• No se han encontrado resultados

Efecto de cuatro concentraciones de cobre sobre el crecimiento y la supervivencia de un consorcio microbiano nativo biolixiviador en condiciones de laboratorio

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2020

Share "Efecto de cuatro concentraciones de cobre sobre el crecimiento y la supervivencia de un consorcio microbiano nativo biolixiviador en condiciones de laboratorio"

Copied!
87
0
0

Texto completo

(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Ciencias Biológicas. N. Escuela Académico Profesional de. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. Microbiología y Parasitología. RM ÁT. Tesis de Investigación. IN FO. Efecto de cuatro concentraciones de cobre sobre el crecimiento y la supervivencia de un consorcio microbiano. AS. DE. nativo biolixiviador en condiciones de laboratorio. EM. Para obtener el Título Profesional de. DE. SI. ST. Biólogo - Microbiólogo. Asesor: Dr. Heber Max Robles Castillo. DI. RE CC IO. N. Autor: Br. Omar Daniel Pairazamán Quiroz. Trujillo – Perú 2012. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO. AC IÓ. N. Dr. Orlando Velásquez Benites. M UN. IC. RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. RM ÁT. IC. A. Y. VICERECTORA ACADÉMICA. CO. Dra. Vilma Julia Méndez Gil. Dr. Regne Cortez Lara. DE. IN FO. SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. AS. Dr. Hermes Escalante Añorga. DE. SI. ST. EM. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. Dr. César Augusto Jara Campos. Ms. C. Pedro Alvarado Salinas. DI. RE CC IO. N. SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIAS.  En primer lugar dedicar este trabajo a Dios, ya que a través de Él, he podido. AC IÓ. N. culminar con satisfacción me tesis, y sé que con su ayuda y su bendición todo se puede.. M UN. IC.  A mi madre Doris con todo mi corazón, por ser ella la que contra viento y marea, contra todos los problemas fue valiente para apoyarme y sacarme adelante.. Y. CO.  A mi padre Salvador, que a pesar de que no se encuentre físicamente conmigo,. A. siempre está en mi corazón.. RM ÁT. IC.  A mis familiares por apoyarme siempre de una u otra manera e impulsarme a salir. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. adelante.. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTO. A la Universidad Nacional de Trujillo ya mi asesor de tesis el Dr. Heber Max Robles. AC IÓ. N. Castillo por brindarme la oportunidad de realizar mi trabajo en el Laboratorio de. IC. Biotecnología y por sus asesoramientos y consejos.. M UN. Al Dr. Mario Esparza Mantilla por su interés en mi persona, apoyándome con sus. CO. consejos, experiencias y conocimientos. Por brindarme la confianza de trabajar con él y. la. Dra.. Eva. Elizabeth Villanueva. Tarazona. RM ÁT. A. IC. A. Y. aprender del mundo de la ciencia.. por. apoyarme. sincera. y. IN FO. desinteresadamente, y que con sus buenos consejos han contribuido en mi formación. DE. académica y en esta obra.. EM. AS. A Mblo. Silvia Valdés Anco, por su contribución en este trabajo.. SI. ST. A la profesora Dra. Manuela Lujan por su gentileza y amabilidad, y que en momentos. RE CC IO. N. DE. difíciles pudo ayudarme a salir de algunos problemas.. A Mily, por siempre apoyarme y animarme a salir adelante.. DI. Además, quisiera agradecer desde lo más profundo de mi corazón a todas y cada una de las personas que han hecho posible la realización de este trabajo.. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. AC IÓ. N. Señores Miembros del Jurados: En cumplimiento con las disposiciones vigentes emanadas del Reglamento de Grados y. IC. títulos de la Facultad de Ciencias biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo,. M UN. someto a vuestra consideración, el presente informe de Tesis titulado: Efecto de cuatro concentraciones de cobre sobre el crecimiento y la supervivencia de un consorcio. CO. microbiano nativo biolixiviador en condiciones de laboratorio.. Y. Esperando que los miembros del jurado se sirvan calificar este trabajo según su criterio. Trujillo, Octubre del 2012. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. establecido.. DI. RE CC IO. N. Br. Pairazamán Quiroz Omar Daniel. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MIEMBROS DEL JURADO. Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido ejecutada en. AC IÓ. N. concordancia con las normas de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y. Y. ___________________________. CO. M UN. IC. Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.. DE. IN FO. RM ÁT. PRESIDENTE. IC. A. Dra. Eva Elizabeth Villanueva Tarazona. AS. __________________________. SECRETARIO. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. Dr. Juan Guevara González. ___________________________ Dr. Heber Max Robles Castillo VOCAL. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN. Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Examinador, declaran que el presente Informe de Tesis titulado: “Efecto de cuatro concentraciones de cobre sobre el. AC IÓ. N. crecimiento y la supervivencia de un consorcio microbiano nativo biolixiviador en condiciones de laboratorio”, ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales,. Y. CO. M UN. IC. siendo APROBADO por UNANIMIDAD.. DE. IN FO. RM ÁT. PRESIDENTE. IC. A. ___________________________. SECRETARIO. ___________________________ VOCAL. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. __________________________. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEL ASESOR. El que suscribe, profesor asesor de la tesis titulada: “Efecto de cuatro concentraciones de cobre sobre el crecimiento y la supervivencia de un consorcio microbiano nativo. AC IÓ. N. biolixiviador en condiciones de laboratorio”. IC. CERTIFICA:. M UN. Que ésta ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad de. CO. Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad. Y. con su correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado acogiendo las. RM ÁT. IC. A. observaciones y sugerencias alcanzadas.. Por lo tanto, autorizo a Omar Daniel Pairazamán Quiroz, continuar con el trámite del. IN FO. reglamento correspondiente.. ST. EM. AS. DE. Trujillo, octubre del 2012.. DE. SI. ----------------------------------------. N. Dr. Heber Max Robles Castillo. DI. RE CC IO. ASESOR. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Índice Pág.. AC IÓ. N. Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo………………………………ii. IC. Dedicatoria…………………………………………………………………………iii. M UN. Agradecimiento………………………………………………………….....……... iv. CO. Presentación…………………………………………………....……….….…….. v. IC. A. Y. Miembros del jurado……………………………………………………………..vi. RM ÁT. Aprobación……………………………………………………………………….vii. IN FO. Del asesor……………………………………………………………..…………viii. DE. Resumen……………………………………………………………….…….……vii. EM. AS. Abstract…………………………………………………………..…...…………..viii. ST. 1. INTRODUCCIÓN…………………………………...………….……..……...15. DE. SI. 2. MATERIAL Y MÉTODO…………………………………..…….….……....24. RE CC IO. N. 2.1. Material biológico…………………………………………….………..….24 2.2. Métodos……………………………………………………………….….24. DI. 2.2.1 Características del consorcio bacteriano nativo 2.2.1.1 Morfología y coloración Gram………………………………..24 2.2.1.2 Crecimiento en 9K-Fe2+………………………………………24 2.2.2 Biorreactores y sistema de incubación. 2.2.2.1. Diseño y construcción de biorreactores………………..…24. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.2.2.2. Reactivación y propagación del consorcio bacteriano nativo…...……………………………………….………..25 Estandarización del inóculo................................................25. 2.2.2.4. Esterilización, acondicionamiento de los biorreactores e. N. 2.2.2.3. AC IÓ. inoculación…………………… …………………………26. Monitoreo ………………………………………………..27. 2.2.2.6. Análisis de datos…………………………………………28. M UN. Análisis molecular. CO. 2.2.3. IC. 2.2.2.5. Extracción de ADN genómico de los microorganismos. Y. 2.2.3.1. IC. A. presentes en el consorcio bacteriano nativo………………28 Amplificación del gen que codifique para el ARNr 16S. RM ÁT. 2.2.3.2. IN FO. empleando la técnica del PCR……………………………29 2.2.3.3. Evaluación del gen ARN 16S mediante electroforesis en gel. DE. de agarosa al 1%.................................................................29. EM. AS. 3. RESULTADOS. ST. 3.1 Curvas de crecimiento del consorcio microbiano nativo biolixiviador…..33. SI. 3.2 Velocidad específica de crecimiento del consorcio microbiano nativo sin. DE. exposición y expuesto del sulfato de cobre …………………..…...…….34. RE CC IO. N. 3.3 Análisis estadístico del Test ANOVA……………...…..……………...…35 3.4 Análisis post estadístico. Prueba de HSD de Tukey……………………..36. DI. 3.5 Electrofotograma del ADN metagenómico extraído del consorcio microbiano nativo, expuesto a diferentes concentraciones de sulfato de cobre……………………………….…………………………………….37. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 3.6 Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de amplificación por PCR, del consorcio microbiano nativo expuesto a diferentes concentraciones de sulfato de cobre……………………….……………..38. N. 3.7 Características morfológicas de los microorganismos del consorcio. AC IÓ. microbiano nativo, vistas al microscopio..………...……………………..39. IC. 3.8 Fotos de los microorganismos del consorcio biolixiviador teñidos con la. M UN. técnica de tinción Gram vistas a inmersión. …..…………………………40. CO. 3.9 Tiempo de reactivación del consorcio luego de ser expuesto a diferentes. A. Y. concentraciones de sulfato de cobre……………………………………...41. RM ÁT. IC. 4. DISCUSIÓN…………………………………………………………………...42. IN FO. 5. ENUNCIADO RESUMEN……………………………...………….…………49. DE. 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………50 ANEXOS. EM. AS. Anexo 01. Diseño de biorreactor.. ST. Anexo 02. Dispositivos usados en la construcción de biorreactores.. SI. Anexo 03. Biorreactores cilíndricos aireados y agitados de 1 litro de capacidad.. DE. Anexo 04. Filas con solución de sulfato de cobre 1M y sulfato de cobre en sal.. RE CC IO. N. Anexo 05.Cálculos realizados en la preparación de los medios de cultivo 9K Fe más cobre en los 4 biorreactores en la primera repetición.. DI. Anexo 06. Cálculos realizados en la preparación de los medios de cultivo 9K Fe más cobre en los 4 biorreactores en la segunda repetición.. Anexo 07. Cálculos realizados en la preparación de los medios de cultivo 9K Fe más cobre en los 4 biorreactores en la tercera repetición. Anexo 08. Protocolo de extracción de ADN Mobio.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 09. Set de oligonucleótidos (PCR multiplex biolixiviantes). Anexo 10. Composición de Master mix, Mix taq, Power mix. Programa de PCR MULTIPLEX.. AC IÓ. N. Anexo 11. Composición y preparación de TAE 50X Y 10X. Anexo 12. Recuento celular del consorcio microbiano nativo y concentraciones. IC. de cobre (primera repetición).. M UN. Anexo 13. Recuento celular del consorcio microbiano nativo y concentraciones. CO. de cobre (segunda repetición).. IC. de cobre (tercera repetición).. A. Y. Anexo 14. Recuento celular del consorcio microbiano nativo y concentraciones. RM ÁT. Anexo 15. Promedio del recuento celular del consorcio microbiano nativo. IN FO. biolixiviador. Anexo 16. Resultado del análisis por espectrofotometría de absorción Atómica. DE. Anexo 17. Protocolo de determinación de cobre por espectrofotometría de. AS. absorción Atómica.. EM. Anexo 18. Crecimiento in vitro por superficie del consorcio microbiano nativo. SI. ST. expuesto a 200, 400, 600 y 800mM de cobre en agar nutritivo, y. DE. observaciones microscópicas. RE CC IO. N. Anexo 19. Crecimiento in vitro por incorporación del consorcio microbiano nativo en agar nutritivo, y observaciones microscópicas. DI. Anexo 20. Crecimiento in vitro por puntura del consorcio microbiano nativo expuesto a 200, 400, 600 y 800mM de cobre en agar sabouraud, y observaciones microscópicas Anexo 21. Composición y preparación de los medios de cultivo.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN. El objetivo de la presente investigación fue determinar el efecto de cuatro. N. concentraciones de sulfato de cobre sobre el crecimiento de un consorcio biolixiviante. AC IÓ. aislado de efluentes de relaves mineros. Para ello se expuso el consorcio microbiano. IC. nativo frente a 200, 400, 600 y 800mM de cobre. Utilizando biorreactores cilíndricos de. M UN. 1L de capacidad. A cada biorreactor se adicionó 250ml del inóculo previamente. CO. estandarizado, además de medio 9K-Fe+2 y luego se adicionó el sulfato de cobre. El. Y. ensayo se realizó por triplicado. El monitoreo se realizó cada 8 horas durante 96 horas;. IC. A. se extrajeron muestras de los cuatro biorreactores y se determinó el número total de. RM ÁT. bacterias en cel/mL, en cámara de recuento celular y la concentración de cobre se. IN FO. determinó por espectrofotometría de absorción atómica. Para la caracterización molecular, se tomaron muestra de cada biorreactor, se les hizo desarrollar en medio 9K-. DE. Fe para potenciar el crecimiento de los microorganismos resistentes al cobre. A partir de. AS. estas muestras se purificó el ADN total del consorcio y se analizó las zonas conservadas. EM. de la región del ADN16S mediante desoxioligonucleotidos o primers específicos. Los. SI. ST. resultados de resistencia al cobre se evaluaron por análisis de varianza con un nivel de. DI. RE CC IO. N. DE. significancia de 95%.. xiii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT. The aim of this investigation was to determine the effect of different. AC IÓ. N. concentrations of copper sulfate on the growth of a consortium isolated biolixiviante tailings effluent. This exposed the native microbial consortium against 200, 400, 600. IC. and 800mm copper. Using cylindrical bioreactors 1L capacity. Each bioreactor was. M UN. added 250ml of inoculum previously standardized, and 9K medium-Fe +2 and then. CO. added copper sulfate. The assay was performed in triplicate. The monitoring is. Y. performed every 8 hours for 96 hours, samples were extracted and the four bioreactor. IC. A. was determined the total number of bacteria cells / mL, cell counting chamber and the. RM ÁT. copper concentration was determined by atomic absorption spectrophotometry. For. IN FO. molecular characterization, samples were taken from each bioreactor, were asked to develop amid 9K-Fe for growth of microorganisms resistant to copper. From these. DE. samples Total DNA was purified and analyzed consortium conserved areas ADN16S. AS. region through deoxyoligonucleotides or specific primers. The copper resistance results. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. were evaluated by analysis of variance with a significance level of 95%.. xiv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. I.. INTRODUCCIÓN. Como se sabe desde la antigüedad el cobre ha demostrado ser un gran. AC IÓ. N. antimicrobiano. Antes que se reconociera la existencia de microorganismos, los antiguos egipcios, griegos, romanos y aztecas usaron compuestos de cobre para el. IC. tratamiento de enfermedades y con fines de higiene. Los egipcios usaron cobre como. M UN. agente esterilizante para el agua potable y para tratar heridas. El médico griego. CO. Hipócrates trataba heridas abiertas e irritaciones cutáneas con cobre. También los. Y. romanos, aztecas, persas e indios usaron cobre como parte de preparaciones médicas.. IC. A. Años después en el siglo XVIII, por accidente, el uso del cobre se extendió y se aplicó. RM ÁT. como agente fungicida en agricultura, al descubrirse que el tratamiento de semillas en. IN FO. soluciones de sulfato de cobre inhibía el crecimiento de hongos. Ensayos con diferentes mezclas de cobre revelaron que pequeñas cantidades del metal podían prevenir el. AS. DE. desarrollo de muchas enfermedades de plantas1.. EM. Hoy en día, los usos antimicrobianos del cobre se han expandido para incluir. SI. ST. medicinas antimicrobianas, productos de higiene oral, aparatos de higiene médica,. DE. antisépticos, artículos para limpieza de cocina, textiles antimicrobianos y pinturas anti-. N. incrustantes que reducen las poblaciones bacterianas de Staphylococcus aureus,. RE CC IO. Streptococcus faecalis, Escherichia coli, y Pseudomonas aeruginosa en un 99,9975% en 24 horas 1. Inclusive en Chile, existe un hospital de cobre “Dr. Salvador Allende”, en. DI. el que sus instrumentos están fabricados de cobre. Con esta iniciativa se ha logrado reducir de manera considerable las infecciones intrahospitalarias2.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. El cobre, como se ha visto, es un antimicrobiano muy efectivo, pero por otra parte existen microorganismos que pueden tolerar cantidades considerables de este metal y es de mucho interés ya que su aplicación en tareas de biolixiviacion seria de. IC. biotecnológica para la extracción de metales de una manera limpia.. AC IÓ. N. mucha relevancia. Mayores estudios y un buen manejo sería una buena herramienta. M UN. La problemática actual de la minería es extraer al máximo los metales. 3, 4, 5. .La biotecnología en el sector minero metalúrgico, ha sido. Y. medio ambiente. CO. contenidos en diferentes tipos de minerales de una manera limpia y sin contaminar el. IC. A. utilizada como una herramienta en el estudio de microorganismos empleados en la. RM ÁT. disolución y recuperación de los valores metálicos contenidos en las minas6, lo que. IN FO. hace que los valores metálicos puedan ser extraídos mediante lixiviación utilizando microorganismos y cuando se utilizan bacterias se denomina lixiviación bacteriana o. DE. biolixiviación7. Mayormente, los procesos bacterianos han sido empleados en la. AS. lixiviación del cobre y en el mejoramiento de la extracción de metales preciosos. EM. contenidos en sulfuros refractario 6, es por esta razón que los microorganismos tienen. SI. ST. un rol predominante en la solubilización, transporte y deposición de metales y. N. DE. minerales en el medio ambiente 8 y 9.. RE CC IO. La lixiviación bacteriana es una lixiviación química asistida por las bacterias. como catalizadores, por convención la lixiviación bacteriana ha sido clasificada en. DI. directa o indirecta. La primera ocurre por el ataque enzimático de las bacterias sobre los componentes del mineral que son susceptibles a la oxidación; los electrones liberados por la oxidación son transportados a través del sistema proteico de la membrana celular y de allí a los átomos de oxígeno en microorganismos aeróbicos. En el segundo caso no 2. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ocurre un ataque frontal de la bacteria sobre la estructura atómica del mineral, en su lugar la bacteria oxida el hierro ferroso a hierro férrico y a su vez a sulfato férrico, que es un poderoso oxidante que reacciona con los metales transformándolos a una forma. AC IÓ. N. soluble 10.. IC. Uno de los impedimentos de la lixiviación bacteriana ha sido la lentitud del. M UN. proceso, debido esencialmente a que las bacterias, están sometidas a los embates del. a temperatura extremadamente bajas y. Y. particularmente los iones Ag, Hg, Mn,. CO. medio ambiente y son particularmente sensibles a la presencia de metales pesados,. IC. A. temperaturas muy elevadas que se dan por reacciones exotérmicas dentro de la pila de. RM ÁT. biolixiviación. La biolixiviación es más sencilla para las especies nativas que siempre. IN FO. estén presentes en los depósitos, pero como éstas no se reproducen en gran escala es necesario preparar cepas artificiales, con las características de las nativas y que son. AS. DE. finalmente las bacterias que se regarán sobre el material a lixiviar 10.. EM. En Chile en el 2007, la constante y creciente actividad minera no sólo generó un. SI. ST. importante beneficio de divisas y desarrollo tecnológico, sino que además, ocasionó. DE. una constante contaminación de los recursos hídricos a donde se derivan sus relaves,. N. originando la formación de aguas ácidas. Es quizá el drenaje ácido de mina uno de los. RE CC IO. más graves, por su naturaleza, extensión y dificultad de resolución. Los ríos y acuíferos se ven afectados además de la acidez, por el alto contenido en sulfatos y metales. DI. pesados de sus sedimentos11.. Estos drenajes ácidos de minas son el resultado de las aguas ácidas que se generan por reacción del agua, tanto superficial como subterránea, con minerales. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. sulfurados que están presentes en el interior de las rocas asociados con diferentes metales, por un proceso de oxidación, en el que se produce ácido sulfúrico; entre los efectos específicos de la acidificación de los cursos de agua se encuentran la. AC IÓ. N. interrupción del crecimiento y reproducción de fauna y flora acuática, daño a los ecosistemas (cadenas tróficas, comunidades, otros), en algunos casos contaminación de. IC. las fuentes de agua potable, y efectos corrosivos en las bases de los puentes11, pero se. M UN. han encontrado microorganismos que sobreviven en estas condiciones y que pueden. CO. ayudar en las labores de extracción de metales de una manera biológica y sin. IC. A. Y. contaminación.. RM ÁT. A finales del siglo XIX Winogradsky describió un grupo de bacterias de. IN FO. diversos ambientes: suelo, agua y mina, que crecen por oxidación de minerales con azufre, hierro, cobre, cobalto, níquel y otros metales12. Estas bacterias realizan la. DE. lixiviación bacteriana de manera natural13 y se caracterizan por ser autótrofas, aeróbicas 16. AS. mesófilas14 y quimiosintéticas15,. . Todas estas características les confieren la. EM. clasificación de bacterias quimilitoautotróficas ferro-sulfo oxidantes14, 16, 17. Uno de sus. SI. ST. principales exponentes es la bacteria Acidithiobacillus ferrooxidans o también llamada. DE. Thiobacillus ferrooxidans, aislada por primera vez a partir de aguas de una mina de 15, 18. . Esta fue la primera bacteria identificada capaz de lixiviar el. N. carbón en 1947. RE CC IO. cobre, sin embargo, hasta la fecha se han identificado otros géneros que realizan esta misma acción15; entre las cuales encontramos a. A. thioxidans y Leptobacillus. DI. ferroxidans19, bacterias del género Acidiphilium20 y Leptospirillum21 que se encuentran juntas en consorcio. Lamentablemente hay poca información sobre los consorcios bacterianos nativos biolixiviantes, es por ese motivo que hablaremos de las bacterias más importantes. 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. A. ferrooxidans son unos bacilos, gramnegativos de 0.5 a 1.7 µ; algunas cepas tienen flagelos, son quimioautotróficos, capaces de oxidar compuestos inorgánicos como los iones de hierro (Fe+2) y azufre, los que les sirven de fuente primaria de. AC IÓ. N. energía. El carbono lo obtienen por fijación de CO2, de manera similar a las plantas verdes (ciclo de Calvin - Benson). Son aerobios, acidófilos en rangos de pH que varían 16, 11, 22, 23. . Dichos Acidithiobacillus son mesófilos (temperaturas que. IC. entre 1.5 a 2.5. CO. M UN. oscilan entre 25-35)24, 21.. Y. A. ferrooxidans, posee dos sitios de transferencia de electrones en la célula, uno. IC. A. para el sistema de oxidación del azufre y otro para hierro localizados en sitios distintos. RM ÁT. de la membrana celular. La enzima ferrooxidante clave parece ser la citocromo c-Fe+2. IN FO. óxido reductasa; en el proceso también intervienen la coenzima Q y el citocromo a, quienes realizan el transporte de electrones. De otro lado el mecanismo de la oxidación. DE. de azufre requiere de sulfito (SO3-2) como molécula intermediaria. La energía. AS. producida de la oxidación de sulfito a sulfato involucra a las enzimas sulfito oxidasa,. EM. ADP sulfurilasa, APS reductasa, y adenilato quinasa13. En ausencia de oxígeno T.. SI. ST. ferrooxidans es susceptible al crecimiento sobre compuestos reducidos de azufre. N. DE. usando iones férricos como una alternativa de receptor de electrones 19.. RE CC IO. La bacteria A. thiooxidans es frecuentemente asociada a minerales sulfurados y. que participa directa o indirectamente en los procesos de solubilización de metales a. DI. partir de minerales junto a otros microorganismos 22. Esta bacteria es capaz de catalizar. la oxidación de compuestos inorgánicos reducidos de azufre utilizando el oxígeno como último aceptor de electrones. Cuando el azufre elemental es el sustrato utilizado por este microorganismo. 25, 26. . La contribución más importante de esta bacteria es la. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. solubilización de metales especialmente cuando estos se encuentran asociados a especies oxidadas fácilmente atacables por vía ácida. 27, 28. , ya que permite crear las. condiciones ácidas necesarias para el crecimiento de otras bacterias acidófilas 12, mediante la formación de ácido sulfúrico.. AC IÓ. N. 29. IC. Para la identificación de los microorganismos por medios moleculares, se tiene. M UN. que trabajar con el ADN. Este, tiene que ser de buena calidad y tiene que tener buena. CO. cantidad. La amplificación es un proceso realizado en un termociclador, aparato que. Y. permite aumentar y disminuir las temperaturas en cuestiones de segundo, favoreciendo. IC. A. la desnaturalización, alineamiento y alargamiento de las secuencias amplificadas. A. RM ÁT. todo este proceso se le conoce como PCR o “reacción en cadena de la polimerasa”. IN FO. Ahora bien, el PCR multiplex tiene el mismo principio que el PCR convencional ya permite obtener un elevado numero de copias del fragmento a partir de una pequeña. DE. concentración de ADN, con esta técnica es posible el análisis de ciertas regiones de los. AS. genes 16S, 23S y 5S y sólo se diferencia en que se adicionan todos los oligonucleótidos. EM. para que estos puedan reaccionar con las secuencias complementarias del DNA. Uno de. SI. ST. los objetivo de este trabajo está centrado en la amplificación de unos genes altamente. DE. conservados y que evolutivamente contienen zonas que son comunes para. N. microorganismos filogenéticamente semejantes, es por eso que en el genoma de los. RE CC IO. microorganismos se pueden encontrar estas regiones en los genes que codifican para el ARN 16S, que es una subunidad del ARN 30S del ribosoma bacteriano 70S (coeficiente. DI. de sedimentación, en unidades Silberg).. Las condiciones de PCR múltiplex, comprenden la activación de la enzima polimerasa o también llamada Hot Start, este paso es importante para que la enzima se. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. active y pueda cumplir su función,. Esta enzima es aislada de una bacteria termófila llamada Thermus aquaticus es por eso que necesita de elevadas temperaturas para estar activa. El siguiente paso es la desnaturalización, en el que las moléculas de DNA se. AC IÓ. N. separan y es posible que los primers puedan acoplarse, a este paso se le denomina acoplamiento y la Taq polimerasa una vez activada puede realizar el alargamiento, que. IC. es en sí la síntesis de las nuevas cadenas de DNA. Todo este proceso se repite de 30 a. CO. M UN. 45 veces o también llamados ciclos.. Y. A continuación se nombran otros microorganismos que han sido recientemente. IC. A. identificados y que se encuentran al igual que las bacterias del género Acidithiobacillus. RM ÁT. en zonas mineras y que también pueden realizar biolixiviación y presumiblemente se. IN FO. encuentran dentro de los consorcios biolixiviantes naturales en zonas mineras: Acidimicrobium ferrooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans, Leptospirillum. metallicus,. acidarmanus,. Sulfobacillus. AS. Sulfolobus. Ferrooplasma. DE. ferrooxidans,. Sulfobacillus. montserratensis,. thermosulfidooxidans,. Acidithiobacillus. caldus,. EM. Thiobacillus prosperus, Metallosphaera sedula, Thiomonas cuprina y Acidianus. DE. SI. ST. infemus30.. N. La calcopirita (CuFeS2) es la fuente mineral de cobre más importante por su. RE CC IO. abundancia en yacimientos de sulfuros polimetálicos. Este mineral se concentra por flotación antes de la extracción del Cu por fundición, donde se separa de Fe, S y otras. DI. impurezas 31. La fundición de sulfuros es ahora considerada como contaminante y poco competitiva. Por lo tanto, se requieren procesos que minimicen el impacto ambiental y reduzcan los costos, por lo que la biolixiviación de concentrados de calcopirita es considerada como una opción para la extracción de Cu32.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La lixiviación bacteriana es el reto más importante en el futuro de la Metalurgia y la conservación del medio ambiente, ya que los métodos tradicionales de recuperación de metales deberán dar paso a métodos no contaminantes y la. N. biolixiviación es uno de ellos y que debe responder a la exigencia de un mundo. IC. AC IÓ. atribulado que clama por un ambiente cada vez más limpio 12.. M UN. El consorcio bacteriano nativo utilizado en esta investigación, se aplica en. CO. labores de biolixiviación con minerales como la calcopirita; Romero y col. 33 señalan. Y. que la calcopirita contiene 10% a 36 % de cobre. El problema existente es que no se. IC. A. cuenta con información sobre el efecto del cobre a diferentes concentraciones en el. RM ÁT. crecimiento de consorcios bacterianos biolixiviantes, pudiendo estos crecer o inhibir su 34. , At. ferrooxidans; uno de los. IN FO. crecimiento. Según Harvey and Crundwel. microorganismos más importantes en los procesos de biolixiviación, e integrante de los. DE. consorcios bacterianos procedentes de relaves mineros, tiene una resistencia de cobre. AS. de 800 mM, que equivale aproximadamente a 56g Cu+2/L. Otros microorganismos. EM. quimiolitoautotróficos tienen valores cercanos y menores de resistencia al cobre, es por. SI. ST. esta razón que se han tomado como referencia valores cercanos a esta concentración ya. N. DE. que hasta donde se conoce es el que mayor resistencia tiene.. RE CC IO. Los resultados obtenidos permitirán la aplicación del consorcio utilizado en esta. investigación en futuros procesos de biolixiviación con minerales que contengan cobre,. DI. como la calcopirita. Además permitirá conocer a los géneros o especies microbianas que integran el consorcio.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Problema. ¿Cuál es el efecto de 200; 400; 600; 800 mM de cobre sobre el crecimiento y la supervivencia de un consorcio microbiano nativo biolixiviador a 30ºC, a pH 1;5, en. M UN. IC. AC IÓ. N. medio 9K-Fe y a 96 horas?. CO. OBJETIVOS. Determinar el efecto de las diferentes concentraciones de cobre sobre el. RM ÁT. -. IC. A. Y. Objetivo general. condiciones de laboratorio. AS. Determinar la velocidad específica de crecimiento del consorcio microbiano. EM. -. DE. Objetivos específicos. IN FO. crecimiento y la supervivencia del consorcio microbiano nativo biolixiviador en. Identificar a los microorganismos del consorcio microbiano nativo biolixiviador. SI. -. ST. nativo biolixiviador sin exposición al cobre y expuestos al cobre.. DI. RE CC IO. N. DE. que fueron expuestos a las concentraciones de 200, 400, 600, 800mM de cobre.. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. II. MATERIAL Y MÉTODOS. 2.1 Material Biológico. AC IÓ. N. Consorcio microbiano nativo biolixiviador, adquirido del Laboratorio de. IC. hidrometalurgia de la facultad de Ingeniería. M UN. 2.2 Procedimiento. IC. A. 2.2.1.1 Morfología y coloración Gram.. Y. CO. 2.2.1 Características del consorcio bacteriano nativo.. RM ÁT. Se realizaron diversas observaciones en microscopia de. IN FO. contraste de fases y microscopia de luz óptica, también se. DE. realizó la coloración Gram y se observó a 1000A.. AS. 2.2.1.2 Crecimiento en 9K-Fe2+. EM. El consorcio bacteriano nativo se inoculó en medio 9K-Fe2+. DE. SI. ST. líquido 35.. DI. RE CC IO. N. 2.2.2. Biorreactores y sistema de incubación. 2.2.2.1 Diseño y construcción de biorreactores. Se diseñó un biorreactor (Anexo 1) y se construyeron unidades de 1L de capacidad los que fueron construidos utilizando botellas de vidrio de 2L de capacidad.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las botellas fueron cortadas según las dimensiones requeridas y las tapas fueron confeccionadas de jebe microporoso con dispositivo de toma de muestra, además,. AC IÓ. N. en la tapa se instalaron conexiones correspondientes a entrada de las paletas rotatorias y de una fuente de aire. IC. estéril. En el tanque se adosaron cuatro deflectores con las. M UN. medidas correspondientes a las dimensiones de los. CO. biorreactores. Una vez construidos fueron evaluados. RM ÁT. IC. construcción (Anexo 2 y 3).. A. Y. durante 24 horas para realizar correcciones en el diseño y. 2.2.2.2. Reactivación y propagación del consorcio. IN FO. microbiano nativo.. DE. El consorcio microbiano nativo se reactivó en un. AS. biorreactor cilíndrico aireado y agitado de 1L de capacidad. EM. conteniendo 250 mL de consorcio microbiano nativo en. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. 750ml de medio 9K-Fe+2, se incubó a 30 °C +/-2ºC durante 96 horas. El consorcio se reactivó en medio líquido9K-Fe+2, de la. siguiente composición: para 700 mL de solución nutritiva (NH4)2SO4, 3.00 g.; K2HPO4, 0.50 g.; MgSO4 .5 H2O, 0.50g.; KCl, 0.10g.; Ca (NO3)2 0.01g. y para 300 mL de solución energética que contiene FeSO4.7H2O, 50 g. al final se mezclaron las dos soluciones35. Este medio permite. el. crecimiento. de. microorganismos. ferrooxidantes. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.2.2.3. Estandarización del inóculo.. Una vez reactivado y propagado el inóculo, se determinó la presencia de microorganismos mediante microscopia de. AC IÓ. N. contraste de fases y microscopia óptica de luz. Entonces se. IC. realizó el recuento celular para determinar el número de. M UN. bacterias/mL a través de la observación por microscopía de contraste de fases del biorreactor de propagación. El. Y. CO. número de células se estandarizó a 1.80x108. A. biorreactores. e. RM ÁT. inoculación.. de. IC. 2.2.2.4. Acondicionamiento. IN FO. Los biorreactores fueron lavados con detergente y desinfectados con hipoclorito de sodio al 2% durante 24. DE. horas. Cumplido ese tiempo, se enjuagaron con Agua de. AS. caño estéril.. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. A cada biorreactor se le adicionó, 250 mL del inóculo previamente estandarizado, además de medio 9K con el porcentaje de cobre establecido para cada biorreactor, en la forma de sulfato de cobre (Anexo 4). En el Anexo 5, 6 y. 7 se describe detalladamente las composiciones de los medios 9K Fe con cobre para cada biorreactor y en cada repetición. Se utilizó H2SO4 para llevar el pH del medio entre 1 y 2, y se expuso durante 96 h en aireación y agitación utilizando un motor de máquina de coser. El. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ensayo se realizó por triplicado para cada biorreactor y se evaluará a 30ºC +/- 2ºC. Los cinco biorreactores fueron acondicionados en una. AC IÓ. N. incubadora de tecnopor de fabricación casera. La temperatura fue proporcionada por focos de 50 watts. La. IC. temperatura de incubación fue de 30°C +/- 2°C.. M UN. 2.2.2.5.Monitoreo. CO. El monitoreo de las condiciones de los sistemas de. Y. evaluación, se realizó una vez empezada la experiencia y. IC. A. luego cada 8 horas hasta 96 horas El número total de. RM ÁT. bacterias en cámara de recuento celular, utilizando. IN FO. microscopio de contraste de fase; adicionalmente se determinó la concentración de Cu+2 al inicio y al final de la. DE. experiencia. Este metal se determinó por espectrofotometría. AS. de absorción atómica. Además del monitoreo se realizó un. EM. control de la. temperatura y del valor de pH con cinta. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. indicadora.. 2.2.2.6. Análisis de datos Los datos de los recuentos celulares, se organizaron en tablas y gráficas. El análisis estadístico se realizó por análisis de varianza con un nivel de significancia de 95%, para determinar el grado de significancia entre el consorcio sin exposición (control) y el consorcio expuesto a concentraciones de 200, 400, 600 y 800mM de Cu;. 13. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. además de determinar el grado de significancia entre el consorcio expuesto a 200, 400, 600, 800mM Cu. Se utilizó. 2.2.3.. AC IÓ. N. el paquete estadístico SPSS v. 15.. Análisis molecular. IC. Este análisis se realizó para determinar que género o especie. CO. M UN. bacteriana forma parte de este consorcio resistente al cobre.. Extracción de ADN genómico de los microorganismos. Y. 2.2.3.1.. IC. A. presentes en el consorcio bacteriano nativo.. RM ÁT. El ADN genómico fue extraído de los microorganismos que. IN FO. habían proliferado en 500mL del consorcio bacteriano nativo en medio 9K-Fe+2, después de aproximadamente 96. DE. horas a temperatura ambiente y a 120rpm. Luego, mediante. AS. un sistema de filtración al vacío estéril y con un filtro de 0,2. EM. micras de diámetro de poro se filtró 500 mL. El filtro se. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. guardó en un tubo de punta cónica estéril a 4°C hasta su posterior extracción. Luego, el filtro se lavó con agua libre de nucleasas (HPLC) a pH 2, se lo llevó a un volumen de 10 mL y de allí se lo repartió en 10 eppendorff para una primera centrifugación a 1000 rpm por 25 segundos, para extraer los restos de jarosita remanente en el filtro, posteriormente se realizó una segunda centrifugación. a. 5000 rpm por 10 minutos; luego, se concentró el pellet celular en un solo eppendorff. Para la extracción se utilizó. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. un kit de extracción comercial siguiendo las instrucciones del manual (PowerSoil DNA Isolation Kit, MoBio Lac., Inc) (Anexo 8). Amplificación del gen que codifique para el ARNr 16S específicos. para. AC IÓ. N. 2.2.3.2.. microorganismos. biolixiviantes,. M UN. IC. empleando el PCR multiplex.. ACIDO594F/ACIDO1150R;. Y. Acidiphilium. CO. Se utilizó los desoxioligonucleótidos o primers del género. Ferroplasma. IC. A. SULFO170F/SULFO606R;. Sulfobacillus. caldus. RM ÁT. FERROP576F/1391R y para las especies Acidithiobacillus CALD460F/CALD1475R;. Acidithiobacillus. IN FO. ferrooxidans (ver anexo 9) con el fin de detectar la. DE. presencia de estos microorganismos en el consorcio. Para la. AS. amplificación de las secuencias conservadas elegidas se. EM. trabajó con el PCR múltiplex. Se le añadió a los pocillos de. Taq. La composición de los mix se observan en el Anexo 10.. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. PCR: 18,5µl de Power Mix; 1,5µl ADN consorcio; 5µl mix. 2.2.3.3.. Evaluación de los productos de amplificación mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se preparó el gel de agarosa al 1%, se pesó 0,5g de agarosa y se le adicionó 50 ml de solución amortiguadora Tris-ácido acético-EDTA (TAE) al 1X (Anexo 11), se disolvió y se calentó por 90 segundos en horno microondas. Luego se 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. esperó a que la solución no estuviera muy caliente, se vertió en el soporte de electroforesis previamente desinfectado con alcohol de 96°. Se esperó por 10 min aproximadamente para. AC IÓ. N. que la solución gelificara. Posteriormente en los carriles dejados por la peineta se inoculó 20 µl del producto de PCR. IC. multiplex, en el primer carril se le colocó 3µl de marcador. M UN. molecular de 1Kb, este gel debe estar dentro de un volumen. CO. de TAE 1X dentro de la cámara electroforética. Las. Y. condiciones de electroforesis fueron de 100 voltios por 20. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. minutos.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. III.. RESULTADOS. En la Figura 1, se muestra el crecimiento del consorcio microbiano nativo frente a. AC IÓ. N. diferentes concentraciones de cobre. Se observa una disminución considerable hasta las primeras 8 horas y luego se mantiene constante el número de células por el resto del. IC. tiempo de incubación.. M UN. Los resultados obtenidos en la Figura 2, muestran que el consorcio microbiano. CO. nativo biolixiviador sin exposición al cobre tiene una velocidad de crecimiento de. Y. 0.0144h-1 en su curva de crecimiento exponencial. En el consorcio expuesto a 200mM. IC. A. de cobre tiene una velocidad de crecimiento negativo de -0.0142h-1. En el consorcio. RM ÁT. expuesto a 400mM de cobre tiene una velocidad de crecimiento negativo de 0.0013h-1.. IN FO. En el consorcio expuesto a 600mM de cobre tiene una velocidad de crecimiento negativo de -0.0218h-1, En el consorcio expuesto a 800mM de cobre tiene una velocidad. DE. de crecimiento negativo de -0.0043h-1 Estas curvas comprenden desde las 8 a las 96. AS. horas en medio de cultivo 9K-Fe a pH entre 1 y 2, a temperatura de 30 °C, en un. EM. biorreactor cilíndrico aireado y agitado.. SI. ST. En la Tabla 1, se observa el grado de significancia entre el consorcio sin exposición. DE. al cobre con el consorcio expuesto a concentraciones de 200, 400, 600 y 800mM de. N. cobre. Los resultados muestran que existe diferencia significativa (p<0.05).. RE CC IO. En la Tabla 2, se observa el grado de significancia entre todos los grupos del. consorcio microbiano nativo expuesto a concentraciones de 200, 400, 600 y 800mM de. DI. cobre. Los resultados muestran que existe diferencia significativa entre el consorcio expuesto a las concentraciones 200 y 400mM de cobre con el consorcio expuesto a 800mM de cobre.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En la Figura 3, se muestra las bandas de ADN metagenómico de los microorganismos del consorcio que fueron expuestos a diferentes concentraciones de cobre, extraídas utilizando el Kit comercial Mobio. En la Figura, 1 se observa: 1.. AC IÓ. N. Marcador molecular 1 Kb. 2. Control negativo. 3. ADN metagenómico de microorganismos expuestos a 200mM de Cu. 4. ADN metagenómico de. IC. microorganismos expuestos a 400mM de Cu. 5. ADN metagenómico de. M UN. microorganismos expuestos a 600mM de Cu. 6. ADN metagenómico de. CO. microorganismos expuestos a 800mM de Cu. 7. ADN metagenómico del consorcio sin. Y. exposición al cobre.. IC. A. En la figura 4, se observa el resultado de la electroforesis del ADN metagenómico. RM ÁT. del consorcio. En esta figura aparecen tres bandas o amplificaciones de los. IN FO. oligonucleótidos. En los carriles 5 y 6 que corresponden en comparación con el marcador molecular a los a los productos de amplificación de 1000pb y 500pb.. DE. En la tabla 3 se muestran las características morfológicas de los microorganismos. AS. del consorcio microbiano nativo. Dentro del consorcio se encuentran bacterias en forma. EM. de bacilo, espirilos, con bordes redondeados, con movimiento y sin movimiento.. SI. ST. En la figura 5 se aprecia la reacción de los microorganismos, expuestos a diferentes. DE. concentraciones de cobre, a la técnica de coloración gram. Se observan bacterias. N. grampositivas, bacterias gramnegativas además de células globosas. En la Figura 6, se. RE CC IO. observa el tiempo que le llevó al consorcio microbiano nativo, lograr una oxidación completa del ion ferroso dentro del medio 9K Fe después que estos microorganismos. DI. fueron expuestos al cobre. Para su determinación se tomó 2,5 ml de muestra y se adicionó en 97,5ml de 9K-Fe a pH 1,6 a 150 RPM.. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 1.90E+01. AC IÓ. N. 1.85E+01. M UN. IC. 1.80E+01. 1.75E+01. Y. CO. 1.70E+01. IC. A. 1.65E+01. 1.60E+01 8. 16. 24. 32. 40. RM ÁT. Log N del promedio de los recuentos celulares. 1.95E+01. 48. 56. 64. 72. 80. 88. 96. 200mM Cu. 400mM Cu. 600mM Cu. 800mMCu. ST. EM. AS. DE. 0mM Cu. IN FO. Tiempo (h). SI. Figura 1. Curva de crecimiento de un consorcio microbiano nativo biolixiviador,. DE. aislado de relave minero, a diferentes concentraciones de sulfato de cobre,. RE CC IO. N. durante 96 horas de incubación a 30°C +/- 2°C, en medio 9K Fe a pH entre. DI. 1y 2, en condiciones de laboratorio.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) 1.82E+01. 1.93E+01. y = 0.0144x + 19.128. 1.91E+01 1.91E+01 1.90E+01 1.90E+01. 1.77E+01. 1.76E+01. DE. 1.76E+01. IC. M UN. 1.77E+01 1.76E+01. y = -0.0218x + 17.874. 1.75E+01 1.74E+01. IC. 1.73E+01 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 Tiempo (h) 600mM Cu. Lineal (600mM Cu). e. 1.75E+01 1.75E+01. y = -0.0043x + 17.522. 1.74E+01 1.74E+01. EM. ST. 1.78E+01. 1.73E+01 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 Tiempo (h) 800mMCu. Lineal (800mMCu). DE. SI. 1.79E+01. IN FO. Lineal (400mM Cu) Log N del promedio del recuento del consorcio expuesto a 800Mm de cobre. 400mM Cu. 1.79E+01. RM ÁT. Tiempo (h). 1.79E+01. CO. Log N del promedio del recuento del consorcio expuesto a 600Mm de cobre. y = 0.0013x + 17.936. 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96. y = -0.0142x + 18.175. 1.80E+01. 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 Tiempo (h) 200mM Cu Lineal (200mM Cu). c 1.81E+01 1.80E+01 1.80E+01 1.79E+01 1.79E+01 1.78E+01 1.78E+01 1.77E+01. 1.80E+01. AS. Log N del promedio del recuento del consorcio expuesto a 400Mm de cobre. 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 Tiempo (h) 0mM Cu Lineal (0mM Cu). 1.81E+01. Y. 1.92E+01. 1.81E+01. A. 1.92E+01. b. 1.82E+01. N. 1.93E+01. AC IÓ. a. 1.94E+01. Log N del promedio del recuento del consorcio expuesrto a 200mM. Log N del promedio del recuento sin exposicion al cobre. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. Figura 2. Velocidad específica de crecimiento del consorcio microbiano nativo. a:. RE CC IO. consorcio sin exposición al cobre. b: consorcio expuesto a 200mM de cobre. c: Consorcio expuesto a 400 mM de cobre. d: consorcio expuesto a 600mM. DI. de cobre. e: consorcio expuesto a 800mM de cobre. Tomado entre las 8 y 96 horas.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.. d.

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC IÓ IC. M UN. .346 .005 .497 .020. 70.846. .000. .000. 25.427. .693 .003. 249.369. .000. P < 0.05. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. 800. Sig. .000. CO. 600. F 59.308. Y. 400. Media cuadrática .264 .004. A. 200. gl 3 9 12 3 9 12 3 9 12 3 9 12. IC. Inter-grupos Intra-grupos Total Inter-grupos Intra-grupos Total Inter-grupos Intra-grupos Total Inter-grupos Intra-grupos Total. Suma de cuadrados .791 .040 .831 1.039 .044 1.083 1.492 .176 1.668 2.078 .025 2.103. RM ÁT. Concentración de cobre (Mm Cu). N. Tabla 1. Análisis estadístico del Test ANOVA. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. -.33077 -.19231 .20769. .064 .517 .439. .12189 .12189 .12189. -1.58462(*). .12189. .000. -.53846(*) -.40000(*) -.20769. .12189 .12189 .12189. .000 .014 .439. DE. 200 400 600. N. .000. AC IÓ. .12189. IC. -1.37692(*). Intervalo de confianza al 95% Límite Límite superior inferior .7034 1.3890 .8418 1.5274 1.0341 1.7197 1.2418 1.9274 -1.3890 -.7034 -.2043 .4813 -.0120 .6736 .1957 .8813 -1.5274 -.8418 -.4813 .2043 -.1505 .5351 .0572 .7428 -1.7197 1.0341 -.6736 .0120 -.5351 .1505 -.1351 .5505 -1.9274 1.2418 -.8813 -.1957 -.7428 -.0572 -.5505 .1351. M UN. 400. CO. 800. 200 400 800 0. 200. Límite inferior 1.04615(*) 1.18462(*) 1.37692(*) 1.58462(*) -1.04615(*) .13846 .33077 .53846(*) -1.18462(*) -.13846 .19231 .40000(*). Sig. Límite inferior .000 .000 .000 .000 .000 .787 .064 .000 .000 .787 .517 .014. Y. 600. 200 400 600 800 0 400 600 800 0 200 600 800 0. Error típico Límite superior .12189 .12189 .12189 .12189 .12189 .12189 .12189 .12189 .12189 .12189 .12189 .12189. A. 0. Diferencia de medias (I-J). IC. (J) Concentraciones (mM Cu). IN FO. (I) Concentraciones (mM Cu). RM ÁT. Tabla 2. Análisis estadístico post ANOVA, utilizando la prueba HSD de Tukey. DI. RE CC IO. N. DE. SI. ST. EM. AS. * La diferencia de medias es significativa al nivel .05.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DE. Figura 3. Electrofotograma del ADN metagenómico extraído del consorcio microbiano. DI. RE CC IO. N. nativo, expuesto a diferentes concentraciones de sulfato de cobre.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) SI. ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DE. Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de amplificación. RE CC IO. N. por PCR, del consorcio microbiano nativo expuesto a diferentes concentraciones de sulfato de cobre. 1. Marcador de peso molecular de. DI. 1Kb. 2. Control negativo. 3. Muestra de consorcio en medio 9K más 200mM de cobre. 4. Muestra de consorcio en medio 9K más 400mM de cobre. 5. Muestra de consorcio en medio 9K más 600mM de cobre. 6.. Muestra de consorcio en medio 9K más 800mM de cobre.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 3. Características morfológicas de los microorganismos del consorcio microbiano. 200mM Cu. 400mM Cu. 600mM Cu. Forma. Bacilo,. Bacilo,. células. Bacilo,. espirilo,. espirilo,. globosas. espirilo,. células. células. globosas. globosas. Cantidad. +++++. +++. +++. Tamaño. Grandes y. Grandes y. pequeños. pequeños. Con. Con. movimiento y. movimiento y. sin. sin. CO Y. Pequeños. Con. Con. Con. movimiento. movimiento. movimiento. Presencia. Presencia. Presencia. Presencia. ++. +++. ++++. ++. +++++. Si. Si. Si. Si. Si. RM ÁT. IN FO. DE. movimiento. EM. ST. DE. Movimiento. A. Pequeños. IC. Grandes. SI. Cantidad. globosas +. Presencia. globosas. espirilo. ++. movimiento Células. Bacilo,. células. AS. Movimiento. 800mM Cu. IC. 0mM Cu. M UN. Características. AC IÓ. N. nativo, vistas al microscopio.. DI. RE CC IO. N. +++++: Abundante +++: Regular ++: Poco + Escaso. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) ST. EM. AS. DE. IN FO. RM ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC IÓ. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. SI. Figura 5. Fotos de los microorganismos del consorcio biolixiviador teñidos con la. DE. técnica de tinción Gram vistas a inmersión. A: Bacterias del consorcio. RE CC IO. N. expuestas a 200 mM de Cu. B: Bacterias del consorcio expuestas a 400 mM de Cu. C: Bacterias expuestas a 600mM de Cu. D y E: Bacterias. DI. expuestas a 800 mM de Cu. F1: Microorganismos globosos ramificados; F2: célula globosa. F3: Acúmulo de bacterias protegidas por una biopelícula.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N AC IÓ CO. M UN. IC. 600. IC. A. Y. 400. IN FO. RM ÁT. 200. Consorcio. DE. Consorcio expuesto a diferentes concnetraciones de cobre en mM. 800. 5. 10. EM. AS. 0. 20. Tiempo en días. 200. 400. 600. 800. RE CC IO. N. DE. SI. ST. Consorcio. 15. Figura 6. Tiempo de reactivación del consorcio luego de ser expuesto a diferentes. DI. concentraciones de sulfato de cobre.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IV.. DISCUSIÓN. Las curvas de crecimiento de los consorcios expuestos a diferentes. AC IÓ. N. concentraciones de cobre en la Figura 1, tienen una tendencia negativa, es decir que los microorganismos en vez de crecer o aumentar, han disminuido bruscamente. La curva. IC. del consorcio sin exposición al cobre es ascendente y se determinó su velocidad de. M UN. crecimiento a partir de las 8 horas hasta las 96 horas que es cuando aproximadamente. CO. empieza a mantener una tendencia lineal. La constante de la velocidad de crecimiento. Y. del consorcio24 es de 1,44x10-2 h-1: es decir, 0.0144 bacterias por hora (ver Anexo 12);. IC. A. también se verificó gratamente que el consorcio expuesto a 400mM de cobre tuvo una. RM ÁT. pendiente positiva, dentro de las 8 96 horas; es decir que fue el único que se adaptó más. IN FO. rápido en comparación con las velocidades del crecimiento obtenidas del consorcio expuesto a concentraciones de 200, 600, 800mM de cobre. El lento crecimiento de estos. DE. microorganismos es deducible, ya que utilizan el ion ferroso para oxidarlo y obtener. AS. energía, aunque esta energía es poca, aproximadamente 1 ATP por cada ion ferroso. EM. oxidado24, además de las altas concentraciones de cobre en el medio. Es importante. SI. ST. mencionar que se utilizó biorreactores aerobios y agitados para lograr una mayor. DE. concentración celular y a la vez permitir una mayor transferencia y distribución de los. Anexo13).. RE CC IO. (ver. N. nutrientes a las células Las. 36. . Estos resultados se corroboran con los recuentos celulares concentraciones. de. cobre. fueron. determinadas. por. DI. espectrofotometría de absorción atómica (ver Anexo 14 y 15).. El cobre es un antimicrobiano por excelencia y se ha demostrado por muchos. años su efecto mortal en microorganismos como bacterias y mohos. Cabe señalar que existen mecanismos que brindan cierta resistencia a microorganismos que no tienen mucha importancia en la biominería pero que sirven de modelo para estudiar mejor los. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

Referencias

Documento similar

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú.. ii

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comecial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia,

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons. Compartir bajo la misma licencia versión Internacional. Para ver una copia de dicha licencia,

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú.. Esta obra ha sido publicada bajo la

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia,

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú.. INDICE