Validación de un método analítico por cromatografía líquida de alta resolución para la determinación de trazas de benzocaína, en las superficies de un equipo de fabricación farmacéutica”
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(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UI M. IC A. Agradecimientos:. Q. A Dios:. BI. O. Gracias por el regalo de la vida y. IA. Y. por iluminar cada paso. FA. RM. AC. de mi camino.. DE. Gracias por permitirme lograr mis metas,. BI BL. IO. TE. CA. por el inmenso amor que me regalas y por bendecir a mis seres queridos.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IC A. A mis padres Rocío Pérez y Feliciano Vásquez,. UI M. desde lo más profundo de mi corazón. Q. mil gracias por su apoyo, por su ayuda. BI. O. incondicional, comprensión y estar. FA. RM. AC. IA. Y. siempre conmigo.. DE. A mis hermanas Taly y Lucero,. CA. gracias por prestarme su ayuda cuando. BI BL. IO. TE. más lo he necesitado y apoyarme en los momentos más difíciles.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(4) UI M. IC A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. O. Q. Un sincero agradecimiento al. Y. BI. Dr. Pedro Alva Plasencia. AC. IA. por su apoyo y asesoramiento. RM. en la realización del. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. presente trabajo.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. JURADO EVALUADOR. IC A. ----------------------------------------. Q. RM. AC. IA. Y. BI. O. PRESIDENTE. UI M. M. Sc. Segundo Miranda Leyva. FA. -----------------------------------. MIEMBRO. BI BL. IO. TE. CA. DE. Mg. Roger Rengifo Penadillos. ----------------------------------Dr. Pedro Alva Plasencia MIEMBRO. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. UI M. IC A. Señores miembros del jurado:. Dando cumplimiento a las disposiciones establecidas en el Reglamento. O. Q. para la obtención de GRADOS Y TÍTULOS DE LA FACULTAD DE. BI. FARMACÍA Y BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE. Y. TRUJILLO, presento a vuestra consideración y elevado criterio el Informe de. ANALÍTICO. POR. AC. IA. Prácticas Pre-profesionales, intitulado: “VALIDACIÓN DE UN METODO CROMATOGRAFÍA. LÍQUIDA. DE. ALTA. EN. LAS. FA. BENZOCAÍNA,. RM. RESOLUCIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE TRAZAS DE SUPERFICIES. DE. UN. EQUIPO. DE. DE. FABRICACIÓN FARMACÉUTICA”, con el que pretendo obtener el Título. CA. de Químico Farmacéutico.. TE. Dejo a vuestra consideración, señores miembros del jurado la calificación del. BI BL. IO. presente Informe de Prácticas Preprofesionales.. Trujillo, julio de 2012. Génesis C. Vásquez Pérez. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IC A. INDICE. UI M. RESUMEN…………………………………………………....i. Y. BI. O. Q. ABSTRACT………………………………………..…………ii. AC. IA. I. INTRODUCCIÓN ................................................................... 1. RM. II. MATERIAL Y MÉTODO ..................................................... 7. FA. III. RESULTADOS ......................................................... ….…. 25. CA. DE. IV. DISCUSIÓN ......................................................................... 28. TE. V. CONCLUSIONES ................................................................ 34. BI BL. IO. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.............................. 35 ANEXOS ..................................................................................... 39. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN El objetivo del presente estudio fue demostrar que el método analítico por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) desarrollado para la determinación de trazas de benzocaína en las superficies de un equipo de fabricación farmacéutica cumple con los parámetros de validación. IC A. considerados por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Para lo cual se. UI M. utilizó como fase móvil la solución de Metanol: Agua: Heptanosulfonato de sodio 0,005 M (50:50:2) y como fase estacionaria la columna RP-18 (5µm). Q. 150 x 4,6 mm. Se determinó la ausencia de interferencias en el tiempo de. BI. O. retención del pico de benzocaína para el blanco y la presencia del pico de. Y. benzocaína en la muestra. En la linealidad del estándar, la pendiente (b) fue. IA. 20,1364 y el intercepto (a) de 0,4255; el coeficiente de correlación fue 0,9999. AC. y el coeficiente de determinación de 0,9999; los límites de confianza de “b”. RM. fueron 2,8287 y 37,4440; y texp = 2,5130; los límites de confianza de “a”. FA. fueron - 216,1889 y 217,0399; y texp = 0,0042; mediante el test estadístico del =. 307,6225 y la desviación estándar. DE. coeficiente de correlación se obtuvó tr. relativa fue de 0,66% en el test de linealidad, por tanto el método es lineal en. CA. el intervalo de concentraciones de 3 a 20 μg/mL. Los límites de detección y. TE. cuantificación fueron evaluados para ser 0,0331 μg/mL y 0,0489 μg/mL. IO. respectivamente, siendo estos resultados conformes para un límite de. BI BL. limpieza de 9,70 μg/mL. Se obtuvó un porcentaje de recuperación de 76,05% y 75,50% en los equipos Agilent Techologies VWD 1200 y Agilent Techologies VWD 1260 respectivamente, mediante el método de muestreo por superficies usando hisopos humedecidos con metanol. Por tanto los resultados obtenidos permiten dar como validado el método analítico por HPLC para la determinación de trazas de benzocaína, en las superficies de equipos de fabricación farmacéutica, al cumplir con los parámetros de validación considerados necesarios por la OMS. Palabras claves: HPLC, benzocaína, validación, OMS. i. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT The purpose of this study was to demonstrate that the analytical method by high performance liquid chromatography (HPLC) developed for the determination of trace amounts of benzocaine on the surfaces of pharmaceutical manufacturing equipment meets the validation parameters considered by the World Health Organization. IC A. (WHO). To which was used as mobile phase solution Methanol: Water: 0,005 M. UI M. sodium heptanesulfonate (50:50:2) as stationary phase column RP-18 (5μm) 150 x 4,6 mm. Was determined by the absence of interference in the retention time of. Q. benzocaine peak in the white and the presence of the benzocaine peak in the sample.. BI. O. The linearity of the standard, the slope (b) was 20,1364 and the intercept (a) of. Y. 0,4255; the correlation coefficient was 0,9999 and the coefficient of determination of. IA. 0,9999; the confidence limits "b" were 2,8287 and 37,4440; and texp = 2,5130; the. AC. confidence limits of "a" were - 216,1889 and 217,0399; and texp = 0,0042; using the. RM. statistical test of the coefficient of correlation was obtained tr = 307,6225 and the. FA. relative standard deviation was 0,66% in the test of linearity, therefore the method is. DE. linear over the concentration range of 3 to 20 μg/mL. The detection and quantification limits were evaluated to be 0,0331 μg/mL and 0,0489 μg/mL. CA. respectively, these results conform to a limit of cleaning 9,70 μg/mL. We obtained a. TE. recovery rate of 76,05% and 75,50% in the Agilent Techologies 1200 and Agilent. IO. Techologies VWD 1260 respectively, using the sampling method using swabs wetted. BI BL. surfaces with methanol. Thus the results obtained are given as validated HPLC analytical method for the determination of trace amounts of benzocaine in the areas of pharmaceutical manufacturing equipment, to meet the validation parameters considered by WHO.. Keywords: HPLC, benzocaine, validation, WHO.. ii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN Los productos farmacéuticos pueden ser contaminados por una variedad de sustancias tales como contaminantes asociados a los microbios, productos anteriores (tanto ingredientes farmacéuticos activos (API) y residuos de excipientes), residuos de agentes de limpieza, materiales transportados por el aire, lubricantes,. UI M. IC A. desinfectantes y los residuos de descomposición 1.. Por tanto los procedimientos adecuados de limpieza desempeñan un papel importante. O. Q. en la prevención de la contaminación y la contaminación cruzada. La validación del. BI. método de limpieza proporciona evidencia documentada de que un procedimiento de. Y. limpieza proporcionará un equipo limpio, adecuado para su uso previsto, por tanto. IA. los procedimientos de limpieza deben ser validados y los métodos para determinar. AC. trazas de ingredientes farmacéuticos activos, deben considerarse con especial. FA. RM. atención 1,2,3,17.. DE. Una limpieza inadecuada de una planta de fabricación de productos farmacéuticos o. CA. inadecuada depuración de las piezas individuales de equipos usados en la fabricación de múltiples productos o equipos que no se dedican a productos individuales, pueden. TE. conducir a la contaminación del siguiente lote de productos farmacéuticos fabricados. BI BL. IO. con el mismo equipo 4.. Los desafíos para la validación de limpieza se encuentran especialmente en el desarrollo de métodos analíticos sensibles capaces de detectar trazas de ingredientes farmacéuticos activos que son susceptibles de permanecer en la superficie del equipo después de la limpieza 4,5,16.. Es así que todo laboratorio farmacéutico debe emplear el método analítico en combinación con el método de muestreo para demostrar que los contaminantes pueden ser recobrados de la superficie del equipo y determinar la concentración 6. 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El método analítico debe ser validado antes que la validación de la limpieza se lleve a cabo. La validación del método de análisis debe incluir según proceda: linealidad, selectividad, límite de detección, límite de cuantificación, porcentaje de recuperación y reproducibilidad 7.. La selectividad evalúa inequívocamente el analito y evidencia la presencia de otros. .. UI M. 8,9. IC A. componentes. Típicamente estos pueden incluir impurezas, degradantes, matriz, etc. Q. La linealidad de un método analítico permite obtener resultados de prueba. BI. O. proporcionales ya sea directamente, o por medio de una transformación matemática. .. AC. IA. 8,9. Y. bien definida, a la concentración de analito en muestras dentro de un intervalo dado. RM. El límite de detección es la mínima cantidad de analito en la muestra que se puede. FA. detectar aunque no necesariamente cuantificar, bajo las condiciones experimentales. DE. descritas 8,9.. CA. Se entiende por límite de cuantificación a la mínima cantidad de analito presente en. IO. TE. la muestra que se puede cuantificar bajo las condiciones experimentales descritas 8,9.. BI BL. Existen varios procedimientos para determinar el límite de detección y el límite de cuantificación. Estos se basan en la evaluación visual, en la relación señal-ruido o en la desviación estándar de la respuesta del blanco y la pendiente de la recta de calibrado (Métodos instrumentales que corrigen la señal frente a un blanco, métodos instrumentales que no corrigen la señal frente a un blanco y el método basado en la extrapolación de la recta de calibrado a concentración cero) 9, 11, 12.. El porcentaje de recuperación se calcula a partir de la cantidad valorada con respecto a la cantidad conocida de analito añadida a la muestra. Los estudios de recuperación deben ser realizados para evaluar y verificar la aplicabilidad del método analítico, y 2. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. el procedimiento de muestreo para recuperar residuos de las superficies que tienen contacto con el producto 8,10.. Dos métodos de muestreo se consideran aceptables. Estos son muestreo con hisopo o por raspado en superficie y muestreo por enjuague. Una combinación de los dos es. IC A. generalmente la más aceptable 7.. El método de muestreo con hisopo o por raspado en superficie (método directo), es el. UI M. método de muestreo más utilizado y consiste en tomar un material inerte (por. Q. ejemplo algodón) en el extremo de una sonda (referido como un "hisopo") y frotarlo. BI. O. en una superficie. El tipo de material del hisopo de muestreo utilizado debe tener la. Y. característica de estar preparados con materiales inertes que no generen. AC. IA. interferencias 7,13,14.. RM. Los factores que deben ser considerados incluyen el proveedor de la torunda, el área. FA. de frotis, el número de hisopos utilizados, si son hisopos húmedos o secos, manejo. DE. del hisopo y la técnica de hisopado. El lugar desde donde se toma la muestra debe tener en cuenta la composición del equipo, la ubicación y los peores lugares deben. TE. CA. ser considerados 7.. IO. El método de muestreo con hisopo tiene la ventaja de ser reproducible, disolver y. BI BL. físicamente remover la muestra, es útil en muchos tipos de superficie, aplicable a activos, detergentes y microorganismos. Entre sus desventajas se encuentran el ser de uso limitado en áreas de difícil acceso, estar influenciado según el entrenamiento y la habilidad del operador 10.. Muestreo por enjuague, este método permite el muestreo de una gran superficie, de las áreas que son inaccesibles o que no pueden ser desmontadas y habitualmente proporcionan una imagen en conjunto e involucra el uso de un volumen conocido de agua para enjuagar el área de la superficie del equipo 7,15.. 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Método de enjuague tiene la ventaja de permitir el muestreo de grandes áreas, no depende del operador y es de fácil muestreo. Presenta la desventaja de no permitir detectar el punto de contaminación, el volumen utilizado es crítico y no todas las sustancias son solubles 10.. Para desarrollar el método de la presente validación para la determinación de trazas. IC A. de benzocaína en las superficies de equipos de fabricación farmacéutica se utilizó la. UI M. técnica de separación, Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).. Q. El término cromatografía de líquidos, según se usa en los diferentes compendios, es. BI. O. sinónimo de cromatografía de alta presión y de cromatografía de alta resolución. La. Y. cromatografía de líquidos es una técnica de separación basada en una fase. AC. IA. estacionaria sólida y una fase móvil líquida 8.. RM. Las fases estacionarias más comúnmente usadas son la sílice modificada o las. FA. microperlas de polímero. El tipo de relleno especifico necesario para completar un. DE. análisis se indica mediante la designación “L” en una monografía individual 8,12.. CA. La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes, según se define en la. IO. TE. monografía individual 8.. BI BL. Un cromatógrafo de líquidos consta de un recipiente que contiene la fase móvil, una bomba para forzar el paso de la fase móvil a través del sistema a alta presión, un inyector para introducir la muestra en la fase móvil, una columna cromatográfica, un sistema de detección y un sistema de proceso de datos 8,12.. Así en varios países del mundo se han realizado estudios similares, como el realizado por Klinkenberg R, Streel B, Ceccato Una. (2003) Bélgica, titulado “Desarrollo y validación de un método de cromatografía de líquidos para la determinación de residuos de amlodipino sobre las superficies del equipo de fabricación”, en el cual se desarrolló un muestreo de frotis con el fin de controlar el procedimiento de limpieza, 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. el porcentaje de recuperación fue de 90% con hisopos humedecidos en metanol, para determinar la amlodipina residual se realizó la cromatografìa a 25 °C en el modo isocrático en una fase estacionaria RP-18 utilizando una fase móvil compuesta de acetonitrilo, metanol, solución trietilamina pH 3,0 (15:35:50 v/v/v). El método ha demostrado ser selectivo y lineal en el intervalo de concentraciones variando desde. IC A. 0,39 a1,56 μg/mL 2.. En el estudio realizado por Arayne MS, Sultana N, Sajid SS, SS Ali. (2008) Pakistán,. UI M. departamento de Química de la Universidad de Karachi, Titulado “Validación de la. Q. limpieza de ofloxacino en equipos de fabricación de productos farmacéuticos y la. BI. O. validación del método deseado por HPLC”. El método para determinar los residuos. Y. ofloxacino sobre las superficies del equipo de fabricación fue validado en cuanto a. IA. precisión, linealidad, especificidad, límite de cuantificación y porcentaje de. AC. recuperación sobre la superficie del equipo, así como la estabilidad de un. RM. contaminante potencial en un proceso de validación de limpieza. Se obtuvó una. FA. recuperación media sobre placas de acero inoxidable de 85%. El ensayo fue lineal en. DE. el rango de concentración de 2 μg/mL a 2000 μg/mL (r = 0,99998). El método fue validado para la exactitud y precisión. Esto confirmó que el nivel deseado de. CA. limpieza se consigue utilizando los procedimientos de limpieza actuales, las cuales. IO. TE. fueron validadas por consiguiente 4.. BI BL. La benzocaína (4-Aminobenzoato de etilo); cristales pequeños blancos o polvo cristalino blanco, es un éster con un peso molecular de 165,18913 g/mol, pka 2,5 y poco soluble en agua. Es un anestésico local, indicado para el alivio temporal del dolor, actúa bloqueando la conducción de los impulsos nerviosos al disminuir la permeabilidad de la membrana neuronal a los iones sodio 19.. El principio activo benzocaína, fue considerado como el analito de interés para el presente trabajo, de ahí que el motivo de estudio es la validación del método analítico por HPLC para la determinación de trazas en las superficies de un equipo de fabricación farmacéutica. Dicho analito es componente de un producto farmacéutico 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. analgésico, antiinflamatorio bucofaríngeo indicado para el alivio sintomático de los procesos inflamatorios de la boca y la garganta.. Es así que la necesidad de determinar trazas de benzocaína después de un proceso de fabricación hace necesario desarrollar un método de análisis adecuado con la capacidad de cuantificar cantidades pequeñas de dicho principio activo, lo cual. IC A. asegure que el método de análisis de trazas proporcionará de forma consistente y. UI M. repetitiva resultados que cumplan con las especificaciones establecidas.. Q. Por consiguiente se plantea el siguiente problema ¿El método analítico por. BI. O. cromatografía líquida de alta resolución para la determinación de trazas de. Y. benzocaína en las superficies de un equipo de fabricación farmacéutica cumple con. AC. IA. los parámetros de validación considerados por la Organización Mundial de la Salud?.. RM. El objetivo general del presente trabajo es demostrar que el método analítico por. FA. cromatografía líquida de alta resolución, desarrollada para la determinación de trazas. DE. de benzocaína en las superficies de un equipo de fabricación farmacéutica cumple con los parámetros de validación considerados por la Organización Mundial de la. TE. CA. Salud.. -. BI BL. IO. Dentro de los objetivos específicos se consideran:. Determinar los parámetros de validación (Selectividad, Linealidad, Límite de detección, Límite de cuantificación y Porcentaje de recuperación) para el método analítico por cromatografía liquida de alta resolución, para la determinación de trazas de benzocaína en las superficies de equipos de fabricación farmacéutica.. -. Evaluar los parámetros de validación considerados por la Organización Mundial de la Salud, para establecer si cumplen con los criterios de aceptación. 6. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIAL Y MÉTODO. 1.. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS. IC A. 1.1. Materiales. Estándar primario Benzocaína USP. Q. -. UI M. 1.1.1. Estándares. BI. O. USP Reference Standard Benzocaína 500 mg. Y. Lote: J1G214. Estándar secundario Benzocaína. FA. Lote: C5031105009. RM. -. AC. IA. Potencia: 100,0%. DE. Potencia: 100,36% Tal cual (T/C) Protocolo: ST 24/11. TE. CA. Reanálisis: 2012-12-20. BI BL. IO. 1.1.2. Material de vidrio -. El de uso común en laboratorio, debidamente verificado.. 1.2. Reactivos y solventes -. Agua ultrapura.. -. Heptanosulfonato de sodio Fisher Scientific 25 g, lote 101723.. -. Metanol grado HPLC Merck 4 L, lote I577107 106.. 7. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.3. Equipos. PROTOCOLO DESCRIPCIÓN. MARCA. MODELO. SERIE. DE CALIFICACIÓN. Ohaus. PA214. 8328320492. Cromatógrafo líquido de alta resolución HPLC VWD 1260. Agilent. TE. BI BL. IO. Ultrasonido. Vórtex. ---. ITCI-CC.033 ITCO-CC.033 ITCD-CC.033. MSE3.6P000-DM. 27203340. PCI-CC.045 PCO-CC.045 PCD-CC.045. BI Y. IA. DE. FA. Sartorius. CA. agua. 1200 Infinite Series. AC RM. Microbalanza Purificador de. ---. 1200 Series. Q. Agilent. PCI-CC.004 PCO-CC.004 PCD-CC.004. O. Cromatógrafo líquido de alta resolución HPLC. UI M. IC A. Balanza analítica. PCI-CC.016 PCO-CC.016 PCD-CC.016. Millipore. Reference. PCI-CC.046 F1NA21877C PCO-CC.046 PCD-CC.046. Fisher Scientific. FS23. 222043. PCI-CC.016 PCO-CC.016 PCD-CC.016. Daigger Vórtex Genie 2. G-560E. 2-79085. ITCI-CC.007 ITCO-CC.007 ITCD-CC.007. 1.4. Otros -. Guantes de látex, Rubbercare lote 110.. 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. -. Jeringas de plástico 5 mL 21G x 11/2”.. -. Membrana de filtración Sartolon Polyamida, tamaño de poro 0,45 um x 25 mm; lote 1111 25006 1140783.. -. Membrana de filtración Sartolon Polyamida, tamaño de poro 0,45 um x 45 mm; lote 0811 25006 1140493. Papel Parafilm “M”, Laboratorio Film.. -. Portafiltro descartable Agilent Technologies Econofilter 25 cm de diámetro x 0,2 um de tamaño de poro PTFE.. IC A. -. Tapas y septas Agilent Technologies, lote 091996-3-1.. -. Viales 100/PK Agilent Technologies, lote 1112001095.. MÉTODO:. RM. AC. 2.1. Condiciones cromatográficas. IA. Y. 2.. BI. O. Q. UI M. -. : RP-18 (5µm) 150 x 4,6 mm; equivalente a L1. DE. FA. Columna. según USP 34 : 254 nm. Flujo. : 1 mL/min. CA. Longitud de onda. TE. Volumen de inyección : 20 μL : 25 °C. BI BL. IO. Temperatura. 2.2. Preparación de la fase móvil y solución diluyente -. Fase Móvil. Metanol: Agua: Heptanosulfonato de sodio 0,005 M (50:50:2). Solución de Heptanosulfonato de sodio 0,005 M: En un matraz volumétrico de 100 mL; se pesó 101,12 mg de Heptanosulfonato de sodio, disolviéndose y llevó a volumen con agua. 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. -. Solución diluyente. Metanol: Agua (50:50). 2.3. Preparación de las soluciones de trabajo. Preparación de la solución estándar. IC A. -. UI M. Se pesó aproximadamente 25 mg de benzocaína estándar y añadió a un. Q. matraz volumétrico de 50 mL, disolviéndose y enrasó con metanol.. BI. O. Luego se transfirió 2 mL de ésta solución en un matraz volumétrico de. Y. 100 mL, enrasándose con solución diluyente, luego se homogeneizó y. IA. filtró a través de membrana de Polyamida con tamaño de poro de 0,45. FA. Preparación de la muestra. DE. -. RM. AC. µm x 25 mm. Se preparó estándares por duplicado e inyectó 5 veces.. CA. Al tubo de ensayo conteniendo 100 µL de metanol y luego de haber. TE. realizado el hisopado correspondiente se le adicionó volumétricamente. IO. 10 mL de solución diluyente, dejándolo reposar por 30 minutos. Se. BI BL. sonico por 10 minutos y agitó con ayuda del vórtex por 1 minuto, luego se filtró las muestras e inyectó por duplicado.. 2.4. Parámetros de validación. 2.4.1. Selectividad. Se analizó el hisopo a emplear para determinar posibles interferencias durante el análisis de las muestras, empleándose hisopos de muestreo. 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. de algodón poliéster diseñado específicamente para validaciones de limpieza, en técnicas analíticas por HPLC.. a. Preparación del blanco -. Se dispuso de tubos de ensayo conteniendo 100 µL de metanol y se colocó el hisopo de muestreo. Luego se adicionó 10 mL de solución diluyente.. -. Se dejó reposar por 30 minutos, sonico por 10 minutos y agitó en el. UI M. IC A. -. Q. vórtex por 1 minuto. -. BI. O. Se filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e inyectó las. IA. Y. muestras por duplicado.. RM. AC. b. Preparación de las muestras -. FA. Se dispuso de tubos de ensayo conteniendo 100 µL de metanol y se colocó el hisopo de muestreo.. DE. -. Se adicionó 10 mL de la solución estándar de benzocaína, dejándolo. CA. reposar por 30 minutos, se sonico por 10 minutos y agitó en el vórtex. Se filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e inyectó las. IO. -. TE. por 1 minuto.. BI BL. muestras por duplicado.. Criterio de aceptación 8,9 El blanco (Hisopo + solución diluyente) no presenta interferentes en el tiempo de retención del analito benzocaína. La muestra (Hisopo + solución diluyente + solución estándar de benzocaína) no presenta interferentes en el tiempo de retención del analito benzocaína; asimismo en caso de presentarse, el interferente próximo al pico de benzocaína debe tener una resolución mayor o igual a 1,5. 11. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.4.2. Linealidad. Se analizaron por triplicado 5 soluciones estándar de Benzocaína a concentraciones decrecientes de 30%, 20%, 10%, 5% y 3%. Se determinó la pendiente “b” y el intercepto o término independiente “a” a partir de la ecuación de la recta de regresión Y = b X + a tomando como. IC A. X la concentración y como Y la respuesta.. Q. UI M. a. Preparación de las muestras. Y. BI. O. - Muestra 3 %. IA. Se pesó aproximadamente 15,0 mg de benzocaína estándar y añadió a un. AC. matraz volumétrico de 100 mL, se disolvió y enrasó con metanol; de. RM. esta solución se transfirió 2 mL en un matraz volumétrico de 100 mL y. FA. se enrasó con solución diluyente (3,0 µg/mL), luego se homogeneizó y. DE. filtró a través de membrana de Polyamida con tamaño de poro de 0,45. CA. µm x 25 mm.. IO. TE. - Muestra 5 %. BI BL. Se pesó aproximadamente 25,0 mg de benzocaína estándar y añadió a un matraz volumétrico de 100 mL, se disolvió y enrasó con metanol; de esta solución se transfirió 2 mL en un matraz volumétrico de 100 mL y se enrasó con solución diluyente (5,0 µg/mL), luego se homogeneizó y. filtró a través de membrana de Polyamida con tamaño de poro de 0,45 µm x 25 mm. - Muestra 10 %. 12. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Se pesó aproximadamente 50,0 mg de benzocaína estándar y añadió a un matraz volumétrico de 100 mL, se disolvió y enrasó con metanol; de esta solución se transfirió 2 mL en un matraz volumétrico de 100 mL y se enrasó con solución diluyente (10,0 µg/mL), luego se homogeneizó y filtró a través de membrana de Polyamida con tamaño de poro de 0,45 µm x 25 mm.. UI M. IC A. - Muestra 15 %. Q. Se pesó aproximadamente 50,0 mg de benzocaína estándar y añadió a un. BI. O. matraz volumétrico de 50 mL, se disolvió y enrasó con metanol; de esta. Y. solución se transfirió 3 mL en un matraz volumétrico de 200 mL y se. IA. enrasó con solución diluyente (15,0 µg/mL), luego se homogeneizó y. AC. filtró a través de membrana de Polyamida con tamaño de poro de 0,45. FA. RM. µm x 25 mm.. DE. - Muestra 20 %. CA. Se pesó aproximadamente 50,0 mg de benzocaína estándar y añadió a un. TE. matraz volumétrico de 100 mL, se disolvió y enrasó con metanol; de. IO. esta solución se transfirió 2 mL en un matraz volumétrico de 50 mL y se. BI BL. enrasó con solución diluyente (20,0 µg/mL), luego se homogeneizó y filtró a través de membrana de Polyamida con tamaño de poro de 0,45 µm x 25 mm.. b. Cálculos 8,9,11 -. Determinación de la curva de calibración. Se determinó la curva de calibración relacionando la respuesta (área) con la concentración de analito (μg/mL) sobre los puntos sin promedio. 13. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Ecuación de la recta:. Y. bX a. Donde:. Concentración de analito (μg/mL). Y :. Área del pico cromatográfico. b :. Valor de la pendiente de la recta. a :. Valor del intercepto o del término independiente de la recta. Q. UI M. IC A. X :. BI. O. con el eje “Y”. AC. IA. Y. Donde:. RM. b. FA. X. DE CA. Xi n. Xi Yi. Xi n. 2 i. Yi b n. 2. Xi. IO. TE. a. Yi. BI BL. - Coeficiente de correlación (r) El coeficiente de correlación "r" refleja el grado de relación o ligazón existente entre las variables X e Y. Si es cercano a la unidad significa que existe correlación con una probabilidad elevada. Xi. Xi. r. Yi. Yi. n. 2. X i2. 2. Xi n. Yi. 2. Yi n. 14. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Criterio de aceptación “r” no debe ser significativamente diferente de 1, valores mayores a 0,999 se consideran como aceptables.. IC A. - Coeficiente de determinación (r2) Es el cuadrado del coeficiente de correlación "r" e indica la proporción. Q. UI M. de la varianza total de "Y".. Y. BI. O. Criterio de aceptación. IA. “r2” no debe ser significativamente diferente de 1, valores mayores a. Test de verificación de la pendiente “b” o de la Linealidad (Límites. FA. -. RM. AC. 0,990 se consideran como aceptables.. CA. p=0,05). DE. de confianza de la pendiente y test de t para n-2 grados de libertad y. TE. Hipótesis nula (H0): “b” es igual a 0. BI BL. IO. Hipótesis alternativa (Ha): “b” es diferente de 0 Varianza del error experimental total o Residual (S2y,x). s. y2 a. 2 y,x. y b. xy. n 2. Varianza de la pendiente (S2b). S y2, x. 2 b. s. x. 2. x. 2. n 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Desviación estándar de la pendiente (Sb). sb2. sb. IC A. Desviación estándar relativa de la pendiente (Sb rel. (%)). Sb x100 b. Y. BI. O. Límites de confianza de la pendiente. Q. UI M. Sb rel .(%). AC. IA. b ± t Sb. texp. b Sb. CA. DE. FA. RM. Test de t. IO. TE. Criterios de aceptación. BI BL. En los límites de confianza de “b”, no se incluyen el cero. En el Test de t, el valor de texp debe ser mayor al valor de ttabla (texp > ttabla);. para n-2 grados de libertad y un nivel de confianza del 95% (p=0,05), para que “b” sea diferente de cero (Ha).. -. Test de verificación de la variable independiente o Intercepto o de proporcionalidad. “a”. (Límites. de. confianza. del. término. independiente y test de t para n-2 grados de libertad y p=0,05). 16. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. H0: “a” es igual a 0 Ha: “a” es diferente de 0 Varianza del término independiente o intercepto (S2a). x2. 2 b. S x. n. UI M. IC A. s. 2 a. BI. O. Q. Desviación estándar del término independiente o intercepto (Sa). Sa2. AC. IA. Y. sa. RM. Desviación estándar relativa del término independiente o intercepto. Sa x100 a. S a rel .(%). TE. CA. DE. FA. (Sarel. (%)). BI BL. IO. Limites de confianza del término independiente o intercepto. a ± t Sa. Test de t. texp. a Sa. 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Criterios de aceptación En los límites de confianza de “a”, estos incluyen el cero. En el Test de t, el valor de texp debe ser menor al valor de ttabla (texp < ttabla); para n-2 grados de libertad y un nivel de confianza del 95%. Test estadístico del coeficiente de correlación "r". UI M. -. IC A. (p=0,05), para que “a” sea estadísticamente igual a cero (Ho).. O BI r. n 2 1 r2. FA. RM. AC. tr. IA. Y. Ha: Hay correlación entre X e Y. Q. HO: No hay correlación entre X e Y. DE. Donde:. Coeficiente de determinación. TE. r2:. Coeficiente de correlación. CA. r:. Número de determinaciones. BI BL. IO. n:. Criterio de aceptación. Si el valor de tr obtenido es mayor que el ttabla calculado para (n-2) grados de libertad y un nivel de confianza del 95% (α=0,05); entonces existe correlación lineal significativa y se rechaza la H0. -. Test de linealidad. Se define obteniendo el factor de respuesta (f) por cada determinación: 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Y X. f. Donde:. Concentración de analito (μg/mL). Y :. Área del pico cromatográfico. IC A. X :. Q. UI M. Criterio de aceptación. Y. BI. O. Desviación estándar relativa (DSR): ≤ 2%. AC. IA. 2.4.3. Determinación del límite de detección y límite de cuantificación. RM. El límite de detección y cuantificación de Benzocaína se determinó a. FA. partir de la curva de calibración realizada a niveles de concentración. DE. cercanos a los límites esperados, mediante el método basado en la. CA. extrapolación de la curva de calibración a concentración cero.. IO. TE. a. Determinación de la curva de calibración. BI BL. Se obtuvó una curva de calibración, a partir de las concentraciones de 3, 5 y 10 µg/mL, determinándose la ecuación de esta nueva recta de calibración y se extrapoló la respuesta a concentración cero (Ybl).. Se determinó la desviación estándar (S) de cada concentración de la nueva curva de calibración y se efectuó el análisis de regresión tomando como X a la concentración y la desviación estándar de la respuesta como Y. Se extrapoló la desviación estándar de la respuesta a concentración cero (Sbl).. 19. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. b. Cálculos 8,9,11 -. Límite de detección. Ybl 3Sbl b. IC A. Limite de det ección. Respuesta a concentración cero. Q. Ybl:. UI M. Donde:. BI. O. Factor: 3. Desviación estándar de la respuesta a concentración cero. b:. pendiente. RM. Límite de cuantificación. FA. -. AC. IA. Y. Sbl:. Ybl 10Sbl b. CA. DE. Limite de cuantificación. IO. TE. Donde:. BI BL. Ybl:. Respuesta a concentración cero. Factor: 10 Sbl:. Desviación estándar de la respuesta a concentración cero. b:. pendiente. 2.4.4. Determinación del porcentaje de recuperación. Se determinó el porcentaje de recuperación del método de muestreo en combinación con el método analítico.. 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. a. Preparación de la solución estándar. Se preparó la solución estándar por duplicado según lo descrito anteriormente e inyectó 5 veces.. IC A. b. Preparación de la Solución Stock. UI M. Se pesó aproximadamente 25 mg de benzocaína estándar y llevó a un matraz volumétrico de 25 mL, disolviéndose, enrasó con metanol y. BI. O. Q. homogenizó.. Y. c. Determinación del volumen de saturación (Volumen de solvente. AC. IA. utilizado para el muestreo por hisopado). RM. Se dispuso de una batería de tubos conteniendo diferentes volúmenes de. FA. metanol en cantidades mínimas de 0,1 a 1,0 mL (100 μL, 200 μL, 300. DE. μL, 500 μL y 1000 μL), colocándose un hisopo en cada tubo y dejándolo. CA. reposar por 5 minutos. Luego se observó los tubos.. BI BL. IO. TE. Criterio de aceptación. Se eligió el tubo de ensayo que no muestre sobrante de solvente; el volumen presente en dicho tubo constituye el volumen de saturación. El volumen de solvente a utilizar para efectuar las pruebas de hisopado será la mitad del volumen de saturación.. d. Preparación de las muestras Se tomó 100 µL de la solución stock, se “ensució” 25 cm2 de una superficie similar al equipo utilizando una plantilla de acero y se dejó secar. 21. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. e. Hisopado - Para realizar el muestreo se eligió el método de muestreo en superficie o también llamado hisopado, ya que permite tener acceso a los puntos más críticos del equipo sobre el cual se realiza el muestreo para la validación del procedimiento de limpieza (Secadora de lecho fluido TF Glatt 60).. IC A. - Se utilizó hisopos dispuestos en tubos de ensayo conteniendo 100 µL. UI M. de metanol. Los hisopos utilizados fueron Texwipe TX715 de algodón. Q. poliéster (Anexo 6) diseñado específicamente para la determinación. O. de trazas de analitos en técnicas analíticas como HPLC.. Y. BI. - El muestreo se realizó sobre placas de acero en una superficie de área. IA. conocida (25 cm2), en tres direcciones (horizontal, vertical y diagonal,. AC. este último en ambas direcciones) y con una concentración conocida. RM. de la solución estándar de benzocaína.. FA. - Se adicionó volumétricamente 10 mL de solución diluyente y se dejó reposar por 30 minutos.. DE. - Se sonico por 10 minutos y agitó con ayuda del vórtex por 1 minuto.. CA. - Filtró las muestras e inyectó por triplicado.. IO. TE. - Se repitió este ensayo con tres muestras.. BI BL. f. Cálculos 8,9,10, 11,22. -. Se determinó los µg/mL de benzocaína recuperados a partir de la siguiente fórmula:. C Hallada. AMP ÄSt. x CSt. 22. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Donde:. CHallada : Concentración en µg/mL hallados. ASt. : Área del estándar. CSt. : Concentración del estándar (µg/mL). IC A. : Área de la muestra. UI M. -. AMP. Se determinó el porcentaje de recuperación a partir de la siguiente. Y. BI. O. Q. fórmula:. IA. C hallado C agregado. x 100. RM. AC. %R. DE. FA. Donde:. : Porcentaje de recuperación. CA. %R. TE. C hallado. : concentración agregada (µg/mL). BI BL. IO. C agregado. : concentración hallada (µg/mL). Criterios de aceptación El uso del factor de corrección para los estudios de recuperación se realizó según la siguiente tabla:. 23. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. FACTOR DE CORRECCION. IC A. % DE RECUPERACION. Método no adecuado. UI M. < 50 %. O. Q. > 50 < 89%. Y. AC. No Requerido Requerido Método no adecuado. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. > 150. IA. >111 < 150. BI. > 90 % < 100%. Requerido. 24. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III. RESULTADOS Cuadro 1: Parámetro de Selectividad para la validación del método analítico por cromatografía líquida de alta resolución para la determinación de trazas de benzocaína, en las superficies de un equipo de fabricación farmacéutica. Muestra. Ausencia de interferentes en el tR del pico de benzocaína, en caso de presentarse R ≥ 1,5. Ausencia. Conforme. UI M. Ausencia de interferentes en el tR del pico de benzocaína. Conformidad. Ausencia (Benzocaína tR=3,349). Conforme. RM. AC. IA. Y. BI. O. Blanco. IC A. Resultado a. Criterio de aceptación. Q. Prueba. FA. Tiempo de retención (tR), Resolución (R). DE. a: En el anexo 1 se muestra los cromatogramas obtenidos de la solución. TE. CA. muestra y la muestra con analito.. IO. Cuadro 2: Parámetro de Linealidad para la validación del método analítico. BI BL. por cromatografía liquida de alta resolución para la determinación de trazas de benzocaína, en las superficies de un equipo de fabricación farmacéutica. Estimadores estadísticos. Criterio de aceptación. Resultado b. Conformidad. Coeficiente de correlación (r). r > 0,995. 0,9999. Conforme. Coeficiente de determinación (r2). r2 > 0,990. 0,9999. Conforme. 25. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Criterio de aceptación. Estimadores estadísticos. Resultado. Conformidad. LS= 37,4440 LI= 2,8287. Conforme. Test de verificación de la pendiente. h. Test de t. IC A. LC no incluye el cero. texp= 2,5130 ttabla= 2,160. UI M. g. Límite de confianza (LC). BI. O. Q. texp > ttabla. IA. Y. Test de verificación de la variable independiente. LS= 217,0399 LI= -216,1889. Conforme. texp < ttabla. texp= 0,0042 ttabla= 2,160. tr > ttabla. 307,6225. Conforme. DSR ≤ 2%. 0,66 %. Conforme. FA. j. Test de t. RM. AC. i. Límite de LC incluye el cero confianza (LC). DE. Test estadístico del. CA. coeficiente de correlación. TE. "r"*. BI BL. IO. Test de linealidad. *ttabla: 2,160 para: α=0,05 y n-2 grados de libertad Y = 20,1364 X + 0,4255 Límite inferior (LI), Límite superior (LS). b: En el anexo 2 se muestra los datos obtenidos y cálculos realizados.. 26. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Cuadro 3: Límite de detección y Límite de cuantificación para la validación del método analítico por cromatografía liquida de alta resolución para la determinación de trazas de benzocaína, en las superficies de un equipo de fabricación farmacéutica. Criterio de aceptación del límite de limpieza c. Resultado d. Límite de detección. 9,70 μg/mL. 0,0331 μg/mL. Límite de cuantificación. 9,70 μg/mL. Conformidad. Conforme. 0,0489 μg/mL. Conforme. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. Estimadores estadísticos. c: En el anexo 3 se muestra los datos obtenidos y cálculos realizados.. FA. RM. d: En el anexo 5 se muestra el procedimiento para determinar el límite de limpieza. DE. Cuadro 4: Parámetro de porcentaje de recuperación para la validación del. CA. método analítico por cromatografía liquida de alta resolución para la. TE. determinación de trazas de benzocaína, en las superficies de un equipo de. BI BL. IO. fabricación farmacéutica. Estimadores estadísticos. Criterio de aceptación. Porcentaje de recuperación (Agilent Techologies VWD 1200). > 50 < 89%. 76,05%. Porcentaje de recuperación (Agilent Techologies VWD 1260). > 50 < 89%. 75,50%. Resultado e. Conformidad. Conforme. Conforme. e: En el anexo 4 se muestra los datos obtenidos y cálculos realizados. 27. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV. DISCUSIÓN. En el presente trabajo se desarrolló un método analítico por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la determinación de trazas de benzocaína, en las superficies de un equipo de fabricación farmacéutica, el cual combina el método. IC A. analítico y el método de muestreo utilizado para demostrar mediante resultados que los contaminantes pueden ser recuperados de la superficie de un equipo de. BI. O. Q. UI M. fabricación farmacéutica 6.. Y. Debido a que no se disponía de un método de análisis para determinar. IA. cuantitativamente trazas de benzocaína después de un proceso de fabricación con el. AC. fin de controlar un procedimiento de limpieza, se propuso un método por HPLC al. RM. ser altamente específico (detectar un único compuesto en presencia de contaminantes. FA. potenciales), directo (hay una correlación directa entre la presencia del residuo objetivo y la respuesta cuantitativa en el procedimiento analítico), sensitivo, preciso. TE. CA. DE. y altamente reproducible 10.. IO. Para la determinación de trazas de benzocaína se realizó la cromatografía a 25 °C en. BI BL. el modo isocrático en una fase estacionaria RP-18 (relleno de octadecilsilano unido químicamente a micropartículas de sílice o cerámica porosa) de 5 µm de tamaño de partícula y 150 x 4,6 mm de tamaño de columna; equivalente a una columna “L1” según USP 34, utilizando como fase móvil Metanol: Agua: Heptanosulfonato de sodio 0,005 M (50:50:2), detección UV a 254 nm, flujo de 1 mL/min y un volumen de inyección de 20 μL 8,21.. Luego de determinar las condiciones cromatográficas de trabajo, se validó por medio de estudios de laboratorio que las características del método cumplen con los 28. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. parámetros de validación establecidos para la aplicación prevista. Se evaluó los siguientes parámetros: Selectividad, Linealidad, Limite de detección, Limite de cuantificación y Porcentaje de recuperación 20.. La selectividad es un parámetro definido según la Conferencia internacional sobre la. IC A. armonización de requerimientos técnicos para el registro de productos farmacéuticos para uso humano (ICH), como la habilidad para evaluar inequívocamente al analito. UI M. en busca de la presencia de componentes esperados como impurezas, productos de. Q. degradación y componentes de la matriz, realizada a través de las pruebas de. IA. Y. BI. O. identificación para asegurar la identidad del analito 9.. AC. En el Cuadro 1, encontramos los resultados obtenidos de la prueba de identificación,. RM. así mediante el uso de cromatogramas se identificó que el blanco (Hisopo a emplear. FA. + solución diluyente), no presenta interferentes en el tiempo de retención (tR) del pico de benzocaína. En la muestra (Hisopo + solución diluyente + solución estándar. DE. de benzocaína) se comprobó la ausencia de interferentes y la presencia del pico de. CA. benzocaína con un tR igual a 3,349; al compararlos, se puede afirmar que la. TE. identificación del analito benzocaína es posible sin incurrir en resultados falsos. BI BL. IO. positivos, por lo tanto el resultado es conforme.. Para evaluar el parámetro de linealidad; la USP 34 y la Guía de validación de métodos analíticos de la Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria (AEFI), establecen que los resultados deben hallarse mediante métodos estadísticos adecuados como el cálculo de una línea de regresión por el método de los mínimos cuadrados, la intersección con el eje de ordenadas o variable independiente (b), la pendiente de la línea de regresión (m) y la suma de los cuadrados residuales. Así también se debe presentar el coeficiente de correlación (r) el cual indica el grado de relación entre la variable X (concentración) y la variable Y (respuesta), el valor 29. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. recomendable es ≥ 0,995. El coeficiente de determinación (r2), expresa la proporción de la variación total de Y explicada por el método, el valor recomendable es ≥ 0,990 8,11. .. El test de linealidad, verificado mediante el coeficiente de variación de los factores. IC A. de respuesta (f), expresa la relación entre Y y X, siendo recomendable considerar la desviación estándar relativa (RSD) ≤ 2 %; o la significación estadística de la. UI M. desviación estándar de “b” mediante la prueba “t de Student”, empleada para. Q. comprobar que es significativamente distinta de cero. El test de proporcionalidad, el. O. cual permite evaluar si la recta pasa por el origen de coordenadas determinando si. BI. “b” es significativamente distinta de cero. El test estadístico del coeficiente de. IA. Y. correlación "r" (tr>ttabla) permite determinar si el coeficiente correlación “r” es lo. FA. RM. AC. suficientemente grande para afirmar que hay correlación entre los valores X y Y 8,11.. En el cuadro 2, la ecuación de la recta de las cinco concentraciones (3%, 5%, 10%,. DE. 15% y 20%) de la solución estándar de benzocaína resultó Y = 20,1364 X + 0,4255.. CA. Del análisis estadístico se obtuvó un valor de r = 0,9999; lo cual demuestra que. TE. existe una relación o ligazón existente entre las variables X e Y con una probabilidad. IO. superior al 99,99%. El valor de r2 fue de 0,9999; lo que significa que “a” explica un. BI BL. 99,99% de la varianza total de Y.. En la linealidad del estándar, los límites de confianza de “b” hallados fueron 2,8287 y 37,4440; este intervalo no incluye el cero, en la aplicación del test de “t” el valor hallado de texp = 2,5130 es mayor al ttabla = 2,160; por lo tanto se rechaza la hipótesis nula (H0: b es igual a 0) y se acepta la hipótesis alternativa (Ha: b es diferente de 0); es decir, el valor hallado indica que la probabilidad de ser “b” diferente de 0 es muy elevada (> 99,5%).. 30. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los límites de confianza de “a" hallados fueron de -216,1889 y 217,0399; este intervalo incluye el cero, en el test de “t” el valor obtenido de texp = 0,0042 es menor al ttabla = 2,160; por lo tanto no se rechaza la hipótesis nula (H0: a es igual a 0); es decir, éste valor hallado indica que la probabilidad de ser “a” igual a 0 es alta (superior al 99,5%), lo que significa que “a” en el origen es estadísticamente igual a. IC A. cero.. UI M. En la aplicación del test estadístico del coeficiente de correlación "r", se obtuvó el valor de tr = 307,6225 y ttabla = 2,16; al comparar el “tr” obtenido con el “ttabla” se. O. Q. observó que este último es menor que el primero, con lo cual se rechaza la hipótesis. BI. nula (HO: No hay correlación entre X e Y) y se acepta la hipótesis alternativa (Ha); es. AC. IA. Y. decir, hay una correlación significativa entre los valores X y Y.. RM. En la aplicación del test de linealidad, se determinó el valor promedio de f =. FA. 20,2095; los cuales indican que no existe diferencia significativa entre el valor de “b”. DE. respecto a los valores de “f” hallados de cada determinación. Así también se halló el. TE. CA. valor de RSD = 0,66 %; los cuales cumplen el test de linealidad.. IO. Esto demostró que el método es lineal, en el rango de concentraciones de 3 a 20. BI BL. μg/mL, así mismo se cumple con la ley de Beer - Lambert, existe una relación directamente proporcional entre la absorbancia y la concentración, representada con una recta (Gráfico N°1).. Según la guía ICH, establecen que siempre que el método de análisis se emplee en la determinación de impurezas o trazas de principio activo, es recomendable establecer el límite de detección y el límite de cuantificación. El método basado en la extrapolación de la recta de calibrado a concentración cero, es un procedimiento que 31. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. proporciona datos numéricos y utiliza “b” de una recta de calibrado realizada a niveles de concentración cercanos a los límites esperados 9.. En el cuadro 3, se muestra el límite de detección igual a 0,0331 μg/mL y el límite de cuantificación de 0,0489 μg/mL, valores que se encuentran por debajo del límite de. IC A. limpieza establecido de 9,70 μg/mL; con lo cual se demuestra que el método es realmente capaz de detectar y cuantificar trazas de benzocaína en las superficies de. BI. O. Q. UI M. equipos de fabricación farmacéutica, aún por debajo del valor límite establecido.. Y. El porcentaje de recuperación según la AEFI, puede evaluarse como su nombre lo. IA. menciona mediante la recuperación del analito. El porcentaje de recuperación se. AC. realiza para poder corregir los resultados por un factor calculado al determinar la. RM. cantidad de analito residual real que se recupera de la superficie muestreada y similar. FA. al equipo a muestrear. Asimismo se considera necesario para determinar trazas de analitos de las superficies de equipos utilizar métodos analíticos altamente sensibles. TE. CA. DE. y capaces de detectar concentraciones muy bajas del analito 11,21,24.. IO. Dos métodos de muestreo se consideran aceptables según la organización mundial de. BI BL. la Salud, tales como el muestreo con hisopo o por raspado en superficie y el muestreo por enjuague. El método con hisopo es el más utilizado y consiste en el uso de hisopos con los cuales se frota en forma horizontal, vertical y diagonal (en ambas direcciones) las superficies de los puntos críticos considerados en los equipos de fabricación farmacéutica, se debe tener en cuenta que el material de muestreo no interfiera en los resultados, por tanto debido al empleo de fuerzas físicas así como el análisis químico se considera necesario evaluar la eficacia del método analítico mediante la determinación del porcentaje de recuperación 7,10, 22,23.. 32. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En el cuadro 4, el porcentaje de recuperación promedio obtenido usando el equipo Agilent Techologies VWD 1200 (celda de flujo estándar de 10 mm de paso óptico) fue de 76,05 % del principio activo de benzocaína y de 75,50% utilizando el equipo Agilent Techologies VWD 1260 (celda de flujo de alta sensibilidad de 60 mm de paso óptico), encontrándose ambos valores dentro los límites de aceptación (> 50 < 89%). Se consideró necesario realizar el análisis cromatográfico en equipos con. IC A. diferentes celdas de paso óptico con la finalidad de comprobar que se obtienen resultados similares; lo que hace más seguro el parámetro de validación, aunque cabe. UI M. resaltar que el equipo con una celda de 60 mm demostró ser más sensible que el. IA. Y. BI. O. comparar las alturas obtenidas por ambos equipos.. Q. equipo con celda de paso de 10 mm, como se puede mostrar en el Anexo 7 al. AC. Por todo lo mencionado anteriormente se considera que el método analítico para la. RM. determinación de trazas de benzocaína por HPLC en las superficies de un equipo de. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. fabricación farmacéutica es válido y confiable.. 33. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V.. CONCLUSIONES. 1. El método analítico desarrollado para la determinación de trazas de benzocaína en las superficies de un equipo de fabricación farmacéutica por cromatografía líquida de alta resolución, cumple con los parámetros de. IC A. validación (Selectividad, Linealidad, Límite de detección, Límite de cuantificación y Porcentaje de recuperación) considerados por la. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. organización Mundial de la Salud.. 34. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(44) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. 1. Buenas prácticas de fabricación para establecimientos de la industria químico farmacéutica dedicados a la fabricación de medicamentos - Norma Oficial Mexicana NOM-059-SSA1-2006 (modifica a la NOM-059-SSA1-1993,. 2012]. IC A. publicada el 31 de julio de 1998) [Sede Web] 2008. [acceso 05 de Julio del México.. Disponible. en:. UI M. http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/164ssa18.html. O. Q. 2. Klinkenberg R, Streel B, Ceccato U. Desarrollo y validación de un método de. BI. cromatografía líquida para la determinación de residuos de amlodipino sobre. IA. Y. las superficies del equipo de fabricación. Revista de análisis farmacéutico y. AC. análisis [revista en internet] 2003. [acceso 05 de julio del 2012]; 32 (2).. RM. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12763545. FA. 3. Ministerio de Salud. Manual de Buenas Prácticas de Manufactura de. DE. Productos Farmacéuticos. Informe de la Dirección General de Medicamentos,. CA. Insumos y Drogas: DIGEMID. 1999. Pag. 19-20, 26.. TE. 4. Arayne MS, Sultana N, Sajid SS, Ali SS. Validación de la limpieza de. IO. ofloxacino en el equipo fabricación de productos farmacéuticos y la. BI BL. validación de método HPLC deseada. PDA Revista de ciencia y tecnología farmacéutica [revista en internet] 2008. [acceso 06 de julio del 2012]; 62 (5). Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19055231. 5. Martínez L, García L, Pérez N y Chang A. Determinación de trazas de lidocaína y epinefrina en el procedo de limpieza posterior a la fabricación de carpules. Revista cubana farmacéutica [revista en internet] 2008. [acceso 06 de. julio. del. 2012];. 35(2).. Disponible. en:. http://bvs.sld.cu/revistas/far/vol35_2_01/far04201.pdf. 35. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
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