ( PCR). Se efectuo la reacción de cadena de la polimerasa enzimática la cual permitirá. la. amplificación de miles de secuencias de ADN, es decir, las enzimas, los oligonucleótidos o primers, los dNTPs (Adenina Citosina, Guanina y Timina). El ion magnesio, buffer y H2O (Sln amortiguadora), estos elementos interactúan en tres etapas, la desnaturalización, hibridación y extensión. Este proceso se realiza en un Termociclador, el cual tendrá una temperatura y tiempo específicos que no tendrá variaciones en cada ciclo. (Tamay de Dios et.al 2013) (Figura9). 4.5 PROTOCOLO PARA ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 1% VERIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE LOS GENES.. Este procedimiento se realizó utilizando la cámara de electroforesis BIORAD® mini SubCell, para esto se debe preparar el gel de agarosa al 1%, es decir, se agrega 0,45 gr de. 50.

(51) agarosa a 30 ml de TBE al 1% (TRIS Borato EDTA) (Dorado, 2008) y se adiciona 2 µl de SYBR. Al momento de sembrar en el gel se añadieron 2 µl del producto de la PCR con 2 µl de buffer carga (Azul de bromofenol) (Dieffenbach & Dveksler, 2003), para un total de 4 µl por pozo (Anexo1). Finalmente se conectó la cámara con la fuente de poder eléctrica, programandose de la siguiente forma: 110 mV, 200 mA, por 40 min. Finalmente se lleva el gel a la cámara de revelado BIORAD® usando la opción de SYBR Safe® en el programa computarizado de Image Lab para así visualizar el resultado final de la electroforesis. 4.6 PROCESOS DE SECUENCIAS La secuenciación de los productos PCR se realizó mediante el servicio de Macrogen INC. Korea. Las secuencias de las cadenas Forward y Reverse se editaron con ayuda del programa Sequencher versión 5.4 (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI, USA). La obtención de la secuencia consenso se realizó a partir del alineamiento múltiple de las secuencias escritas mediante el algoritmo clustal en el software BioEdit V.2.1 (Hall, 1999) (Anexo 4). 4.7 ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO. Los análisis bioinformáticos fueron realizados en las instalaciones del laboratorio de Biología Molecular del Proyecto Curricular de Licenciatura en Biología de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Los equipos utilizados para dicho análisis constan de: Un (1) equipo Lenovo MT - M 10AM, procesador Intel Core i7 (8 núcleos reales, 16 núcleos en total).. 51.

(52) Se realizó una matriz de las secuencia obtenida junto a 30 secuencias más del gen 16s de otras especies del género Atractus obtenidas del GenBank de NCBI (Clark et al. 2015) y como grupo externo se postula la especie Sibon nebulata basados en la cercanía taxonómica entre los géneros (Arteaga et al. 2017, Zaher et al. 2009). (Tabla 5). Especie. Voucher. A. albuquerquei. GenBank 16S. Pares de bases (bp). GQ457726. 418 bp. AF158485. 369 bp. KY610046. 520 bp. KY610047. 544 bp. ATAL001 A. badius ///////////////////////// // A. carrioni MZUTI 4195 A. cerberus MZUTI 4330 A. crassicaudatus. 364bp. A. duboisi. KT944041. 517 bp. MZUTI62 A. dunni. MZUTI2189. KY610048. 524 bp. A. elaps. DHMECN 10179. KY610052. 513 bp. A. esepe. MZUTI3758. KY610053. 522 bp. AF158471. 537 bp. KT944043. 518 bp. A. flammigerus ///////////////////////// // A. gigas. MZUTI3286. 52.

(53) A. iridescens. MZUTI3680. KY610056. 519 bp. KY610058. 514 bp. DHMECN8343. KY610059. 516 bp. A. microrhynchus. MZUTI5109. KY610060. 469 bp. A. modestus. MZUTI 4760. KY610061. 521 bp. A. multicinctus. MZUTI5106. KY610062. 523 bp. A. occidentalis. MZUTI3323. KY610065. 521 bp. KY610067. 520 bp. KY610068. 518 bp. KT944042. 517 bp. KY610069. 516 bp. KY610070. 515 bp. AF158486. 369 bp. KT944040. 531 bp. A. lehmanni DHMECN7644 A. major. A. paucidens MZUTI5105 A. pyroni MZUTI 5107. A. resplendens MZUTI3996. A. roulei MZUTI 4544 A. savagei MZUTI 4916 A. schach ///////////////////////// // A. sp. MZUTI4178. 53.