Caracterización morfo fisiológica y genética de bacterias marinas de los Manglares de Tumbes, con actividad antibiótica sobre Staphylococcus aureus resistente a meticilina
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(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. RA DO. In meroriam a mi abuela Francisca Guevara Alva por su formación, consejos, cuidados y su gran amor, que permitió que a pesar de que no está. SG. presente materialmente; siempre fue motivo de mi crecimiento académico.. A mis padres Estela, Carmen y Luis por su sacrificio, su cariño, su. PO. protección y apoyo que permitió iniciar este proyecto hoy concluido con esta. DE. tesis y que hace que cada día trate de ser mejor profesional para el servicio. BI B. LI O. TE CA. de la sociedad.. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTO. A Dios, por darme la fuerza necesaria para batallar con el cansancio, pereza y desidia para concluir con mis proyectos.. RA DO. A mis padres Estela, Carmen y Luis por estar siempre presentes para darme una palabra de aliento, esperanza y motivarme cada día de vida.. Al Mg. Mayar Luis Ganoza Yupanqui, por el gran apoyo y asesoramiento del. SG. presente trabajo de investigación.. PO. Al equipo de investigación de la Universidad Nacional de Trujillo: Blgo-Mblgo.. su colaboración y apoyo.. Dr. Till F. Schäberle y MSc. Luis Linares Otoya del Instituto de Biología. TE CA. Al. DE. Lizbeth Armas Mantilla, Ing. Virginia Linares Otoya y Dr. Julio Campos Florián por. Farmacéutica, Universidad de Bonn (Alemania) por los conocimientos impartidos. BI B. LI O. que fueron de mucha ayuda para el presente trabajo.. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. FINANCIAMIENTO. Esta tesis fue financiada por CIENCIATIVA de CONCYTEC Perú, bajo el convenio de adjudicación N˚ 092-2014-FONDECYT-DE, proyecto de investigación básica y. RA DO. aplicada: “Biodiversidad mixobacterial marina del Perú: potencial fuente de. BI B. LI O. TE CA. DE. PO. SG. biomoléculas antibióticas contra patógenos multidrogo resistentes”.. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO. RA DO. Dando cumpliendo con el reglamento de grados de la Escuela de Postgrado de la Universidad Nacional de Trujillo, se pone a vuestra consideración el presente trabajo de tesis intitulado: “Caracterización morfo-fisiológica y genética de bacterias marinas aisladas de los Manglares de Tumbes, con actividad antibiótica. SG. sobre Staphylococcus aureus resistente a meticilina”, con lo cual pretendo optar el. PO. Grado Académico de Maestro en Farmacia y Bioquímica con mención en. TE CA. DE. Farmacología.. BI B. LI O. Trujillo, abril del 2018. VICTORIA GIOVANNA MORILLO RAMOS. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RA DO. JURADO DICTAMINADOR. DE. PO. SG. Dr. Julio Víctor Campos Florián PRESIDENTE. BI B. LI O. TE CA. Dr. Iván Miguel Quispe Díaz SECRETARIO. Ms. Mayar Luis Ganoza Yupanqui ASESOR. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. RESUMEN……………………………………………………………….vii. RA DO. ABSTRACT………………………………………………………………viii INTRODUCCIÓN………………………………………………….1. II.. MATERIAL Y MÉTODO…………………………………………..6. III.. RESULTADOS …………………………………………………...16. IV.. DISCUSIÓN………………………………………………...……..26. V.. CONCLUSIONES…………………………………………………31. VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………….…32. TE CA. DE. PO. SG. I.. BI B. LI O. ANEXOS……………………………………………………………38. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN La investigación se realizó con el objetivo de determinar las características morfofisiológicas y genéticas de bacterias marinas de los Manglares de Tumbes, con actividad antibiótica sobre Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM).. RA DO. Se realizaron tres fases; la primera fase fue recolectar 25 muestras como sedimentos marinos (barro), plantas, conchas, raíces, algas, madera e insectos en los Manglares de Tumbes; la segunda fase fue sembrar y aislar las cepas. SG. marinas por el método de siembra en parches de Escherichia coli XL-1 Blue y Phaeobacter inhibens en agar marino y se determinó su actividad antibiótica. PO. frente a SARM, por método de difusión en disco; la última fase fue determinar las características morfológicas a nivel macroscópico (forma y color), nivel. DE. microscópico (forma, color y tamaño), características fisiológicas por ensayos de salinidad y termorresistencia; así mismo, caracterizarlas genéticamente, por el. TE CA. método basado en el ARNr 16S; identificándose la cepa Streptomyces sp. NPA1, que según morfología macroscópica tiene colonias convexas con crecimiento circular, de color blanco a las 24 horas de incubación y blanco con negro a las 72. LI O. horas, a nivel microscópico es Gram positiva, bacilos con presencia de esporas de 244 µm y según su fisiología es halotolerante y mesófilo. Finalmente, se. BI B. obtuvo la concentración mínima inhibitoria de 1,25 mg/mL para SARM ATCC 43300.. Palabras. Claves:. Caracterización. morfo-fisiológica,. actividad. antibiótica,. Streptomyces sp. NPA1, Staphylococcus aureus resistente a meticilina, Manglares de Tumbes.. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT The research was carried with the objective of determine the morpho-physiological and genetic characteristics of marine bacteria of the Manglares de Tumbes, with antibiotic activity on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Three. RA DO. phases were performed; the first phase was to collect 25 samples such as marine sediments (mud), plants, shells, roots, algae, wood and insects in the Manglares de Tumbes the second phase was to sow and to isolate the marine strains by the. SG. patch planting method of Escherichia coli XL-1 Blue and Phaeobacter inhibens in marine agar and their antibiotic activity was determined against MRSA, by disc. PO. diffusion method; the last phase was to determine the morphological characteristics at the macroscopic level (shape and color), microscopic level color. and. size),. physiological. characteristics. by. salinity. and. DE. (shape,. thermoresistance tests; likewise, by the method based on the 16S rRNA was. TE CA. characterized genetically; identifying the strain Streptomyces sp. NPA1, which according to macroscopic morphology has convex colonies with circular growth, white at 24 hours of incubation and white with black at 72 hours, at the. LI O. microscopic level is Gram positive, bacilli with the presence of spores of 244 μm and according to their physiology it is halotolerant and mesophilic. Finally, the. BI B. minimum inhibitory concentration of 1,25 mg/mL against MRSA ATCC 43300 was obtained.. Keywords:. Morphological-physiological. characterization,. antibiotic. activity,. Streptomyces sp. NPA1, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Manglares de Tumbes.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCIÓN. Los océanos poseen la mayor riqueza filogenética sobre la tierra, presentando el mayor número de animales, plantas y microorganismos. Así mismo estos han desarrollado una serie de estrategias metabólicas y fisiológicas, que les permiten. RA DO. sobrevivir en este medio extremo, lo cual puede significar la producción de metabolitos estructuralmente diferentes a los encontrados en sus contrapartes terrestres (Alvarenga y Arévalo, 2012).. SG. Es así que desde el año 1995 las investigaciones sobre nuevos metabolitos de origen marino incrementaron considerablemente gracias a los hallazgos de. PO. nuevos compuestos bioactivos en microorganismos, algas e invertebrados, realizándose estudios principalmente en bacterias y hongos aislados de agua de. DE. mar, sedimentos, peces, algas y principalmente de invertebrados marinos como esponjas, moluscos, tunicados, celenterados, crustáceos y algunos protocordados. TE CA. (León y Liza, 2010; Jensen et al., 2005) Por otro lado, el surgimiento de nuevas enfermedades en el mundo moderno (enfermedades emergentes y reemergentes) y la aparición cada vez mayor de. LI O. patógenos antibiótico-resistentes, han generado la necesidad de evaluar diversos compuestos naturales con actividad antimicrobiana como una alternativa en el. BI B. tratamiento de enfermedades infectocontagiosas y, de esta manera, contrarrestar algunos de estos problemas de salud pública. Es así que la investigación de cepas productoras de metabolitos bioactivos en el océano ha abarcado hábitats tan diversos como: columna de agua, sedimentos y tejidos de invertebrados. Ya se ha investigado y determinado una lista de compuestos obtenidos a partir de microrganismos marinos que incluyen por ejemplo agentes anticancerígenos. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. como la briostatina y didemnina B; también incluyen antinflamatorios y antimicrobianos, los cuales la mayoría difiere en lo que respecta a clase química de los microorganismos de origen terrestre (Jensen et al., 2005; Garrity, 2004). Existen estudios que han demostrado el potencial productor de metabolitos. partir. de. bacterias. marinas. poseen. RA DO. antimicrobianos en bacterias marinas. Gran parte de estas moléculas aisladas a cualidades. importantes,. como. su. halogenación, siendo notable la presencia de átomos de bromo o cloro, esta. SG. halogenación rara vez se encuentra presente en metabolitos de bacterias de origen terrestre. En el ambiente marino los antibióticos y otros metabolitos. PO. secundarios cumplirían funciones de supervivencia, confiriéndoles a los microorganismos productores una ventaja selectiva respecto a otras poblaciones. DE. microbianas que compiten por el mismo nicho (Hentschel, 2001). Estudios realizados por Barcina et al. (1987) con cepas de Streptomyces aisladas desde. TE CA. agua y sedimentos marinos, demostraron actividad inhibitoria principalmente contra Gram positivos, tales como Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Streptococcus faecalis. Fudou et al. (2003) aislaron desde una myxobacteria. LI O. marina el primer antibiótico: haliangicina, este compuesto tiene una potente actividad contra hongos filamentosos, comparable a las de anfotericina B y. BI B. nistatina, además de poseer actividad contra Oomycetes. Estudios de Leiva et al. (2004) identificaron 2 nuevas macrolactinas desde una cepa marina de Bacillus aisladas desde el alga Schizymenia dubyi. Estas macrolactinas mostraron actividad contra Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus, pero no contra Escherichia coli. Por otro lado Villarreal y Soria, (2014) aislaron desde sedimentos marinos cepas de actinomicetos con actividad antagónica contra hongos filamentosos (Aspergillus niger, Fusarium moniliforme y Trichoderma viridae) y 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. levaduriformes. (Candida. albicans,. Candida. kruzei),. finalmente. estos. investigadores concluyeron que la actividad antifúngica era mayormente debida a polienos como por ejemplo hexaenos. Sin embargo; a pesar de que se obtienen muchos hallazgos benéficos como las. RA DO. investigaciones mencionadas en párrafos anteriores que pueden ayudar a disminuir enfermedades infecciosas, también los microorganismos tienden a evolucionar y obtener capacidad de tolerancia y resistencia a ciertas condiciones. SG. físico-químicas y biológicas que pudieran ser adversas para su supervivencia, lo que se llamaría farmacológicamente resistencia bacteriana (García, 2006).. PO. Uno de los microorganismos con mayor facilidad de generar resistencia bacteriana son los estafilococos, considerados por la Sociedad Americana de. DE. Enfermedades Infecciosas (IDSA) como uno de los 6 microorganismos de mayor importancia en la práctica médica diaria por causa frecuente de infeccione en la. TE CA. comunidad. Históricamente por el año 1941 las infecciones estafilocóccicas eran erradicadas con penicilinas y poco después reportó cepa resistente por producción de β- lactamasas y a dos décadas ya el 60% de las cepas eran. LI O. resistentes. En 1959 fue desarrollada la meticilina, penicilina semisintética; como antibacteriano para cepas resistentes, pero en el año 1961 se reportó el primer. BI B. aislamiento de Staphylococcus aureus resistente a meticilina y en 1963 Jevons,. en Londres, hizo el primer reporte de brote epidémico, destacándolo como. principal causa de infección nosocomial en Europa (Gil, 2000; Alvares y Ponce, 2012). Staphylococcus aureus, es un coco Gram positivo cuyas células miden aproximadamente 1 μm de diámetro, se agrupan en racimos que son indicativos 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. de que tienen la capacidad de dividirse en más de un plano, su respiración es aeróbica y anaeróbica. Este microorganismo es uno de los principales patógenos en humanos y animales, capaz de causar una amplia gama de infecciones de diferente severidad, ha desarrollado de forma gradual una resistencia a todas las. RA DO. clases de antibióticos (Guillén et al., 2016; García, 2006). Así; desde años anteriores ha sido una lucha constante contra bacterias altamente resistentes por lo que el ser humano en su ansia de supervivir sigue en. SG. busca de antibióticos que permitan librarnos de muchas patologías utilizando para ello medios de estudio antes no explorados como el ambiente marino. En el Perú. PO. nuestro litoral es extenso y variado a diferencia de otros lugares por la diferencia de temperaturas del agua del mar y es una microbiota poco estudiada, además;. DE. basándonos en resultados preliminares se pueden encontrar muchas cepas biológicamente activas que poseen un interesante potencial como fuente de. TE CA. metabolitos antagonistas que podrían ayudar en combatir enfermedades infecciosas (Alvarenga y Arévalo, 2012). Los Manglares de Tumbes, con una extensión de 2072 hectáreas, ubicado en la. LI O. costa fronteriza con Ecuador, es un lugar único pues alberga la mayor extensión de manglares del país y es una potencial e importante área para la investigación.. BI B. El manglar es un tipo de ecosistema de zonas tropicales que toma su nombre del mangle, un árbol adaptado fisiológica y anatómicamente a las aguas con mucha salinidad y que crece solo en lugares inundados alternadamente por el mar y la desembocadura de alguna fuente de agua dulce. Es por todo ello, que se optó por iniciar un estudio en busca de cepas bioactivas (basta una cepa para su replicación) contra una de las cepas resistentes como SARM en uno de los lugares más ricos en flora y fauna como el Santuario Nacional de los Manglares 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. de Tumbes. Objetivo General . Determinar las características morfo-fisiológicas y genéticas de bacterias. RA DO. marinas con actividad antibiótica sobre Staphylococcus aureus resistente a meticilina recolectadas de los Manglares de Tumbes. Objetivos Específicos. Caracterizar genéticamente las bacterias marinas recolectadas de los. SG. . . PO. Manglares de Tumbes con actividad antibiótica sobre SARM. Determinar las características morfo-fisiológicas de las bacterias marinas. DE. recolectadas de los Manglares de Tumbes con actividad antibiótica sobre SARM.. Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de bacterias marinas. TE CA. . BI B. LI O. con actividad antibiótica sobre SARM ATCC 43300.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. 2.1.. MATERIAL Y MÉTODO. Material. 2.1.1. Material biológico. RA DO. Bacterias marinas aisladas de sedimentos (barro), plantas, conchas, raíces, algas, madera e insectos provenientes de los Manglares de Tumbes, provincia de Zarumilla, departamento de Tumbes, Perú. Las muestras recolectadas fueron transportadas para su estudio al Laboratorio de Farmacología de la Facultad de. SG. Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Nacional de Trujillo, Perú.. PO. 2.1.2. Material de Laboratorio 2.1.2.1. Material de vidrio Asa de Drigalski. . Frascos estériles 500 mL y 1000 mL. . Láminas portaobjetos y cubreobjetos. . Matraz Erlenmeyer de 50, 100, 125, 250 y 500 mL. . Matraz de fondo plano de 50, 100, 250 y 1000 mL. . Mecheros de vidrio. . Pipetas graduadas de 2, 5 y 10 mL. . Placas Petri de plástico estéril de 100 mm x 15 mm. . Placas Petri de vidrio de 90 mm x 15 mm. . Probetas de 100 y 500 mL. . Varillas de vidrio. . Vasos de precipitación de 500 y 1000 mL. BI B. LI O. TE CA. DE. . 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.1.2.2. Medios de cultivo, reactivos y colorante Aceite de cedro, J.T. Baker. . Acetato de etilo, J.T. Baker. . Agar agua de mar artificial (WCX-ASW), Merck. . Agar Mueller-Hinton, Difco. . Agar nutritivo, Difco. . Alcohol acetona. . Alcohol yodado, Erza. . Caldo Mueller-Hinton, Difco. . Cristal violeta, Dropaksa. . Dimetilsulfóxido (DMSO), Fisher Chemical. . Etanol 96º G.L., Alkofarma. . Kit de purificación de ADN, Promega. . Lugol. . Metanol, J.T. Baker. . Resazurina, Merck. . Safranina, Merck. LI O. TE CA. DE. PO. SG. RA DO. . 2.1.2.3. Microorganismos Arthrobacter psychrolactophilus (colección UNIBONN). . Bacillus subtilis ATCC 6633. . Escherichia coli ATCC 25922. . Escherichia coli XL-1 Blue (colección UNIBONN). . Phaeobacter inhibens (colección UNIBONN). . Staphylococcus aureus ATCC 25923. BI B. . 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. . Staphylococcus aureus resistente a meticilina (colección UNIBONN). . Staphylococcus aureus resistente a meticilina ATCC 43300. 2.1.2.4. Equipo Agitador vórtex, Heidolph Reax Control. . Autoclave, marca Airshoft. . Balanza analítica, marca Radwag, sensibilidad:0,0001 g. . Cabina de Bioseguridad clase II tipo A2, marca Biobase. . Centrífuga, marca Hettich. . Estufa, marca Memmert. . Micropipeta de 100 a 1000 µL, marca Transferpette. . Micropipeta de 20 a 200 µL, marca Transferpette. . Micropipeta de 500 a 5000 µL, marca Transferpette. . Microscopio, marca Carl Zeiss. . pHmetro digital, marca Cole Parmer. . Plancha de calentamiento, marca IKA. . Refrigeradora, marca Coldex. . Rotaevaporador, marca Heidolph. . Ultracongeladora -86°C, marca Arctiko. BI B. LI O. TE CA. DE. PO. SG. RA DO. . 2.1.2.5. Otros materiales e insumos . Algodón. . Asa bacteriológica. . Espátula de metal. . Gradilla. . Guantes estériles 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Hisopos estériles. . Papel filtro. . Papel parafilm. . Papel Toalla. . Placas estériles de poliestireno para microtitulación. RA DO. . 2.2. Método. SG. 2.2.1. Recolección de muestras. Entre las 10:00 y 14:00 horas del mes de agosto, previa observación de la zona,. PO. en los Manglares de Tumbes, fueron recolectadas 25 muestras de sedimentos marinos de acuerdo a las características del suelo. Los puntos de recolección. DE. fueron registrados en el sistema de coordenadas UTM (Universal Transversal de Mercator) inmediatamente después. TE CA. temperatura y pH.. de la recolección, también se registró su. Las muestras fueron tomadas de suelo marino en poca profundidad (0 a 0,5 cm bajo nivel del mar) en la zona intermareal, recolectándose sedimentos marinos. LI O. (barro), plantas, conchas, raíces, algas, madera e insectos; se colocaron en tubos cónicos de boca ancha estéril, registrándose 25 tubos para la zona de muestreo. BI B. debidamente codificados. Cada característica de cada muestra fue detallada en un formato. (anexo 1). Las muestras fueron transportadas en cajas térmicas al. Laboratorio de Farmacología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de. la. Universidad Nacional de Trujillo para su estudio.. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.2.. Siembra y aislamiento de bacterias marinas de los Manglares de Tumbes. 2.2.2.1. Siembra de muestras marinas en parches de Escherichia coli XL-1 Blue y Phaeobacter inhibens. RA DO. Se preparó por separado cultivo líquido Escherichia coli XL-1 Blue y Phaeobacter inhibens en medio Luria Bertani (LB) (anexo 2), incubándose con agitación constante a 30 °C por 48 horas; posterior al tiempo, de acuerdo al cultivo se vierte. SG. en 2 tubos cónicos estériles de 50 mL centrifugándose por 5 minutos a 4000 rpm, se eliminó el sobrenadante y se repitió el mismo proceso para tener mayor. PO. concentración de pellets. Luego se le agregó agua destilada estéril y se agitó hasta disolver (Sandín y Algorta, 2008).. DE. En placas con agar WCX-ASW (anexo 3), se agregó 50 µL de cada pellet hidratado, de acuerdo al cultivo, en 3 puntos diferentes, se expandieron los. TE CA. parches con ligeros golpes de la placa y se dejó secar en la cabina de bioseguridad clase II tipo A2. Tanto en parche con Escherichia coli XL-1 Blue y Phaeobacter inhibens se sembraron las muestras en estudio, rotulándose según. LI O. el código de la muestra y el cultivo e incubándose a 30 °C (Sandín y Algorta,. BI B. 2008).. 2.2.2.2. Aislamiento de bacterias marinas De acuerdo a las propiedades bacteriolíticas de las muestras en estudio, si hubo lisis de los parches de Escherichia coli XL-1 Blue y Phaeobacter inhibens, con. ayuda de una espátula esterilizada en flama, en la cabina de bioseguridad, se realizaron cortes cuadrados de acuerdo a observación de colonias con coloraciones intensas y/o diferentes crecimientos en el agar WCX-ASW de las 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. placas en estudio y se llevaron a medios nuevos de agar con parches de Escherichia coli XL-1 Blue y Phaeobacter inhibens según el medio inicial. Se rotularon las placas de acuerdo a cada muestra y parche, luego se incubaron a 30 °C hasta obtener un cultivo axénico, verificado por medio de una siembra en. RA DO. estrías en agar WCX-ASW (Sandín y Algorta, 2008). 2.2.3. Actividad antibiótica de extractos de bacterias marinas. SG. 2.2.3.1. Preparación de extractos. Las bacterias marinas con buena actividad frente a Escherichia coli XL-1 Blue y. PO. Phaeobacter inhibens, fueron incubadas por separado, en 35 mL de medio caldo marino, en matraces de 125 mL a 30 °C con agitación constante por 72 horas.. DE. Posterior, se vertió 25 mL de cada matraz en tubos cónicos estériles, sonicando por 15 minutos y agregando 25 mL de acetato de etilo. Con agitador vórtex fue. TE CA. homogeneizado. Reposó durante 1 hora y se centrifugó por 10 min a 3500 rpm a 30 °C, siguiendo recomendaciones de Zheng et al. (2004). El sobrenadante se concentró bajo presión reducida en el rotaevaporador a 40 °C, 242 rpm y. LI O. 199 mbar, obteniéndose el extracto seco de cada una de las bacterias marinas en estudio, se le agregó agua estéril hasta obtener una concentración de 5 mg/mL. BI B. (Schäberle et al, 2010). 2.2.3.2. Selección de bacterias marinas con actividad sobre Arthrobacter psychrolactophilus. De los extractos de cada muestra se colocaron 50 μL en pocillos realizados en las placas. con. agar. conteniendo. el. organismo. de. prueba. Arthrobacter. psychrolactophilus (colección UNIBONN); se incubaron a 30 °C por 24 horas y si. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. hubo actividad frente a este microorganismo, es decir presencia de halos, se realiza la actividad antibiótica sobre SARM (Villarreal, 2014) 2.2.3.3. Actividad antibiótica de extractos de bacterias marinas sobre SARM. RA DO. De las muestras seleccionadas del apartado 2.2.3.2., se utilizaron 40 μL del extracto (5 mg/mL) en discos de papel filtro y fueron colocados en placas con agar Müller-Hinton-agar con SARM, cepas puras, aisladas de casos de pacientes presentados en el Hospital Uni Klinikum de la Universidad de Bonn - Alemania. SG. (colección UNIBONN). La incubación se llevó a cabo a 37 °C por 24 horas. 2.2.4. Caracterización. genética. de. bacterias. marinas. con. actividad. DE. antibiótica sobre SARM. PO. (García, 2006; Villarreal y Soria, 2014).. La identificación genética se realizó mediante secuenciación del ARNr 16S. El. TE CA. ácido desoxirribonucleico (ADN) genómico de la cepa respectiva se aisló usando el kit de purificación de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante Promega. La amplificación fue por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del. LI O. gen ARNr 16S usando el par de cebadores pA (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3') y el pH (5'-AAGGAGGTGATCCAGCCCCA-3'). Los fragmentos de ADN. BI B. resultantes fueron purificaron en gel y secuenciados posteriormente por la empresa GATC Biotech AG, Konstanz, Alemania, usando los mismos cebadores. Los datos resultantes de ambos lados de la secuencia final se fusionaron y analizaron utilizando el programa BLASTn y el árbol filogenético se construyó utilizando el método de evolución mínima del software MEGA 7, por la empresa GATC Biotech AG (Schäberle et al., 2010; Vásquez 2016; Linares et al., 2017).. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.5. Caracterización morfo-fisiológica de bacterias marinas con actividad antibiótica sobre SARM 2.2.5.1. Caracterización morfológica. RA DO. Para observar la morfología macroscópica se inoculó por siembra por puntura una pequeña colonia (diluida en agua estéril) de la bacteria marina en agar WCXASW y se llevó a incubar hasta 72 horas, visualizando su crecimiento cada 24. SG. horas.. Para la morfología microscópica se utilizó la tinción Gram, para ello; fue necesario. PO. realizar un extendido fino en el portaobjeto, dejándolo secar y pasándolo por flama de mechero 3 ó 4 veces para fijar muestra, luego; se cubrió la superficie con. DE. solución cristal violeta por 1 minuto y pasado el tiempo, fue lavado con agua destilada. Después; cubriéndose la muestra con solución Lugol por un lapso de 1. TE CA. minuto, fue lavado nuevamente con agua destilada. Posteriormente, se decoloró con unas gotas de alcohol acetona por 30 segundos y con agua destilada fue lavada la muestra. Finalmente se cubrió la superficie con Safranina (contracolor),. LI O. que pasado 1 minuto se enjuagó con agua destilada. Usando un soporte fue dejado el portaobjetos en posición vertical hasta secado total, examinando el. BI B. extendido al microscopio con aceite de inmersión a 100x. Observación: bacterias Gram positivas de color azul intenso o violeta y bacterias Gram negativas de color. rojo o rosado (Heyduck-Söller, 2000; Mancilla, 2003). 2.2.5.2. Caracterización fisiológica Se sembró la bacteria marina en placas con agar LB en diferentes concentraciones de cloruro de sodio (0,50%; 1,00%; 1,95%; 2,14%; 2,23%; 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 3,89%; 5,00% y 10,00%) a 30 °C por 72 horas para verificar su crecimiento (anexo 4). También se sembró la bacteria marina en agar WCX-ASW y se incubó en diferentes temperaturas (10, 25, 30, 37 y 45 °C) por 72 horas (anexo 5) (Alvarenga y Arévalo, 2012).. RA DO. 2.2.6. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de bacterias marinas con actividad sobre otras bacterias no resistentes y SARM. CMI de bacterias marinas con actividad sobre bacterias no. SG. 2.2.6.1.. PO. resistentes. Para ello se usó cepas puras de Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus. DE. subtilis ATCC 6633 y Escherichia coli ATCC 25922 y como medio de cultivo se usó agar Mueller-Hinton (MH). Se preparó una suspensión de las bacterias a. TE CA. emplear a partir de cultivos de 48 horas (Blanco, 2017) Se emplearon placas estériles de poliestireno para microtitulación de 96 pocillos con fondo plano. Fueron repartidos 100 µL de caldo Mueller-Hinton en cada. LI O. pocillo hasta el décimo pocillo. Añadiendo 100 µL del extracto de bacteria marina al primer pocillo, se mezcló hasta homogenizar el medio y a partir de allí se inició. BI B. la dilución sacando 100 µL y agregando al siguiente pocillo hasta concluir con el último pocillo. De la suspensión de inóculo preparada de cepas a enfrentar, se distribuyeron 100 µL por pocillo del primer al décimo pocillo. En él undécimo pocillo fue mezclado 100 µL de caldo MH inoculado con 100 µL de cepa a enfrentar para tener un control negativo de inhibición de crecimiento y en el siguiente pocillo se adicionó 100 µL de caldo MH y 100 µL de extracto de 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. bacteria marina para tener un control positivo de inhibición de crecimiento. Las placas fueron incubadas a 37 °C durante 24 horas, luego dentro de la cabina de bioseguridad se les añadió 20 μL de resazurina al 0,02% a todos los pocillos, incubándose por 1 hora antes de dar lectura. El color azul indica respuesta. actividad antibiótica) (Alvarenga y Arévalo, 2012). 2.2.6.2.. RA DO. positiva (actividad antibiótica) y el color rosado indica respuesta negativa (sin. CMI de bacterias marinas con actividad sobre SARM. BI B. LI O. TE CA. DE. PO. procedimiento del apartado 2.2.6.1. (anexo 6).. SG. Para ello se usó cepas puras de SARM ATCC 43300 y se siguió el mismo. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESULTADOS. SG. RA DO. III.. PO. cepa 33. TE CA. DE. cepa 166-3 cepa 214-2. cepa 120. cepa 118. cepa 32 cepa 37 cepa 100 cepa 186-2 cepa 186-3. cepa 132-A1 cepa 132-3. BI B. LI O. cepa 164-1 cepa 178-1 cepa 189-1. Figura 1. Ubicación de cepas axénicas, aisladas de muestras marinas de los Manglares de Tumbes. La línea negra corresponde a los límites entre Perú y Ecuador. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 1. Actividad antibiótica de extractos de cepas marinas aisladas de los Manglares de Tumbes sobre Arthrobacter psychrolactophilus y Staphylococcus aureus resistente a meticilina. Extracto. Arthrobacter. Staphylococcus. N° de. psychrolactophilus. aureus. muestra. colección UNIBONN. resistente a meticilina. +. Cepa 33. 19. +. Cepa 37. 8. +. Cepa 100. 7. +. Cepa 118. 13. +. Cepa 120. 23. Cepa 132-A1. 4. Cepa 132-3. 4. Cepa 164-1. -. SG. 9. +. -. ND. -. ND. 1. +. -. 11. +. -. 1. +. -. 7. +. -. Cepa 186-3. 7. +. -. Cepa 189-1. 2. +. -. Cepa 214-2. 11. -. ND. Cepa 178-1. LI O. Cepa 186-2. TE CA. Cepa 166-3. DE. +. BI B. PO. Cepa 32. RA DO. colección UNIBONN. (+) con actividad; ( - ) sin actividad; (ND) no determinado. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 2. Caracterización genética de la cepa 120 aislada de los Manglares de Tumbes con actividad antibiótica sobre Staphylococcus aureus resistente a meticilina Código Cepa. Identidad. Secuencia genética CGAATTCGTCGACACAGAGTTTGATCCTGG CTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAAC ACATGCAAGTCGAACGATGAACCTCCTTCG GGAGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTA ACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGG ACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGG ATACTGACCCGCTTGGGCATCCAAGCGGTT CGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCC GCGGCTTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATG GCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGC CTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACT GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGC AGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAA AGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGA TGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAG CAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGC AGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGC AGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTT GTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGT AGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCC CGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATA CGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGAT CGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGC AGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGG CGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGG AGCGAAAGCGTGGGgAGCGAACAGGATTAG ATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTG GGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCG TCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCC CGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAA ACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAA GCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCA ACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATA CACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCC TTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCT GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGT TAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCC CGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGG GGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACT CGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCA TCATGCCCCTTATGTCTTGTGCTGCACACGT GCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGAT ACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAGGCC GGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTC GACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATC GCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTT CCCGGGCCTTGTACACACTGCCCGTCACGT CACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTG GCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCAA AGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGT AACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCT GGATCACCTCCTTAAGCTTGGATCCCGGG. DE. PO. SG. RA DO. Bacteria. TE CA. Streptomyces sp. NPA1. 99%. BI B. LI O. 120. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 3. Características morfológicas de la cepa 120 aislada de los Manglares de Tumbes con actividad antibiótica sobre Staphylococcus aureus resistente a meticilina Bacteria marina. Características. Streptomyces sp. NPA1. Identidad. 99%. Procedencia. Manglares de Tumbes S 03° 24’ 57,9’’ W 80° 17’ 14,5’’. Localización. Color. En 24 horas, blanco y en 72 horas, blanco y negro. Forma. Bacilos con presencia de esporas. Coloración. Gram +. Tamaño. 244 µm. SG. Convexa con crecimiento circular. BI B. LI O. TE CA. Morfológicas microscópicas. Forma de colonias. DE. Morfológicas macroscópicas. RA DO. Nombre. PO. Generales. Cepa 120. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(29) SG. RA DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 2. Morfología macroscópica de Streptomyces sp. NPA1 a 24 horas de. BI B. LI O. TE CA. DE. PO. incubación, colonias convexas con crecimiento circular de color blanco. Figura 3. Morfología macroscópica de Streptomyces sp. NPA1 a 72 horas de incubación, colonias convexas con crecimiento circular de color blanco con negro. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(30) TE CA. DE. PO. SG. RA DO. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 4. Morfología microscópica de Streptomyces sp. NPA1, bacteria Gram+,. BI B. LI O. bacilos con presencia de esporas de tamaño 244 µm a 100x. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 4. Características fisiológicas de Streptomyces sp. NPA1, ensayo de salinidad – crecimiento en diferentes concentraciones de cloruro de sodio Streptomyces sp. NPA1. 0,50. +++. RA DO. % NaCl. 1,00. +++. 1,95. ++ ++. SG. 2,14. ++. PO. 2,23. 5,00. ++ + -. TE CA. 10,00. DE. 3,89. BI B. LI O. (+++) muy buen crecimiento; (++) buen crecimiento; (+) ligero crecimiento; ( - ) sin crecimiento. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 5. Características fisiológicas de Streptomyces sp. NPA1, ensayo de termorresistencia – crecimiento en diferentes temperaturas Streptomyces sp. NPA1. Temperatura (°C). 72 h. 10. -. 25. ++. 30. +++. 37. +. 45. PO. RA DO. 48 h. -. -. ++. SG. +++ + -. BI B. LI O. TE CA. DE. (+++) muy buen crecimiento; (++) buen crecimiento; (+) ligero crecimiento; ( - ) sin crecimiento. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Escherichia coli. 5,00. 2,50. 1,25. Staphylococcus aureus ATCC 25923. (+). (+). (+). (+). (+). Bacillus subtilis ATCC 6633. (+). (+). (+). (+). (+). Escherichia coli ATCC 25922. (+). (+). (+). (+). (+). 0,63. 0,16. 0,08. 0,04. (-). (-). (-). (-). (-). (-). (+). (+). (+). (+). (+). (-). (-). (+). (+). (-). (-). (-). (-). (-). (+). DE. PO. 10,00. 0,31. Control negativo** 0,02. SG. CMI (mg/mL). Control positivo*. Microorganismos. RA DO. Tabla 6. Concentración mínima inhibitoria del extracto de Streptomyces sp. NPA1 sobre Staphylococcus aureus, Bacillus subtillis y. BI BL. IO TE. CA. *Caldo MH y bacteria no resistente ** Caldo MH y extracto de bacteria Streptomyces sp. NPA1 (+) Color azul (actividad antibiótica); (-) color rosado (sin actividad antibiótica). 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Staphylococcus aureus resistente a meticilina ATCC 43300. CMI (mg/mL). Control positivo*. 10,00. 5,00. 2,50. 1,25. 0,63. (+). (+). (+). (+). (+). (-). 0,16. 0,08. 0,04. (-). (-). (-). (-). BI BL. IO TE. CA. DE. PO. *Caldo MH y SARM ** Caldo MH y extracto de bacteria Streptomyces sp. NPA1 (+) Color azul (actividad antibiótica); (-) color rosado (sin actividad antibiótica). 0,31. SG. Microorganismo. RA DO. Tabla 7. Concentración mínima inhibitoria del extracto de Streptomyces sp. NPA1 sobre SARM. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/. Control 0,02 negativo**. (-). (-).
(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV.. DISCUSIÓN. En la figura 1, se mostraron las ubicaciones de dónde se obtuvieron las 15 muestras axénicas con actividad frente a Escherichia coli XL-1 Blue y Phaeobacter inhibens provenientes de los Manglares de Tumbes, la mayoría de. RA DO. ellas recolectadas de la zona intermareal clasificada como fondos blandos, es decir; intermareales arenosos, barrosos y marismas, lo que significa según Sesse y Martinez (2013), que los microorganismos estaban en movimiento continuo por. SG. acción de las olas logrando adaptarse a procesos físicos y biológicos no sólo de ambientes marinos sino de terrestres. Al momento de la recolección se tuvo en. PO. cuenta la temperatura ambiental y pH del suelo, los cuales estaban entre 26,5 °C y 27 °C; con pH entre 7,46 y 7,61, datos importantes ya que Jones y Keddie. DE. (2006), determinaron que la mayoría de microorganismos tiene un óptimo crecimiento entre 20 °C y 45 °C y un pH entre 5 y 9, ayudando a obtener bacterias. TE CA. marinas con mayor actividad.. Posterior a realizar pruebas con Arthrobacter psychrolactophilus, los extractos positivos fueron enfrentados a cepas clínicas de SARM (colección UNIBONN). LI O. (tabla 1), determinándose que solo un extracto tenía actividad antibiótica; esta cepa positiva fue la codificada como 120, tomada de un hábitat de insectos. BI B. (muestra 23) en el área intermareal a 0 cm a nivel del mar con una temperatura de 27 °C y pH 7,46; condiciones de un ambiente óptimo para un buen crecimiento, reproducción y actividad depredadora por competencia de su hábitat, lo que explicaría a priori su actividad antibacteriana contra la cepa patógena de SARM.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La cepa del extracto codificado como 120 posterior a su caracterización genética (tabla 2) fue identificada como Streptomyces sp. NPA1 con un 99% de identidad. En la actualidad, que una bacteria sea identificada a un 99% (99-100%) indica que sólo hay un porcentaje de divergencia de 1% entre secuencias del ARNr 16S,. RA DO. por lo que; se trataría de un género ya existente, es decir perteneciente al género Streptomyces, sin embargo de una especie aún no determinada. Según Rodicio y Mendoza (2003) y Ludwing y Schleifer (2014), el método utilizado para determinar la secuenciación genética es aceptado en la sistemática bacteriana porque ha. SG. permitido establecer identidades genéticas así como relaciones evolutivas entre. PO. microorganismos de manera certera. Así mismo, González (2010), relata que Streptomyces es el género más extenso de actinobacterias, con olor característico. DE. a “tierre húmeda” (metabolito volátil geosmina, gracias a la actividad microbiana) y con un grupo de contenido generalmente alto de Guanina-Citocina, determinados. TE CA. también por la secuenciación del ARNr 16S.. En cuanto a la morfología macroscópica y microscópica (tabla 3), se obtuvo las características del género identificado, visualizando la particularidad del. LI O. crecimiento en placa de Streptomyces, colonias de forma convexas y el cambio de color entre las 24 y 72 horas de blanco a blanco con negro (figura 2 y 3). Se. BI B. realizó la tinción Gram, determinándose que era Gram positiva (figura 4) con forma de bacilos con presencia de esporas de 244 µm de tamaño, no diferenciando este resultado de estudios realizados en el 2014 por Villarreal y Soria con sedimentos marinos, los cuales evidenciaron que la mayoría de las bacterias que conforman la comunidad bacteriana parecen ser Gram positivas; adicionalmente, González (2013) especifica que se puede encontrar múltiples. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. especies de Streptomyces en zonas intermareales a pesar del hábitat tan variable del área. En la tabla 4, se mostró los ensayos de salinidad en diferentes concentraciones de cloruro de sodio (8 concentraciones) que va desde 0,50% a 10,00%,. RA DO. encontrándose mejor crecimiento entre 0,50% a 1,00% de NaCl, sin embargo tiene moderado crecimiento hasta 3,89 % de NaCl y un ligero crecimiento a 5,00% de salinidad, al clasificarse según capacidad de sobrevivir o vivir en diferentes. SG. niveles de NaCl; se puede considerar que la especie de Streptomyces encontrada en los Manglares de Tumbes es halotolerante,. ya que si bien es cierto su. PO. crecimiento es óptimo a porcentajes bajos de NaCl, toleran hasta un 5,00% de NaCl con un ligero crecimiento de cepas; presumiblemente como toda bacteria. DE. halotolerante expuesta a concentraciones elevadas de NaCl, tratan de combatir la pérdida de agua citoplasmática y como infirió Meseguer (2004), la explicación. TE CA. sería que acumulan en su citoplasma una sustancia que se conoce como soluto compatible, para regular su turgencia interna sin producir inhibición del metabolismo. celular;. esta. sustancia. puede. tener. distinta. procedencia. LI O. dependiendo del microorganismo que lo puede sintetizar como de azúcares, polialcoholes, aminoácidos, etc., o se puede tratar de sustancias o iones. BI B. presentes en su mismo medio (betaínas, potasio) acumulándose en el interior celular gracias a mecanismos de transporte de membrana que le permite sobrevivir en medios salinos. En la tabla 5, se enfrentó la bacteria Streptomyces sp. NPA1 a diferentes grados de temperatura oscilando entre 10 °C y 45 °C (5 temperaturas diferentes), encontrándose que la temperatura óptima fue de 30 °C, crecimiento moderado a. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 25 °C y ligero crecimiento a 37 °C, tanto a las 48 horas como a las 72 horas de incubación, por lo que según su temperatura óptima de crecimiento y la clasificación de Merino (2016), la bacteria en estudio sería mesófila, clase que comprende crecimiento a temperatura óptima entre 20 °C hasta 45 °C. En este. RA DO. rango de temperatura como dice Brock en su investigación en el 2006, se encuentran miles de bacterias contaminantes para el ser humano, se podría decir que, es el rango óptimo común de miles de bacterias.. SG. En la tabla 6, se observó la CMI de bacterias “no resistentes”, dos de ellas Gram positivas y una Gram negativa, sin embargo; el extracto de Streptomyces sp. PO. NPA1 obtuvo actividad antibacteriana sobre las tres cepas con un mejor resultado en Bacillus subtilis con concentración de 0,04 mg/mL, lo que es consecuente ya. DE. que en la investigación realizada por Calvo y Zúñiga (2010) detalla que esta bacteria se le puede considerar como un organismo “benigno”, no patógeno ni. TE CA. infeccioso para los seres humanos y que no presenta mayor resistencia a antibacterianos. Posterior le sigue Escherichia coli con 0,31 mg/mL, bacteria patógena sobre todo en enfermedades digestivas agudas y que a lo largo de la. LI O. historia ha presentado y sigue presentando resistencia a ciertos antibióticos. Finalmente se visualiza la CMI de Staphylococcus aureus con 0,63 mg/mL,. BI B. bacteria con mayor tendencia a evolucionar y crear resistencia a antibacterianos por mecanismos como hiperproducción de β-lactamasas y modificación de las “penicillin binding proteins” (PBPs), proteínas de anclaje de penicilinas.. En la Tabla 7, se observó la CMI de Staphylococcus aureus resistente a meticilina determinando una concentración de 1,25 mg/mL; es decir, que es un eficaz inhibidor bacteriano, no sólo porque proviene de una familia conocida como. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. productores proliferativos de metabolitos especializados sino que, debió desarrollar diferentes características para superar a otras bacterias en el entorno altamente competitivo y variable del océano para que pueda acceder a nutrientes sea lisando con sus metabolitos secundarios las células de sus “oponentes” o tal. RA DO. vez por medio de genes policétido sintasa (PKS) u otra clase de metabolitos bioactivos por determinar, que podría ser un buen hallazgo para la medicina clínica ya que SARM es una cepa muy peligrosa y en muchas ocasiones mortal, la cual ya ha hecho resistencia hasta a vancomicina como especificó González en. SG. el 2013, no obstante; Salcedo en el mismo año también detalló que al género. PO. Streptomyces se le considera como la “farmacia” de la naturaleza, porque; de este grupo se extraen la mayor parte de compuestos utilizados en la medicina actual,. DE. tal como antibióticos, antifúngicos, antitumorales, entre otros, y como Torres dijo en el 2012, son más de 50 antibióticos diferentes que se han aislado de especies de Streptomyces, incluyendo la estreptomicina, la neomicina, el cloranfenicol y las. TE CA. tetraciclinas, radicando en ello la importancia de identificar a futuro los metabolitos secundarios de la nueva especie denominada Streptomyces sp NPA1, lo cual llevaría a aislar nuevos antibióticos, en pro del bienestar de la población y utilidad. BI B. LI O. de la biomédica.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V.. CONCLUSIONES. La cepa codificada como 120, con actividad antibiótica sobre SARM colección UNIBONN, corresponde a Streptomyces sp. NPA1.. RA DO. Las características de Streptomyces sp. NPA1; según morfología macroscópica tiene colonias convexas con crecimiento circular, de color blanco a las 24 h de incubación y blanco y negro a las 72 h. Según morfología microscópica, es Gram positiva, bacilos con presencia de. SG. esporas de 244 µm. Características fisiológicas, crecimiento desde 0,50%. PO. hasta 5,00% de cloruro de sodio y entre 25 y 37 °C.. El extracto de Streptomyces sp. NPA1 presenta una CMI de 1,25 mg/mL. BI B. LI O. TE CA. DE. para Staphylococcus aureus resistente a meticilina ATCC 43300.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. Alvarenga A, Arévalo M (2012). Bacterias productoras de glicosidasas, aisladas del Canal de Beagle: Caracterización de bacterias marinas de interés. RA DO. biotecnológico. Editorial Académica Española. Argentina. Alvares I, Ponce J (2012). Staphylococcus aureus, evolución de un viejo patógeno.. Revista. bvs,. 1. (84).. Recuperado. de:. SG. http://bvs.sld.cu/revistas/ped/vol84_4_12/ped074212.htm. Barcina I, Iriberri J, Egea L (1987). Enumeration, isolation and some physiological. PO. properties of Actinomycetes from sea water and sediment. System Appl Microbiol; 10: 85-91.. DE. Blanco C (2017). Caracterización morfo-fisiológica y genética de bacterias marinas de Laguna Grande, con actividad antibiótica sobre Staphylococcus. TE CA. aureus resistente a meticilina [tesis de maestría]. Universidad Nacional de Trujillo, La Libertad, Perú.. Brock TD (2006). Introduction, an overview of the thermophiles. Thermophiles:. LI O. general, molecular and applied microbiology. Edited by: Brock TD. New. BI B. York: John Wiley & Sons, 1-16.. Calvo P, Zúñiga D (2010). Caracteriazación fisiológica de cepas de Bacillus spp., aisladas de la rizósfera de papa (Solanum tuberosum). Universidad Agraria La. Molina.. Perú. Recuperado. de:. http://www.scielo.org.pe/pdf/ecol/v9n1/a04v9n1. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
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(47) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ANEXOS Anexo 1. Formato de registro de las características de las muestras recolectadas de los Manglares de Tumbes Localización de Toma de Muestra: Los Manglares de Tumbes Fecha: 20 agosto 2015 Tiempo de muestreo:10:00 - 14:00 h. 2. S 03°27´05.8´´ W 80°16´29.7´´. 3. S 03°26´29.8´´ W 80°16´39.4´´. 4. S 03°26´28.1´´ W 80°16´42.1´´. 5. S 03°26´25.2´´ W 80°16´47.6´´. 6. S 03°26´13.7´´ W 80°16´49.8´´. 7. S 03°26´13.7´´ W 80°16´49.8´´. 8. S 03°26´13.7´´. 9. 26,5. 7,61. Barro. 26,5. 7,61. Barro. 26,5. 7,61. Barro. 26,5. 7,61. Planta. 26,5. 7,61. Barro. 27,0. 7,46. Planta. 27,0. 7,46. Barro. 27,0. 7,46. TE CA. W 80°16´49.8´´ S 03°26´13.7´´. W 80°16´49.8´´. 10 S 03°26´13.7´´. W 80°16´49.8´´. Barro. 27,0. 7,46. Conchas. 27,0. 7,46. Barro. 27,0. 7,46. Conchas. 27,0. 7,46. Conchas. 27,0. 7,46. LI O. 11 S 03°24´57.9´´. W 80°17´14.5´´. 12 S 03°24´57.9´´. W 80°17´14.5´´. BI B. 13 S 03°24´57.9´´. W 80°17´14.5´´. pH. BarroConchas. 27,0. 7,46. Raices. 27,0. 7,46. Raices. 27,0. 7,46. Barro. 27,0. 7,46. Algas. 27,0. 7,46. Algas. 27,0. 7,46. Madera. 27,0. 7,46. Barro. 27,0. 7,46. Barro. 27,0. 7,46. Insectos. 27,0. 7,46. Algas. 27,0. 7,46. Barro. 27,0. 7,46. RA DO. W 80°16´29.7´´. Barro. 14 S 03°24´51.1´´. W 80°17´07.5´´. 15 S 03°24´42.5´´ W 80°16´12´´. 16 S 03°24´42.5´´ W 80°16´12´´. 17 S 03°24´42.5´´ W 80°16´12´´. PO. S 03°27´05.8´´. T (°C). Caracte-. pH N° Coordenadas rística. 18 S 03°24´42´´ W 80°16´09.4´´. 19 S 03°24´42´´ W 80°16´09.4´´. DE. 1. T (°C). SG. CaracteN° Coordenadas rística. 20 S 03°24´48.9´´ W 80°15´33.6´´. 21 S 03°24´48.9´´ W 80°15´33.6´´. 22 S 03°24´48.9´´ W 80°15´33.6´´. 23 S 03°24´48.9´´ W 80°15´33.6´´. 24 S 03°24´48.9´´ W 80°15´33.6´´. 25 S 03°24´48.9´´ W 80°15´33.6´´. 38 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
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