Obtención, aislamiento e identificación de metabolitos secundarios de la especie vegetal Lobelia decurrens con posible potencial antitumoral

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UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA

La Universidad Católica de Loja

ÁREA BIOLÓGICA Y BIOMÉDICA

TITULO DE BIOQUÍMICO FARMACÉUTICO

Obtención, aislamiento e identificación de metabolitos secundarios de la especie

vegetal

Lobelia decurrens

con posible potencial antitumoral

TRABAJO DE TITULACIÓN

AUTOR:

Villamar Pardo, Darwin Oswaldo

DIRECTOR:

Romero Benavides, Juan Carlos, PhD.

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Esta versión digital, ha sido acreditada bajo la licencia Creative Commons 4.0, CC BY-NY-SA: Reconocimiento-No comercial-Compartir igual; la cual permite copiar, distribuir y comunicar públicamente la obra, mientras se reconozca la autoría original, no se utilice con fines comerciales y se permiten obras derivadas, siempre que mantenga la misma licencia al ser divulgada. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/deed.es

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APROBACIÓN DEL DIRECTOR DE TRABAJO DE TITULACIÓN

PhD.

Juan Carlos Romero Benavides

DOCENTE DE LA TITULACIÓN

De mi consideración

En el presente trabajo de titulación “Obtención, aislamiento e identificación de metabolitos secundarios de la especie Lobelia decurrens, con posible potencial antitumoral”, realizado por Villamar Pardo Darwin Oswaldo, el mismo que ha sido orientando y revisado durante su ejecución, por cuanto se aprueba la presentación del mismo.

Loja, octubre del 2016

f)……….

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DECLARACIÓN DE AUTORIA Y CESIÓN DE DERECHOS

Yo, Villamar Pardo Darwin Oswaldo, declaro ser el autor del presente trabajo de titulación

“Obtención, aislamiento e identificación de metabolitos secundarios de la especie vegetal Lobelia decurrens con posible potencial antitumoral” de la titulación de

Bioquímica y Farmacia, siendo el PhD Juan Carlos Romero Benavides director del presente trabajo; y eximo a la Universidad Técnica Particular de Loja y a sus representantes legales de posibles reclamos o acciones legales. Además, certifico que las ideas, conceptos, procedimientos y resultados vertidos en el presente trabajo investigativo, son de mi exclusiva responsabilidad.

Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposición del Art. 88 del Estatuto Orgánico de la Universidad Técnica Particular de Loja que en su parte pertinente textualmente dice: “Forman

parte del patrimonio de la Universidad la propiedad intelectual de investigaciones, trabajos científicos o técnicos y tesis de grado o trabajos de titulación que se realicen con el apoyo

financiero, académico o institucional (operativo) de la Universidad”

f)………..

Villamar Pardo Darwin Oswaldo

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DEDICATORIA

Dedico este trabajo en primer lugar a DIOS, que es la fuente de toda fuerza y voluntad, ya que con su bendición y ayuda todo sueño se logra alcanzar.

A mis padres OSWALDO VILLAMAR Y GLADYS PARDO que son y siempre serán el apoyo fundamental en cada decisión tomada en mi vida, ya que, gracias a sus consejos, esfuerzo, valores inculcados y enseñanzas de perseverancia y dedicación, he logrado terminar esta meta planteada.

A mis hermanos DANIEL, JESSICA Y JEFFERSON que con su apoyo y ejemplo me han ayudado a que este proyecto de vida sea posible, ya que siempre me enseñaron a no darme por vencido ante los obstáculos que se presentan en el día a día.

Así mismo dedico este trabajo a MARIANA TANDAZO, por la ayuda, consejos, palabras de aliento y por ser mi inspiración durante la realización de este proyecto.

A mis familiares, amigos y personas que de una u otra manera han influenciado en mi vida y me han ayudado a desarrollarme como persona, estudiante con la finalidad de alcanzar un sueño planteado.

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AGRADECIMIENTO

Agradecido con Dios por permitirme cumplir con esta meta, por ser parte de mi vida, por estar presente en los momentos más difíciles, por ayudarme a salir adelante en cada momento, y por bendecirme con una familia tan cariñosa.

Así como también agradezco a mis padres por el apoyo incondicional, han estado a mi lado en cada instante de mi vida con sus palabras, consejos de superación, porque es gracias a ellos es que este proyecto de mi vida se hizo posible.

A mis hermanos que, con su ayuda, me han inspirado a seguir adelante dándome palabras de aliento y estando a mi lado cada momento.

A mis amigos Rómulo, Leonardo, Fernando, Stalin, Paola, Cristian Tacuri, Cristian Ogoño, Santiago Jaramillo, Willan Sauca, Rafael cueva, que siempre han logrado estar el momento adecuado para darme un consejo, una palabra de aliento, y por todo su apoyo incondicional.

Agradecido con el Doctor. Juan Carlos Romero Benavides por su colaboración y ayuda con sus conocimientos, consejos, críticas, y sugerencias, que han servido para que este sueño sea logrado.

Mi más sincero agradecimiento al Bioquímico Farmacéutico Ronald Silva, que con sus conocimientos y su calidad de persona me ha proporcionado la ayuda adecuada para finalizar este trabajo, dándome así también un ejemplo como persona y amigo.

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ÍNDICE DE CONTENIDOS

CARÁTULA ... i

APROBACIÓN DEL DIRECTOR DE TRABAJO DE TITULACIÓN ... ii

DECLARACIÓN DE AUTORIA Y CESIÓN DE DERECHOS ... iii

DEDICATORIA ... iv

AGRADECIMIENTO ... v

ÍNDICE DE CONTENIDOS ... v

ÍNDICE DE FIGURAS ... x

ÍNDICE DE TABLAS ... xi

ABREVIATURAS ... xiii

RESÚMEN ... 1

ABSTRACT ... 2

INTRODUCCIÓN ... 3

CAPITULO I FIN, PROPÓSITO Y COMPONETES DEL PROYECTO ... 5

1.1 Fin, propósito y componentes del proyecto ... 6

1.1.1 Fin del proyecto. ... 6

1.1.2 Propósito del Proyecto. ... 6

1.1.3 Componentes del Proyecto. ... 6

2 CAPITULO II MARCO TEÓRICO ... 7

2.1 Aspectos generales ... 8

2.1.1 Antecedentes y Biodiversidad en el Ecuador. ... 8

2.1.2 Cáncer y medicina tradicional. ... 9

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vii

2.1.4 Metabolitos secundarios. ... 10

2.1.5 Descripción de las características de la familia Campanulácea y de la especie L. decurrens. ... 11

2.1.5.1 Familia campanulácea y especie L. decurrens. ... 11

2.1.5.2 Descripción de la especie L. decurrens. ... 12

2.1.5.3 Composición química. ... 12

2.2 Técnicas para la obtención, aislamiento e identificación de metabolitos secundarios ... 15

2.2.1 Maceración. ... 15

2.2.1.1 Maceración Estática. ... 15

2.2.2 Cromatografía. ... 15

2.2.2.1 Cromatografía en capa fina (CCF). ... 16

2.2.2.2 Cromatografía en columna abierta (CCA). ... 16

2.2.2.3 Cromatografía en fase inversa. ... 17

2.2.3 Cristalización... 17

2.2.4 Punto de fusión. ... 18

2.2.5 Cromatografía de gases acoplada a espectroscopía de masas (CG/EM). 18 2.2.6 Resonancia Magnética Nuclear (RMN). ... 19

3 CAPITULO III MATERIALES Y METODOS ... 20

3.1 Esquema ... 21

3.2 Selección y preparación de la muestra ... 21

3.3 Obtención de los extractos ... 23

3.4 Desclorofilación del extracto de acetato de etilo ... 25

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viii

3.5.1 Cromatografía en columna abierta. ... 25

3.5.2 Cromatografía en capa fina. ... 25

3.6 Unión y cristalización ... 25

3.7 Caracterización de metabolitos ... 26

3.7.1 Punto de fusión. ... 26

3.7.2 Solubilidad. ... 26

3.7.3 Factor de retención. ... 26

3.7.4 Cromatografía de gases acoplado a espectroscopia de masas (CG/EM). . 27

3.7.5 Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). ... 27

3.8 Evaluación de la actividad antitumoral. ... 28

4 CAPITULO IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 29

4.1 Recolección de la especie, identificación, y obtención de extractos en hexano, acetato de etilo y metanol. ... 30

4.2 Rendimientos y análisis de los extractos obtenidos de L. decurrens ... 30

4.3 Evaluación de la actividad antitumoral ... 31

4.4 Aislamiento de metabolitos secundarios ... 31

4.4.1 Extracto de acetato de etilo. ... 31

4.4.1.1 Desclorofilación del extracto de acetato de etilo. ... 31

4.4.1.2 Elución mediante cromatografía en columna abierta de la fracción desclorofilada Fr1. ... 33

4.4.1.3 Elución mediante cromatografía en columna abierta de la fracción desclorofilada Fr8. ... 36

4.5 Extracto metanólico ... 42

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ix

CONCLUSIONES ... 48

BIBLIOGRAFÍA ... 49

(11)

x

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Lobelina

... 13

Figura 2. Palmitato de β

-amirina

... 13

Figura 3. Lobetyolin

... 14

Figura 4. Apigenina

... 14

Figura 5. Esquema de la metodología empleada

... 21

Figura 6. Mapa del cantón Saraguro

... 22

Figura 7. Cámara de secado

... 23

Figura 8. Maceración de la materia vegetal

... 24

Figura 9. Rota evaporación del extracto

... 24

Figura 10. Equipo fisher-Johns-Melting

... 26

Figura 11. Extractos obtenidos de la especie

L. decurrens ... 30

Figura 12. Citropten (

1

)

... 34

Figura 13. Alfa amirina

(2

)

... 37

Figura 14. Lupeol (

3

)

... 38

(12)

xi

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Descripción de la especie

L. decurrens ... 12

Tabla 2: Características del CG/EM

... 27

Tabla 3. Rendimiento de los extractos de la especie

L. decurrens ... 30

Tabla 4. Inhibición de los extractos en varias líneas celulares

... 31

Tabla 5. Fracciones de la desclorofilación del extracto de acetato de etilo

... 32

Tabla 6. Unión de fracciones de la fracción Fr1 desclorofilada

... 33

Tabla 7. Datos espectroscópicos RMN

13

C correspondiente al citropten (1) comparado

con la referencia bibliográfica

... 35

Tabla 8: Datos espectroscópicos RMN

1

H correspondiente al citropten (1) comparado

con la referencia bibliográfica

... 35

Tabla 9. Unión de fracciones de la Fr8 desclorofilada

... 36

Tabla 10. Comparación de los datos espectroscópicos RMN

13

C de la alfa-amirina (2)

con la bibliografía.

... 38

Tabla 11. Comparación de los datos espectroscópicos RMN

1

H del alfa-amirina (2)

con la bibliografía

... 39

Tabla 12. Comparación de los datos espectroscópicos RMN

13

C del Lupeol (3) con la

bibliografía

... 40

Tabla 13. Comparación de los datos espectroscópicos RMN

1

H del lupeol (3) con la

bibliografía

... 41

Tabla 14. Unión de fracciones del extracto metanólico

... 42

Tabla 15. Comparación de los datos espectroscópicos RMN

13

C de la sacarosa (4)

con la bibliografía

... 44

(13)

xii

(14)

xiii

ABREVIATURAS

AcOEt Acetato de etilo

CCA Cromatografía en columna abierta

CCF Cromatografía en capa fina

CDCl3 Cloroformo deuterado

CG/EM Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas

DO2 Agua deuterada

Hex Hexano

MeOH Metanol

MS Metabolitos secundarios

Pf Punto de fusión

Rf Factor de retención

RMN 1H Resonancia Magnética Nuclear del Protón

RMN 13C Resonancia Magnética Nuclear del Carbón

CH2Cl2 Diclorometano

MCF-7 Línea celular cáncer de mama

D-384 Línea celular de astrocitoma cerebral

PC-3 Línea celular de próstata

RKO Línea celular de cáncer de colon

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1

RESÚMEN

De la especie Lobelia decurrens, se obtuvieron tres extractos de disolventes en polaridad ascendente hexano (Hex), Acetato de etilo (AcOEt) y metanol (MeOH).

El extracto de MeOH presentó mayor rendimiento con 7.8%. El extracto de AcOEt posee un mayor porcentaje de inhibición en las líneas celulares RKO (cáncer de colon), MCF-7 (cáncer de mama), D-384 (astrocitoma cerebral), PC-3 (cáncer de próstata), y HCT-116 (cáncer de colon).

Los extractos fueron trabajados mediante cromatografía en columna abierta, obteniendo del extracto de AcOEt un compuesto identificado como citropten (1) presenta un tiempo de retención de 18.47, punto de fusión de 145-147°C, Rf de 0,64. También se obtuvo una mezcla con punto de fusión de 165-167°, Rf de 0.70 y tiempo de retención de 34.61 y 35.89, en la que se identificó dos compuestos α-amirina (2) y lupeol (3). Del extracto de MeOH se obtuvo un compuesto cristalizado de color blanco identificado como sacarosa (4) con punto de fusión de 185-186°C, Rf de 0.69. Los compuestos fueron identificados con técnicas espectroscópicas y espectrométricas como: RMN, 1H, 13C, punto de fusión y CG/EM.

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ABSTRACT

Of Lobelia decurrens species I obtain three extracts in dissolvents in ascendant polary: hexane (Hex) Acetate etilo (AcoET) and methanol MeOH.

The methanol extract presents more performance it means 7,8%. The extract AcOEt has a better porcent of inhibiton in the cell lines it means in the RKO (colon cancer), MCF-7 (cáncer de mama) D-384 (cerebral astrocynoma), PC-3 (de prostate cancer), y HCT-116 (colon cancer). The extract was made through open chromathic column and obtaining the acetate extract (AcOEt). This is an identified compound named citropten (1) in wich retention presents un 18.47of time in its fusion 145-147°C, Rf of 0.64. Also I obtain one point of fusion in the a 165-167°C mix, and 0.70 Rf whith 34.61 and 35.89 of retained time, in wich compounds I identify two compounds more α-amiryna (2) and Lupeol.

Of the MeOH extract I obtain one withr cristallized compound identidied as saccharose (4) whith a fusion point of 185- 186°C, Rf of 0.69. The identified compounds were found whith espectroscopics techniques and espectroscopics like RMN, 1H, 13C in fusion

point and CG/EM.

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INTRODUCCIÓN

En la actualidad la medicina tradicional es el medio primordial para preservar la salud humana.

Las plantas utilizadas son la plataforma para el progreso de la medicina moderna, se estima que alrededor de tres cuartas partes de la población mundial, todavía se basa en medicamentos procedentes de plantas habitualmente derivados de prácticas ancestrales (Aruna, et al., 2013).

Las plantas medicinales poseen el recurso principal para las poblaciones campesinas de nuestro país. Es así que el 80% de la población local está sujeta a la medicina tradicional y por lo tanto de las plantas o recursos naturales, para el cuidado de la salud y su bienestar (Karuppusamy, 2009). Si consideramos que nuestras culturas andinas, poseen un enorme conocimiento sobre el uso de las plantas, la aumento de especies usadas y las experiencias medicinales, podría ser más diversas de las que hasta ahora se han descubierto y publicado; por lo tanto es esencial proseguir con búsquedas etnobotánicas que consientan sistematizar y enseñar estos ventajosos conocimientos que podrían ser de mucha ayuda para toda la población ecuatoriana (Ansaloni, et al., 2010).

Las plantas producen sustancias que son de mucha utilidad para el bienestar y salud de los seres humanos. Una gran parte de estas sustancias son el resultado del metabolismo secundario. Estas sustancias se utilizan como dispositivos de protección de la planta ante insectos, patógenos, microorganismos, predadores, o inclusive a situaciones ambientales perjudiciales. (Arom, 2008).

A pesar del creciente uso de las plantas medicinales, aún preexiste una importante falta de datos de exploración en este campo, ya que las plantas aportan una gran cantidad de moléculas bioactivas y cada vez, se encuentran más productos naturales que juegan un papel fundamental en el tratamiento enfermedades (Fernoli´s, 2005).

Cerca del 60% de los medicamentos que hoy se manipulan para tratar el cáncer, han sido aislados a partir de especies naturales en donde el reino vegetal ha sido la fuente más significativa. Estos incluyen los alcaloides de la vinca, diterpenos, alcaloides Taxus y lignanos (Castro, et al., 2011).

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4

anuales y perennes, nativas de lugares tropicales y templadas del mundo, pero sobre todo de América. Tiene tallos leñosos finos y flexibles, en la base, con hojas de olor agudo, color verde claro, muy aromático. Las flores son pequeñas pero muy numerosas, tubulares, con el labio inferior más grande que el superior. Habitualmente se agrupan en capullos, en racimo terminal o en mazorca, pero también hay solitarias. Los colores de las flores varían según la especie y la diversidad y van del azul, al morado, al rojo o al blanco (Hassan, et al., 2012).

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5

(20)

6

1.1 Fin, propósito y componentes del proyecto

1.1.1 Fin del proyecto.

Contribuir al estudio fitoquímico e identificación de metabolitos secundarios con posible acción contra el cáncer, para fomentar el uso sustentable de la especie Lobelia decurrens utilizándola en la industria farmacéutica.

1.1.2 Propósito del Proyecto.

Obtención, aislamiento e identificación de metabolitos secundarios de la especie

Lobelia decurrens con potencial antitumoral.

1.1.3 Componentes del Proyecto.

 Recolección e identificación de la especie.

 Obtención de extractos en hexano, acetato de etilo y metanol.

 Fraccionamiento en columna abierta.

 Aislamiento, identificación y caracterizacion de los metabolitos secundarios.

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7

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8

2.1 Aspectos generales

2.1.1 Antecedentes y Biodiversidad en el Ecuador.

Desde el inicio las plantas medicinales han constituido una parte transcendental de la tradición, de la cultura y de los conocimientos de los pueblos indígenas, cuando se habla de plantas medicinales se refiere a su aplicación y uso como tratamiento de malestares ya que establece un conocimiento que aun en estos días se trasfiere de generación en generación (Cosme, 2008).

Se estima que una gran parte de la población mundial aún se fundamenta en medicamentos derivados de plantas, generalmente obtenidos de experiencias ancestrales. Por lo tanto, es incuestionable que la medicina natural juega un papel principal en las estrategias terapéuticas en el mundo moderno (Aruna, et al., 2013).

Las plantas medicinales son las que poseen en una o más de sus partes compuestos activos, que dosificados en cantidades adecuadas provocan efectos beneficiosos para la salud, además se deduce que el 10% de las plantas que existen actualmente se consideran como medicinales, es decir se hallan almacenados en los tratados médicos de fitoterapia efectivos (Cosme, 2008).

Hay cerca de medio millón de plantas en todo el mundo, en las cuales las plantas medicinales tienen un futuro satisfactorio, ya que la mayoría de sus actividades médicas aún no han sido investigadas, y sus actividades médicas podrían ser definitivas en el tratamiento de las enfermedades presentes o futuras (Hassan, et al., 2012).

Las plantas originan una gran cantidad de moléculas bioactivas y cada vez, se localizan más productos naturales que juegan un papel primordial en el tratamiento de enfermedades como el cáncer (Karakaş, et al., 2012).

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Ecuador es calificado como uno de los países que posee la mayor biodiversidad en el mundo, y donde la localidad mantiene sus tradiciones ancestrales en el uso de los recursos naturales, por lo cual contiene una alta oportunidad de investigación sobre los principios activos de muchas especies con el fin de hallar tratamientos alternos en contra del cáncer. En Ecuador es innegable el papel que desempeña el conocimiento tradicional relacionado con la naturaleza, especialmente por su contribución en el desarrollo sostenible (Tene, et al., 2007). Además la variedad de la vegetación ecuatoriana ha sido examinada y reconocida desde mucho tiempo atrás, pues la flora de este país ha sido examinada por ser enormemente rica en plantas útiles (Balslev, et al., 2008).

2.1.2 Cáncer y medicina tradicional.

Una de los padecimientos que más acecha a la humanidad es el cáncer, ya que se le atribuyen tendencias de muertes muy elevadas que están siendo expresadas a nivel mundial, el número de personas que mueren de cáncer en todo el mundo se espera que aumente de 8,2 millones en 2012 a 14.6 millones en el 2035, según datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS, 2014). Algunas infecciones causan incluso un 20% de las víctimas por cáncer en los países de ingresos bajos, y un 9% en los países con niveles de vida elevados. Más del 30% de los fallecimientos por cáncer se pueden prevenir. El cáncer empieza con una modificación en una sola célula, que puede haber sido iniciada por agentes externos o por factores genéticos heredados (OMS, 2014).

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Por lo tanto, es evidente la necesidad de nuevos compuestos para poder contrarrestar enfermedades como cáncer, la medicina tradicional sirve de soporte a la medicina actual ya que aporta conocimientos fundamentales en el descubrimiento de nuevos compuestos. La "medicina tradicional", se centra en la idea de utilizar las plantas para fines medicinales, pues, se utilizan con frecuencia como materias primas para la extracción de ingredientes activos que cumplan un rol importante en el descubrimiento de nuevos compuestos (Hassan, et al., 2012).

Ecuador contiene una extensa cantidad de conocimientos en el empleo de plantas medicinales debido al saber ancestral. Se reconocen alrededor de 3118 variedades que pertenecen a 206 familias que son utilizadas con propósitos medicinales (Hassan, el al., 2012).

2.1.3 Fitoquímica.

El análisis fitoquímico se enfoca a corroborar la presencia de metabolitos secundarios en la vegetación, como en plantas medicinales, empleando técnicas de separación, extracción, purificación y determinación estructural.

Mediante el análisis fitoquímico es posible reconocer la presencia de compuestos de mucha importancia como por ejemplo flavonoides, glúcidos, taninos, fitoesteroles, antraquinonas, alcaloides, saponinas, entre otros (Villavicencio, et al., 2012). La comprobación de metabolitos secundarios se la ejecuta por medio de experimentos fitoquímicos, las cuales consisten en la caracterización en una reacción química que provoca variación rápida en la organización molecular de un compuesto, por ejemplo, el cambio de un grupo funcional, el orden de un complejo, lo que da como consecuencia una expresión sensible como el cambio de color, la formación de un precipitado o el separación de un gas, provocando indicios de la ausencia o presencia de un compuesto en particular (Amparo, et al., 2008).

2.1.4 Metabolitos secundarios.

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11

Los metabolitos secundarios además de no mostrar una función determinada en los procesos citados, se distinguen también de los metabolitos primarios en que algunos grupos demuestran un orden concreto en el reino vegetal. Los metabolitos secundarios son compuestos orgánicos de bajo peso molecular que no cumplen ningún rol fisiológico principal (Ávalos y Elena, 2009). Pero dichos metabolitos ayudan a la defensa contra situaciones de estrés biótico y abiótico, así como al perjuicio producido por la herida y el ataque de microorganismos patógenos o insectos, esto incita a una defensa química provocando, síntesis y acumulación de compuestos, conocidos como metabolitos secundarios. Durante la respuesta, unos compuestos intervienen directamente atacando al microorganismo patógeno o contrarrestando su invasión al resto de la planta. Al mismo tiempo, otros metabolitos secundarios favorecen a devastar las especies reactivas de oxígeno que son tóxicas para la misma célula vegetal, las cuales se producen durante las etapas tempranas de la respuesta de defensa. Es así, como algunos metabolitos secundarios forman una parte significativa de la respuesta de la defensa de las plantas con heridas y ataque por las plagas. (Sepúlveda et al., 2003). Asimismo los metabolitos secundarios, presentan propiedades biológicas, que cumplen funciones ecológicas y se identifican por los variables usos y tendencias entre los cuales tenemos herbicidas, insecticidas, medicamentos, perfumes o colorantes,(Ávalos y Elena, 2009).

2.1.5 Descripción de las características de la familia Campanulácea y de la especie L. decurrens.

2.1.5.1 Familia campanulácea y especie L. decurrens.

Las familias campanuláceas se identifican por ser plantas perennes o anuales, arbustos, a veces árboles terrestres, a veces epífitas o acuáticas, así mismo presentan hojas: enteras, alternas o dentadas, de vez en cuando pinnatisectas, sin estípulas. Sus flores: ocasionalmente actinomorfas o zigomorfas, a veces casmógamas, dimorfas, y cleistógamas; en inflorescencias cimosas o solitarias, en forma de espigas o racimos. La gran mayoría de las campanuláceas son originarias de los territorios temperados del hemisferio sur.

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2.1.5.2 Descripción de la especie L. decurrens.

Concierne al género Lobelia de la familia Campanulaceae involucra plantas anuales y perennes, originarias de zonas templadas y tropicales de América. Contiene tallos leñosos flexibles y finos, hojas de color verde claro aromático y olor agudo. Las flores son pequeñas y muy numerosas, tubulares, el labio superior más pequeño que el inferior. Por lo general se agrupan en inflorescencias, racimo terminal o mazorca pero también hay solitarias. Los colores de las flores varían según la especie y la diversidad y van del morado al azul, al blanco o al rojo (Cian, 1985). En la tabla 1 se muestra la descripción de la especie L decurrens.

Tabla 1. Descripción de la especie L. decurrens

Nombre científico

Lobelia decurrens

Reino Plantae

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

Orden Asterales

Familia Campanulaceae

Genero Lobelia

Especie L. decurrens

Fuente: (Acta Botánica, Mexicana 1997)

2.1.5.3 Composición química.

Hasta el momento no se han encontrado estudios o reportes sobre metabolitos secundarios aislados de L. decurrens, para el presente estudio se ha considerado metabolitos secundarios aislados a partir de especies del mismo género entre los cuales podemos citar a L. inflata, L. chinensis y L. yuccoides (Joshi, et al., 2011).

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Otro de los compuestos aislados se encuentra el palmitato de β-amirina (figura 2) que es un triterpeno pentacíclico que posee una actividad antidepresiva aislado de la especie L. inflata (Aruna, et al., 2013), perteneciente al mismo género de la especie en estudio. Otro de los usos importantes que se le atribuye a la lobelina, es que posee efectos positivos en el tratamiento de las células tumorales resistentes a múltiples fármacos (Joshi, et al., 2011).

Además de los compuestos ya mencionados, investigaciones han demostrado la presencia de poliacetilenos entre los cuales está el lobetyolin (figura3) que posee actividad antineoplásica (Chen, et al., 2014). También podemos citar algunos alcaloides como el isolobetyol que posee una actividad moderada de citotoxicidad en células tumorales de pulmón, así mismo dentro de especies similares podemos citar flavonoides como la apigenina (figura 4), que poseen actividad neoplásica en células de leucemia todos estos compuestos aislados de especies similares como es la L. chinensis. (Yang, et al., 2014).

Figura 1. Lobelina

Fuente: El autor

Figura 2. Palmitato de β-amirina

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Figura 3. Isobetyol

Fuente: El autor

Figura 4. Apigenina

Fuente: El autor

Entre las actividades biológicas encontradas en el género Lobelia están su uso como: expectorante, estimulante respiratorio, antiespasmódico, antidepresivo y como eméticos (Karakaş, et al., 2012). Tradicionalmente, se ha utilizado para el asma bronquial, bronquitis espasmódica y concretamente para la bronquitis crónica. También se usa para los nódulos reumáticos y miositis. L. chinensis se ha empleado como un diurético, y para combatir el cáncer de estómago (Joshi, et al., 2011).

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2.2 Técnicas para la obtención, aislamiento e identificación de metabolitos secundarios

2.2.1 Maceración.

La maceración es el desarrollo de extracción solido-líquido en que la materia prima contiene compuestos que pueden disolverse en el líquido de extracción, que son aquellos que se intenta extraer. El proceso de maceración radica en colocar la materia vegetal en un depósito con la cantidad suficiente de disolvente hasta revestir toda la materia vegetal, una de las mejorías que se adquiere de la maceración es que se ayuda a conseguir la mayor cantidad de compuestos, hábilmente en su totalidad. (Fernoli´s, 2005).

Se habla de un proceso que tiene como consecuencia un armonía de concentración entre la materia vegetal y el disolvente empleado que depende de factores relacionados, como por ejemplo el tamaño de la partícula, su naturaleza y la de sus principios activos, su contenido de humedad y cantidad además de los factores existentes con el disolvente (Naveda, 2010).

2.2.1.1 Maceración Estática.

La maceración estática es el proceso que radica en situar el material vegetal, en contacto con el disolvente en depósitos o dispositivos cerrados, con temperatura ambiente varios días sin proporcionar ningún movimiento (Sharapin, 2000). Logrando que el disolvente penetre en la materia vegetal, debido a la permeabilidad de las membranas celulares (Naveda, 2010).

2.2.2 Cromatografía.

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2.2.2.1 Cromatografía en capa fina (CCF).

La cromatografía en capa fina reside en la dispersión de los componentes de una mezcla a través del desplazamiento diferencial sobre una capa fina de adsorbente, suspendida sobre una extensión plana. En esta técnica, La muestra a analizar se coloca por medio de un capilar sobre la superficie de sílica que es adsorbente inerte. Como soporte del adsorbente se manipulan placas metálicas, algunas placas tienen indicador de fluorescencia (Naveda, 2010).

La placa que contiene la muestra se coloca en una cámara, la cual debe encontrarse saturado de eluyente que sería la fase móvil, esta se desplazara por capilaridad en la placa llevando los componentes de la mezcla a diferentes velocidades, produciendo sombras que representan a los compuestos. (Abbott, et al., 2011). La dispersión se da por desplazamiento diferencial, es decir la fase móvil llevara a los compuestos menos polares y las más polares son detenidas por la fase estacionaria dando lugar a la separación. Seguidamente se deja evaporar el eluyente empleado y la placa es analizada por métodos químicos en la que se obtienen derivados fluorescentes, o por medio de procesos físicos utilizando luz UV. (Santos, 2011).

La relación del trayecto recorrido por un elemento y por el disolvente empelado desde el comienzo se llama factor de retención (Abbott, et al., 2011).

2.2.2.2 Cromatografía en columna abierta (CCA).

La cromatografía en columna abierta es específica por contener una fase estacionaria que se localiza internamente en una columna en la que se pasa una fase móvil líquida, que estará en constante movimiento. Según la similitud de las moléculas por la fase móvil o la estacionaria, éstas se consiguieran aislar (Santos, 2011).

El extracto de la materia vegetal se coloca en la parte superior de la fase estacionaria mientras que la fase móvil atraviesa la fase estacionaria. Los elementos van siendo separados de la columna, hasta que son recogidas en fracciones, los elementos más polares quedan detenidos, para lo cual hace falta un aumentonen la polaridad del disolvente para lograr extraer todos los compuestos. El tiempo que se emplean para eluir un compuesto de la columna se llama tiempo de retención (Abbott, et al., 2011).

(31)

17

mucho más rápida, la cual ayuda a obtener resultados mejores. Las condiciones que influyen en la eficacia de la separación en cromatografía de columna y utilizando gel de sílice como adsorbente son las siguientes.

 Diámetro de la columna con la cantidad de compuestos a separar.

 Elección del disolvente. El disolvente tiene que llevar a una buena dispersión de los elementos de la mezcla, empelándose mezclas de disolventes y realización de una elución en gradiente (Abbott, et al., 2011).

2.2.2.3 Cromatografía en fase inversa.

Todas las formas de cromatografía son procesos de desplazamiento diferencial, donde los elementos de la muestra son selectivamente detenidos por una fase estacionaria y eluídos por medio del cambio de polaridad de la fase móvil (Esquivel y Leal, 2004).

La cromatografía en fase inversa constituye un líquido de carácter apolar como fase móvil en la cual se emplean mezclas de agua con disolventes polares que puedan ser miscibles, como metanol siendo la fase móvil más polar que la fase estacionaria (Abbott, et al., 2011).

Este metodo facilita la selectividad y retención adecuadas cuando los especímenes contienen un carácter predominante aromático o alifático (Esquivel y Leal, 2004).

La disgregación ocurre como resultado de las diferencias en la superficie apolar de los elementos de la muestra, los elemetos menos polares serán más solubles en la fase estacionaria que los más polares. Los compuestos más polares quedarán menos retenidos que los menos polares (Abbott, et al., 2011).

2.2.3 Cristalización.

La cristalización es un proceso bastante selecto de purificación, ya que la unión de las moléculas idénticas de acuerdo al tamaño y forma tiende a eliminar la presencia de impurezas.

(32)

18

cristalización total del compuesto. Las impurezas halladas se recogen por filtración separándolas de las aguas madres, este procedimiento de repite varias veces con el mismo disolvente para tratar de obtener un compuesto libre de impurezas (Hernández, et al., 2010).

2.2.4 Punto de fusión.

El punto de fusión es la temperatura que ayuda al cambio de estado sólido a líquido. Para que este proceso se dé, es necesario que las fuerzas intermoleculares se rompan ya que estas son las que mantienen unidas a las moléculas de un compuesto que poseen una estructura cristalina, por tanto, una de las beneficios de la comprobación del punto de fusión es la eventualidad de identificar sustancias. Igualmente, la presencia de impurezas, así sea en mínimas cantidades, provoca una reducción en el punto de fusión, que se acompaña generalmente de un aumento del intervalo en que cambia su estado de solido a líquido, por ello otra de las conclusiones del punto de fusión es como sirve como criterio de pureza de un compuesto (Jaramillo, 2007).

2.2.5 Cromatografía de gases acoplada a espectroscopía de masas (CG/EM).

El ajuste de estas dos técnicas favorecen una herramienta para, identificar, separar y cuantificar, los elementos volátiles o semivolátiles de mezclas (Gutiérrez y Droguet, 2002).

La asociación de las dos técnicas, CG (Cromatografía de Gases) y EM (Espectroscopía de Masas) da lugar a un método combinado (CG-EM) que consiente la dispersión e caracterización de compuestos. El manejo de la CG-EM solicita sistemas específicos de enlace. En principio, se trata de métodos que trabajan en fase gaseosa y requieren una cantidad pequeña de muestra para el análisis, por lo que son muy compatibles (Gutiérrez y Droguet, 2002).

(33)

19

2.2.6 Resonancia Magnética Nuclear (RMN).

Un espectrómetro de RMN reside substancialmente en un imán, un emisor de radiofrecuencia y un detector de radiofrecuencia.

Este método de espectroscópica puede ser utilizado sólo para examinar núcleos atómicos con un número impar de protones o neutrones (o de ambos). Este contexto se da en los átomos de 1H, 13C, 19F y 31P. Este tipo de núcleos son magnéticamente

activos, es decir poseen espín, igual que los electrones, ya que los núcleos contienen carga positiva y además poseen un movimiento de rotación sobre un eje que hace que se comporten como si fueran pequeños imanes. En la ausencia de campo magnético, los espines nucleares se orientan al azar (Pardo, 2007).

(34)

20

(35)

21

3.1 Esquema

La metodología (figura 5) que se empleo fue realizada en el Departamento de Química de la Universidad Técnica Particular de Loja.

Figura 5. Esquema de la metodología empleada

Fuente: El autor

3.2 Selección y preparación de la muestra

(36)

22

La especie vegetal L. decurrens fue recolectada en octubre del 2014, en la provincia de Loja, en el cantón Saraguro (figura 6) en las siguientes coordenadas geográficas S

03°53’00.65; W 07°91’96.98.

La identificación de la planta fue realizada por la Dra. Fani Tinitana, un ejemplar de la muestra fue depositado en el herbario de la Universidad Técnica Particular de Loja con número de voucher HUTPL1082.

Figura 6. Mapa del cantón Saraguro

Fuente: Mapas virtuales

(37)

23

Figura 7. Cámara de secado

Fuente: El autor

3.3 Obtención de los extractos

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24

Figura 8. Maceración de la materia vegetal

Fuente: el autor

Figura 9. Rota evaporación del extracto

Fuente: El autor

Para la obtención del rendimiento de cada uno de los extractos se utilizó la siguiente fórmula:

ECUACIÓN 1. Ecuación para el rendimiento de los extractos

(39)

25

3.4 Desclorofilación del extracto de acetato de etilo

El extracto de acetato de etilo fue sometido desclorofilación, proceso que consiste en eliminar todas las clorofilas posibles de los extractos, para lo cual se utilizó sílica de fase inversa C18 15-20 µm, posteriormente se utilizó cromatografía en capa fina para observar el perfil cromatográfico similar entre fracciones y así poder unirlas.

3.5 Fraccionamiento del extracto desclorofilado

3.5.1 Cromatografía en columna abierta.

Después de unir las fracciones similares, se procedió a realizar el fraccionamiento de varias fracciones, para lo cual se utilizó cromatografía en columna abierta empleando sílica gel 60 F254 en una relación 1:20 extracto-sílica, se trabajó con 10 g de extracto, para realizar la elución de la columna se utilizó mezclas de diferentes disolventes: hexano, acetato de etilo, diclorometano y metanol, recolectando fracciones de 5 ml aproximadamente, posterior se dejó evaporar el disolvente, para luego realizar cromatografía en capa fina de cada una de las fracciones que se obtuvieron, con el propósito de evaluar su perfil cromatográfico y riqueza fitoquímica, las fracciones con el mismo perfil cromatográfico fueron unidas.

3.5.2 Cromatografía en capa fina.

Para el análisis y fraccionamiento de las fracciones obtenidas de la CCA se utilizó cromatografía en capa fina (CCF), utilizando placas de aluminio cubiertas de sílica gel 60 F254 y sílica gel RP-18, utilizando disolventes para la fase móvil como Hex:AcOEt en proporciones definidas, para la visualización de las placas se utilizó luz UV de onda corta 254nm y luz UV de onda larga 360 nm, también se utilizó sulfato sérico y vainillina como reveladores.

3.6 Unión y cristalización

Para realizar la unión de las diferentes fracciones obtenidas, se tomaron en cuenta: la altura de las manchas características de cada fracción y la similitud visual que estas reflejaron ante la luz ultravioleta de 254 y de 365 nm, además se confirmó dicha similitud con el agente revelador sulfato sérico en ácido sulfúrico al 5% y vainillina.

La cristalización se separa un componente de una solución en estado líquido pasándolo a

estado sólido a modo de cristales que precipitan, logrando así la separación de los

(40)

26

3.7 Caracterización de metabolitos

A las fracciones cristalizadas y/o metabolitos puros se realizó la caracterización por medio de: punto de fusión (Pf), solubilidad, factor de retención (Rf), RMN 1H y 13C,

CG/EM para su elucidación.

3.7.1 Punto de fusión.

Para determinar el punto de fusión de los compuestos se utilizó muestra sólida, utilizando el equipo Fisher-Johns-Melting (Figura 10), así se procedió a medir la temperatura en el que la muestra pasa de su estado sólido a líquido.

Figura 10. Equipo fisher-Johns-Melting

Fuente: el autor

3.7.2 Solubilidad.

Entre los disolventes que empleamos para la solubilidad se encuentra: hexano, diclorometano, acetato de etilo, cloroformo, metanol, éter, y diferentes mezclas que se ejecutaron entre ellos.

3.7.3 Factor de retención.

El valor de Rf fue calculado utilizando la siguiente fórmula:

� = �� � �� �� � �� � � � �

ECUACION 2: Factor de retención

(41)

27

3.7.4 Cromatografía de gases acoplado a espectroscopia de masas (CG/EM).

La identificación de los compuestos aislados a partir de la especie L. decurrens utilizó un cromatógrafo de gases, (Agilent Technologies 6890N) acoplado a un espectrómetro de masas (Agilent Technologies 5973 inert) con una columna cromatográfica BSNS, las respectivas inyecciones se ejecutaron en columnas capilares DB-5MS (5%-Fenil-metilpolisiloxano). En la tabla 2 de observan las características del CG/EM.

Tabla 2: Características del CG/EM

COLUMNA Columna capilar: Agilent 122-5562 DB-5ms, 0.25mm*

60mm*0.25μm

Temperatura máxima: 350 ˚C

Flujo constante. Flujo inicial 1.5 ml/min Presión inicial: 26.99 psi

Velocidad promedio: 32 cm/s Presión de salida: vacío

INYECTOR EN MODO SPLITLES

Temperatura inicial de 50 ˚C

Gas: Helio

DETECTOR Temperatura de 250 ˚C

Gas: Nitrógeno

HORNO Temperatura inicial: 80˚C Temperatura final: 300 ˚C

Gradiente de temperatura de 5 ˚C/min

Fuente: El autor.

3.7.5 Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN).

Para conseguir un espectro de RMN, se coloca una cantidad pequeña del compuesto disuelto en 500μl del disolvente deuterado en un tubo de vidrio que se localiza dentro del campo magnético del equipo. Dicho tubo gira en su eje, el ordenador recoge la intensidad respecto al tiempo y convierte los datos en intensidad de relación a la frecuencia, formando representaciones gráficas.

Los espectros de RMN fueron obtenidos en el equipo Varian 400 MHz-Premium Schelded, los espectros de RMN 1H y 13C se obtuvieron a 400 MHz y 100 MHz

(42)

28

3.8 Evaluación de la actividad antitumoral.

Se realizó en cinco líneas celulares: RKO (cáncer de colon), MCF-7 (cáncer de mama), D-384 (astrocitoma cerebral), PC-3 (cáncer de próstata), y HCT-116 (cáncer de colon) los cuáles fueron cultivados en medio RPMI suplementado, adicionalmente se llevaron a una incubadora humidificada a 37 °C, 5% CO2.

(43)

29

(44)

30

4.1 Recolección de la especie, identificación, y obtención de extractos en hexano, acetato de etilo y metanol.

La recolección de esta especie se la realizó en el cantón Saraguro, el ejemplar fue recolectado sin tomarla desde la raíz es decir las partes aéreas como son flores, hojas y tallo, para poder evitar la extinción de la misma.

De la muestra recolectada se obtuvo un peso de 12.5 kg, la cual fue colocada dentro de una cámara de secado una temperatura de 37°C con la finalidad de eliminar la humedad existente en las hojas y tallos, obteniéndose 4.7 kg de materia vegetal seca, que se utilizaron para la obtención de los diferentes extractos.

En la figura 11 se muestran los extractos obtenidos etiquetados e identificados de la especie L. decurrens.

Figura 11. Extractos obtenidos de la especie L. decurrens

Fuente: el autor

4.2 Rendimientos y análisis de los extractos obtenidos de L. decurrens

El rendimiento de los extractos obtenidos con los diferentes disolventes empleados (tabla 3), se obtuvo utilizando la ecuación 1.

Tabla 3. Rendimiento de los extractos de la especie L. decurrens

Especie vegetal Disolventes Peso (g) Rendimiento %

L. decurrens

Hexano 81.88 1.74

Acetato de etilo 119.53 2.54

Metanol 405.02 8.62

(45)

31

El extracto de mayor rendimiento fue el extracto de metanol con 8.62 % mientras que los extractos de hexano y acetato de etilo mostraron rendimientos de 1.74 y 2.54 % respectivamente

4.3 Evaluación de la actividad antitumoral

La evaluación de la actividad antitumoral, se la realizó con los diferentes extractos obtenidos (Hex, AcOEt, MeOH) en las cinco líneas celulares de cáncer humano las cuales se muestran a continuación en la tabla 4.

Tabla 4. Inhibición de los extractos en varias líneas celulares

Porcentaje de inhibición en Líneas celulares

Extracto

MCF-7

PC3

RKO

D-384

HCT-116

Hex 1.9 ± 9.7 2.3 ± 1.3 12.5 ± 0.7 16.8 ± 2.1 SA

AcOEt 16.8 ± 4.1 39.1 ± 0.4 23.2 ± 0.2 56.9 ± 6.4 35.7 ± 3.0

MeOH SA SA SA SA SA

Fuente: El autor

De acuerdo a los porcentajes mostrados en la tabla 3 se observa que el extracto con mayor porcentaje de actividad antitumoral fue el extracto de AcOEt (56.9%) en la línea celular D-384. De acuerdo a estudios hechos en especies similares como L. chinensis

el extracto de AcOEt mostró actividad antitumoral en varias líneas celulares como MCF-7 y PC-3. estudios realizados in vitro (Santosa, et al., 1985) (Chen, et al., 2014).

4.4 Aislamiento de metabolitos secundarios 4.4.1 Extracto de acetato de etilo.

4.4.1.1 Desclorofilación del extracto de acetato de etilo.

Para la desclorofilación del extracto de acetato de etilo se utilizó una columna abierta en fase inversa en relación 15:200 extracto: sílica, además se utilizó como eluyente una mezcla de MeOH:H2O en proporción 80:20 (v/v) recolectando fracciones de 150

(46)

32

A continuación, en la tabla 5 se muestra la unión de fracciones, polaridades y disolventes que se empleó para eluir la columna.

Tabla 5. Fracciones de la desclorofilación del extracto de acetato de etilo

Fuente: el autor

Unión de fracciones desclorofiladas # fracción Apariencia

G1Fr2,G2Fr1-2,G3Fr2,G4Fr1-4 Fr1 cristalino Sólido

G2Fr4,G3Fr3-4 Fr2 Sólido

G1Fr1 Fr3 Sólido

G1Fr4 Fr4 Líquido

G1Fr5 Fr5 Líquido

G1Fr6-16 Fr6 Semisólido

G1Fr17-19,21 Fr7 Semisólido

G1Fr20 Fr8 cristalino Solido

G2Fr3 Fr9 Líquido

G2Fr5-7 Fr10 Semisólido

G2Fr8 Fr11 Semisólido

G2Fr9-11 Fr12 Sólido

G2Fr12-13 Fr13 Sólido

G3Fr1 Fr14 Sólido

G3Fr5-6 Fr15 Sólido

G3Fr7-10 Fr16 cristalino Sólido

G3Fr11 Fr17 cristalino Sólido

G3Fr5 Fr18 Sólido

G4Fr6-7 Fr19 cristalino Sólido

G4Fr8 Fr20 Sólido

G4Fr9 Fr21 Sólido

G4Fr10 Fr22 Semisólido

G4Fr11-12,14 Fr23 Semisólido

(47)

33

4.4.1.2 Elución mediante cromatografía en columna abierta de la fracción desclorofilada Fr1.

De la fracción Fr1 desclorofilada se realizó cromatografía en columna abierta obteniéndose 138 muestras, con un volumen de 10 ml cada fracción, luego se procedió a unirlas de acuerdo a su perfil cromatográfico, se logró obtener 35 fracciones. Fr1_AcOEt_1: Fr1_AcOEt_35, en la Tabla 6 se muestran las fracciones obtenidas.

Tabla 6. Unión de fracciones de la fracción Fr1 desclorofilada

Unión de

fracciones # fracción Proporción Disolventes Apariencia

Fr1-Fr17 Fr1_AcOEt_1 10:90 Hex: CH2Cl2 Sólido

Fr18-Fr25 Fr1_AcOEt_2 10:90 Hex: CH2Cl2 Sólido

Fr26-Fr31 Fr1_AcOEt_3 10:90 Hex: CH2Cl2 Sólido

Fr32 Fr1_AcOEt_4 100 CH2Cl2 Sólido

Fr33-Fr38 Fr1_AcOEt_5 100 CH2Cl2 Sólido

Fr39 Fr1_AcOEt_6 100 CH2Cl2 Sólido

Fr40 Fr1_AcOEt_7 90:10 CH2Cl2:AcOEt Semisólido

Fr41-Fr48 Fr1_AcOEt_8 90:10 CH2Cl2:AcOEt amarillos Cristales

Fr49 Fr1_AcOEt_9 90:10 CH2Cl2:AcOEt Semisólido

Fr50-Fr54 Fr1_AcOEt_10 80:20 CH2Cl2:AcOEt Semisólido

Fr55-Fr56 Fr1_AcOEt_11 80:20 CH2Cl2:AcOEt Semisólido

Fr57-Fr61 Fr1_AcOEt_12 80:20 CH2Cl2:AcOEt Semisólido

Fr62-Fr64 Fr1_AcOEt_13 70:30 CH2Cl2:AcOEt Sólido

Fr65-Fr68 Fr1_AcOEt_14 70:30 CH2Cl2:AcOEt Sólido

Fr69 Fr1_AcOEt_15 70:30 CH2Cl2:AcOEt Sólido

Fr70-Fr72 Fr1_AcOEt_16 60:40 CH2Cl2:AcOEt Sólido

Fr73 Fr1_AcOEt_17 60:40 CH2Cl2:AcOEt Sólido

Fr74-Fr79 Fr1_AcOEt_18 60:40 CH2Cl2:AcOEt Semisólido

Fr80 Fr1_AcOEt_19 50:50 CH2Cl2:AcOEt Semisólido

Fr81 Fr1_AcOEt_20 50:50 CH2Cl2:AcOEt Semisólido

Fr82-Fr88 Fr1_AcOEt_21 100 AcOEt Semisólido

Fr89-Fr90 Fr1_AcOEt_22 100 AcOEt amarillos Cristales

Fr91 Fr1_AcOEt_23 90:10 AcOEt:MeOH Solido cristalino

Fr92 Fr1_AcOEt_24 90:10 AcOEt:MeOH Semisólido

(48)

34

Fr97-Fr104 Fr1_AcOEt_26 70:30 AcOEt:MeOH Semisólido

Fr105-Fr112 Fr1_AcOEt_27 70:30 AcOEt:MeOH Sólido

Fr113-Fr119 Fr1_AcOEt_28 70:30 AcOEt:MeOH Sólido

Fr120-Fr121 Fr1_AcOEt_29 50:50 AcOEt:MeOH Sólido cristalino

Fr122-Fr123 Fr1_AcOEt_30 50:50 AcOEt:MeOH Sólido

Fr124-Fr125 Fr1_AcOEt_31 50:50 AcOEt:MeOH Sólido

Fr126-Fr127 Fr1_AcOEt_32 50:50 AcOEt:MeOH Sólido

Fr128-Fr131 Fr1_AcOEt_33 100 MeOH Sólido

Fr132-Fr135 Fr1_AcOEt_34 100 MeOH Sólido cristalino

Fr136-Fr3138 Fr1_AcOEt_35 100 MeOH Sólido cristalino

Fuente: el autor

A la fracción Fr1_AcOEt_8 (Fr41-Fr48) obtenida de la columna abierta con un peso de 15 mg, en una polaridad 90:10 de CH2Cl2:AcOEt, presentó una apariencia de color

amarillo, que posteriormente fue llevado a recristalización con hexano. Obteniendo 8 mg de compuesto puro, presentando la apariencia de un sólido cristalino con un punto de fusión de 145-147°C soluble en diclorometano, así también presento un Rf de 0,64 eluido en diclorometano al 100%.

Este compuesto fue identificado como citropten (1) (figura 12) en base a los análisis correspondientes mediante CG/EM (ver anexo 1 y 2) y RMN, el mismo que muestra un tiempo de retención de 18.47, un M+ de 206 m/z que corresponde con fórmula

molecular C11H10O4 y peso molecular 206.20 g/mol y RMN de 1H y 13C (ver anexo 3 y

4).

1 Figura 12. Citropten (1)

(49)

35

Los desplazamientos de RMN 1H (ver anexo 3) y 13C (ver anexo 4) del citropten (1)

disuelto en CDCl3 se muestran a continuación en las tablas 7 y 8.

Tabla 7. Datos espectroscópicos RMN 13C correspondiente al citropten (1) comparado con la

referencia bibliográfica

CITROPTEN

Compuesto 1 13C Referencia (Tobergte y Curtis, 2013)

Desplazamiento

químico δ ppm carbono Tipo de

Asignación Desplazamiento

químico δ ppm carbono Tipo de

Asignación

161.7 C C2 161.3 C C2

111.1 CH C3 111.1 CH C3

138.8 CH C4 138.7 CH C4

157.1 C C5 157.0 C C5

95.0 CH C6 94.9 CH C6

163.8 C C7 163.7 C C7

92.9 CH C8 92.9 CH C8

156.9 C C9 156.9 C C9

104.1 C C10 104.1 C C10

55.9 CH3 C11 55.9 CH3 C11

55,9 CH3 C12 55,8 CH3 C12

Fuente: El autor

Tabla 8: Datos espectroscópicos RMN 1H correspondiente al citropten (1) comparado con la

referencia bibliográfica

CITROPTEN

Compuesto 1 1H Referencia (Tobergte y Curtis, 2013)

Desplazamien to químico δ

ppm

Multiplici

dad acoplamiento J Constante de (Hz)

Asignació

n Desplazamiento químico δ

ppm

Multiplici

dad Asignación

7.9 d 9,6 H 7.9 d Sobre C4

6.4 d 9,6 H 6.4 d Sobre C8

6.2 d 2,1 H 6.2 d Sobre C6

6.1 d 2,1 H 6.1 d Sobre C3

3.9 s --- CH3 3.9 s Sobre C12

3.8 s --- CH3 3.8 s Sobre C11

Fuente: El autor

(50)

36

hepatoprotector, Varios informes indican que esta estructura posee la capacidad de regular diversas rutas celulares, principalmente relacionado con algunos tipos de cáncer como el carcinoma hepatocelular (Ferlazzo, et al., 2016) y en L decurrens esta es la primera vez que se reporta el compuesto para la especie en estudio.

4.4.1.3 Elución mediante cromatografía en columna abierta de la fracción desclorofilada Fr8.

A la fracción Fr8 desclorofilada se la eluyó en columna abierta con una proporción isocrática de mezcla Hex:AcOEt 60:40 y se obtuvo 137 muestras, con un volumen de 10 ml cada fracción, fueron unidas de acuerdo al perfil cromatográfico obteniéndose 20 fracciones Fr8_AcOEt_1: Fr8_AcOEt_20. Las mismas que se muestran a continuación en la tabla 9.

Tabla 9. Unión de fracciones de la Fr8 desclorofilada

Unión de fracciones # Fracción Apariencia

Fr1-Fr12 Fr8_AcOEt_1 Sólida

Fr13-Fr16 Fr8_AcOEt_2 Sólida cristalina

Fr17-Fr18 Fr8_AcOEt_3 Sólida

Fr19-Fr33 Fr8_AcOEt_4 Sólida

Fr34-Fr46 Fr8_AcOEt_5 Sólida

Fr47-Fr49 Fr8_AcOEt_6 Semisólida

Fr50-Fr63 Fr8_AcOEt_7 Semisólida

Fr51 Fr8_AcOEt_8 Cristales amarillos

Fr59 Fr8_AcOEt_9 Semisólida

Fr64 Fr8_AcOEt_10 Sólida

Fr65-Fr101 Fr8_AcOEt_11 Sólida cristalino

Fr85 Fr8_AcOEt_12 Semisólida

Fr97 Fr8_AcOEt_13 Líquida

Fr100,Fr102-106,Fr108-110 Fr8_AcOEt_14 Sólida cristalino

Fr107,109-112 Fr8_AcOEt_15 Líquida

Fr7114-Fr120 Fr8_AcOEt_16 Sólida

Fr7121-Fr134 Fr8_AcOEt_17 Semisólida

Fr135 Fr8_AcOEt_18 Sólida

Fr136 Fr8_AcOEt_19 Sólida

(51)

37

Fuente: El autor

De la fracción Fr8_AcOEt_11 (Fr65-Fr101) obtenida, que se eluyó en columna abierta en una polaridad Hex:AcOEt : 60:40 obtuvieron 13 mg, de un compuesto impuro de color amarillo, que posteriormente fue llevado a la recristalización con metanol, Obteniendo 9.5 mg de una mezcla de compuestos, presentando la apariencia de un sólido cristalino con un punto de fusión de 165-167°C soluble en diclorometano, así también presento un Rf de 0,75 eluido en una polaridad AcOEt al 100%.

Esta mezcla de compuestos fue identificada como alfa-amirina (2) (figura 13) y Lupeol (3) (figura 14) en base a los análisis correspondientes mediante CG/EM (ver anexos 5-7) y RMN (ver anexos 8-11), Los mismos que muestran un tiempo de retención de 34.61 correspondiente al compuesto 2 con un ion M+ de 426 m/z, que corresponde a la

fórmula molecular C30H50O, con peso molecular de 426.72 g/mol; Y para el compuesto

3 el tiempo de retención es 35.89, ion un ion M+ 426 m/z que corresponde la fórmula

molecular C30H50O y peso molecular 426.72 g/mol, mezcla soluble en diclorometano

con Rf de 0,70.

(2)

Figura 13. α-amirina (2)

(52)

38 (3)

Figura 14. Lupeol (3)

Fuente: El autor

En las siguientes tablas 10 y 11 se detallan Los datos espectroscópicos obtenidos del alfa amirina (2) en RMN 13C y 1H respectivamente diluidos en CDCl

3 (Ver anexos

8-11).

Tabla 10. Comparación de los datos espectroscópicos RMN 13C de la α-amirina (2) con la

bibliografía.

α-amirina

Compuesto 2 13C Referencia (Ebajo, et al., 2015)

Desplazamiento

químico δ ppm carbono Tipo de Asignación Desplazamiento químico δ ppm carbono Tipo de asignación

38.7 CH2 C1 38.7 CH2 C1

28.5 CH2 C2 28.7 CH2 C2

79.2 CH-OH C3 79.6 CH-OH C3

38.6 C C4 38.7 C C4

55.3 CH C5 55.1 CH C5

18.4 CH2 C6 18.4 CH2 C6

32.6 CH2 C7 32.2 CH2 C7

40.9 C C8 40.7 C C8

(53)

39

--- C C10 36.6 C C10

23.6 CH2 C11 23.3 CH2 C11

124.1 CH C12 124.4 CH C12

145.3 CH C13 139.5 CH C13

41.8 C C14 42.0 C C14

27.3 CH2 C15 27.2 CH2 C15

26.3 CH2 C16 26.6 CH2 C16

33.5 C C17 33.7 C C17

55.5 CH C18 59.0 CH C18

39.0 CH C19 39.6 CH C19

39.0 CH C20 39.6 CH C20

31.2 CH2 C21 31.2 CH2 C21

41.8 CH2 C22 41.5 CH2 C22

28.1 CH3 C23 28.1 CH3 C23

15.6 CH3 C24 15.6 CH3 C24

15.5 CH3 C25 15.6 CH3 C25

15.7 CH3 C26 16.8 CH3 C26

23.6 CH3 C27 23.2 CH3 C27

28.1 CH3 C28 28.1 CH3 C28

17.0 CH3 C29 17.4 CH3 C29

21.0 CH3 C30 21.4 CH3 C30

Fuente: El autor

Tabla 11. Comparación de los datos espectroscópicos RMN 1H del α-amirina (2) con la

bibliografía

α-amirina

Compuesto 2 1H Referencia (Ebajo et al., 2015)

Desplazamient o químico δ

ppm Multiplici dad Constante de acoplamiento J (Hz) Asignació n Desplazamient o químico δ

ppm

Multipli cidad

Asignación

3.1 d 5,1 H 3.1 dd Sobre C3

0.6 d 11,6 H 0.6 d Sobre C5

5.1 t 3,2 H 5.0 t Sobre C12

1.7 m 3,5 CH2 1.9 ddd Sobre C22

(54)

40

1.6 m 3,0;7,0 CH2 1.8 dddd Sobre C22

0.9 s --- CH3 0.9 s Sobre C23

0.7 s --- CH3 0.7 s Sobre C24

0.7 s --- CH3 0.7 s Sobre C25

0.8 s --- CH3 0.8 s Sobre C26

1.0 s --- CH3 1.0 s Sobre C27

0,94 s --- CH3 0,9 s Sobre C28

0,8 d 6,0 CH3 0,8 d Sobre C29

0,7 d 7,0 CH3 0,7 d Sobre C30

FUENTE: el autor

Los datos espectroscópicos obtenidos del lupeol (3) en RMN 13C y 1H diluidos en

CDCl3 (Ver anexos 8-11), se detallan a continuación en las tablas 12 y 13

respectivamente.

Tabla 12. Comparación de los datos espectroscópicos RMN 13C del Lupeol (3) con la

bibliografía

LUPEOL

Compuesto 3 13C Referencia (Jamal, et al., 2008)

Desplazamiento

químico δ ppm carbono Tipo de Asignación Desplazamiento químico δ

ppm

Tipo de

carbono Asignación

28.2 CH2 C1 28.2 CH2 C1

25.2 CH2 C2 25.3 CH2 C2

79.1 CH-OH C3 79.1 CH-OH C3

38.9 C C4 38.9 C C4

55.4 CH C5 55.5 CH C5

18.5 CH2 C6 18.5 CH2 C6

34.4 CH2 C7 34.4 CH2 C7

41.8 C C8 41.1 C C8

50.5 CH C9 50.6 CH C9

37.2 C C10 37.3 C C10

21.0 CH2 C11 21.1 CH2 C11

27.5 CH2 C12 27.5 CH2 C12

39.0 CH C13 39.0 CH C13

(55)

41

27.6 CH2 C15 27.6 CH2 C15

25.3 CH2 C16 25.7 CH2 C16

43.1 C C17 43.2 C C17

48.4 CH C18 48.5 CH C18

48.1 CH C19 48.1 CH C19

151.1 C C20 151.2 C C20

30.0 CH2 C21 30.0 CH2 C21

40.1 CH2 C22 40.2 CH2 C22

28.2 CH3 C23 28.2 CH3 C23

15.6 CH3 C24 15.6 CH3 C24

16.2 CH3 C25 16.3 CH3 C25

16.1 CH3 C26 16.2 CH3 C26

14.7 CH3 C27 14.7 CH3 C27

18.1 CH3 C28 18.2 CH3 C28

109.4 CH2 C29 109.6 CH2 C29

19.4 CH3 C30 19.5 CH3 C30

Fuente: El autor.

Tabla 13. Comparación de los datos espectroscópicos RMN 1H del lupeol (3) con la bibliografía

LUPEOL

Compuesto 3 1H Referencia (Jamal et al., 2008)

Desplazamiento químico δ ppm

Multiplici dad Constante de acoplamiento J (Hz) Asigna ción Desplazamient o químico δ

ppm

Multiplici dad

Asignación

3.16 dd 2,73; 3,10 H 3.16 dd Sobre C3

2.35 s CH2 2.35 s Sobre C12

3.17 s H 3.18 s Sobre C19

0.93 d ---- CH2 0.92 s Sobre C22

0.75 t H 0.73 t Sobre C5

1.25 s H 1.28 s Sobre C9

1.13 t H 1.12 t Sobre C18

0.94 d ---- CH3 0.95 s Sobre C24

0.99 d ---- CH3 0.98 s Sobre C25

1.02 d --- CH3 1.05 s Sobre C26

(56)

42

0.87 s --- CH3 0.89 s Sobre C28

4.69 s ---- CH3 4.68 s Sobre C29

1.68 s ---- CH3 1.60 s Sobre C30

Fuente: El autor

El compuesto 2 es muy importante ya que presenta actividad antitumoral en líneas celulares como MCF-7 además es un potente antidiurético, así mismo posee una actividad significativa con un porcentaje de inhibición de 56,34% contra la leucemia linfocítica (Aragão et al., 2006). El compuesto 3 posee múltiples actividades medicinales importantes incluyendo antiinflamatorios, antioxidante y efectos anticancerígenos en la línea celular MCF-7 in vitro, en donde presenta un IC50=

36.09±6.5 en ml/mg (Pedro et al., 2013). Además proporcionan protección contra la genotoxicidad, Estos compuestos ya han sido reportados en especies del mismo género como L. chinesis. (Gallo y Sarachine, 2009).

4.5 Extracto metanólico

El extracto metanólico se trabajó sin desclofilación para este proceso se utilizó cromatografía en columna abierta obteniendo 232 muestras, las cuales eluimos en cromatografía en capa fina para proceder a unir las fracciones semejantes tomando en cuenta el perfil cromatográfico, de lo cual quedaron como resultado 35 fracciones finales. (Fr_MeOH_1 Fr_MeOH_35)

A continuación, en la tabla 14 se muestran la unión de las fracciones del extracto de metanol.

Tabla 14. Unión de fracciones del extracto metanólico

Unión de

fracciones # Fracción Proporción Disolventes Apariencia

Fr1-2 Fr_MeOH_1 95:05 CH2Cl2:MeOH Liquida

Fr3,8-10 Fr_MeOH_2 95:05 CH2Cl2:MeOH Sólida

Fr4-6 Fr_MeOH_3 95:05 CH2Cl2:MeOH Sólida

Fr11 Fr_MeOH_4 95:05 CH2Cl2:MeOH Sólida

F12-16 Fr_MeOH_5 95:05 CH2Cl2:MeOH Sólida

Fr17-24 Fr_MeOH_6 95:05 CH2Cl2:MeOH Sólida

Fr25 Fr_MeOH_7 90:10 CH2Cl2:MeOH Liquida

Fr26-28 Fr_MeOH_8 90:10 CH2Cl2:MeOH Liquida

(57)

43

Fr31-32 Fr_MeOH_10 90:10 CH2Cl2:MeOH Semisólida

Fr33-35 Fr_MeOH_11 90:10 CH2Cl2:MeOH Semisólida

Fr36-40 Fr_MeOH_12 90:10 CH2Cl2:MeOH Sólida

Fr41-43 Fr_MeOH_13 60:40 AcOEt:MeOH Sólida

Fr44-48 Fr_MeOH_14 60:40 AcOEt:MeOH Sólida

Fr49-69 Fr_MeOH_15 60:40 AcOEt:MeOH Liquida

Fr62-72 Fr_MeOH_16 60:40 AcOEt:MeOH Semisólida

Fr73-80 Fr_MeOH_17 60:40 AcOEt:MeOH Semisólida

Fr81-88 Fr_MeOH_18 60:40 AcOEt:MeOH Semisólida

Fr89-91 Fr_MeOH_19 50:50 AcOEt:MeOH Sólida

FrMeOH92-96 Fr_MeOH_20 50:50 AcOEt:MeOH Sólida

Fr97-112 Fr_MeOH_21 50:50 AcOEt:MeOH Sólida

Fr113-114 Fr_MeOH_22 50:50 AcOEt:MeOH Sólida

Fr113-118 Fr_MeOH_23 50:50 AcOEt:MeOH Semisólida

Fr119-120 Fr_MeOH_24 50:50 AcOEt:MeOH Semisólida

Fr121-122 Fr_MeOH_25 40:60 AcOEt:MeOH Sólida

Fr123-128 Fr_MeOH_26 40:60 AcOEt:MeOH Sólida

Fr129-136 Fr_MeOH_27 40:60 AcOEt:MeOH Sólida

Fr137-144 Fr_MeOH_28 40:60 AcOEt:MeOH Sólida

Fr145-150 Fr_MeOH_29 40:60 AcOEt:MeOH Cristales

Fr151-160 Fr_MeOH_30 40:60 AcOEt Sólida

Fr161-192 Fr_MeOH_31 100 AcOEt Semisólida

Fr193-200 Fr_MeOH_32 100 AcOEt Semisólida

Fr201-208 Fr_MeOH_33 100 MeOH Semisólida

Fr209-216 Fr_MeOH_34 100 MeOH Semisólida

Fr217-232 Fr_MeOH_35 100 MeOH Sólida

Fuente: El autor

Figure

Tabla 1. Descripción de la especie L. decurrens

Tabla 1.

Descripción de la especie L. decurrens p.26
Figura 1. Lobelina

Figura 1.

Lobelina p.27
Figura 4. Apigenina

Figura 4.

Apigenina p.28
Figura 5. Esquema de la metodología empleada

Figura 5.

Esquema de la metodología empleada p.35
Figura 6. Mapa del cantón Saraguro

Figura 6.

Mapa del cantón Saraguro p.36
Figura 7. Cámara de secado

Figura 7.

Cámara de secado p.37
Figura 8. Maceración de la materia vegetal

Figura 8.

Maceración de la materia vegetal p.38
Figura 9. Rota evaporación del extracto

Figura 9.

Rota evaporación del extracto p.38
Figura 10. Equipo fisher-Johns-Melting

Figura 10.

Equipo fisher-Johns-Melting p.40
Tabla 2: Características del CG/EM COLUMNA Columna capilar: Agilent 122-5562 DB-5ms, 0.25mm*

Tabla 2:

Características del CG/EM COLUMNA Columna capilar: Agilent 122-5562 DB-5ms, 0.25mm* p.41
Tabla 3. Rendimiento de los extractos de la especie L. decurrens

Tabla 3.

Rendimiento de los extractos de la especie L. decurrens p.44
Figura 11.  Extractos obtenidos de la especie L. decurrens

Figura 11.

Extractos obtenidos de la especie L. decurrens p.44
Tabla 4. Inhibición de los extractos en varias líneas celulares

Tabla 4.

Inhibición de los extractos en varias líneas celulares p.45
Tabla 5. Fracciones de la desclorofilación del extracto de acetato de etilo

Tabla 5.

Fracciones de la desclorofilación del extracto de acetato de etilo p.46
Tabla 6. Unión de fracciones de la fracción Fr1 desclorofilada

Tabla 6.

Unión de fracciones de la fracción Fr1 desclorofilada p.47
Figura 12. Citropten (1)

Figura 12.

Citropten (1) p.48
Tabla 8: Datos espectroscópicos RMN 1H correspondiente al citropten (1) comparado con la referencia bibliográfica

Tabla 8:

Datos espectroscópicos RMN 1H correspondiente al citropten (1) comparado con la referencia bibliográfica p.49
Tabla 7. Datos espectroscópicos RMN 13C correspondiente al citropten (1) comparado con la

Tabla 7.

Datos espectroscópicos RMN 13C correspondiente al citropten (1) comparado con la p.49
Tabla 9. Unión de fracciones de la Fr8 desclorofilada

Tabla 9.

Unión de fracciones de la Fr8 desclorofilada p.50
Figura 13. α-amirina (2)

Figura 13.

α-amirina (2) p.51
Figura 14.  Lupeol (3)

Figura 14.

Lupeol (3) p.52
Tabla 10. Comparación de los datos espectroscópicos RMN 13C de la α-amirina (2) con la

Tabla 10.

Comparación de los datos espectroscópicos RMN 13C de la α-amirina (2) con la p.52
Tabla 11. Comparación de los datos espectroscópicos RMN 1H del α-amirina (2) con la

Tabla 11.

Comparación de los datos espectroscópicos RMN 1H del α-amirina (2) con la p.53
Tabla 12. Comparación de los datos espectroscópicos RMN 13C del Lupeol (3) con la bibliografía

Tabla 12.

Comparación de los datos espectroscópicos RMN 13C del Lupeol (3) con la bibliografía p.54
Tabla 13. Comparación de los datos espectroscópicos RMN 1H del lupeol (3) con la bibliografía

Tabla 13.

Comparación de los datos espectroscópicos RMN 1H del lupeol (3) con la bibliografía p.55
Tabla 14. Unión de fracciones del extracto metanólico

Tabla 14.

Unión de fracciones del extracto metanólico p.56
Tabla 15. Comparación de los datos espectroscópicos RMN 13C de la sacarosa (4) con la

Tabla 15.

Comparación de los datos espectroscópicos RMN 13C de la sacarosa (4) con la p.58
Figura 15. Sacarosa (4)

Figura 15.

Sacarosa (4) p.58
Tabla 17. Comparación de los datos espectroscópicos de los OH de la sacarosa (bibliografía4) con la

Tabla 17.

Comparación de los datos espectroscópicos de los OH de la sacarosa (bibliografía4) con la p.59
Tabla 18. Unión de fracciones del extracto de Hexano

Tabla 18.

Unión de fracciones del extracto de Hexano p.60

Referencias

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Outline : Extracto de hexano