Efecto in vitro de la miel de Apis mellifera frente a Escherichia coli y Candida albicans
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(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. Al creador de todas las cosas por ser la luz que ilumina nuestro camino, por fortalecer. A. nuestros corazones y alumbrar. M IC. nuestra mente para lograr. BI. O. Q. UI. nuestros objetivos.. A. Y. A nuestros padres que con su. FA. RM. AC I. infinito amor nos han inculcado valores, con trabajo y dedicación nos han logrado. sacar adelante para ser grandes. BI BL IO. TE CA. DE. personas.. A nuestros profesores, por compartir sus conocimientos, experiencia y por el tiempo que le dedican a la labor de formar profesionales de éxito.. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTO. Gracias a Dios por amarnos sobre todas las cosas, por ser nuestro amigo fiel, por estar en. A. nuestras alegrías y tristezas y. M IC. por ayudarnos a terminar este. Y. BI. O. Q. UI. trabajo.. AC I. A. Nuestro especial agradecimiento a nuestra asesora Mg. Q.F. Marilú. RM. Roxana Soto Vásquez y Coasesora Dra. Mblga. Manuela Natividad Luján. dedicación en toda esta travesía, y por motivarnos a ser mejores cada día.. BI BL IO. TE CA. DE. FA. Velásquez, por su paciencia, esfuerzo y. A los miembros del jurado Dr. Quispe Díaz Iván Miguel, Mg. Q.F. Gavidia Valencia José Gilberto, por los conocimientos impartidos durante la carrera profesional.. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR: De conformidad con las disposiciones legales y vigentes del Reglamento de Grados y Títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo – la Libertad, sometemos a vuestro elevado criterio el. M IC. A. presente informe de investigación titulado:. UI. Efecto in vitro de la miel de Apis mellifera frente a Escherichia coli y. BI. O. Q. Candida albicans.. Y. De manera muy especial agradecemos la valiosa colaboración de los señores. AC I. A. miembros del jurado.. RM. Esperamos vuestra aprobación y dejamos a su criterio la calificación del. FA. presente informe.. BI BL IO. TE CA. DE. Trujillo, Junio del 2017. García Caballero Vilma Jhovana. Adrianzén Ramírez Jilwer Joel. (Autora). (Autor). iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. M IC. A. JURADO DICTAMINADOR. Mg. Q.F. Gavidia Valencia José Gilberto. FA. RM. AC I. A. Y. BI. O. Q. UI. (Presidente). DE. Dr. Q.F. Quispe Díaz Iván Miguel. BI BL IO. TE CA. (Miembro). Mg. Q.F. Soto Vásquez Marilú Roxana (Miembro). iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN El presente trabajo de investigación, estuvo orientado a evaluar el efecto in vitro de la miel de Apis mellifera frente a Escherichia coli y Candida albicans, determinar las características. fisicoquímico, los metabolitos secundarios. y determinar la. concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB). A. de miel de Apis mellifera frente a Escherichia coli y Candida albicans;. M IC. procedente de la provincia San Ignacio, Departamento de Cajamarca-Perú, todos. Q. UI. los ensayos fisicoquímicos realizados se encuentran dentro de los estándares. BI. O. establecidos por el Codex Alimentarius y la National Honey Board. Los valores de. Y. la acidez libre fue de 19.5 meq/kg de miel ± 1.31, la humedad 19.4%, la actividad. 66.8g/100g de miel ± 1.85; además el pH. 4.18 ± 0.20,. RM. azúcares reductores. AC I. A. diastasa 12 en la escala de Goethe ± 0.58, cenizas 0.824 g/100g de miel ±0.07 y. FA. densidad 1.44g/mL ± 0.05, sólidos totales fue 80.6%, índice de refracción 1.4876 ±. DE. 0.58, grados Brix de 79 ± 0.58, sólidos solubles 79, sólidos insolubles de. TE CA. 0.058g/100g ± 0.019 que también cumplen dentro del rango establecido. En la determinación de metabolitos secundarios, mediante reacciones de coloración. BI BL IO. y precipitación, se identificaron cualitativamente flavonoides, fenoles, antocianinas, saponinas y alcaloides. Finalmente se determinó el efecto antimicrobiano in vitro mediante la técnica de macrodilución mostrando la concentración mínima inhibitoria (CMI) de 50% y concentración mínima bactericida (CMB) de 80% para Escherichia coli, y un CMI de 60% y CMB de 90% para Candida albicans. Palabras claves: miel de Apis mellifera, antimicrobiano, in vitro.. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. This research work, was aimed to evaluate the in vitro effect of honey from Apis mellifera against Escherichia coli and Candida albicans, determining the physicochemical characteristics, secondary metabolites and determine the minimum. A. concentration inhibitory (MIC) and minimum bactericidal concentration (CMB) of. M IC. honey from Apis mellifera against Escherichia coli and Candida albicans; coming. UI. from the province San Ignacio, Department of Cajamarca-Peru, all the. O. Q. physicochemical tests are within the standards set by the Codex Alimentarius and. Y. BI. the National Honey Board. The values of the free acidity was 19.5 meq/kg of honey. AC I. A. ± 1.31, moisture 19.4%, activity diastase 12 on the scale of Goethe ± 0.58, ash 0.824. RM. g / 100g of honey ±0. 07 and reducing sugars 66.8g / 100g of honey ± 1.85; In. FA. addition the pH 4.18 ± 0.20, 1.44 g/mL ± 0.05, total solids density was 80.6%, index. DE. of refraction 1.4876 ± 0.58, Brix degrees of 79 ± 0.58, solid soluble 79, insoluble. TE CA. solids of 0. 058g / 100g ± 0.019 that also meet within the established range. In the definition of secondary metabolites, using color and precipitation reactions,. identified.. BI BL IO. flavonoids, anthocyanins, saponins, phenols and alkaloids were qualitatively Finally was determined the antimicrobial effect in vitro using the. technique of macrodilucion showing the minimum inhibitory concentration (MIC) of 50% and minimum bactericidal concentration (MBC) of 80% for Escherichia coli, and a 60% MIC and MBC of 90% for Candida albicans. Keywords: honey of Apis mellifera, antimicrobial, in vitro. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE Pág.. DEDICATORIA……………………………………………………………………i AGRADECIMIENTO……………………………………………………………..ii PRESENTACIÓN………………………………………………………………...iii. IC A. JURADO DICTAMINADOR…………………………………………………….iv. UI M. RESUMEN………………………………………………………………………..v. Q. ABSTRACT………………………………………………………………………vi INTRODUCCIÓN…………………………………………………..............01. II.. MATERIAL Y MÉTODO…………………………………………………...09. III.. RESULTADOS………………………………….......................................29. IV.. DISCUSIÒN…………………………………………………......................35. V.. CONCLUSIONES……………………………………………....................41. VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………….…………….42. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. I.. BI BL. IO. TE. CA. ANEXOS. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCIÓN. La medicina natural es un campo terapéutico que parte de la integración del hombre con la naturaleza; constituyéndose una vía para contrarrestar los efectos adversos de los productos farmacéuticos obtenidos mediante síntesis química. Su aplicabilidad en la terapéutica actual, se ha vuelto un medio de tratamiento importante para la sociedad, muchas veces como tratamiento eficaz. IC A. para patologías graves y en el alivio de enfermedades o trastornos tomando. UI M. como base la salud y no la enfermedad; buscando obtener en los pacientes un. Q. equilibrio entre mente, cuerpo y alma 1,2.. BI. O. El uso de miel de Apis mellifera, como terapia alternativa en el área de la. Y. medicina para diferentes tipos de padecimientos, se ha utilizado desde tiempos. AC. IA. muy antiguos, hace más de 4000 años. De hecho, existe constancia de que. RM. civilizaciones tales como los egipcios, los asirios, los chinos, los griegos y los. otras. hierbas,. principalmente. DE. con. FA. romanos fueron precursores en el empleo de la miel de abeja en combinación para. tratar. heridas. y. dolencias. CA. gastrointestinales, debido a sus propiedades antibacterianas, antiinflamatorias,. IO. TE. desodorizantes y antioxidantes 3,4.. BI BL. Los griegos consideraban que una dieta constituida por miel de Apis mellifera, era muy importante para alcanzar una espiritualidad profunda. En la mitología griega, era el alimento de los Dioses del Olimpo, símbolo de conocimiento y de sabiduría, reservada para los elegidos, los iniciados, los seres de excepción, en este mundo como en el otro 5. En la actualidad la miel de Apis mellifera, continúa siendo aprovechada como un producto curativo en la medicina popular 6. Así como en la India se utiliza para enfermedades oculares, en África se aplica en úlceras infectadas en las. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. piernas y para el dolor de oídos 7. En el Perú se recomienda su empleo para paliar el catarro y el dolor de garganta 8. Recientemente se ha experimentado un auge en el uso como medicina alternativa en los países desarrollados, aumentando el número de patologías tratadas con miel de abeja 9. Esto se debe a que la miel no genera resistencias como los antimicrobianos, no presenta efectos adversos de gravedad y posee. IC A. buena acción antimicrobiana 10, 11.. UI M. La miel es considerada una sustancia dulce elaborada por Apis mellifera, o. Q. por diferentes sub-especies, a partir del néctar de las flores y de otras. BI. O. secreciones extraflorales, que las abejas liban, transportan, transforman,. IA. Y. combinan con otras sustancias, deshidratan, concentran y almacenan en. AC. panales 12.. RM. Desde el punto de vista de su composición es una solución de glucosa, fructosa,. FA. sacarosa, maltosa, proteínas, minerales, ácidos orgánicos, vitaminas y. CA. DE. enzimas13.. TE. La miel de Apis mellifera, contiene: Carbohidratos (73 - 83%); constituyendo. IO. el principal componente, además de fructosa (30,9 - 44,3%), glucosa (22,9 -. BI BL. 40,8%), sacarosa (0,8 - 10%), maltosa (0,5 - 2,8%), isomaltosa (0,5 - 1,5%), furanosa (0,5 - 1,5%) y nigerosa (0,2 - 1,0%); agua (14,5 - 18,5%). Además contiene ácidos orgánicos (0,6%): glucónico (principal), acético, butírico, cítrico, fórmico (también presente en el veneno de las abejas), láctico, málico, piroglutámico y succínico. Estos ácidos confieren a la miel un pH entre 3,4 y 6,1. Además de ello también presenta compuestos nitrogenados (0,4%): proteínas (0,3%), aminoácidos (principalmente prolina) (0,05 - 0,1%) y enzimas (amilasa, glucooxidasa, diastasa, invertasa, etc.). Minerales (0,1%): se han 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. encontrado, principalmente, potasio (0,05%), fósforo (0,005%), calcio (0,0048%), sodio (0,0029%), magnesio (0,002%). Sustancias volátiles como flavonoides antioxidantes y ácidos fenólicos, también vitaminas, lípidos y sustancias aromáticas 12. La composición química de la miel depende principalmente de las fuentes vegetales de las cuales se deriva, pero también de la influencia de factores. IC A. externos, como el clima, el manejo de extracción y almacenamiento 13.. UI M. Un manejo incorrecto de la miel puede reducir su calidad; los factores que más. Q. influyen en ello son las altas temperaturas, el tiempo de almacenamiento y. BI. O. contenido de humedad superior a 21 %, los cuales ocasionan fermentaciones,. IA. Y. formación de hidroximetilfurfural, pérdida de la actividad enzimática, cambio del. AC. sabor, oscurecimiento y crecimiento microbiano en la miel 14.. RM. Por otro lado Candida albicans, es una levadura, normalmente inofensiva, que. FA. se encuentra en nuestro organismo sin efectos patológicos, al nivel de los. DE. genitales, tracto digestivo, boca y piel. Las razones de su existencia como parte. TE. CA. de la microbiota de las personas sanas son todavía desconocidas 15, 16.. IO. Algunos factores han contribuido al incremento de las infecciones por este. BI BL. microorganismo a nivel mundial. Por ejemplo; disfunciones metabólicas, interacciones con la microbiota bacteriana, SIDA, cáncer, diabetes, leucemia, extremos de la edad (niños y ancianos), utilización de antibióticos de amplio espectro, quimioterapias citotóxicas, terapias en cuidados intensivos y trasplantes de órganos. Estos a su vez han facilitado la conversión de Candida, de la forma comensal a parásita 17.. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La resistencia a Candida albicans, representa un reto terapéutico que deja un menor número de posibilidades para el tratamiento de estas infecciones que se caracterizan a su vez por una alta morbimortalidad. 18.. En un estudio realizado en la Universidad Autónoma de México, se aislaron 40 cepas de Candida albicans, de pacientes Hospitalizados en el Centro Médico Nacional Siglo XXI, en la ciudad de México, de las cuales en el 27.5% (11. IC A. pacientes) se demostró resistencia a uno o varios compuestos azólicos. Los. UI M. azoles que se utilizaron en este estudio fueron: ketoconazol e itraconazol a la. Q. concentración de 32 µg/ml y 256 µg/ml, respectivamente 19.. BI. O. Por otro lado, un trabajo realizado en Chile ha demostrado la existencia de 6,8%. IA. Y. de SDD (sensible dosis dependiente) y a 0,8% de resistencia en aislados de. AC. Candida albicans, recuperados fundamentalmente de flujo vaginal 20.. RM. En otro estudio de sensibilidad al fluconazol en 337 aislamientos, muestra que. FA. de todas las especies de Candida estudiadas, el 78,3% de los aislamientos fue. DE. sensible (S), el 12,2% fue sensible dosis dependiente (SDD) y el 9,5% fue. TE. CA. resistente (R). El 95,2% de los aislamientos de Candida albicans, (144. el 65,6% de Candida glabrata, y el. BI BL. tropicalis,. IO. aislamientos) fue sensible al fluconazol, seguidos por el 86% de Candida 59,6% de Candida. parapsilosis 21. Así mismo, Escherichia coli, es una especie del género Escherichia, que es un miembro de la familia Enterobacteriaceae, estos son los más abundantes anaerobios facultativos en el ser humano del tracto gastrointestinal, donde la mayor parte de ellos son habitantes normales no patógenas 22.. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Escherichia coli, es la causante más común de infecciones agudas del tracto urinario, así como sepsis urinaria. También puede causar meningitis neonatal, sepsis, enteritis aguda, diarrea del viajero y colitis hemorrágica 23. En un estudio reciente de Escherichia coli, aisladas de heces de pacientes hospitalizados en EE.UU., 353 cepas mostraron sensibilidad disminuida hacia fluoroquinolonas, teniendo el 85 % una o más mutaciones a nivel de Gyr A (ADN. IC A. girasa) y 46 % una o más mutaciones a nivel del gen Par C 24.. UI M. Investigadores de la Universidad Nacional de Trujillo, realizaron un estudio. Q. sobre la resistencia bacteriana según CMI 90 de Escherichia coli uropatógena. BI. O. aislada en el laboratorio de Microbiología del Hospital II Chocope-EsSalud,. IA. Y. ayudándose de los reportes clínicos y los urocultivos de los pacientes. AC. ambulatorios y hospitalizados del Hospital II Chocope – EsSalud, durante. RM. Octubre 2010 a Agosto 2013 donde detectaron elevadas tasas de resistencia a. FA. ampicilina (84%), trimetoprima/ sulfametozaxol (74%), tetraciclina (72%),. DE. ciprofloxacino (67%), levofloxacino (59%), cefalotina (58%), cefepima (37%),. TE. CA. gentamicina (32%) 25.. IO. Por otro lado, en Cuba se realizó un estudio retrospectivo sobre el aislamiento. BI BL. de gérmenes uropatógenos y la susceptibilidad antibiótica del microorganismo más frecuente en 2912 pacientes ambulatorios que presentaron infección urinaria, del cual se. tomó como muestra 484 pacientes con urocultivos. positivos, en el municipio Banes, Holguín, dando como resultado que Escherichia coli, mostró mayor resistencia a ampicilina (83,7 %), cefazolina (74,5 %), ácido nalidíxico (72,1 %), cotrimoxazol (57,3 %), alrededor del (50,0 %) de resistencia a ciprofloxacino, kanamicina y ceftaxidima; mejor sensibilidad ante la gentamicina, cefotaxima y ceftriaxona. 26.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La creciente aparición de cepas microbianas resistentes contra los antimicrobianos sintéticos ha motivado que se analice, de nuevo, el uso de tratamientos alternativos, como la miel de abeja, sobre úlceras, quemaduras y heridas 27. Diversos estudios han demostrado que la miel de abejas posee acción antimicrobiana contra un amplio espectro de bacterias y hongos. Además,. IC A. pesquisas recientes sugieren que la miel podría ser útil en el tratamiento de. UI M. infecciones causadas por microorganismos patógenos como, Escherichia coli. Q. y Candida albicans 27.. BI. O. La miel de abeja posee actividad antimicrobiana debido a su contenido en. IA. Y. azúcares y ácidos orgánicos: su pH (pH 3,4 – 6,1), la alta osmolaridad (posee. AC. una alta concentración de azúcares) y el contenido de flavonoides impiden que. RM. las bacterias puedan sobrevivir y desarrollarse 12.. FA. En un estudio realizado en la Universidad de Chile, mostraron que la miel de. DE. abeja tenía actividad antibacteriana contra Pseudomonas aureginosa, Staphylococcus. CA. coli,. typhi,. Staphylococcus. aureus,. TE. Escherichia. IO. Streptococcus pneumoniae tipo β, y Vibrio cholerae, y actividad antifúngica. BI BL. contra la levadura Candida albicans 28. Así mismo investigadores de la Universidad de Eslovenia Ljubljana probaron miel. de. abeja. contra. Escherichia. coli,. Enterococcus. faecalis,. Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, junto con los hongos Aspergillus niger, pullulans Aureobasidium, Candida albicans, Candida parapsilosis,. Candida. tropicalis,. Cladosporium. cladosporioides,. Penicillium chrysogenum y Rhodotorula mucilaginosa, encontrándose que todas las bacterias fueron inhibidas por la miel de abeja. En cuanto a los 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. hongos, estos fueron inhibidos a la concentración de 50 %, excepto a Aspergillus niger, Candida albicans y Penicillium chrysogenum 29. En otro estudio de la Universidad de Pakistán de Malakand encontraron que las mieles de plantas locales inhibieron la bacteria Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli junto con dos hongos, Alternaria alternata y Trichoderma harzianum 30.. IC A. Investigadores de la Universidad de Tecnología de Sydney probaron miel de. UI M. abeja de diferentes regiones del país contra Bacillus subtilis, Escherichia. Q. coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, encontrándose. BI. O. que la miel de abeja inhibía el crecimiento de las bacterias 31.. IA. Y. Actualmente en el Perú se ha incrementado el porcentaje de infecciones. AC. causada por Escherichia coli y Candida albicans constituyéndose un. RM. problema de salud pública; por lo que se considera. necesario la realización. FA. del presente trabajo de investigación orientado a determinar el efecto in vitro de. DE. miel de Apis mellifera frente a Escherichia coli y Candida albicans, con la. TE. CA. finalidad de proporcionar una alternativa de solución a este problema con. IO. recursos que estén el alcance de la población 32.. BI BL. Cada día se hace más difícil el tratamiento antimicrobiano por la capacidad de dichos microorganismos al crear resistencia, tal fenómeno ha sido considerado emergente en todo el mundo 32. Los fármacos disponibles actualmente, tienen una toxicidad importante, producen recurrencia o causan resistencia, razón por la cual se está procurando descubrir nuevos agentes antimicrobianos más potentes, pero sobre todo seguros 32.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El consumo de miel de Apis mellifera, es de interés en este contexto porque comprende. una. alternativa. más segura. y eficaz. que. los agentes. antimicrobianos producidos sintéticamente, lo cual motiva a que estos compuestos naturales sirvan como base para el desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos que sean más eficaces que los sintéticos. En base a los antecedentes se formula el siguiente problema:. IC A. ¿Cuál es el efecto in vitro de miel de Apis mellifera frente a Escherichia coli. Q. UI M. y Candida albicans?. BI. O. Postulándose la siguiente hipótesis.. Y. La miel de Apis mellifera tiene efecto antimicrobiano in vitro frente a. AC. IA. Escherichia coli y Candida albicans.. FA. RM. Objetivos. DE. Objetivo general:. CA. Evaluar el efecto in vitro de la miel de Apis mellifera frente a Escherichia coli. IO. TE. y Candida albicans.. BI BL. Objetivos específicos:. -. Determinar las características fisicoquímicas de miel de Apis mellifera.. -. Determinar los metabolitos secundarios de miel de Apis mellifera.. -. Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Máxima Bactericida (CMB) de miel de Apis mellifera frente a Escherichia coli y Candida albicans.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIAL Y MÉTODO. A. Materiales 1) Muestra de estudio Miel de abeja (Apis mellifera) extraída el mes de febrero del 2017. IC A. del Departamento de Cajamarca-Perú.. Q. O. Cepas de Escherichia coli 25922(ATCC) proporcionadas por el. BI. . UI M. 2) Material biológico y medios de cultivo. IA. Cepas de Candida albicans 10231(ATCC) proporcionadas por el. AC. . Y. Centro Referencial de Salud de Trujillo.. RM. Centro Referencial de Salud de Trujillo. 200 mL Agar Sabouraud, L007492, Britania. . 200 mL Agar Muller Hilton, B0413792, Britania. . 100 mL Caldo BHI 110493, Merck. . 100 mL Caldo Sabouraud, L007492, Britania. IO. TE. CA. DE. FA. . BI BL. 3) Antibióticos . Ciprofloxacino. 200mg/100mL,. LT. 2F51675,. CLARIS. LIFESCIENCES LIMITED. . Fluconazol 200mg/50mL, LT 1097105, MEDIFARMA.. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 4) Material de laboratorio. - Material de vidrio El de uso común en el laboratorio.. - Equipos Cocina eléctrica INDUCOR. . Mufla modelo HM 2,5 /1,5 KW- 220 V- 6Amp.. . Estufa de convección forzado PIC-01-2014 ( EQ-02). . pHmetro METROHM. . Incubadora Microbiológica P SELECTA. . Autoclave LONER. . Refrigeradora COLDEX. . Balanza analítica OHAUS-GA 200 (precisión 0.0001 g). . Embudo buchner. . Refractómetro CAL 6 modelo ABBE. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. . IO. Espectrofotómetro, GENESYS. BI BL. . -. Baño maría, MEMMERT. Solventes . Agua destilada DROPAKSA. . Solución salina fisiológica 0.9%. . Alcohol de 96° C. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Reactivos Limaduras de magnesio. . 1mL Tricloruro férrico. . 1 mL solución reactiva de gelatina al 1%. . 1 mL de reactivo Dragendorff. . 1 mL de reactivo Hager. . 1 mL de reactivo Mayer. . 1 mL de reactivo Wagner. . 1 mL de reactivo diclorometano. . 1mL de hidróxido de sodio al 10%. . 200 mL hidróxido de sodio a 0.05N, 98% SIGMA. . 20 mL hidróxido de sodio 0.1N, 98% SIGMA. . 150 mL ácido clorhídrico 0.05N, 37% SIGMA. . 15 mL solución estándar de almidón. . 15 mL solución tampón de acetato de sodio, 98%, SIGMA. . 10 mL cloruro de sodio, 99.5% SIGMA. UI M Q. O. BI. Y. IA. AC. RM. FA. DE. CA. 30 mL solución de yodo diluida (0,0007 N), 99.5% SIGMA. BI BL. IO. . IC A. . TE. -. . 12 mL de acetato de plomo al 30%, SIGMA. . 10 mL de solución saturada de sulfato de sodio. . 50 mL de Fehling A (Sulfato de cobre cristalizado, 35 g y agua destilad hasta 1.000 mL.). . 50 mL de Fehling B (Tartrato mixto de potasio y sodio 150 g, solución de hidróxido de sodio al 40 %, 3 g y agua hasta 1.000 mL.). 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2 mL azul de metileno 1%. . 10 mL de ácido clorhídrico concentrado. . 50 mL solución de hidróxido de sodio al 40%. Otros Guantes estériles. . Mascarilla. . Papel aluminio. . Tapers hermético con tapa rosca. . Cartulina folcote blanca. . Alfileres entomológicos. . Papel filtro Whatman Nº 1. . Termómetro. . Rollos de algodón. . Rollos de papel toalla. . Etiquetas. UI M. Q O BI Y. IA. AC RM. FA. DE. CA. Lapicero indeleble. IO. . IC A. . TE. -. . Papel kraft. . indicador papel rojo de tornasol. . Mechero. . Jeringas de 1mL, 5mL y 10 mL. BI BL. . 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. B. Método 1. Captura de abejas productoras de miel del caserío San GerónimoCajamarca (Ver anexo 1) La zona de captura de las abejas se encuentra ubicada en el caserío San Gerónimo, centro poblado menor de Churuyacu, Distrito Tabaconas, Provincia San Ignacio, Departamento de Cajamarca-Perú. Presenta una temperatura. IC A. media anual de 23°C; una humedad relativa de 68% en promedio y una. UI M. precipitación media anual de 2500 mm. La mayor parte de la zona se encuentra. O. BI. mango, coca que crece de forma natural, etc.. Q. dentro del bosque tropical donde hay variedad de cultivos como café, cacao,. IA. Y. Las abejas fueron seleccionadas al azar de tres panales equidistantes dentro. AC. de la zona, para la recolección se empleó el método de captura directa del. RM. panal, buscando de esta manera capturar las diferentes abejas que pudiesen. FA. tener actividad en diferentes horas del día, específicamente entre las 10 am y. insectos. capturados. fueron. colocados. en. frascos. de. plástico. TE. Los. CA. DE. las 12:30 pm (mañana) y entre las 2 pm y las 4 pm (tarde).. IO. herméticamente cerrados conteniendo la tercera parte, alcohol de 70°. Estos. BI BL. fueron debidamente rotulados con datos como el lugar, fecha y nombre de los colectores 33.. 2. Identificación entomológica de la especie de abeja productora de miel Una vez en el laboratorio se seleccionaron al azar 3 insectos los cuales fueron colocados sobre una plancha de tecnopor, posteriormente se les atravesó un alfiler entomológico al nivel del abdomen. La identificación entomológica fue. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. realizada en el Departamento de Ciencias Biológicas de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo-Perú 32. (Ver anexo 2). 3. Recolección de miel de Apis mellifera La miel de abeja fue recolectada en el mes de febrero del 2017 del caserío San Gerónimo, centro poblado menor de Churuyacu, Distrito Tabaconas, Provincia. IC A. San Ignacio, Departamento de Cajamarca-Perú. La muestra se recolectó en. UI M. envases estériles, herméticamente cerrados, conservados a temperatura. Y. BI. O. Q. ambiente y protegidas de la luz con papel aluminio. (Ver anexo 3).. IA. 4. Tamizaje fitoquímico preliminar de la miel de Apis mellifera. RM. AC. Para la determinación de metabolitos de la miel de Apis mellifera, se 34.. FA. empleó el método de la “prueba de la gota” de Olga Lock de Ugaz. DE. Preparación de los extractos. CA. Para la preparación de los 4 tipos de extractos (diclorometánico,. TE. etanólico, acuoso- ácido y acuoso) se pesaron 5g de miel y se colocaron. BI BL. IO. en 4 balones de 250 mL con 50 mL de cada uno de los solventes. Posteriormente fueron sometidos a reflujo en baño maría por ebullición durante 15 minutos. Al término del tiempo se filtraron los extractos y se colocaron en frascos de color ámbar debidamente rotulados.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Identificación fitoquímica A. Extracto diclorometánico: sirve para identificar compuestos de muy baja polaridad como: quinonas. . Ensayo de Bortranger: Medimos XX gotas del extracto en una capsula, llevamos a sequedad y luego se redisolvió en XX gotas de diclorometano, transvasando a un tubo de ensayo y agregando XX gotas. IC A. de NaOH 10%. Se agitó mezclando las fases y se dejó en reposo hasta. UI M. su separación.. Q. Reacción positiva: El ensayo fue considerada positivo cuando la fase. Extracto acuoso y etanólico: Se identificó compuestos de alta polaridad,. AC. B.. IA. Y. BI. O. acuosa alcalina (superior) se colorea de rosado o rojo.. FA. RM. como: flavonoides, compuestos fenólicos, leucoantocianidinas, saponinas,. Ensayo de Shinoda: Permite conocer la presencia de flavonoides, para ello se. CA. . DE. taninos.. TE. midió X gotas del extracto llevando a sequedad, después se redisolvió en 1mL. BI BL. IO. de metanol y trasvaso a un tubo de ensayo, se agregó limaduras de magnesio metálico más II gotas de ácido clorhídrico concentrado (HClcc). Además se hizo lo mismo pero en extracto etanólico. Reacción positiva: Se evidencio la aparición de color rojiza, que nos indicó la presencia de flavonas.. . Ensayo de Tricloruro férrico: Si el extracto se realiza en alcohol, el ensayo determina tanto fenoles como taninos. A una alícuota del extracto alcohólico se le adiciona III gotas de tricloruro férrico al 5% en solución 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. salina fisiológica. Si el extracto es acuoso determina fundamentalmente taninos. A una alícuota del extracto se añade acetato de sodio para neutralizar y III gotas de tricloruro férrico al 5%. La reacción fue considerada positiva con la aparición de una coloración verde-negruzca, la cual nos indicó la presencia de polifenoles.. Ensayo de Rosemheim: Permitió reconocer en los extractos (acuoso,. IC A. . UI M. etanólico) la presencia de estructuras de secuencia C6-C3-C6 del grupo. Q. de los flavonoides. Se calienta 2 mL del extracto etanólico por 10 min,. BI. O. con 1 mL de HCl concentrado. Dejar enfriar y luego adicionar 1 mL de. IA. Y. agua y 2 mL de alcohol amílico. Agitar y dejar separar las 2 fases.. AC. Reacción positiva: La reacción se consideró positiva con la aparición de. FA. Ensayo de espuma: Medimos XX gotas del extracto, luego se agitó. CA. . DE. de leucoantocianidinas.. RM. coloración roja a marrón en la fase acuosa, indicándonos la presencia. IO. TE. vigorosamente por 30 segundos, esperamos 15 minutos en reposo.. BI BL. Reacción positiva: se observó la persistencia de espuma, el cual nos indicó la presencia de saponinas.. . Ensayo de gelatina: Se midió XX gotas del extracto en un tubo de ensayo y luego añadimos I gota de solución reactiva de gelatina al 1%. Reacción positiva: El ensayo se consideró positivo al observar un precipitado blanco, indicándonos la presencia de taninos.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. C. Extracto acuoso / ácido y etanólico: Se identificaron compuestos básicos, como: alcaloides. . Ensayo de Dragendorff: Permitió reconocer en un extracto la presencia de alcaloides, para lo cual, la alícuota del extracto se evaporo en baño de agua y el residuo se redisolvió en 1mL de ácido clorhídrico al 1%. Con la solución acuosa acida se realiza el ensayo. Se añade III gotas del. IC A. reactivo Dragendorf,. UI M. Reacción positiva: La reacción fue considerada positiva con la. O. Ensayo de Mayer: Se realizó según la forma descrita anteriormente,. BI. . Q. formación de precipitados de color anaranjado.. IA. Y. hasta obtener una solución acida. Se añadió luego, una pizca de cloruro. AC. de sodio en polvo, se agito y filtro. Se añadió II o III gotas de la solución. RM. reactiva de Mayer.. FA. Reacción positiva: La reacción se consideró positiva con la formación. TE. Ensayo de Hager: Se midió XX gotas del extracto en un tubo de ensayo. IO. . CA. DE. de precipitado de color blanco.. BI BL. y luego agregamos III gotas del reactivo. Reacción positiva: La reacción se consideró positiva con la formación de precipitados de color blanco amarillento.. . Ensayo de Wagner: Medimos XX gotas del extracto en un tubo de ensayo y luego agregamos III gotas del reactivo. Reacción positiva: La reacción fue considerada positiva con la formación de precipitado de color marrón claro. 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 5. Análisis fisicoquímicos de miel de Apis mellifera Todas las pruebas fueron realizadas por triplicado. 5.1. Características organolépticas 35. Color, será variable desde ámbar claro hasta ámbar oscuro, pero siendo uniforme en todo el volumen que contenga. Sabor y aroma, deberán ser característicos y estar libre de sabores y aromas. IC A. extraños.. O. Q. UI M. Textura: podrá ser fluida, viscosa o cristalizada total o parcialmente.. Y. BI. 5.2. Medición de pH 35.. AC. IA. Esta prueba se llevó a cabo mediante el pH metro, el cual cuenta con un sensor. RM. que realiza la medición al sumergirlo en un vaso de precipitación que contiene. FA. a la muestra en cantidad suficiente. Esperamos que la lectura se estabilice y. DE. anotamos. Se enjuagó el sensor con agua destilada y posteriormente se secó. TE. CA. el sensor con papel suave, para una próxima lectura.. BI BL. IO. 5.3. Determinación de acidez libre, lactónica y total 35. Se disuelven 10gr de muestra en 75mL de agua destilada en un vaso de precipitación de 250mL con ayuda de agitación magnética, posteriormente se mide el pH, anotando la lectura. Se valora con solución de hidróxido sódico 0.05N a una velocidad de 5mL por minuto hasta un pH de 8.5 (acidez libre), inmediatamente agregaremos 10 ml de NaOH 0.05 N y se valora el exceso de éste con HCl 0.05 N a un pH de 8.3. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. (acidez lactónica). Se realizó un testigo con 75 ml de agua destilada siguiendo los pasos anteriores.. 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 =. (𝑚𝐿 𝑁𝑎𝑂𝐻 0.05𝑁 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝑚𝐿 𝑁𝑎𝑂𝐻 𝑑𝑒𝑙 𝐵𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜)𝑥50 (𝑔 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎). 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑙𝑎𝑐𝑡ó𝑛𝑖𝑐𝑎 =. (10 − 𝑚𝐿 𝐻𝐶𝑙 0.05𝑁) (𝑔 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎). UI M. IC A. 𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 𝑎𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 + 𝑎𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑙𝑎𝑐𝑡ó𝑛𝑖𝑐𝑎. BI. O. Q. 5.4. Determinación de sólidos totales 35.. Y. Los sólidos totales se determinaron a partir del valor del contenido de. AC. IA. humedad.. RM. 𝑆ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠(%) = 100 − 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑒 ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑. DE. FA. Los resultados serán expresados en %.. TE. CA. 5.5. Sólidos Solubles 36.. IO. Se refiere a los sólidos solubles en agua, como azúcares y ácidos orgánicos.. BI BL. Se determinó en un refractómetro con una escala calibrada en grados Brix (% en peso de sacarosa), un grado Brix equivale comercialmente a una concentración en sólidos solubles de 1g/100mL. Los grados Brix, también puede medirse de acuerdo al índice de refracción obtenido, se hizo una transformación empleando una tabla de conversión a grados Brix (Ver tabla 4). Para lectura directa en el refractómetro, se abrió el doble prisma del refractómetro y esparció una gota de la muestra, sobre la cara inferior, después. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. cerramos los prismas firmemente y se dejó un minuto para que la temperatura de la miel y del instrumento sea la misma. Se buscó en el campo del visor la franja que indica reflexión total; ajustando dicha franja en el punto de intersección de la cruz del visor, rotando el tornillo compensador si la línea no fuera nítida y presentara coloración. Después hicimos la lectura del % de sólidos solubles directamente en la escala. UI M. IC A. específica para dicha medida.. O. Q. 5.6 Determinación del índice de refracción y de humedad 36.. BI. Este método se basó en determinar el índice de refracción de la muestra,. IA. Y. utilizando un refractómetro; ajustando a una temperatura de 20 °C para luego. AC. obtener el porcentaje correspondiente de la humedad, según la tabla. (Ver tabla. FA. RM. 5).. DE. Si la temperatura es diferente de 20 °C se hacen las siguientes correcciones:. CA. Para temperaturas superiores de 20 °C sumar 0.00023 por cada (ºC). BI BL. IO. TE. Para temperaturas inferiores de 20 °C restar 0.00023 por cada (ºC). 5.7. Determinación de la densidad especifica 36. La densidad de la miel de Apis mellifera se realizó por picnometría, se pesó el picnómetro limpio y seco, luego se llenó el picnómetro con agua destilada, sin llevar al enrase y se colocó durante 30 minutos en un baño de agua a 25°C, después se completó hasta el enrase y tapó cuidando de que no queden burbujas. Se secó exteriormente y pesó, luego se vació el picnómetro, e introdujo la muestra de miel y efectuó la misma operación que en el paso. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. anterior. El cociente de dividir el peso de la miel sobre el peso del agua destilada a la temperatura de 25°C, se multiplica por el peso específico del agua a 25°C, que es 0.99707 dándonos así el peso específico relativo a 25/4°C. Para ello se empleó la ecuación: 𝜌1 = (. 𝑚2 − 𝑚0 ) 0.99707 𝑚1 − 𝑚0. IC A. Dónde:. UI M. m0 = Masa del picnómetro vacío. Q. m1= Masa del picnómetro con agua. BI. O. m2= Masa del picnómetro con miel de Apis mellifera. AC. IA. Y. 𝜌1 = Densidad de miel de Apis mellifera a 25°C. FA. RM. 5.8. Determinación de sólidos insolubles en agua a 80°C 37.. DE. El método se basa en la eliminación de los azúcares de la miel para obtener un. CA. residuo insoluble en agua. Se pesó 20 gramos de miel y diluyó en la mínima. TE. cantidad posible de agua caliente a 80°C. La solución fue filtrada en un embudo. IO. buchner, mediante un lavado profundo con agua caliente (80°C), hasta que no. BI BL. haya azúcares reductores; esto se consiguió utilizando la reacción de Fehling. Después se secó en una estufa de convección forzada a la temperatura de 40°C durante 24 horas. Para calcular los sólidos insolubles se emplea la siguiente ecuación. % 𝑑𝑒 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑖𝑛𝑠𝑜𝑙𝑢𝑏𝑙𝑒 𝑒𝑛 𝑎𝑔𝑢𝑎 =. 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑎 𝑥100 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑖𝑒𝑙. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 5.9. Determinación de cenizas 36. Se pesaron con precisión de 0.1mg, de 5 a 10 g de muestra de miel en cápsulas crisol previamente calcinadas y taradas. Se calentó suavemente hasta carbonizar la muestra poniéndole unas gotas de aceite de oliva para impedir la formación de espuma. Se llevó a la mufla a 550°c durante la noche y al día siguiente se enfrió en un desecador, hasta que la diferencia entre las dos. IC A. pesadas consecutivas efectuadas a intervalos de 30 min fuera inferior a 1mg. UI M. (cenizas sin residuos carbonosos).. Q. El contenido de cenizas expresado en porcentaje (p/p), se obtiene por la. 𝑃−𝑃2. Y. (𝑃1−𝑃2)𝑥100. AC. IA. 𝐶𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 (%) =. BI. O. siguiente formula:. RM. Donde:. FA. P: Peso en gramos del crisol con la muestra. DE. P1: Peso en gramos del crisol con las cenizas. IO. TE. CA. P2: Peso en gramos del crisol vacío. BI BL. 5.10. Determinación de la actividad de diastasa en miel 38. La determinación de la enzima diastasa en miel fue realizada mediante el protocolo aprobado por la comisión europea de miel. El principio de la técnica se basa en la unidad de actividad diastásica, º Goethe (º G), que es la cantidad de enzima capaz de hidrolizar una solución de almidón al 1% hasta un punto final en 1 hora a 40°C. La determinación se realizó utilizando una solución estándar de almidón capaz de generar un complejo coloreado en presencia de yodo. Por la acción de la enzima presente en la 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. muestra de miel bajo condiciones estándar, se produce una disminución del color azul que es medido a intervalos de tiempo a una absorbancia de 660 nm. Se pesó 10 g de miel en un vaso de precipitado de 50 mL, se adicionó 5 mL de la solución tampón de acetato y 20 mL de agua destilada. La miel se disolvió mediante agitación y luego se adicionó 3 mL de cloruro de sodio, llevándose a un volumen final de 50 mL con agua destilada.. IC A. Se transfieren 10 mL de la solución de miel a un vaso de precipitación de 50. UI M. mL y se incubó a baño maría (40°C). Después de 15 minutos, se adicionó 5 mL. Q. de la solución de almidón, éste se considera como el tiempo inicial de la. BI. O. reacción. Luego de 5 minutos, se tomó 1 mL de esta solución y se le adicionó. IA. Y. a 10 mL de la solución de yodo diluida (0,0007 N).. AC. Finalmente fue adicionado el volumen de agua destilada determinado en la. RM. estandarización de almidón y se midió la absorbancia a 660 nm a intervalos de. DE. FA. tiempo por una hora hasta obtener una absorbancia menor a 0,235 nm.. CA. La actividad diastásica se calcula como número diastásico (DN), que. TE. corresponde al número de la escala Gothe. Este número expresa la cantidad. IO. de diastasa como volumen de almidón al 1% hidrolizado por la enzima en 1. BI BL. gramo de miel en 1 hora a una temperatura de 40°C. Esto se obtiene a través de la siguiente fórmula:. 𝐷𝑁 =. (60min)(0.1)(1.0) 300 = (𝑡𝑥)( 0.01)(2.0) 𝑡𝑥. DN= mL de sol. De almidón (1%)/g miel/hora a 40°C tx= es el tiempo de reacción en minutos. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 100𝑚𝐿 50𝑚𝐿 60𝑚𝑖𝑛 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 300 = ( )( )( ) 2𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑙𝑚𝑖𝑑𝑜𝑛 10𝑔 𝑎𝑙𝑚𝑖𝑑𝑜𝑛 5𝑚𝐿 𝑎𝑙𝑚𝑖𝑑𝑜𝑛 𝑥 10𝑚𝐿 𝑚𝑖𝑒𝑙. Para obtener DN se realizó un gráfico de absorbancia vs tiempo en minutos. De la recta resultante se determinó el tiempo en que la mezcla alcanza una absorbancia de 0,235 nm. También se puede utilizar una ecuación de regresión. IC A. lineal para determinar tx. Se divide 300 entre el tiempo en minutos requeridos. Q. UI M. para obtener una absorbancia de 0,235 nm.. Y. Determinación de glúcidos solubles reductores libres: Para ello se pesó. IA. . BI. O. 5.11. Determinación de azúcares reductores en muestra de miel de abeja39.. AC. 5g de la muestra en estudio y diluimos con 50 mL de agua destilada, dejar. RM. 30 minutos en contacto para luego agregar 4 mL de acetato de plomo al 30%. FA. y 3 mL de solución saturada de sulfato de sodio. Aforar a 100mL (aforado 1). DE. y filtrar, por separado en un matraz Erlenmeyer se colocó 5 mL de Sol de. CA. Fehling “A” y 5 mL de Fehling “B”, diluir con 50 mL de agua destilada y. IO. TE. agregar III gotas de azul de metileno, llevar a ebullición dejando caer de la. BI BL. bureta el aforado anterior en pequeñas porciones, procurando mantener la ebullición. El final de la valoración se evidencia por la decoloración total del indicador azul de metileno y la aparición de un precipitado de color rojo ladrillo. Anotar el volumen gastado y relacionar a 100 el resultado para obtener el porcentaje.. . Determinación de glúcidos solubles totales: Del aforado 1 tomar 50 mL y agregar 2 mL de ácido clorhídrico concentrado, llevar a ebullición en baño 24. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. maría con refrigerante a reflujo, durante 2 horas. Luego dejar enfriar y neutralizar con solución de hidróxido de sodio al 40%, utilizando como indicador papel rojo de tornasol, luego aforar a 100 mL. Por separado en un matraz Erlenmeyer se colocan 5 mL de Sol de Fehling “A” y 5 mL de Fehling “B”, diluir con 50 mL de agua destilada y agregar III gotas de azul de metileno, llevar a ebullición dejando caer de la bureta el aforado anterior en. IC A. pequeñas porciones, procurando mantener la ebullición. El final de la. UI M. valoración se evidencia por la decoloración total del indicador azul de. Q. metileno y la aparición de un precipitado de color rojo ladrillo. Anotar el. Determinación de glúcidos solubles no reductores: Se obtiene restando. AC. . IA. Y. BI. O. volumen gastado y relacionar a 100 el resultado para obtener el porcentaje.. RM. el porcentaje de glúcidos solubles reductores libres del porcentaje de. FA. glúcidos solubles totales. A este resultado se multiplica por 0.95 para obtener. Determinación de glúcidos insolubles: Se obtiene restando el porcentaje. IO. . TE. CA. DE. el porcentaje expresado en sacarosa.. BI BL. de glúcidos solubles totales del porcentaje de glúcidos totales. A este resultado se multiplica por 0.90 para obtener el porcentaje expresado en almidón.. 6. Evaluación del efecto antimicrobiano in vitro 6.1. Obtención de las cepas microbianas Las cepas microbianas estándar Escherichia coli y Candida albicans, fueron proporcionadas por el Centro Referencial de Salud de Trujillo. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 6.2. Reactivación de las cepas microbianas 40. Los microorganismos fueron reactivadas en caldo BHI para Escherichia coli, y caldo Sabouraud para Candida albicans, se incubaron durante 24 horas a 37°C. Luego se tomó una azada de cada microorganismo y se ajustó con solución salina fisiológica al patrón de turbidez de Mac Farland N°0.5 (1X108. IC A. UFC/mL).. UI M. 6.3. Preparación del inóculo bacteriano 41.. O. Q. Inicialmente se verificó la viabilidad de cada uno de los microorganismos. BI. otorgados. Posteriormente, se realizó una suspensión en 5 mL de solución. IA. Y. salina fisiológica a una turbidez equivalente al estándar 0,5 del Nefelómetro de. de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de la. DE. 6.4. Determinación. FA. RM. AC. McFarland (1X108 UFC/mL), establecida por visión directa.. CA. miel de Apis mellifera frente a Escherichia coli y Candida albicans.. TE. La concentración mínima inhibitoria de miel de abeja sobre las cepas de. BI BL. IO. Escherichia coli y Candida albicans, se determinó por el método de macrodilución en tubos con caldo BHI para Escherichia coli y para Candida albicans, en caldo Sabouraud.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 6.5. Método de Macrodilución en caldo 40. Este método permite determinar el efecto antimicrobiano de miel de Apis mellifera. Para lo cual se realizaron diluciones de miel de Apis mellifera, a concentraciones de 10% al 90%. En este caso, se calculó la dilución en el que es inhibido Escherichia coli y Candida albicans. Para el desarrollo del experimento se utilizó 66 tubos de ensayo (33 para. IC A. determinar el CIM de Escherichia coli y 33 para Candida albicans), a cada. UI M. tubo se le añadió 5mL del caldo respectivo, luego se adicionó los gramos de. Q. miel necesaria para llegar a las concentraciones antes mencionadas (ver tabla. BI. O. 10 del anexo 17), finalmente se añadió 0.1 mL del inóculo bacteriano. Estos. IA. Y. tubos se llevaron a incubación en condiciones de anaerobiosis controlada a. AC. 37°C durante 24h.. RM. Después de 24 horas de incubación a 37°C, los tubos de ensayo se examinaron. FA. visualmente. Se consideró la concentración mínima inhibitoria a la menor. DE. concentración de la miel de abeja a la cual el microorganismo ensayo no. TE. CA. presentó desarrollo visible. El ensayo se trabajó por triplicado.. IO. Para la determinación de la concentración mínima inhibitoria de los controles. BI BL. positivos; del ciprofloxacino se colocó 2.5 mL al tubo de ensayo que contenía caldo BHI, de fluconazol se le adicionó 2.5 mL al tubo que contenía caldo Sabouraud. Para el control negativo, 1.5 g de miel de abeja sin suspensión microbiana en los tubos que contenía caldo BHI y caldo Sabouraud. Todo el procedimiento se llevó a cabo dentro del diámetro de 10 cm de la llama de un mechero El ensayo se trabajó por triplicado.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 6.6. Determinación de la concentración mínima bactericida (CMB) de miel de Apis mellifera frente a Escherichia coli y Candida albicans. A partir de los tubos de ensayo donde no presentó desarrollo visible de microorganismos, se determinó las cuentas viables sembrando 0.1mL de solución de cada uno de los tubos restantes, en placas petri con agar Mueller Hinton para Escherichia coli y con agar Sabourad para Candida albicans,. IC A. por cada concentración, utilizando el asa de digralsky para dispersar la. UI M. muestra; dichas placas fueron llevadas a estufa por 24 horas a 37°C y luego se. Q. observó el crecimiento del microorganismo mediante el conteo de Unidades. BI. O. Formadoras de Colonias (UFC), considerándose el efecto antimicrobiano en. IA. Y. el cual no se observó UFC, teniendo la menor concentración de la miel de abeja.. AC. Todo el procedimiento se llevó a cabo dentro del diámetro de 10 cm de la llama. FA. RM. de un mechero. El ensayo se realizó por triplicado.. CA. DE. 7. Análisis estadístico. TE. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba de análisis de varianza. IO. (p<0.05) y la de complemento múltiple test Tukey (nivel de significancia de 5%). BI BL. con el programa estadístico SPSS 18.0 (Statistical Package for the Social Sciences).. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III. RESULTADOS. Tabla 1. Características fisicoquímicas de la miel de Apis mellifera. Parámetro. Resultado. Valores normales según la comisión del Codex Alimentarius. Suigeneris. -------. Color. Ámbar oscuro. -------. Sabor. Característico. Textura. Viscosidad moderada. O. Q. UI M. IC A. Olor. 4.18 ± 0.20. Acidez libre. 19.5 meq/kg ± 1.31. Sólidos totales. 80.6 %. ------3.4–4.7. Max. 50 meq/kg. AC. IA. Y. BI. pH. -------. 1.4876 ± 0.58. RM. Índice de refracción. 79 ± 0.58. FA. Grados Brix. 19.4 %. Sólidos solubles. 79 g/100. Densidad. 1.4437 g/ml ± 0.05. IO. TE. CA. DE. Contenido de humedad. Max. 20%. 0.058 g/100g ± 0.019. Max. 0.1g/100g Min. 12 en la escala. BI BL. Sólidos insolubles. 12 Goethe ± 0.58. Azúcares reductores. 66.8 g/100g ± 1.85. 65 a 79 g/100g. 0.824 g/100g ± 0.07. No más de 1g/100g. Actividad Diastásica. Cenizas. de Goethe. n= 3 repeticiones. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 2. Tamizaje fitoquímico de la miel de Apis mellifera Extracto. Ensayo. Metabolitos. Resultado. secundarios Diclorometano. Etanólico. Bortranger. Quinonas. -. Shinoda. Flavonoides. +++. Tricloruro férrico. Fenoles. +. Gelatina. Taninos. -. Dragendorff. +. Hager. IC A. Alcaloides. UI M. Mayer. Q. Wagner. O. Dragendorff. BI. Hager. Acuoso/Ácido. Alcaloides. IA. Y. Mayer. + + + + + ++. Leucoantocianidinas. +. Gelatina. Taninos. -. Espuma. Saponinas. +. Tricloruro férrico. Fenoles. +. FA. Rosemheim. BI BL. IO. TE. CA. DE. Acuoso. Leyenda:. +. Flavonoides. RM. Shinoda. AC. Wagner. +. Intensidad: (+): poca;(++): moderada; (+++): alta Identificación: (+): presencia; (-): ausencia. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 3. Concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB) de la miel de Apis mellifera frente a Eschericha coli.. CMB CONCENTRACIÓN. (Recuento de UFC). 10%. +++. ----. 20%. +++. ----. 30%. ++. UI M. 40%. ----. +. ----. 0. 4583. 0. 2747. 0. 570. 80%. 0. 247. 0. 77. 0.8%. 0. 20. 0.8%. 0. 0. Miel de Apis. O. Q. 50%. mellifera.. Y. IA. 70%. BI. 60%. RM. 90%. FA. Control. (Turbidez). AC. CONTROL. CMI. IC A. MUESTRAS Y. DE. positivo. Control. TE. negativo (Miel. CA. (Ciprofloxacino). BI BL. IO. sin suspensión bacteriana). Leyenda: 0: Sin turbidez +: Menor turbidez ++: Mediana turbidez +++: Mayor turbidez UFC: Unidad Formadoras de Colonias 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 4. Análisis de varianza de la concentración mínima bactericida (CMB) de la miel de Apis mellifera frente a Escherichia coli. ANOVA. Suma de cuadrados. gl. Media cuadrática. F. Sig.. Entre grupos. 52853161. 5. 10570632. 1365,91. 0,000. Dentro de grupos. 92867. 12. 7739. Total. 52946028. 17. BI. O. Q. UI M. IC A. Fuente de variación. Y. Tabla 5. Análisis Post Hoc- Prueba HSD de Tukey de la concentración. AC. IA. mínima bactericida (CMB) de la miel de Apis mellifera frente a. Ciprofloxacino. 1. BI BL. Miel con susp. E. coli 90 Miel con susp. E. coli 80 Miel con susp. E. coli 70 Miel con susp. E. coli 60 Miel con susp. E. coli 50 Sig.. Subconjunto para alfa = 0.05 2. 3. 4. 5. 6. 20,0. IO. 3. HSD Tukeya. DE. N. CA. Grupo. TE. FA. RM. Escherichia coli. 3. 76,7. 3. 246,7. 3. 570,0. 3. 2746,7. 3. 4583,3 1,000. 1,000. 1,000. 1,000. 1,000. 1,000. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 6. Concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB) de la miel de Apis mellifera frente a Candida albicans.. CONCENTRACIÓN. (turbidez. (recuento de. ). UFC). 10%. +++. ----. 20%. +++. ----. 30%. ++. ----. +. ----. 0. 46500. 0. 38833. 0. 9467. 0. 4333. 1%. 0. 0. 1%. 0. 0. Q. 50%. O. mellifera.. BI. 60%. IA. Y. 70%. AC. 80%. RM. 90%. FA. Control. DE. positivo. TE. negativo (Miel. CA. (Fluconazol) Control. ----. ++. 40% Miel de Apis. CMB. UI M. CONTROL. CMI. IC A. MUESTRAS Y. BI BL. IO. sin suspensión bacteriana). Leyenda: 0: Sin turbidez +: Menor turbidez ++: Mediana turbidez +++: Mayor turbidez UFC: Unidad Formadoras de Colonia 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 7. Análisis de varianza de la concentración mínima bactericida (CMB) de la de la miel de Apis mellifera frente a Candida albicans. ANOVA. Suma de cuadrados. gl. Media cuadrática. F. Sig.. Entre grupos. 5388470667. 4. 1347117667. 3502,04. 0,000. Dentro de grupos. 3846667. 10. 384667. Total. 5392317333. 14. BI. O. Q. UI M. IC A. Fuente de variación. Y. Tabla 8. Análisis Post Hoc- Prueba HSD de Tukey de la concentración. AC. IA. mínima bactericida (CMB) de la miel de Apis mellifera frente a. N. IO. Fluconazol. TE. CA. Grupo. BI BL. Miel con susp. C. albicans 90 Miel con susp. C. albicans 80 Miel con susp. C. albicans 70 Miel con susp. C. albicans 60 Sig.. DE. FA. RM. Candida albicans. 3. 1. HSD Tukeya Subconjunto para alfa = 0.05 2. 3. 4. 5. 433. 3. 4333. 3. 9467. 3. 38833. 3. 46500 1,000. 1,000. 1,000. 1,000. 1,000. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV.. DISCUSIÓN. En el presente estudio, fue evaluada la acción antimicrobiana in vitro de miel de Apis mellifera, sobre Echerichia coli y Candida albicans, donde se observa en la tabla 1, los valores promedios de los parámetros fisicoquímicos como el pH, el cual presentó un valor de 4.18 ± 0.20, la acidez libre de 19.5. IC A. meq/Kg ± 1.31 de miel; estos están dentro del límite establecido por Normas. UI M. Internacionales de la National Honey Board, donde establece el rango de pH de 3.9-6.1 y para la acidez libre el Codex Alimetarius, donde el máximo Así mismo la densidad específica de. Q. 41,42.. O. permitido es de 50meq/Kg de miel. Este parámetro está relacionado. IA. 14.. AC. A. (densidad rango: 1.39 – 1.44). Y. BI. 1.44 ± 0.05, se encuentra dentro del rango obtenido según un estudio de Correa. RM. directamente proporcional a la humedad, a medida que la humedad disminuye. FA. la densidad se incrementa; el contenido promedio de humedad fue 19.4%,. DE. estos datos son similares a los encontrados por Zandamela (2008) (con un. CA. rango que osciló entre 15,30 y 21,65g/100g de miel). El contenido de humedad. TE. fue menor del 20%, este es un factor determinante en su calidad, no solo porque. BI BL. IO. influye en sus características organolépticas (viscosidad, condiciones de palatabilidad y sabor), sino además, por ser determinante en su vida útil. 36.. El contenido de azúcares reductores fue del 66.8% ± 1.85, índice de refracción de 1.486 ± 0.58, y los grados Brix 79% ± 0.58, estos valores están dentro de los límites aceptables por el National Honey Board, estos valores indican un adecuado grado de madurez y excluye la posibilidad de una alimentación artificial. 41 En un estudio realizado por Ulloa (2010), encontró que las mieles en estudio presentaron un valor promedio de 77.85% de azucares reductores 3.. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
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