Aislamiento y selección de rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal en cultivos de uchuva (physalis peruviana l.) con capacidad antagónica frente a fusarium sp

Texto completo

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AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO

VEGETAL EN CULTIVOS DE UCHUVA (Physalis peruviana L.) CON CAPACIDAD

ANTAGÓNICA FRENTE A Fusarium sp.

CRIS VENNER RODRÍGUEZ MARÍA JOSÉ MARTIN HERNÁNDEZ

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar al título de MICROBIÓLOGO AGRÍCOLA Y VETERINARIO y

MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

DIRECTOR

María Ximena Rodríguez Bocanegra Ph.D.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

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AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO

VEGETAL EN CULTIVOS DE UCHUVA (Physalis peruviana L.) CON CAPACIDAD

ANTAGÓNICA FRENTE A Fusarium sp.

APROBADO

______________________ ________________________

María Ximena Rodríguez Ph.D Pedro Jimenez Ph.D

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AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO

VEGETAL EN CULTIVOS DE UCHUVA (Physalis peruviana L.) CON CAPACIDAD

ANTAGÓNICA FRENTE A Fusarium sp.

APROBADO

_______________________ ________________________

INGRID SHULER JANETH ARIAS

Decana Académica Directora de Carrera

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NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

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A Dios y a mis padres,

por su apoyo incondicional y su amor inmenso

María José Martin Hernández

A mis padres, por su amor y paciencia, a mi hermano y a mi flaquito por

acompañarme durante esta etapa.

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AGRADECIMIENTOS

A Maria Ximena Rodríguez por su infinita paciencia y su guía durante este largo pero gratificante proceso.

A todos los niños de UNIDIA por soportarnos en nuestras eternas tardes de trabajo.

A Javi por su apoyo y toda la comida.

A Carel y Andrés por cuidar de nuestras lindas uchuvitas.

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7

Tabla de contenido

RESUMEN

... 11

1.

INTRODUCCIÓN

... 12

2.

MARCO TEÓRICO

... 12

2.1

Generalidades de la Uchuva ... 12

2.2

Enfermedades de la Uchuva ... 13

2.3 Reguladores de crecimiento vegetal ... 14

2.3.1 Auxinas ... 15

2.4. Rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) ... 15

2.4.1.

Pseudomonas fluorescens

... 17

2.4.2.

Bacillus

sp. ... 17

2.4.3. Actinomycetes ... 17

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

... 18

3.1. Formulación del Problema ... 18

3.2. Justificación de la investigación ... 18

4. OBJETIVOS

... 19

4.1. Objetivo General ... 19

4.2 Objetivos específicos ... 19

5. MATERIALES Y MÉTODOS

... 19

5.1. Diseño de Investigación ... 19

5.1.1. Población de estudio y muestra de población de estudio ... 20

5.1.2. Variables de estudio ... 20

5.2. Metodología... 20

5.2.1. Salida de campo ... 20

5.2.2. Procesamiento de muestras ... 20

5.2.3. Aislamiento e identificación de

Pseudomonas fluorescens

... 21

5.2.4. Aislamiento y selección de

Bacillus

sp. ... 21

5.2.5. Aislamiento y selección de Actinomycetes ... 22

5.2.6. Pruebas de germinación para determinar promoción de crecimiento

vegetal de las cepas aisladas ... 22

(8)

8

5.2.6.2.

Imbibición de las semillas

... 22

5.2.6.3.

Preparación de inóculos

. ... 22

5.2.7 Pruebas de antagonismo

in vitro

frente a

Fusarium

sp. para determinar la

actividad biocontroladora de los aislamientos. ... 23

5.2.7.1.

Preparación de inóculo

... 23

5.2.7.2.

Montaje de la prueba de antagonismo

... 23

5.2.8. Cuantificación de la producción de AIA ... 24

5.2.8.1.

Curva de calibración del reactivo de Salkowski

. ... 24

5.2.8.2.

Cultivo discontinuo en caldo BT de las cepas aisladas y cuantificación

de AIA a partir de los mismos

... 24

5.2.9. Cuantificación de la producción de sideróforos ... 24

5.2.9.1.

Curva de calibración Cromo Azurol S (CAS)

... 24

5.2.9.2

. Cultivo discontinuo en medio mínimo (Simmon y Tessman) y

cuantificación de sideróforos a partir de los mismos

... 24

5.2.10. Pruebas de promoción de crecimiento en invernadero ... 24

5.2.11. Desarrollo del banco de germoplasma ... 25

5.3. Análisis de información... 25

6. RESULTADOS Y DISCUSION

... 25

6.1. Aislamiento e identificación bioquímica de cepas aisladas ... 25

6.2. Producción de Acido indol-acético ... 27

6.3. Promoción de germinación ... 28

6.4. Promoción de crecimiento en invernadero ... 30

6.5. Cuantificación de sideróforos de las cepas aisladas ... 31

6.6. Pruebas de antagonismo frente a

Fusarium

sp ... 34

6.7. Discusión general ... 36

7. CONCLUSIONES

... 38

8. RECOMENDACIONES

... 40

9. REFERENCIAS

... 40

(9)

9

INDICE DE TABLAS

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Longitud promedio en tallo y raíz de las plántulas de uchuva

tratadas en invernadero 30

Figura 2. Peso seco promedio y número de brotes de las plántulas de

uchuva tratadas en invernadero. 31

Figura 3. Cultivo discontinuo en medio mínimo Simmon y Tessman. 33

Figura 4. Imágenes de la prueba de Antagonismo 35

INDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Agrupación Duncan para producción de AIA 45

Anexo 2. Agrupación Duncan para GCR 46

Anexo 3. Análisis de correlación entre variables AIA y GCR 53

Tabla 1. Resultados de la identificación bioquímica. 1° y 2° muestreo. 26

Tabla 2. Producción promedio de AIA (μg/mL) por las cepas bacterianas

aisladas. 27

Tabla 3. Índice de Germinación Relativo promedio presentado en cada

estadio en los tratamientos con las diferentes cepas aisladas. 28

Tabla 4. Concentración de sideróforos producidos por las cepas aisladas 32

Tabla 5. Porcentaje de inhibición de las cepas aisladas frente a

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Anexo 5. Agrupación Duncan para porcentajes de inhibición. 55

Anexo 6. Correlación producción de Sideróforos y porcentajes de

inhibición 57

Anexo 7. Agrupación Duncan para Resultados de promoción de

crecimiento en invernadero. 57

Anexo 8. Relación entre las cepas destacadas en las diferentes pruebas, y

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RESUMEN

Con el fin de aislar, identificar y seleccionar rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal que además de promover la germinación y el crecimiento de las plantas de uchuva, también tuvieran un efecto inhibitorio sobre el patógeno Fusarium oxysporum, se realizaron dos

muestreos, de la zona productora de uchuva en Silvania Cundinamarca, en fincas en donde se presentaba la enfermedad marchitez vascular, causada por fitopatógeno mencionado anteriormente, pero a partir de plantas sanas. Estas muestras fueron procesadas para realizar un aislamiento selectivo de Pseudomonas fluorescens, bacterias del género Bacillus

y de Actinomyces. A partir de estos aislamientos se procedió a realizar pruebas de

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1. INTRODUCCIÓN

La uchuva (Physalis preuviana L.) es considerada como una fruta exótica, muy apetecida en países europeos, ya que se le atribuyen diferentes propiedades medicinales y también por sus características organolépticas. Por esta razón en esta última década ha pasado de ser un cultivo silvestre, a producirse en cultivos más organizados y tecnificados aumentando su área cultivada de 221 hectáreas en el año 1999 a 534 hectáreas en el año 2003 (Sanabria, 2005).

Este aumento en el cultivo es resultado de la demanda de la fruta en Europa, convirtiéndose en uno de los productos de mayor exportación en nuestro país. Sin embargo las normas que permiten la entrada y comercialización del producto en estos países son rigurosas y solo se reciben y se comercializan frutas de una alta calidad con trazas mínimas de químicos, ya que estos pueden afectar la salud humana a largo plazo.

Estas exigencias internacionales más la preocupación por implementar técnicas agrícolas con un menor impacto en el ecosistema, constituyen la base de esta investigación, en donde las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal que también puedan controlar enfermedades tan limitantes como lo es la marchitez vascular, causada por Fusarium

oxysporum, se presentan como una excelente alternativa para que los productores

colombianos sean competitivos el mercado internacional, disminuyendo el uso de agroquímicos nocivos y por tanto las trazas de los mismos en las frutas.

El presente trabajo planteó el aislamiento, preselección e identificación de rizobacterias de cultivos de uchuva, pertenecientes al género Bacillus, Pseudomonas fluorescens y

actinomycetes, que promovieran la germinación de semillas de uchuva y además generaran antagonismo frente a Fusarium oxysporum. Alguno de los aislamientos preseleccionados

fueron probados en invernadero para observar la promoción de crecimiento en plántulas de uchuva a fin de determinar parámetros para evaluación posteriores a escala invernadero.

2. MARCO TEÓRICO

2.1 Generalidades de la Uchuva

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caracteriza por ser semiácido, redondo, amarillo, dulce y pequeño, midiendo entre 1,25 y 2 cm de diámetro. El fruto está envuelto en un capuchón protector, que lo protege del daño mecánico por insectos, pájaros y diversos patógenos, además de las condiciones climáticas externas (Anónimo, 2001). Esta es la especie más conocida de este género y su comercialización ha aumentado actualmente en el exterior por las diferentes propiedades nutricionales y medicinales que este fruto posee. Se caracteriza por ser un fruto azucarado y con altos contenidos de vitaminas A y C, alcanzando una concentración de 26 mg por cada 100 g de pulpa, además contiene hierro y fósforo, en concentraciones de 1.2 y 38 mg/ 100 g de pulpa respectivamente, lo cual es una concentración alta comparado con otras frutas (Florez et al. 2000, citado por Anónimo, 2001).

Colombia, se ubica como el primer productor mundial de uchuva, seguido por Sudáfrica; siendo la uchuva colombiana la de mayor aceptación por tener una mejor coloración y mayor contenido de azúcares. En nuestro país la mayor área cultivada se encuentra en el departamento de Cundinamarca, el cual cuenta con 267 hectáreas, que equivalen al 84.5% del total de área cosechada en el país. Desde el año 2000 se cuenta con registros de cultivos de uchuva en los departamentos de Antioquia y Boyacá, cada uno con áreas de 28 y 15 hectáreas respectivamente, que equivalen al 13.6% del área cosechada en el país (Fischer et al., 2000). Dentro de los municipios productores es importante resaltar la

importancia en la explotación comercial de esta fruta en Granada, Silvania y Fusagasugá en Cundinamarca, y Villa de Leyva en la región oriental del departamento de Boyacá. Una de las razones que explican la concentración de los cultivos en estas zonas es su cercanía a Bogotá, lugar desde donde se exporta al mercado europeo. En el departamento de Antioquia los principales municipios productores son Rionegro y Sonsón (Anónimo, 2002).

La uchuva también se caracteriza por adaptarse fácilmente a una amplia gama de condiciones agroecológicas. Fischer (2000) afirma que en Colombia esta fruta crece entre los 1.500 y los 3.000 msnm, ubicándose los mejores cultivos a una altura entre los 1.800 y los 2.800 msnm, la cual concuerda con una temperatura promedio entre los 13 y 18°C y cuya pluviosidad puede ir de 1.000 a 2.000 mm anuales. El cultivo requiere de una humedad relativa promedio de 70 a 80%. Es importante establecer el cultivo en suelos bien drenados que mantengan un pH entre 5.5 y 7.0 y sean muy ricos en materia orgánica (Zapata, et al.

2002).

2.2 Enfermedades de la Uchuva

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Dentro de las enfermedades más limitantes encontramos las generadas por hongos como lo son el mal de semilleros causado por Pythium sp., la mancha gris causada por Cercospora

sp., muerte descendente o mal de tierra generado por Phoma sp., esclerotiniosis generado

por Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary., mancha foliar generada por Alternaria sp., el

moho gris causado por Botrytis sp. y la marchitez vascular causada por Fusarium oxysporum

Schelecht; sin mencionar la gran variedad de enfermedades causadas por bacterias y por nematodos (Zapata, et al. 2002; Casas, 2006).

Dentro de estas enfermedades causadas por hongos una de las más importantes por su difícil control es la causada por Fusarium oxysporum. La marchitez vascular causada por

este agente, se evidencia por la clorosis, el marchitamiento y la posterior muerte de las plantas, luego de tres meses de haber sido sembradas. Los vasos conductores presentan grandes áreas necrosadas, generadas por la colonización del hongo a través de estos. Esta necrosis se va extendiendo desde la base de la planta hasta la parte donde se ubican los tejidos más jóvenes de la planta, esto produce la incapacidad para transportar nutrientes en la misma y por esta razón se producen los síntomas mencionados anteriormente (Agrios, 2002). Estudios de De LaRotta y Quevedo (2005), citado por Congora y Rojas (2006) encontraron incidencia de esta enfermedad de 10 al 50% y mediante análisis de laboratorio y aplicando pruebas de patogenicidad se confirmó que el agente causal de la enfermedad es

F. oxysporum Schlecht.

Esta enfermedad es la causal de grandes pérdidas económicas a los productores de uchuva, además de disminuir la calidad de la fruta. Para su control se ha implementado el uso de fungicidas con principios activos recalcitrantes para el ambiente, que dejan trazas en las frutas, las cuales pueden llegar a ser tóxicos para el humano. Esto genera rechazo por parte de los diferentes mercados internacionales, que son muy rigurosos con las medidas y los requisitos de salubridad al recibir y liberar el producto.

2.3 Reguladores de crecimiento vegetal

Los reguladores de crecimiento vegetal son sustancias, que en pequeñas concentraciones, son capaces de regular procesos fisiológicos de la planta (Arteca, 1996). Gracias a su capacidad de regular el desarrollo vegetal, los inductores de crecimiento vegetal, en especial los del grupo de las auxinas, son utilizadas en agricultura en frecuentemente. En general las auxinas son obtenidas por síntesis química, por lo cual la síntesis microbiológica de estas sustancias resulta de gran importancia pudiendo constituir una alternativa viable en el contexto de una agricultura ecológica (Castillo et al. 2005). Los reguladores de crecimiento

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Tiempo después, las auxinas en compañía de las giberelinas, las citoquininas, el etileno y el ácido abscísico fueron atribuidas como ―las cinco clásicas‖. Las fitohormonas son sintetizadas no solo por plantas, sino por microorganismos, incluidos bacterias, hongos y actinomycetes (Tudzinzki y Sharon, 2002).

2.3.1 Auxinas

El termino auxina califica una clase de compuestos caracterizados por su capacidad para inducir elongación en células de la región subapical de los brotes (Arteca, 1996). Estas son ácidos débiles derivados del indol y son los mayores reguladores de crecimiento vegetal. Las auxinas se encuentran involucradas en diferentes procesos metabólicos de las plantas como la dominancia del brote principal e inhibición de la ramificación lateral, la diferenciación de los vasos conductores (xilema y floema), el fototropismo y geotropismo, la estimulación de formación de raíces adventicias y el desarrollo de frutos.

Dentro del grupo se puede destacar el ácido indol-acético (AIA), como una de las auxinas naturales más importantes y se ha demostrado que pueden ser sintetizadas por diferentes especies de bacterias, hongos y algas. Entre los más destacados encontramos bacterias de los géneros Azospirillum, Azotobacter, Pseudomonas, Rhyzobium y Bacillus, entre otros

(Patten y Glick, 1996). Aunque la producción de estas fitohormonas por parte de los diferentes microorganismos está debidamente documentada, aún no se encuentran muchos estudios acerca de los efectos fisiológicos que estas producen en ellos (Tudzinzki y Sharon, 2002). La ruta de síntesis del ácido indo-acético ha sido tema de controversia. El aminoácido triptófano se considera el mayor precursor de la síntesis de las auxinas. Sin embargo, mutantes auxotrófos de tiptófano, mostraron evidencia de una ruta de síntesis independiente de triptófano en la que se utiliza el indol, o indol-glicerol como precursor. (Tudzinzki y Sharon, 2002).

2.4. Rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR)

En respuesta a la necesidad de generar cultivos limpios, con trazas mínimas o nulas de agroquímicos que afecten la salud humana a largo plazo, se ha venido implementado el uso de los microorganismos benéficos del suelo, que pueden promover el crecimiento de las plantas y también evitar la infección del tejido vegetal por patógenos, estos son denominados PGPR (plant growth promoting rhizobacteria; rizobacterias promotoras del

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Los primeros trabajos para la inoculación de semillas fueron realizados en Rusia en 1930. A finales de la década de las 70, Kloepper y colaboradores fueron los pioneros en introducir el término PGPR para referirse a las rizobacterias capaces de provocar un efecto benéfico en las plantas. Recientemente, la denominación se ha extendido a microorganismos PGP para incluir hongos y cualquier organismo afín (Vessey, 2003).

Dentro de los mecanismos para la promoción del crecimiento vegetal encontramos dos tipos, mecanismos directos e indirectos.

Los mecanismos directos son aquellos en donde los microorganismos actúan sobre la planta. Dentro de estos encontramos la producción de promotores de crecimiento vegetal (también llamados fitohormonas), como auxina, giberelinas y citoquininas. La producción de estos metabolitos, también generan una mejor regulación de estomas, lo que evita su deterioro el cual está asociado a depresión del crecimiento y síntomas de marchitamiento en la planta. Ocasionan también un desarrollo radical más ramificado jugando un papel fundamental en la absorción del agua y en el mejoramiento de la nutrición al aumentar su acceso a los nutrientes en el suelo (Rivieros, 2008). Adicionalmente, las PGPR pueden promover el crecimiento vegetal mejorando la disponibilidad de nutrientes en el suelo mediante solubilización de fosforo, fijación de nitrógenos y producción de sideróforos (Bobadilla y Rincón, 2008). Igualmente se ha demostrado que las rizobacterias ayudan a disminuir la resistencia a la conductividad hidráulica, lo cual le da a las plantas una mayor tolerancia a periodos de sequía (Rivieros, 2008).

Los mecanismos indirectos son aquellos en donde el microorganismo es capaz de inhibir diferentes patógenos que interfieren con el desarrollo de la planta. Fitopatógenos como hongos y bacterias son neutralizados por diversos mecanismos, como competencia por espacio o nutrientes, o también producción de metabolitos antibióticos, secreción de diversas enzimas hidrolíticas que degradan la pared celular de los patógenos (Reyes et al.

2008). También se ha evidenciado la producción de sideróforos los cuales se definen como moléculas pequeñas con cadenas laterales y grupos funcionales que les proporcionan alta afinidad para captar y concentrar iones férricos. Estas moléculas son producidas típicamente por bacterias, hongos y plantas monocotiledóneas en respuesta al estrés por concentraciones limitantes de hierro en el ambiente (Perez et al., 2007). Debido a que la

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indirecto es el incremento de la capacidad de respuesta sistémica de la planta frente a los patógenos (Vessey, 2003).

Aunque los estudios con microorganismos como Pseudomonas fluorescens se habían

basado únicamente en la utilización de su potencial como biocontrolador de fitopatógenos habitantes del duelo, los esfuerzos ahora comienzan a concentrarse en la capacidad de los PGPR de promover el desarrollo vegetal, utilizándolos en la obtención de plantas más saludables y con mejores rendimientos de cultivo. También se incluyen en estos estudios microorganismos como Azotobacter, Azospirillum, Acetobacter, Burkholderia, Bacillus (Dey

et al. 2004) y actinomycetes (El-Tarabily y Sivasithamparam, 2006).

2.4.1. Pseudomonas fluorescens

Esta bacteria es un cocobacilo Gram negativo, que se encuentra como saprófito en el suelo y es ampliamente conocido por ser una PGPR. Abundan en la superficie de las raíces, ya que son versátiles en su metabolismo y pueden utilizar varios sustratos producidos por las mismas, pero no establecen una relación simbiótica con la planta. Entre sus mecanismos de acción se encuentran el aumento de la toma de agua y nutrientes por la planta, la solubilización de fosfatos, la producción de reguladores del crecimiento vegetal y el control biológico de patógenos, dado fundamentalmente por la producción de sideróforos, la antibiosis y la inducción de resistencia a la planta, mediante la producción de ácido salicílico, el cual actúa como una molécula de señalización que activa la ―resistencia sistémica inducida‖ (RSI) que

es muy similar a la ―resistencia sistémica adquirida‖ (RSA) (Zhang et al., 2002).

2.4.2. Bacillus sp.

Estos microorganismos se caracterizan por ser bacterias Gram positivas con forma bacilar, aerobias estrictos o anaerobias facultativas que en condiciones estresantes forman una endoespora central, que deforma la estructura de la célula. Esta forma esporulada es resistente a las altas temperaturas y a los desinfectantes químicos corrientes. Esta bacteria es capaz de generar un efecto benéfico en el crecimiento de las plantas por diversos mecanismos, en donde se encuentran la producción de sustancias antibióticas, producción de lipopéptidos que actúan como biosurfactantes, solubilización de fosfatos y reducción de enfermedades en las plantas (Kokalis-Burelle et al., 2006).

2.4.3. Actinomycetes

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neutralidad (El-Tarabil y Sivasithampara, 2006). Numerosos estudios demuestran la importancia de los actinomicetos sobre todo de Streptomyces sp., como controlador de

hongos fitopatógenos del suelo y promoción de crecimiento en plantas; por este motivo, los métodos comúnmente utilizados para el aislamiento y recuento de cepas de actinomycetes provenientes de suelo o rizosfera utilizados para biocontrol o promoción de crecimiento en plantas, tratan exclusivamente con aquellos adecuados para las especies de Streptomyces

(Goodfellow y Williams, 1983 citado por El-Tarabil y Sivasithampara 2006).

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

3.1. Formulación del Problema

Las grandes pérdidas económicas producidas por enfermedades en la planta de uchuva, como la marchitez vascular causada por Fusarium oxysporum, no solo por el rechazo por las

instituciones internacionales al disminuir la calidad de este producto, sino también por la pérdida de hectáreas cultivadas, y por el gran impacto ecológico al tratar de controlar la enfermedad mediante fungicidas recalcitrantes en el ecosistema, constituyen en la actualidad una de los principales limitantes del cultivo uchuva en el país.

3.2. Justificación de la investigación

El poder generar una alternativa de control eficiente frente a enfermedades tan agresivas como la marchitez vascular, que disminuya las pérdidas económicas de los productores de uchuva, ayudaría a aumentar la producción de los cultivos y además a abrir cada vez más mercados internacionales, que son mucho más exigentes en cuanto a la calidad fitosanitaria del producto.

El aislamiento de las PGPR es la primera fase para el desarrollo de un producto efectivo para la aplicación a los cultivos de la uchuva tendiente a generar un control frente a F.

oxysporum, que sea efectivo y amigable con el ambiente y que promueva el crecimiento de

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4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo General

Aislar rizobacterias con potencial de control de Fusarium sp., que generen promoción del

proceso de germinación de semillas y promoción de crecimiento de plántulas uchuva en invernadero.

4.2 Objetivos específicos

 Realizar el aislamiento de bacterias del suelo rizosférico en cultivos que presenten síntomas de marchitamiento vascular.

 Seleccionar los aislamientos de rizobacterias de los géneros Bacillus sp. y

Pseudomonas fluorescens.

 Determinar la capacidad promotora de crecimiento de los géneros Bacillus y

Pseudomonas con base en el porcentaje de germinación de semillas.

 Seleccionar las rizobacterias aisladas por su actividad antagónica in vitro frente a Fusarium sp. Realizar la selección de las rizobacterias que presenten una mayor

promoción del crecimiento en las plántulas de uchuva en invernadero.

 Elaborar una colección de aislamientos de rizobacterias con capacidad promotora de crecimiento vegetal por crioconservación.

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. Diseño de Investigación

El tipo de investigación es experimental aplicada, porque se determinó la acción promotora del crecimiento vegetal de los aislamientos de las rizobacterias realizando pruebas de germinación de semillas de uchuva y además evaluando el efecto de algunos de los aislamientos en plántulas, bajo condiciones de invernadero. También se midió el efecto antagónico frente al hongo Fusarium sp. de los mismos aislamientos, mediante la

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5.1.1. Población de estudio y muestra de población de estudio

La población de estudio fueron las rizobacterias aisladas de muestras de raíces y suelo rizosférico de cultivos localizados en el municipio de Silvania, localizado a los 04° 24´ 19¨ de latitud norte y 74° 23´26¨ de longitud oeste, a una altura de 1955 m.s.n.m., tiene una temperatura media de 20°C y la precipitación media anual es de 1955 mm.

5.1.2. Variables de estudio

Para la determinación de la acción promotora de crecimiento de los aislamientos en la germinación de semillas se midieron las siguientes variables: porcentaje de germinación que es una variable cuantitativa, continua de razón. Para la medición de la acción promotora de crecimiento de los aislamientos en el crecimiento de plántulas se midieron las siguientes variables: altura de la planta, longitud de raíces, peso seco y número de brotes, las cuales son variables cuantitativas, continuas, de razón. Para la medición de la acción antagónica de los aislamientos se tuvo en cuenta el porcentaje de inhibición que también es una variable cuantitativa, continua, de razón.

5.2. Metodología

5.2.1. Salida de campo

Se recolectaron las muestras en diferentes fincas ubicadas en el municipio de Silvania, teniendo en cuenta que en estas hubiera cultivos afectados con marchitez vascular causada por F. oxysporum se escogieron plantas sanas en los focos de la enfermedad para tomar

una muestra de raíces secundarias y suelo rizosférico. En cada finca se eligieron tres plantas separadas entre sí por 50m aproximadamente. Las muestras fueron refrigeradas hasta el momento de procesamiento en el laboratorio.

5.2.2. Procesamiento de muestras

Luego del traslado de las muestras al laboratorio se procesaron siguiendo el POE de Corpoica para el aislamiento de Pseudomonas fluorecens y para el aislamiento de bacterias

mesófilas esporuladas.

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actinomycetes. Las siembras en agar King B se llevaron a incubar a temperatura ambiente por 48 horas y se realizó la lectura de las colonias fluorescentes mediante la exposición de luz UV. Las siembras en agar avena se llevaron a incubar a temperatura ambiente, hasta que aparezcan colonias características de estos microorganismos. El remanente de la primera dilución fué llevado a choque térmico, por 10 minutos a una temperatura de 80°C. Luego se realizaron diluciones hasta 10-7 sembrando 0.1 ml de las diluciones 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7 en agar para microorganismos esporulados (Corpoica). Estas siembras se llevaron a incubar de dos a tres días a temperatura ambiente.

5.2.3. Aislamiento e identificación de Pseudomonas fluorescens

A partir de las colonias que presentaron fluorescencia se realizó un aislamiento en agar nutritivo para purificar las colonias. Posteriormente se identificaron los aislamientos por pruebas bioquímicas basadas en la matriz de Schaad (1994), en el POE para el aislamiento de Pseudomonas fluorescens de Corpoica y en Bergey (2000).

Inicialmente se hizo una coloración de Gram. Los cocobacilos Gram-negativos fueron los seleccionados para las siguientes bioquímicas: producción pioverdina, oxidasa, catalasa, urea, nitrato, citrato, arginina descarboxilasa y glucosa OF, escogiéndose los aislamientos que dieran resultados positivos en las anteriores bioquímicas y en esta última, los que dieran como resultado oxidadores. Estos se sembraron en agar Cetrimide y se escogieron las que tuvieran crecimiento moderado o crecimiento normal, sin producción de pigmentos verdes y cafés. Las colonias que coincidieron con los resultados mencionados anteriormente, se consideraron como Pseudomonas fluorescens. Adicionalmente como pruebas confirmatorias

de género se evalúo la prueba de levano y crecimiento en YDC.

5.2.4. Aislamiento y selección de Bacillus sp.

Las colonias que crecieron en el medio para esporulados, luego de realizar el choque térmico, se les realizó el siguiente procedimiento basados en la matriz de Schaad (1994) y en Bergey (2000).

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positivos para las pruebas mencionadas y para esta última los oxidadores y fermentadores. Se realizó también la prueba lecitinasas, mediante la siembra en agar Mossel, aquí se descartaron las colonias positivas para esta prueba, ya que este resultado corresponde a B.

cereus, un patógeno humano. Las cepas que coincidieron con los resultados mencionados

anteriormente se consideraron como Bacillus.

5.2.5. Aislamiento y selección de Actinomycetes

Las cepas que crecieron con las características macroscópicas de estos microorganismos, es decir colonias secas, pulverulentas y con olor característico (olor a suelo por producción de geosminas), fueron purificadas y se observaron sus características microscópicas, hifas en forma de espiral y esporas.

5.2.6. Pruebas de germinación para determinar promoción de crecimiento vegetal de las cepas aisladas

5.2.6.1. Cámara Húmeda

La cámara húmeda fue preparada usando cajas sello pack de tapa alta transparentes, de 16 onzas, en las cuales se ubica un acordeón de papel absorbente (papel para secar manos, marca Familia). Éste tenía cuatro carriles, en donde se ubicaron 5 semillas por cada uno de ellos, es decir un total de 20 semillas por caja. El papel se humedeció con 2ml de agua destilada estéril, por cada carril (Celis y Gallardo, 2008). El montaje se llevó a cabo con cuatro cajas por microorganismo seleccionado (ISTA, 2006).

5.2.6.2. Imbibición de las semillas

Antes de ubicar las semillas en los carriles de la cámara, fue necesario realizar una imbibición de 30 minutos, que según Ramos y Valero (2009) es el tiempo suficiente para estimular la germinación de las semillas de uchuva. Luego de realizar el conteo de las semillas, estas se ubicaron en bolsitas de velo suizo estériles, se realizó un lavado con agua, para eliminar químicos y contaminantes para después ser sumergidas totalmente en agua destilada estéril por el tiempo recomendado. Luego con pinzas estériles se ubicaron en los carriles de la cámara húmeda para ser inoculadas con los microorganismos aislados.

5.2.6.3. Preparación de inóculos.

A partir de cepas reconstituidas en TSA, e incubadas por 48 horas a temperatura ambiente, se realizaron suspensiones en solución salina a una concentración de 0.85% por cada cepa aislada; esta suspensión se llevó a una absorbancia de 0.2 a 540nm, equivalente a 108células/mL. A partir de estas suspensiones se inoculó cada semilla aplicando 100μL de la

(23)

23

Se tuvieron dos controles, inoculando la misma cantidad mencionada anteriormente con agua destilada estéril y solución salina estéril.

Se sellaron las cajas y se ubicaron en el fotoperiodo 12h luz/12h oscuridad, realizando lecturas cada 48 horas, durante 25 días, teniendo en cuenta los estadios de desarrollo de germinación de la uchuva, denominados de la siguiente forma:

Estadio 1 (E1): Rompimiento de la testa y emergencia de la radícula.

Estadio 2 (E2): Desarrollo del hipocótilo.

Estadio 3 (E3): Desplegamiento de hojas cotiledonares.

Estadio 4 (E4): Emergencia de la primera hoja verdadera.

5.2.7 Pruebas de antagonismo in vitro frente a Fusarium sp. para determinar la actividad

biocontroladora de los aislamientos.

5.2.7.1. Preparación de inóculo

La preparación de los inóculos bacterianos para realizar la prueba de antagonismo se hizo de igual forma como se describió en el numeral 5.2.6.3. La cepa de Fusarium sp. que se usó para este ensayo, fue la cepa G1 aislada la Universidad Militar Nueva Granada; esta cepa se reconstituyó en medio PDA y se dejó crecer por 10 días.

5.2.7.2. Montaje de la prueba de antagonismo

Se realizó la técnica de enfrentamiento dual en medio PDA sembrando el inóculo de las bacterias antagonistas, preparado como se mencionó en el numeral 5.2.7.1. Se realizó una

siembra masiva de 50μl de la suspensión celular, la cual ocupó 2cm del borde de la caja al

centro. Esta siembra se dejó incubando por 48 horas a temperatura ambiente, para permitir que el microorganismo liberara metabolitos al medio que inhibieran el crecimiento del patógeno. Pasadas las 48 horas, se sembró un disco de agar con la cepa G1 a 3cm del borde de la caja al centro, frente a la cepa antagonista. Se tuvo como testigo, el crecimiento de la cepa G1 sola, para así poder establecer el porcentaje de inhibición correspondiente a cada aislamiento. Para ello se usó la siguiente fórmula:

(24)

24

Se realizó la lectura 10 días después de la siembra del hongo y se sembraron cuatro réplicas por aislamiento seleccionado.

5.2.8. Cuantificación de la producción de AIA

5.2.8.1. Curva de calibración del reactivo de Salkowski.

El montaje de la reacción y de la curva de calibración, se realizó siguiendo el protocolo de Celis y Gallardo (2008), y Califa y González (2009).

5.2.8.2. Cultivo discontinuo en caldo BT de las cepas aisladas y cuantificación de AIA a partir

de los mismos

Para inducir la producción de AIA durante el cultivo discontinuo, se usó el medio líquido BT, con una concentración de triptona de 20g/L (Celis y Gallardo, 2008). Los cultivos se mantuvieron en agitación constante 120 rpm a 26°C durante 96 horas, protegidos de la luz y se realizó un muestreo a la hora 96, que según Califa y González (2009) es el pico de producción de este metabolito; se manejaron tres réplicas por cepa aislada, de igual forma cada reacción por cepa se hizo por triplicado (Ramos y Valero, 2009). La reacción a partir de cada cultivo se realizó como lo describen Celis y Gallardo (2008).Como microorganismo de referencia se usó a una cepa Azotobacter vinelandii ATCC 12518.

5.2.9. Cuantificación de la producción de sideróforos

5.2.9.1. Curva de calibración Cromo Azurol S (CAS)

El montaje de la reacción, asi como el de la curva de calibración se realizó como lo describen Ramos y Valero (2009), Diaz (2009).

5.2.9.2. Cultivo discontinuo en medio mínimo (Simmon y Tessman) y cuantificación de sideróforos a partir de los mismos

La inducción para la producción de sideróforos se usó el medio de cultivo líquido Simmon & Tessman (1963) probando inicialmente la glucosa y el acido succínico como fuentes de carbono, y nitrato de amonio junto con caseína hidrolizada ácida como fuentes de nitrógeno. El tiempo de cultivo fue de 96 horas y se realizó la reacción de cada cultivo, como lo describió Diaz (2009). Como microorganismo control para la producción de sideróforos se

usó una cepa de Pseudomonas fluorescens ATCC BAA 477.

5.2.10. Pruebas de promoción de crecimiento en invernadero

(25)

25

condiciones apropiadas para el ensayo. Cuando las plántulas tuvieron un mes y un par de hojas verdaderas, se trasplantaron a semilleros de 72 alveolos (Riveros, 2008) en suelo con cascarilla, luego las plántulas se inocularon con 500μl de la suspensión de las cepa seleccionadas, preparada como se describió en el numeral 5.2.6.3. Se realizó un seguimiento durante un mes, evaluando al final: altura, longitud de raíz, número de brotes y peso seco (Riveros, 2008).

5.2.11. Desarrollo del banco de germoplasma

A partir de las cepas aisladas y puras sembradas en un medio nutritivo por 48 horas, se realizó el banco. El medio usado para la criopreservación tiene glicerol al 30%, peptona 5g/l y extracto de carne 3g/l. Se depositó 1.2mL de este medio en tubos eppendorf estériles y luego se suspendió una colonia de la cepa a conservar, posteriormente se conservó en temperatura de -20°C.

5.3. Análisis de información

Para las variables de tipo continuo se realizó un análisis estadístico de varianza ANOVA, para así identificar si hay o no diferencias significativas entre los resultados obtenidos con cada cepa evaluada. Todas las herramientas estadísticas de análisis se aplicaron con una confianza mínima del 95% y se utilizó el software SPSS.

6. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1. Aislamiento e identificación bioquímica de cepas aisladas

En el primer y segundo muestreos realizados se hizo la selección de las rizobacterias de interés, mediante un aislamiento selectivo, por medio de protocolos y medios de cultivo que permitían la diferenciación fenotípica de los géneros Bacillus y Pseudomonas, así como de

(26)

26

14 cepas y dentro del género Bacillus dos cepas y un actinomycete, con las cuales se

trabajaron las pruebas anteriormente descritas en la metodología.

Tabla 1. Resultados de la identificación bioquímica. 1° y 2° muestreo.

Primer muestreo Segundo muestreo

Pseudomonas fluorescens

A1, A4, B4, B8, B11, B13, C1, C2, C3, C4, C6, C7, C11, C15.

Pseudomonas fluorescens

O1, O31, O5, O6, O7, O12, O14, O16, O23, O24, O27, O181.

Bacillus sp.

SB1, SB7.

Bacillus sp

OS1, OS3, OS6, OS14, OS15, OS16, OS19, OS20, OS21

Actinomycetes

AC1

Actinomycetes

AC3

Cepas identificadas como Bacillus cereus

En el segundo muestreo se aislaron 22 cepas de cocobacilos Gram negativos y 13 cepas de bacilos Gram positivos esporulados, contrario a lo anterior, en este caso se trabajó con la totalidad de las cepas aisladas inicialmente, realizando al final la identificación bioquímica. Para este muestreo se encontraron 12 cepas P. fluorescens, un Actinomycete y 9 cepas del

género Bacillus. En este último caso es interesante observar que los aislamientos

pertenecientes al género Bacillus, al realizar la prueba lecitinasas, para descartar al

patógeno B. cereus, fueron en su mayoría positivo, ubicándolos dentro de esta especie.

Aunque B. cereus es un patógeno humano, está reportado en literatura como un PGPR

debido a la capacidad de producción de giberelinas (Joo et al., 2004), las cuales son

reguladores de crecimiento vegetal involucrados en la división y elongación celular, formación y desarrollo de frutos además de actuar en la floración (Blake, et al., 2000).

También esta reportado este género como un activador de la respuesta sistémica inducida (ISR) (Halfeld-Viera, et al. 2006) por producir moléculas señalizadoras y elicitoras, que

activan el sistema de defensa de la planta, para que esta actúe frente a los patógenos de forma más eficiente (Halfeld-Viera, et al. 2006; Van Loon y Bakker, 2005). Para aumentar la

(27)

27

(Bergey, 2000), por lo cual se propone el uso de glucosa en el medio, para que luego de realizar el choque térmico y eliminar durante este los microorganismos no esporulados, se recuperen con mayor facilidad las bacterias de interés.

6.2. Producción de Acido indol-acético

Los reguladores de crecimiento vegetal (PGRs) son sustancias orgánicas que influencian la fisiología y desarrollo de la planta a concentraciones muy bajas (actúan a concentraciones

internas menores a 1μM) (García et al., 2005). Las bacterias habitantes de la rizósfera

pueden influenciar el crecimiento de las plantas contribuyendo con el pool endógeno de PGRs en estas, como las auxinas, entre las que se encuentra el Acido Indol-Acético (AIA) (Patten y Glick, 2002). La producción de AIA por las cepas aisladas fue evaluada en medio mínimo con triptona, inductor de la producción de AIA debido a su alto contenido de triptófano, precursor del este metabolito, cuya concentración fue cuantificada por medio de reacción colorimétrica con reactivo de Salkowski. Los resultados se presentan en la tabla 2.

Tabla 2. Producción promedio de AIA (μg/mL) por las cepas bacterianas aisladas. Cepas AIA

(μg/mL) Cepas

AIA

(μg/mL) Cepas

AIA

(μg/mL) Cepas

AIA (μg/mL)

B4 0.44 O11 2.88 AC3 1.25 A4 5.72

PF 0.77 O5 3.17 OS16 0.93 C3 5.91

O26 0.86 O27 3.23 OS4 0.94 O16 6.16

O18 1.89 O6 3.32 OS6 0.95 O15 6.61

O2 2.01 O31 3.36 OS19 1.02 O32 6.73

O25 2.10 O8 3.66 OS15 1.21 O24 8.26

C11 2.18 O181 3.88 OS17 1.23 O1 8.83

C2 2.34 C7 3.89 OS21 1.24 B13 8.94

C1 2.39 B11 3.95 SB7 1.31 B8 9.61

O4 2.51 O7 3.99 OS11 2.08 A. vinelandii 11.93

C4 2.55 O12 4.17 OS1 2.14 O23 14.68

C15 2.59 O13 4.43 OS5 2.61 SB1 0.53

A1 2.69 O14 5.04 OS3 2.75 BS 0.60

C6 2.72 AC1 1.48 OS20 3.10 OS14 0.62

Cocobacilo gram-negativo que presentó mayor producción de AIA, según agrupación Duncan, con significancia <0.05. Bacilos gram-positivos esporulados que presentaron mayor producción de AIA, según agrupación Duncan, con

significancia <0.05. Cepa control, Azotobacter vinelandii ATCC 12518.

Con base en lo anterior y habiendo determinado las diferencias entre las variables por medio de comparación de medias y prueba de Duncan (Anexo 1.1), se observó que la cepa O23 era significativamente diferente a las otras cepas y fue agrupado conjuntamente con el control utilizado, A. vinelandii. Sin embargo, la producción inducida de AIA documentada por

parte del género Pseudomonas, se encuentra en rangos entre 1 y 6.2 μg/mL (aunque se ha

documentado producción de AIA por P. putida de hasta 32.7 μg/mL) (Vasanthakumar y

(28)

28

cepas evaluadas en su mayoría pertenecientes al género. Por otro lado, los bacilos gram-positivos y actinomicetos evaluados presentaron resultados mucho menores a comparación de los cocobacilos gram-negativos, siendo significativamente mejores según la comparación de medias y prueba de Duncan las cepas OS5, OS3 y OS20 (Anexo 1.2.). Se ha encontrado que la producción de AIA en el género Bacillus es generalmente baja aunque se ha

documentado producciones de hasta 55μg/mL (Felici et al., 2008; Tsavkelova, 2006). Es de

mencionar que la literatura en cuanto a la producción de AIA por actinomicetostiene pocos reportes, pero se encuentra documentado actinomicetos del género Streptomyces como

productores de AIA, cuya capacidad de producción alcanza los 5μg/mL (Dimkpa et al.,

2008), valores más altos comparados con los obtenidos por las cepas evaluadas.

6.3. Promoción de germinación

La capacidad de promoción de germinación por parte de las cepas aisladas fue evaluada mediante montaje de semillas inoculadas en cámara húmeda, registrando los estadios de germinación de las semillas durante 25 días. Los resultados obtenidos se analizaron para obtener los índices de germinación relativos (GCR, cociente de capacidad de germinación máxima del tratamiento y el control (agua), que fueron analizados por comparación de medias y análisis Duncan (Anexo 2.). Los resultados se presentan en la tabla 3.

Tabla 3. Índice de Germinación Relativo promedio presentado en cada estadio en los tratamientos con las diferentes cepas aisladas.

Cepas GCR Estadio 1 GCR Estadio 2 GCR Estadio 3 GCR Estadio 4

O1 1.1892 1.1143 1.4375 5.0000

O2 1.1351 1.3143 1.4375 6.0000

O4 0.9459 1.3714 1.4375 3.0000

O5 1.3243 1.1714 1.2500 8.0000

O6 1.1622 1.1429 1.2813 10.0000

O7 0.9730 1.0571 1.0313 5.0000

O8 1.2162 1.2857 1.2500 7.0000

O11 1.0541 1.0857 1.2500 3.0000

O12 1.2162 1.1143 1.4063 3.0000

O13 0.9459 1.0000 1.1250 10.0000

O14 1.0541 0.8286 1.0938 6.0000

O15 1.2703 1.3714 1.3750 6.0000

O16 1.1892 1.2571 0.7188 0.0000

O18 1.3243 1.3714 1.4375 12.0000

O181 1.1351 1.1143 1.1563 0.0000

O23 0.9730 1.0000 1.0938 10.0000

O24 1.2432 1.2857 1.2500 3.0000

O25 1.5405 1.5143 1.7188 13.0000

O26 1.1081 1.3143 1.3750 1.0000

O27 1.2432 1.3143 1.5000 6.0000

O31 1.1081 1.0286 1.1250 5.0000

(29)

29

Cepas GCR Estadio 1 GCR Estadio 2 GCR Estadio 3 GCR Estadio 4

A1 1.2051 1.1892 1.0625 0.0000

A4 1.1538 1.1622 0.9063 0.0000

B4 0.7949 0.9730 0.8438 0.5000

B8 1.0000 1.0541 1.0313 0.5000

B11 0.9744 1.0000 0.9063 0.0000

B13 1.0000 1.0270 1.0625 1.0000

C1 1.1026 1.1892 1.0625 0.5000

C2 1.0513 1.1622 1.0000 0.0000

C3 0.9744 0.9730 1.0313 0.0000

C4 1.1538 1.2432 1.2500 0.5000

C6 1.0769 1.0000 1.0000 0.0000

C7 1.1795 1.1622 1.2813 0.5000

C11 1.1026 1.0811 1.1875 0.5000

C15 1.0769 1.2703 1.0625 0.0000

PF 0.9744 1.0811 1.0938 0.0000

BS 0.9744 1.0541 0.9063 0.0000

SB1 1.2821 1.1892 1.5000 0.0000

SB7 1.2308 1.1081 1.1250 1.0000

OS1 0.8864 0.8864 0.8929 1.5000

OS3 0.9091 0.8636 0.9643 1.0000

OS4 0.8409 0.8409 0.7857 1.6667

OS5 1.2973 1.0811 1.4483 2.8000

OS6 1.2162 1.1622 1.3448 3.2000

OS11 0.8182 0.7955 0.8929 0.6667

OS14 0.9189 0.7027 0.8621 0.4000

OS15 1.1081 0.9730 1.0000 2.0000

OS16 1.1081 0.9189 0.8621 0.6000

OS17 1.1622 1.0270 1.2759 2.4000

OS19 1.2703 1.3514 1.1724 1.0000

OS20 1.0227 1.0227 1.0000 1.5000

OS21 0.7727 0.7273 0.7500 1.0000

AC1 0.7179 0.7436 0.8261 1.2500

AC3 0.9231 0.9231 1.0000 1.2500

Tratamiento con cocobacilos gram-negativo que presento mayor GCR según agrupación Duncan, (con significancia >0.05 en estadios 1y dos, y <0.05 en estadio 3y4) Tratamiento con bacilos gram-postivos que presentó mayor GCR.

Se debe destacar que en ninguno de los tratamientos de promoción de germinación se observó 100% de semillas germinadas y el análisis de datos para las réplicas de un mismo tratamiento arrojaba diferencias significativas entre ellas, lo cual puede ser causado a la variabilidad genética de la semillas, ya que en Colombia no se tienen variedades genotípicamente homogéneas y tampoco un sistema organizado de producción de semillas, el cual está basado en la selección de las plantas de mayor productividad de frutos en el cultivo (López etal., 2007).

(30)

30

estadios se presentaba solapamiento en los grupos y significancias mayores a 0.05 (Anexo 2.).

Los actinomicetos evaluados presentaron GCR menores o iguales a 1 en los estadios 1, 2 y 3 lo que indica que sus índices de germinación fueron menores a los que control con agua, es decir, no presentaron promoción de germinación, mientras que en el estadio 4 fueron mayores, aunque no fueron tan altos como los presentados presentados por los tratamientos con gram-negativos en los que se observan GCRs mayores a 5 en el estadio 4 con muy buena promoción de germinación.

6.4. Promoción de crecimiento en invernadero

La promoción de crecimiento en invernadero fue observada por medio de evaluación de longitud de raíz y tallo (Figura 1.), peso seco y número de brotes (Figura 2).

C e p a s

H 2 O A 1 A 4 B 4 B 8 B 1 1 B 1 3 C 1 C 2 C 3 C 4 C 6 C 7 C 1 1 C 1 5 P F B S S B 1 S B 7

Lo

ng

itu

d

(c

m

)

0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8

L o n g itu d d e ra iz L o n g itu d d e ta llo

Figura 1. Longitud promedio en tallo y raíz de las plántulas de uchuva tratadas en invernadero.

(31)

31

En cuanto al número de brotes, en la mayoría de tratamientos se presentó un promedio de número de brotes superior al control, siendo los mejores, según agrupación Duncan (Anexo 7, tabla 7.4.), C4, B8, BS y C3 (p<0.001).

C e p a s

H 2 O A 1 A 4 B 4 B 8 B 1 1 B 1 3 C 1 C 2 C 3 C 4 C 6 C 7 C 1 1 C 1 5 P F B S S B 1 S B 7

P es o se co (g )

0 .0 0 0 .0 2 0 .0 4 0 .0 6 0 .0 8 0 .1 0

N o. b ro te s 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0 2 .5 3 .0 3 .5

P re s o s e c o N o . d e b ro te s

Figura 2. Peso seco promedio y número de brotes de las plántulas de uchuva tratadas en invernadero.

El peso seco se encuentra relacionado con la longitud de tallos, raíces y número de brotes (López et al., 2008). De acuerdo a esto, las plantas de los tratamientos que presentaron

mayores longitudes de raíz, tallo y número de brotes, también presentaron mayor peso seco. Los tratamientos que presentaron mayor peso seco fueron los inoculados con las cepas C4 y SB7, siendo la mayor BS.

6.5. Cuantificación de sideróforos de las cepas aisladas

Los sideróforos son uno de los mecanismos indirectos usados por las PGPRs para captar hierro, sin embargo estos solo se producen cuando los microorganismos se encuentran en condiciones hipoférricas. El suelo solo provee 10-18M de este metal (Mercado-Blanco, et al.

2001), esta condición hace que las rizobacterias, entre otro tipo de microorganismos, generen estos compuestos para asegurar su supervivencia. Los resultados de la prueba se muestran en la tabla 4, en donde se observaron las concentraciones finales de sideróforos las cuales presentaron diferencias significativas al presentar un p<0.001 en el análisis de

varianza (Anexo 4). Dentro de las cepas Gram negativas las mejores fueron O5, O181 y O24, las cuales comparadas con el control P. fluorescens, tuvieron una mejor producción de

(32)

32

producción, pero comparadas con el control B. subtilis hubo diferencias significativas entre

estos, siendo muy superiores en su producción. Por último, los resultados obtenidos con las cepas de actinomycetes muestran una producción mucho mayor a la del control P.

fluorescentes y de hecho se observa que obtuvieron las más altas concentraciones

comparado con las cepas Gram negativas y Gram positivas.

Tabla 4. Concentración de sideróforos producidos por las cepas aisladas

Cepa [] μg/ml

sideróforos Cepa

[] μg/ml

sideróforos Cepa

[] μg/ml

sideróforos Cepa

[] μg/ml sideróforos

A1 120,36 PF 116,40 O12 111,43 OS4 40,56

A4 19,43 BS 34,94 O13 69,56 OS5 21,38

B4 4,82 SB1 29,65 O14 74,89 OS6 5,03

B8 121,43 SB7 0 O15+ 96,36 OS11 14,12

B11+ 117,20 O1 110,45 O16 116,54 OS14 3,96

B13 120,00 O2+ 117,29 O18 106,72 OS15 0,39

C1 108,36 O31 116,98 O181+ 124,63 OS16 3,96

C2+ 102,89 O32 84,32 O23+ 123,38 OS17 81,07

C3+ 122,76 O4 49,12 O24 124,80 OS19 4,03

C4 35,69 O5+ 125,12 O25 120,85 OS20 0

C6+ 60,49 O6 110,23 O26+ 21,26 OS21 9,51

C7+ 89,12 O7 108,58 O27 105,83 AC1 131,07

C11 77,07 O8 114,58 OS1 40,36 AC3+ 133,87

C15+ 105,12 O11 110,09 OS3 92,76

Cepa Gram negativa con mayor producción de sideróforos, Cepas de actinomycetes, Cepa Gram positiva con mayor producción de sideróforos, Control para la producción de Sideróforos Pseudomonas fluorescens ATCCBAA477 . + Cepas que

emitieron fluorescencia al final del cultivo.

Las bacterias pertenecientes al género Bacillus no se caracterizan por producir altas

concentraciones de sideróforos, esto es consistente con los resultados obtenidos, ya que como se observa las concentraciones son muy bajas comparando con el resto de los aislamientos, incluso algunos no presentan producción. Se ha reportado que bacterias de este género producen un sideróforo denominado bacillibactina, perteneciente a la familia de los catecolatos; este fue aislado inicialmente de B. subtilis (Wilson et al., 2006). También se

ha encontrado que B. cereus produce un sideróforo de citrato, denominado petrobactina el

cual estaba asociado únicamente a B. antrhacis, pero que gracias a estudios posteriores

está relacionado además de estas dos especies a B. thuringiensis (Wilson et al., 2006).

Durante el cultivo discontinuo de las cepas Gram negativas y de los actinomycetes se observó en algunas de estas, una pigmentación verde del medio, el cual al exponerse a luz

(33)

33

UV emitía fluorescencia (Figura 3.), esto se debe a la producción de pioverdina que es el sideróforo más comúnmente secretado por las cepas fluorescentes de Pseudomonas

Adicionalmente, se observó que las cepas que emitieron fluorescencia también presentaron los valores más altos de producción de sideróforos (60-124µg/mL), exceptuando a la cepa O26 (21,26µg/mL). Se ha reportado también que este género es capaz de producir otros

tipos de sideróforos, como pseudomonina, quinolobactina, corrugativa, nocardamina y ácido piridina-2,6-ditiocarboxílico (Cornelis y Matthijs, 2002 citado por Luque, 2007; Budzikiewiez, 1997). Esta razón puede explicar el por qué cepas como la O24 no presentaron fluorescencia pero si registraron alta la producción de sideróforos, al igual que otras cepas evaluadas que tampoco emitieron fluorescencia al exponerlas a luz UV.

a. b.

Figura 3. Cultivo discontinuo en medio mínimo Simmon y Tessman.

Cepa C2, a las 96 horas de cultivo. a. Se observa la pigmentación verde por producción de pioverdinas; b. Se observa la fluorescencia al exponerse a luz UV.

Los resultados obtenidos con las cepas de actinomicetos son consistentes con los resultados de Díaz (2009), quien reporta en una de sus cepas valores de hasta 237μg/mL y por Franco (2008) quien reportó un máximo de producción de 142μg/ml al día 11 de cultivo. En estos cultivos también se observó la producción de pioverdina.

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34

6.6. Pruebas de antagonismo frente a Fusarium sp

Los porcentajes de inhibición obtenidos, fueron agrupados mediante el análisis de Duncan, encontrándose diferencias significativas entre estos obteniéndose un p<0.001 (Anexo 5).

Como se puede ver, las cepas con mejores porcentajes de inhibición entre los cocobacilos Gram negativos fueron C2, O24 y O26; dentro de los bacilos Gram positivos la mejor cepa fue SB7, y en esta prueba los actinomycetes no se destacaron pero tampoco estuvieron por debajo del 50% de inhibición.

Tabla 5. Porcentaje de inhibición de las cepas aisladas frente a Fusarium sp. Cepa %inhibición Cepa %inhibición Cepa %inhibición Cepa %inhibición

A1 39,11 PF 57,64 O12 42,68 OS4 17,88

A4 38,55 BS 35,36 O13 38,21 OS5 17,88

B4 27,94 SB1 28,38 O14 34,47 OS6 12,60

B8 29,03 SB7 55,45 O15 38,21 OS11 14,63

B11 36,17 O1 40,72 O16 33,46 OS14 18,29

B13 42,33 O2 39,02 O18 48,29 OS15 16,26

C1 60,16 O31 29,59 O181 22,35 OS16 17,47

C2 75,98 O32 36,17 O23 26,01 OS17 15,72

C3 44,10 O4 36,54 O24 73,57 OS19 17,47

C4 28,91 O5 38,21 O25 54,41 OS20 46,98

C6 36,69 O6 27,64 O26 71,48 OS21 24,39

C7 64,62 O7 32,52 O27 57,25 AC1 58,15

C11 49,95 O8 37,34 OS1 25,30 AC3 50,62

C15 39,43 O11 34,55 OS3 26,50

Cepa Gram negativa con mayor % de inhibición, Cepa Gram positiva con mayor % de inhibición, % de inhibición presentados por las cepas de actinomycetes.

En cuanto a los resultados obtenidos en las pruebas de antagonismo frente a Fusarium sp.

se esperaba que los microorganismos con mayor producción de sideróforos fueran los que presentaran los mayores porcentajes de inhibición del patógeno. Como se puede ver, solo la cepa O24 coincide con los resultados esperados, ya que en la prueba de cuantificación de sideróforos presentó uno de los mejores resultados y en la prueba de antagonismo presentó un porcentaje de inhibición de 73,57%, uno de los mejores también. Es importante mencionar que los sideróforos son solo uno de los diversos metabolitos que pueden producir las PGPRs para inhibir el crecimiento de patógenos, dentro de la literatura se mencionan enzimas líticas como proteasas, quitinasas y glucanasas (Adesina, et al. 2007). También se

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Pseudomonas y Streptomyces (Fernando et al., 2005). En cuanto a las bacterias del género

Bacillus, se reportan diversos lipopéptidos con propiedades antifúngicas como iturina,

bacillomicina, plipastatina, surfactina y aminopolioles (Fernando et al., 2005). Es posible que

en cepas como C2, que presentó una baja producción de sideróforos, inhibió al patógeno mediante la producción no solo de estos metabolitos, sino que también mediante la producción de enzimas o antibióticos, como los que se mencionaron anteriormente. Este también puede ser el caso de los bacilos Gram positivos y de los actinomycetes. En estos últimos se observó la producción de pigmentos que se difundieron en el medio de cultivo (Figura 4).

a. b. c.

d.

Figura 4. Imágenes de la prueba de Antagonismo

Se observa el crecimiento influenciado y no influenciado de Fusarium sp., frente a las bacterias antagonistas, a los 10 días de incubación. a. cepa O24 se observa la inhibición del crecimiento del hongo, b. cepa OS14 no hay inhibición del crecimiento del

hongo, c. Control, d. cepa de actinomycetes AC3.

Estos resultados son consistentes con los reportados por Franco (2008) quien reportó un porcentaje de inhibición de 68% frente a F. oxysporum, solo con uno de sus aislamientos.

Estos resultados, en general, superan los obtenidos por Ramos y Valero (2009), cuyos aislamientos de Gram negativos y Gram positivos, no superaron el 40% de inhibición frente a

Fusarium sp. Es posible que los porcentajes de inhibición obtenidos con nuestros

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36

6.7. Discusión general

Evaluando el porcentaje de cepas promisorias para PGPR obtenido con respecto al total aislado durante el primer y segundo muestreo, se observó que el porcentaje de cepas promisorias obtenido durante el segundo muestreo (Anexo 8), por lo cual se estableció que es mejor trabajar con todos los aislamientos durante los ensayos para establecer las cepas promisorias para promoción de crecimiento, de tal manera que no se sesguen los resultados, descartando cepas que aunque no pertenezcan a los géneros de interés, puedan presentar buenos resultados en los ensayos realizados, y por tanto presentar un buen perfil como rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal.

El ácido indol acético promueve el crecimiento radicular y es uno de los parámetros más utilizados para medir los efectos beneficiosos de las bacterias promotoras de crecimiento, ya que ayudan al rápido establecimiento de raíces y anclaje de la planta al suelo, mejorando la capacidad de obtención de agua y nutrientes del medio y por tanto aumentando sus posibilidades de sobrevivencia (Patten y Glick, 2002). Sin embargo, la producción de AIA parece no ser proporcional al efecto de promoción de crecimiento que pueda tener una PGPR sobre una planta evaluado por medio de índice de germinación relativo, ya que la cepa O23, mayor productora de AIA, no presentó GCR altos en los primeros estadios de germinación como se esperaría; mientras que el tratamiento con la cepa O25 presentó los mejores GCR en todos los estadios de geminación aunque esta no se encontró entre los mejores productores de AIA (Anexo 2). Adicionalmente, los índices de correlación Pearson evaluados entre la producción de AIA y el GCR relativo para cada estadío de germinacón son menores a 0,1 para los estadios 1, 2 y 3, mostrando que no se presenta correlación entre estas dos variables, y aunque en el estadio 4 el valor de correlación aumenta (r=0.240), no es representativo. El mismo comportamiento se observó en las pruebas de promoción de crecimiento en invernadero en relación a la producción de ácido indol acético. Los mayores valores de longitud de raíz, tallo, número de brotes y peso seco (cepas C4, SB7, BS, A1, C4, C7 y C1), no corresponden con las mejores cepas productoras de AIA (1 - 4μg/mL), mientras que las cepas B13 y B11 presentaron alta producción de AIA (8.94 y 9.61

μg/mL respectivamente), no presentaron promoción en crecimiento de raíz y tallo (Figura 2).

Respecto a los resultados mencionados anteriormente se presume que las concentraciones de AIA en algunas cepas, aunque bajas, pueden ser suficientes para tener una influencia directa sobre la germinación, teniendo en cuenta que los reguladores de crecimiento vegetal

actúan en bajas concentraciones (menores a 1μM) (García et al., 2005). Adicionalmente se

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37

la rizosfera durante un periodo de tiempo considerable para que esta tenga efecto (Compant

et al., 2005). Estos resultados también podrían confirmar lo propuesto por Glick y

colaboradores (1998), en donde una alta concentración de AIA producido por las rizobacterias sumado al AIA producido endógenamente por la planta pueden activar la producción de 1-Acido 1-aminociclopropano 1-carboxilico (ACC), precursor del etileno, el cual puede anular la acción del AIA inhibiendo la elongación celular en la planta.

Por otro lado, un único mecanismo puede ser responsable por algún porcentaje de la promoción de crecimiento observada, pero el ciento por ciento de la promoción de crecimiento debe ser atribuida a los muchos mecanismos que actúan sinérgicamente durante la etapa de desarrollo de la planta (Kloepper, 2003). Entonces, además de la producción de AIA, otros mecanismos se encuentran involucrados en la promoción de crecimiento de las plantas por parte de la PGPRs, entre estos la colonización competitiva de raíces, la producción de sideróforos, la solubilización de nutrientes en el suelo y la producción de antibióticos y enzimas líticas para combatir patógenos (Patten y Glick, 2002; Antoun y Prevost, 2005; Compant et. al, 2005).

Los sideróforos y la capacidad antagonista están relacionados, ya que la capacidad de producir estos metabolitos es una ventaja competitiva de las PGPRs frente a microorganismos que no son capaces de producirlos, inhibiendo el crecimiento de patógenos en condiciones limitantes de hierro. Sin embargo, al realizar el análisis de correlación entre estas dos variables no se observa una relación significativa entre los dos (r: 0.409). En la literatura se observa que en las pruebas de antagonismo para estimular la producción de sideróforos y así identificar a los posibles antagonistas, la técnica de enfrentamiento en placa es montada en un medio en donde las concentraciones de hierro son limitantes, asegurando de esta forma la secreción de estos metabolitos. Con este fin se usa generalmente el medio King B para este tipo de pruebas (Sindhu et al., 1999;

Mercado-Blanco et al., 2004; Adesina et al., 2007), también agar Martin desferrizado (Kurek y

Jaroszuk-SScisel, 2003). De esta forma se asume que se podrán obtener resultados directamente relacionados con la producción de sideróforos, ya que como se sabe el medio PDA es complejo y puede traer consigo trazas de hierro que inhiban la producción de los mismos.

Figure

Tabla de contenido

Tabla de

contenido p.7
Tabla 1. Resultados de la identificación bioquímica. 1° y 2° muestreo.

Tabla 1.

Resultados de la identificación bioquímica. 1° y 2° muestreo. p.26
Tabla 2. Producción promedio de AIA (μg/mL) por las cepas bacterianas aisladas.

Tabla 2.

Producción promedio de AIA (μg/mL) por las cepas bacterianas aisladas. p.27
Tabla 3. Índice de Germinación Relativo promedio presentado en cada estadio en los tratamientos con las diferentes cepas aisladas

Tabla 3.

Índice de Germinación Relativo promedio presentado en cada estadio en los tratamientos con las diferentes cepas aisladas p.28
Figura 2. Peso seco promedio y número de brotes de las plántulas de uchuva tratadas en invernadero

Figura 2.

Peso seco promedio y número de brotes de las plántulas de uchuva tratadas en invernadero p.31
Tabla 4. Concentración de sideróforos producidos por las cepas aisladas

Tabla 4.

Concentración de sideróforos producidos por las cepas aisladas p.32
Figura 3. Cultivo discontinuo en medio mínimo Simmon y Tessman.

Figura 3.

Cultivo discontinuo en medio mínimo Simmon y Tessman. p.33
Tabla 5.  Porcentaje de inhibición de las cepas aisladas frente a Fusarium sp.

Tabla 5.

Porcentaje de inhibición de las cepas aisladas frente a Fusarium sp. p.34

Referencias

  1. endoespora