Influencia de COMVIT B sobre la neurogénesis pre y postnatal de ratas wistar

(1)INFLUENCIA DE COMPVIT-B® SOBRE LA NEUROGÉNESIS PRE Y POSTNATAL DE RATAS WISTAR. ERIKA LUCIA MAYORGA BELTRÁN. UNIVERSIDAD DEL TOLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS PROGRAMA DE BIOLOGÍA IBAGUÉ 2013.

(2) INFLUENCIA DE COMPVIT-B® SOBRE LA NEUROGÉNESIS PRE Y POSTNATAL DE RATAS WISTAR. ERIKA LUCIA MAYORGA BELTRÁN. Trabajo de tesis presentado como requisito parcial para optar al título de Biólogo. LILIANA FRANCIS TURNER PhD. Fisiología Celular Directora. TERESA GONZÁLEZ GAY Licenciada en Biología Tecnóloga en Procesos de la Industria Farmacéutica Codirectora. UNIVERSIDAD DEL TOLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS PROGRAMA DE BIOLOGÍA IBAGUE 2013.

(3) "Bienvenido a mi casa. Venga libremente, váyase a salvo, y deje algo de la alegría que trae consigo" Abraham Stoker - Drácula. 3.

(4) NOTA DE ACEPTACIÓN. El trabajo de grado titulado, ― INFLUENCIA DE COMPVIT-B® SOBRE LA NEUROGÉNESIS PRE Y POSTNATAL DE RATAS WISTAR‖ presentado por la estudiante ERIKA LUCIA MAYORGA BELTRÁN, para optar al título de Biólogo, fue revisado y calificado como:. _____________________________ Dra. Liliana Francis Turner. _____________________________ Dra. Teresa González Gay. _____________________________ Firma de jurado. _____________________________ Firma de jurado. Ibagué, de Agosto 2013. 4.

(5) DEDICATORIA El esfuerzo, la dedicación y la paciencia dados en la ejecución de este proyecto no pueden ser para otro más que Dios. Gracias a Él, se cruzaron en mi camino las personas correctas en el momento correcto, y solamente gracias a Él pude llevar a término esta investigación que no solo deja conocimientos a mí y a la ciencia, sino personas, momentos y palabras que ahora definen la profesional en la que me convierto.. 5.

(6) AGRADECIMIENTOS Mis agradecimientos se extienden a todos los que de alguna manera contribuyeron a culminar con éxito esta importante etapa. A Dios, quien define mi moral. A mi familia, por su apoyo incondicional, a mis primas Luisa Alejandra y Lorena, a mi madre, mis hermanas, y muy especialmente a mi Padre, Germán Mayorga quien no ha dudado jamás en darme su apoyo en mis decisiones. Mis amigas de toda la vida, Isliana, Diana, mi mejor amiga Jessica, porque tengo mucha suerte de tenerlas y porque a pesar de no tener ni idea de lo que hacía o por qué lo hacía, siempre me acompañaron. A mis amigas de la UT, Johana, Yudy, Jacquelin, Eliana y Jeniffer, por trasnocharse, llorar, reír, viajar, pelear y participar en muchas otras importantes actividades de la carrera conmigo. Gracias a la Universidad del Tolima, a la Facultad de Ciencias Básicas y al Programa de Biología. Muchas gracias al GRUPO DE MODELOS EXPERIMENTALES PARA LAS CIENCIAS ZOOHUMANAS, por acoger mi proyecto y ser la cuna de mi interés como investigador en neurociencias. A todos sus integrantes porque de alguna manera tuve su colaboración durante la ejecución del proyecto y porque sé que más que el apoyo académico, tengo su amistad. Angélica, muchas gracias por acompañarme. Liliana Francis Turner, gracias por ser una inspiración en mi vida académica y un ejemplo como persona y profesional.. 6.

(7) TABLA DE CONTENIDO Pág INTRODUCCIÓN. 19. 1. OBJETIVOS. 21. 1.1 OBJETIVO GENERAL. 21. 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 21. 2. MARCO REFERENCIAL. 22. 2.1 NEUROGÉNESIS. 22. 2.1.1 Neurogénesis Embrionaria. 22. 2.1.2 Desarrollo Postnatal. 26. 2.1.3 Neurogénesis Adulta. 27. 2.2 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA NEUROGÉNESIS. 29. 2.3 VITAMINAS. 31. 2.4 COMPLEJO B. 31. 2.5 COMPVIT -B®. 35. 2.6 LABERINTO ACUÁTICO DE MORRIS (LAM). 36. 2.7 BrdU. 37. 3. METODOLOGÍA. 39. 3.1 SUJETOS EXPERIMENTALES. 39. 3.2 GRUPOS EXPERIMENTALES- TRATAMIENTO PRENATAL. 41. 7.

(8) 3.2.1 Seguimiento al Ciclo Estral. 41. 3.2.2 Inyección Intraperitoneal. 41. 3.3 GRUPOS EXPERIMENTALES – TRATAMIENTO POSTNATAL. 42. 3.3.1 Test Neurológico. 42. 3.3.2 Laberinto Acuático de Morris (LAM). 43. 3.3.3 Marcaje de células con BrdU. 45. 3.3.4 Perfusión. 45. 3.3.5 Inmunofluorescencia. 45. 3.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO. 46. 4. RESULTADOS. 47. 4.1 APAREAMIENTO CONTROLADO Y SEGUIMIENTO DE LA GESTACIÓN 47 4.2 LABERINTO ACUÁTICO DE MORRIS (LAM). 49. 4.2.1 LAM del Tratamiento Prenatal. 49. 4.2.2 LAM del Tratamiento Postnatal. 52. 4.3 INMUNOFLUORESCENCIA. 55. 4.3.1 Inmunofluorescencia del tratamiento prenatal. 56. 4.3.2 Inmunofluorescencia del tratamiento post natal. 58. 5. DISCUSIÓN. 62. 6. CONCLUSIONES. 68. REFERENCIAS. 69. ANEXOS. 100. 8.

(9) LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 1. Línea del tiempo de los principales eventos en el desarrollo del cerebro.. 23. Figura 2. Comparación de los principales eventos del desarrollo en cerebros de ratas y humanos. 25. Figura 3. Neurogénesis y células madre neuronales en el cerebro adulto.. 28. Figura 4. Estructura de la Tiamina.. 32. Figura 5. Estructura de la Piridoxina.. 33. Figura 6. Estructura de la Cianocobalamina. 34. Figura 7. BrdU (5-bromo- 2’-deoxyuridina) Bromodeoxiuridina.. 37. Figura 8. Agrupación de los tratamientos experimentales. 39. Figura 9. Metodología experimental.. 40. Figura 10. Descripción de las características del aparato para realizar LAM. 44. Figura 11. Comparación de la ganancia en peso durante la gestación.. 47. Figura 12. Comparación del número de días de gestación respecto del tratamiento.. 48. Figura 13. Número de animales nacidos y sobrevivientes por camada. 49. Figura 14. Latencia de Escape en el LAM de adquisición para los animales tratados en etapa prenatal. 50. Figura 15. Latencia de escape en el tercer día del LAM de adquisición y la fase de retención para los animales tratados en la etapa prenatal. 50. 9.

(10) Figura 16. Latencia de Escape en el LAM de retención para los animales tratados en etapa prenatal.. 51. Figura 17. Latencia de escape en el LAM de transferencia para los animales tratados en etapa prenatal.. 52. Figura 18. Latencia de escape en el LAM de adquisición para los animales tratados en etapa neonatal.. 53. Figura 19. Latencia de escape del tercer día del LAM de adquisición y la fase de retención para los animales tratados en etapa postnatal. 53. Figura 20. Latencia de Escape en el LAM de retención para los animales tratados etapa neonatal.. 54. Figura 21. Latencia de escape en el LAM de transferencia para los animales tratados en etapa neonatal.. 55. Figura 22. Controles de procedimiento para el doble marcaje. 56. Figura 23. Inmunofluorescencia del grupo prenatal que recibió CompvitB®. 56. Figura 24. Inmunofluorescencia del grupo prenatal tratado con el vehículo. 57. Figura 25. Número de células marcadas con BrdU y NeuN en los animales tratados en la etapa embrionaria. 57. Figura 26. Inmunofluorescencia de los animales tratados con CompvitB® en la etapa postnatal. 58. Figura 27. Inmunofluorescencia de animales tratados con vehículo durante la etapa postnatal. 58. Figura 28. Número de células marcadas con BrdU y NeuN en los animales tratados en la etapa post natal. 59. Figura 29. Inmunofluorescencia de todos los tratamientos en etapas pre y pos natal. 60. Figura 30. Comparación del número de células marcadas con BrdU y NeuN en los animales tratados en las etapas prenatal y postnatal. 61. 10.

(11) Figura 31. Fases del Ciclo Estral. 108. Figura 32. Espermatozoides de rata Wistar tomados de citología vaginal exfoliativa. 108. Figura 33. Ejecución del Laberinto Acuático de Morris. 116. Figura 34. Esquema de cráneo de rata. 123. Figura 35. Esquema de la inserción de la aguja en el corazón de la rata. 127. 11.

(12) LISTA DE CUADROS Pág. Cuadro 1. Factores que influencian la neurogénesis.. 30. Cuadro 2. Distribución y actividades en los grupos de la primera etapa experimental. 41. Cuadro 3. Distribución y actividades en los grupos durante la segunda etapa experimental. 42. Cuadro 4. Descripción de los procedimientos realizados en el Test Neurológico.. 43. Cuadro 5. Descripción de las pruebas estadísticas realizadas. 46. Cuadro 6. Proporción celular que se observa en el tejido vaginal durante cada fase del ciclo estral. 107. Cuadro 7. Resultados de la prueba de normalidad en el LAM prenatal. 134. Cuadro 8. Resultados de la prueba de normalidad en el LAM postnatal. 134. Cuadro 9. Resultados de la prueba de normalidad para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN. 135. Cuadro 10. Resultados de la estadística descriptiva de los animales tratados con Compvit-B® en etapa prenatal. 135. Cuadro 11. Resultados de la estadística descriptiva de los animales tratados con vehículo en etapa prenatal. 135. Cuadro 12. Resultados de la estadística descriptiva de los animales tratados con Compvit-B® en etapa post natal. 136. Cuadro 13. Resultados de la estadística descriptiva de los animales tratados con vehículo en etapa post natal. 136. Cuadro 14. Resultados de la estadística para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN. 137. 12.

(13) Cuadro 15. ANOVA en fase de adquisición del LAM para los animales tratados en etapa prenatal. 137. Cuadro 16. Test de probabilidad Post-hoc para la ANOVA en fase de adquisición del LAM de los animales tratados en etapa prenatal con interacción 1x2. 138. Cuadro 17. ANOVA en fase de retención del LAM para los animales tratados en etapa prenatal. 138. Cuadro 18. ANOVA en fase de transferencia del LAM para los animales tratados en etapa prenatal. 138. Cuadro 19. Test de probabilidad Post-hoc para la ANOVA en fase de transferencia del LAM de los animales tratados en etapa prenatal con interacción 1x2. 139. Cuadro 20. ANOVA en fase de adquisición del LAM para los animales tratados en etapa post natal. 139. Cuadro 21. Test de probabilidad Post-hoc para la ANOVA en fase de adquisición del LAM de los animales tratados en etapa postnatal con interacción 1x2. 139. Cuadro 22. ANOVA en fase de retención del LAM para los animales tratados en etapa postnatal. 140. Cuadro 23. ANOVA en fase de transferencia del LAM para los animales tratados en etapa post natal. 140. Cuadro 24. Test de probabilidad Post-hoc para la ANOVA en fase de transferencia del LAM de los animales tratados en etapa postnatal con interacción 1x2. 140. Cuadro 25. Kruskal-Wallis ANOVA para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN de los animales tratados en etapa prenatal. 141. Cuadro 26. Kruskal-Wallis ANOVA para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN de los animales tratados en etapa post natal. 141. Cuadro 27. Kruskal-Wallis ANOVA para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN de los animales tratados en las etapas pre y post natal. 141. 13.

(14) Cuadro 28. Test de probabilidad Post-hoc para el Kruskal-Wallis ANOVA para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN de los animales tratados en las etapas pre y post natal con interacción 1x2. 142. Cuadro 29. Kruskal-Wallis ANOVA para la comparación de las estructuras.. 142. 14.

(15) LISTA DE ANEXOS Pág. Anexo A. Mantenimiento de una colonia de ratas en el Bioterio de Experimentación Animal de la Universidad el Tolima – PNT. 100. Anexo B. Citología Vaginal Exfoliativa - PNT. 106. Anexo C. Tinción Hematoxilina-Eosina - PNT. 109. Anexo D. Inyección Intraperitoneal (IP) - PNT. 112. Anexo E. Laberinto Acuático de Morris (LAM) - PNT. 115. Anexo F. Preparación de BrdU en líquido cefalorraquídeo - PNT. 118. Anexo G. Inyección Intracerebro Ventricular bilateral de BrdU - PNT. 121. Anexo H. Perfusión de tejidos cerebral - PNT. 126. Anexo I. Inmunofluorescencia: Doble marcaje BrdU – NeuN. PNT. 130. Anexo J. Análisis estadísticos. 134. 15.

(16) LISTA DE ABREVIATURAS AP: Antero Posterior BDNF: Factor neurotrófico derivado del cerebro BHE: Barrera Hemato Encefálica BrdU: Bromodeoxiuridina CA1: Área 1 del cornu ammonis CA3: Área 3 del cornu ammonis cc: corpus callosum CNTF: Factor neurotrófico ciliar CoA: Coenzima A DG: Giro Dentado DV: Dorso Ventral EGF: Factor de crecimiento epidermal f: fornix FAD: Flavín Adenin Dinucleótido FGF: Factor de crecimiento fibroblástico FMN: Flavín mononucleótido ICLAS: International Council for Laboratory Animal Science ICV: Intracerebroventricular ip: Intraperitoneal IV: Intravenosa LAM: Laberinto Acuático de Morris LCRa: Líquido Cefalorraquídeo artificial LV: Ventrículo Lateral ML: Medio Lateral NAD: Nicotinamida Adenín Dinucleótido NeuN: Anti-Neuron Specific Nuclear Protein Antibody OB: Bulbo Olfatorio RMS: Flujo Migratorio Rostral S: Subiculum SGZ: Zona Subgranular SNC: Sistema Nervioso Central SVZ: Zona Sub Ventricular TGF: Factor de crecimiento transformante VEGF: Factor de crecimiento endotelial. 16.

(17) RESUMEN Los requerimientos vitamínicos son cruciales durante las etapas de gestación para el desarrollo correcto del gestante. El complejo vitamínico Compvit-B® compuesto por tiamina, pridoxina y cianocobalamina, ha sido utilizado en tratamientos de neuritis y polineuritis de origen múltiple, neuropatías periféricas, ciáticas, parálisis facial, padecimientos con aumento de la utilización de energía como el estrés y el cáncer. Más recientemente este complejo vitamínico ha sido evaluado en el desarrollo de los procesos de memoria y aprendizaje en animales neonatos concluyendo su contribución a la ejecución exitosa de paradigmas cognitivos. Con el objetivo de evaluar el efecto neurogénico del Compvit-B® durante el desarrollo pre y postnatal del sistema nervioso se establecieron dos grupos experimentales con sus respectivos controles: Grupo Exp. 1: 4 ratas hembras gestante que recibieron una inyección ip. de 0.1ml del complejo vitamínico una vez al día durante los últimos 15 días del embarazo; Grupo Exp. 2: Neonatos de 15 días de nacidos, recibieron una inyección ip. de 0.1ml de complejo vitamínico una vez al día durante 15 días. Los grupos controles para ambos tratamientos recibieron una inyección ip. del vehículo utilizado para diluir la vitamina (agua estéril), bajo las mismas características metodológicas que sus grupos experimentales. Se evaluó la influencia del Compvit-B® en la memoria y el aprendizaje espacial, utilizando la prueba del Laberinto Acuático de Morris (LAM), posteriormente, los animales recibieron una inyección intracerebroventricular (I.C.V) de BrdU, que permitió el marcaje de las células en división. Finalmente se reveló histológicamente el marcaje de las células reactivas a BrdU y NeuN, confirmando la neurogénesis asociada a la aplicación del Compvit-B®. Los animales que recibieron Compvit-B® en estado embrionario tuvieron un mejor desempeño que su grupo control en la prueba LAM en la fase de transferencia; mientras que los neonatos evidenciaron diferencias significativas en la adquisición y la transferencia respecto a su control. En los resultados histológicos, hubo diferencias significativas en la neurogénesis únicamente en los neonatos tratados con Compvit-B®, con un mayor número de neuronas producidas en la zona hipocampal. Estos resultados evidencian, que la neurogénesis en neonatos mejora significativamente con la aplicación del Compvit-B®, y aunque no fue significativa la mejora de estos procesos neurogénicos por la estimulación vitamínica durante la fase embrionaria, el Compvit-B® posiblemente puede afectar positivamente la gestación; y el estado y desarrollo fisiológico de los neonatos. Palabras clave: Compvit-B®, memoria y aprendizaje, BrdU, neurogénesis, ratas 17.

(18) ABSTRACT The vitamin requirements are vital during the stages of pregnancy for the proper development of the fetus. The Compvit-B vitamin complex composed by vitamins B1, B6 and B12 has been used in the treatment of neuritis and multiple source polyneuritis, peripheral neuropathy, sciatica, facial paralysis, diseases with increased energy use as stress and cancer. Additional, this vitamin complex has been evaluated in the development of learning and memory processes in neonatal animals concluding his contribution to the successful implementation of cognitive paradigms. With the objective to evaluate the neurogenic effect of Compvit-B ® during nervous system development, it’s established two experimental groups with their respective controls: Exp Group 1: 4 pregnant female rats received an ip. Injection of 0.1 ml of the vitamin complex one once a day for the last 15 days of pregnancy; Exp Group 2: Neonates with 15 days old received an ip. Injection of 0.1ml multivitamin once a day for 15 days. Controls for both groups received an ip. Injection treatment, the vehicle used to dilute the vitamin (sterile water), under the same methodological features that their experimental groups. The influence of Compvit-B ® in memory and spatial learning was evaluated using the Morris water maze test (MWM), subsequently, the animals received an intracerebroventricular (ICV) injection of BrdU, this allowed to do monitoring to cell in division. Finally, the histochemistry against BrdU and NeuN showed positive cells. It confirmed the presence of neurogenesis associated with the application of Compvit-B®. The animals that received Compvit-B® in an embryonic state had better performance than the control group at the MWM test in the transfer phase, while neonates showed significant differences in the acquisition and transfer regarding their control. On the other hand, on the histological results, there were significant differences only in neurogenesis in neonates, with a larger number of neurons produced in the hippocampal area. These results show, the neurogenesis in neonates significantly improves with the application of Compvit-B®, and although it was significantly improve these neurogenic processes by stimulation of vitamin during the embryonic stage, the Compvit-B® could positively affect pregnancy, state and physiological development of infants. Keywords: Compvit-B ®, memory and learning, BrdU, neurogenesis, rats. 18.

(19) INTRODUCCIÓN El desarrollo del cerebro humano, es un largo proceso que comienza en la tercera semana de gestación, con la diferenciación de las células progenitoras neurales y se extiende al menos, hasta la adolescencia tardía, posiblemente durante toda la vida (Stiles & Jernigan, 2010). Cambios fundamentales se producen a lo largo de este proceso, especialmente en el estado embrionario tardío y neonatal temprano, donde determinados eventos definen las habilidades del cerebro adulto. Mediante la aplicación de Compvit-B®, se pretende establecer la influencia del complejo vitamínico en los eventos neurogénicos tempranos y en el desempeño en pruebas comportamentales que evalúan la memoria y el aprendizaje. El Compvit-B® es un complejo vitamínico liofilizado compuesto por las vitaminas Tiamina (B1), Piridoxina (B6) y Cianocobalamina (B12); La deficiencia en tiamina durante el embarazo puede producir en neonatos síntomas característicos de la polineuritis y se ha asociado con la conducción nerviosa (Smithline, et al. 2012; Talwar, et al., 2000), la piridoxina desempeña funciones en el desarrollo cerebral y del sistema nervioso, y durante la gestación puede prevenir la preclampsia (Thaver et. al. 2008) y su deficiencia puede causar isquemia, formación de edemas, producción de radicales libres, neurotoxicidad y alteraciones cognitivas a largo plazo (Kuypers & Hoane, 2010), mientras que la cianocobalamina, es un nutriente importante para el desarrollo y función normal del cerebro (Stabler, 2003; Healton et. al. 1991), y su hipovitaminosis puede provocar pérdida de la mielina, y en los casos más severos, atrofia cerebral (Black, 2008). Por lo tanto, la aplicación de estas vitaminas puede favorecer eventos en el desarrollo temprano del cerebro. El Compvit-B® se ha indicado para el tratamiento de neuropatías y enfermedades neurodegenerativas (González, et al. 2011) y previamente, González, et al. 2011a han comprobado la efectividad del complejo en la recuperación de una lesión de fimbria-fornix y Bonilla, et. al, 2008 reportaron un mejor desempeño en la ejecución de pruebas comportamentales en animales neonatos tratados con Compvit-B®. Teniendo como referencia estos antecedentes, se propuso evaluar la influencia neurogénica del Compvit-B® en dos etapas diferentes del desarrollo en ratas: embrionaria y neonatal, y comprobar tanto comportamental como histológicamente la posible presencia de eventos neurogénicos asociados al complejo vitamínico. Para llevar a cabo estos objetivos, evaluó del aprendizaje y la memoria espacial se correlacionaron las células con mediante la prueba del LAM, y inmunoreactividad positiva a BrdU y NeuN como marcadores de posibles procesos neurogénicos. Este proyecto, muestra nuevas aplicaciones del Compvit-B®, resalta la importancia de dos etapas en el desarrollo del sistema nervioso fundamentales y 19.

(20) la participación determinante de las vitaminas en los eventos neurológicos iniciales.. 20.

(21) 1. OBJETIVOS 1.1 OBJETIVO GENERAL Evaluar los efectos neurogénicos del complejo vitamínico COMPVIT-B® en dos etapas del desarrollo de ratas Wistar: embrionaria y neonatal. 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Determinar el efecto de la administración intraperitoneal del complejo Compvit-B® sobre los procesos neurogénicos durante las etapas embrionaria y neonatal a través del inmunomarcaje de BrdU y NeuN.  Establecer la influencia de la aplicación del complejo Compvit-B® en la ejecución de tareas de aprendizaje y memoria espacial evaluadas con la prueba del Laberinto Acuático Morris (LAM).  Correlacionar la magnitud de los procesos neurogénicos con la ejecución de la prueba de memoria y aprendizaje espacial de los grupos tratados con Compvit-B® en las etapas embrionaria y neonatal.. 21.

(22) 2. MARCO REFERENCIAL 2.1 NEUROGÉNESIS La neurogénesis es el proceso de producción de nuevas neuronas. Este, sucede tanto durante el desarrollo embrionario como en la edad adulta mediante procesos diferentes que proveen y renuevan al cerebro del material neuronal (Bath & Lee, 2010; Stiles & Jernigan, 2010). El proceso neurogénico tiene un rol importante en el aprendizaje y la memoria (Imayoshi I, et al. 2008), incluso, un incremento en la neurogénesis se asocia con una mejor cognición (Van Praag, 2009). Es por esto, que la búsqueda de elementos que favorezcan la producción neuronal, ocupan siempre un interés primario en la investigación. 2.1.1 Neurogénesis Embrionaria. El desarrollo del cerebro humano es un proceso que comienza en la tercera semana de gestación con sucesos que abarcan desde eventos moleculares de expresión génica a efectos ambientales (Stiles & Jernigan, 2010). Durante la gastrulación emergen líneas de células madres, entre ellas las células madre neuronales, que son capaces de producir las diferentes células que conforman el cerebro y el sistema nervioso central (Stiles & Jernigan, 2010). Posteriormente el proceso neuro-ontogénico del ser humano (como se generaliza en la Figura 1) comienza en las semanas 2 y 3 de gestación con el plegamiento y la fusión del ectodermo para formar el tubo neural (Ladher & Schoenwolf, 2005). En la semana 4 de gestación, la porción rostral del tubo neural forman tres vesículas que están destinadas a dar lugar al prosencéfalo, mesencéfalo y romboencéfalo (Rhinn, et al. 2006). Para iniciar la producción neural la población de progenitores neurales se incrementa mediante divisiones simétricas, desde el fin de la gastrulación hasta el día embrionario 42 en humanos. Pasado esto, la división se vuelve asimétrica, y en el caso de los progenitores neurales, la división asimétrica produce un progenitor neural y una neurona (Wodarz & Huttner 2003). El nuevo progenitor neural se queda en la zona proliferativa, mientras que la neurona postmitótica va a tomar su lugar en el neocórtex en desarrollo (Stiles & Jernigan, 2010). En humanos, la neurogénesis cortical se completa aproximadamente en el día embrionario 108 (Clancy, et al. 2001). Durante las semanas 5 y 6 de gestación, neuroblastos, o precursores neurales están proliferando rápidamente dentro de la zona ventricular (matriz germinal) (Bystron, et al. 2008). Por su parte, en la semana 8 de gestación, los neuroblastos comienzan a diferenciarse en cualquiera de los tipos específicos de células neuronales o 22.

(23) PDFURJOLD 7DX  3HWHUVRQ 

(24)  (Q HVWD GLIHUHQFLDFLyQ ORV SURJHQLWRUHV QHXUDOHV VRQ FDSDFHV GH GLIHUHQFLDUVH D FXDOTXLHU WLSR FHOXODU SHUR HVWD FDUDFWHUtVWLFD VH YD UHVWULQJLHQGR HQ HO WLSR GH QHXURQDV TXH SURGXFH 'HVDL  0F&RQQHOO

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(29) \DOWpUPLQRGHOHPEDUD]RHQODVVHPDQDVDGHJHVWDFLyQ OD SURSRUFLyQ GHO YROXPHQ WRWDO GHO FHUHEUR TXH FRQWLHQH PDWHULD EODQFD PLHOLQL]DGDVHLQFUHPHQWDGHODO +SSLHWDO

(30)   )LJXUD/tQHDGHOWLHPSRGHORVSULQFLSDOHVHYHQWRVHQHOGHVDUUROORGHOFHUHEUR . 5HSUHVHQWDFLyQ GHO GHVDUUROOR FHUHEUDO ,QLFLD FRQ OD QHXUXODFLyQ \ FRQWLQ~D FRQ OD PLJUDFLyQ QHXURQDOVLQDSWRJpQHVLVSRGDPLHOLQL]DFLyQ\DGHOJD]DPLHQWRFRUWLFDO  )XHQWH0RGLILFDGRGH*LHGG. 6LPXOWiQHDPHQWH ORV PHFDQLVPRV FHOXODUHV \ PROHFXODUHV GH H[SDQVLyQ GHO GHVDUUROOR GHO VLVWHPD QHUYLRVR FHQWUDO VRQ FRQWUDUUHVWDGRV SRU OD HOLPLQDFLyQ. .

(31) selectiva de las neuronas y sus procesos (Cowan, et al. 1984). El número de neuronas en el cerebro humano, alcanza su pico en la semana 28 de gestación, sin embargo, al menos la mitad de las neuronas producidas en la neurogénesis mueren por el proceso de apoptosis al final de la adolescencia (Lossi & Merighi, 2003). Durante el desarrollo las neuronas compiten por factores tróficos para optimizar sus funciones, así, unas de las funciones más importantes de la muerte celular en el cerebro en desarrollo es el rol en la regulación del establecimiento de circuitos neuronales funcionales y efectivos (Buss & Oppenheim, 2006). La muerte celular puede también servir para corregir los errores en la producción ó migración neural (Buss & Oppenheim, 2004). Éste proceso apoptótico tiene su primer pico que involucra principalmente precursores celulares de proliferación y neuroblastos post mitóticos jóvenes en la zona ventricular (Blaschke, et al. 1996). Este pico comienza cerca de la semana 7 de gestación y continúa a través del primer trimestre (Tau, G. Z. & Peterson, B. S., 2010), está gobernada por procesos intracelulares relacionados a la regulación del ciclo celular (de la Rosa & de Pablo, 2000). El segundo pico de apoptosis se produce alrededor de las semanas 19 a 23 y elimina neuronas postmitóticas dentro de la placa cortical (Tau, & Peterson, 2010). En este pico la apoptosis es regulada por la actividad sináptica, varias formas de contacto célula-célula y una amplia gama de factores tróficos que son producidos por células gliales y otras neuronas (Lossi & Merighi, 2003). En este sentido, las células que envían procesos a regiones incorrectas son finalmente eliminadas por ser menos propensas a disparar sincrónicamente con la célula postsináptica, la cual, no puede liberar los factores tróficos necesarios para la supervivencia de las neuronas presinápticas (Goda & Davis, 2003). Así, la actividad neuronal coherente también es importante para la supervivencia y el mantenimiento de las neuronas, sinápsis y los circuitos neuronales (Tau, & Peterson, 2010). Por su parte, la microglía, los oligodendrocitos y los astrocitos, son los componentes gliales de la materia blanca en el sistema nervioso central. Éstos participan en una serie de funciones de apoyo importantes para las neuronas, incluyendo la orientación de la migración neuronal, la regulación de la composición del medio extracelular, la modulación de las conexiones sinápticas, y el aclaramiento de los neurotransmisores (Tau, & Peterson, 2010). Oligodendrocitos premielinizantes colonizan la corteza en desarrollo durante la gestación, y la subsecuente producción de mielina mejora la velocidad y fidelidad de la transmisión de información codificada en los potenciales de acción que se propagan a lo largo de las neuronas (Tau, & Peterson, 2010). Entre las semanas de gestación 20 y 28, la mielina madura es detectada por primera vez en regiones subcorticales y posteriormente en las regiones corticales, en la semana 35 de 24.

(32) gestación estas células son detectadas en el giro pre-central, post-central y la radiación óptica, y en la semana 40 de gestación, se presentan en la radiación acústica (Tau, & Peterson, 2010). Al finalizar el periodo embrionario las estructuras rudimentarias del cerebro y el sistema nervioso central se han definido (Stiles & Jernigan, 2010); durante el desarrollo postnatal se produce la continuación y refinamiento de la mayoría de éstos procesos. De manera similar, pero con una distribución temporal diferente, se forma durante el desarrollo del cerebro de los mamíferos, incluyendo la rata (Figura 2), a lo largo de los ventrículos laterales, una capa germinativa que contiene las células progenitoras neurales que posteriormente se diferencian y dan lugar a los diferentes linajes, entre ellos las neuronas que migran hacia todas las estructuras cerebrales (Arias, et al. 2007; Morgane, et al. 1993); y es durante esta etapa también, cuando se inician la mielinización, sinaptogénesis, gliogénesis tardía, apoptosis entre otros procesos que llegan a tener los picos de mayor actividad durante el periodo postnatal (Morgane, et al. 1993). Figura 2. Comparación de los principales eventos del desarrollo en cerebros de ratas y humanos.. Se muestran eventos del desarrollo respecto al nacimiento, eventos de maduración que ocurren en las etapas: prenatal y postnatal. Fuente: Modificado de Morgane, et al., 1993. 25.

(33) 2.1.2 Desarrollo Postnatal. El desarrollo cerebral continúa durante el período postnatal y los cambios estructurales en los principales compartimentos de materia gris y blanca continúan a través de la infancia y la adolescencia, estos cambios en estructura son paralelos a los cambios en organización funcional y se ven reflejados en el comportamiento (Stiles & Jernigan, 2010). Durante el período postnatal temprano, la neurogénesis y la migración neuronal continúan (Bhardwaj, et al. 2006), los niveles de conectividad a través del desarrollo cerebral exceden al de los adultos (Innocenti & Price, 2005). Esta conectividad va decayendo por procesos competitivos que son influenciados por la experiencia del organismo (Stiles & Jernigan, 2010). Además, es un periodo dramático de cambio en la estructura y función cerebral (Tau, & Peterson, 2010). El cerebro crece cerca del 70% del tamaño adulto el primer año de edad y alcanza alrededor del 80% del tamaño adulto para los 2 años de edad (Knickmeyer, et al. 2008). Este crecimiento dramático del cerebro observado en recién nacidos y niños pequeños probablemente es debido a la expansión de la glía y la mielinización durante este periodo (Dekaban, 1978). La mielinización, es característica del desarrollo postnatal y se produce rápidamente durante el primer año de vida, continuando posteriormente a un paso más lento pero estable (Gao, et al. 2009). Por su parte, la materia gris cortical continúa creciendo a través de los primeros años de vida, aunque su tasa es más robusta durante el primer año postnatal (Tau, & Peterson, 2010). La materia blanca, a pesar de tener una tasa de incremento de volumen mayor durante la infancia, su volumen continúa incrementándose a través de la adolescencia y la adultez (Bartzokis, et al. 2003; Sowell, et al. 2003) Los 2 primeros años de vida se ve la arborización de las células piramidales e interneuronas inhibidoras GABAérgicas (Mrzljak, et al. 1990), así como la expansión relativa de las capas corticales II y III, en comparación con otras capas (Landing, et al. 2002). Y para la materia blanca, a pesar de tener una tasa de incremento de volumen mayor durante la infancia, su volumen continúa incrementándose a través de la adolescencia y la adultez (Bartzokis, et al. 2003; Sowell, et al. 2003). Otros eventos en el desarrollo postnatal temprano son las células granulares que aunque comienzan a desarrollarse durante la gestación, tienen su punto máximo durante el periodo postnatal, en el tercer mes en humanos y en la segunda semana en la rata (Altman & Bayer, 1990; Fenoglio, et al. 2006), este proceso ocurre hasta la adultez, aunque en una proporción mucho menor (Gould, et al. 1999). Adicionalmente, durante la etapa postnatal, los factores externos son fundamentales para los procesos que se están desarrollando y determinan las condiciones en las que se manejará el cerebro adulto.. 26.

(34) Por otro lado, al comparar el desarrollo cerebral de la rata con el humano (Figura 2) se hallan grandes similitudes, muchos de los principales eventos suceden proporcionalmente en las mismas etapas, sin embargo, las interpretaciones al usar modelos animales deben ser comparadas específicamente en términos de maduración en el cerebro (Morgane, et al. 1993). Los principales picos de mielinización, apoptosis, sinaptogénesis, gliogénesis y producción de células granulares se dan en el periodo prenatal tardío y postnatal temprano en ratas, y a su vez, de manera similar que en los humanos, durante el periodo postnatal, se produce el mayor crecimiento cerebral en ratas y es esta etapa una de las más sensibles a los estímulos ambientales. Posteriormente, en el periodo postnatal tardío va disminuyendo la producción neuronal, hasta que en la adultez desaparece la zona ventricular germinativa y se mantienen únicamente nichos de proliferación en la Zona Sub Ventricular (Arias, et al. 2007) 2.1.3 Neurogénesis Adulta. Una región cerebral que produce neurogénesis es clasificada como neurogénica, e implica la presencia de células precursoras inmaduras y un micro ambiente que permita la producción de nuevas neuronas (Balu & Lucki, 2009). El descubrimiento de la neurogénesis en adultos se opuso al dogma del siglo pasado, en el que se menciona que en el cerebro mamífero, después del nacimiento, no hay posibilidad de formación de nuevas neuronas (Sierra, et al. 2011). La existencia de neurogénesis en humanos adultos fue firmemente establecida cuando en 1998, demostraron por primera vez que nuevas neuronas se producían en el hipocampo del cerebro adulto (Eriksson, et al. 1998). En roedores, está bien establecido que las nuevas neuronas están involucradas en el olfato así como en ciertas formas de aprendizaje y memoria (Sierra, et al. 2011) y en humanos las nuevas neuronas producidas pueden estar involucradas en el refinamiento del circuito hipocampal optimizándolo para el futuro almacenamiento de memoria (Kempermann, 2002). La neurogénesis adulta ocurre principalmente en dos áreas del prosencéfalo del cerebro adulto en el mamífero, el Giro dentado (GD) y la Zona Sub Ventricular (ZSV) (Taupin & Gage, 2002) (Fig. 3). En el GD del hipocampo, la nuevas neuronas generadas en la Zona Sub Granular (ZSG), una capa bajo la capa granular, migran a la capa granular donde se diferencia a células neuronales de la capa granular y extienden sus proyecciones neuronales al área CA3 del Cuerno de Ammon (Markakis & Gage, 1999); Por esto, la producción de neuronas granulares es importante en el período postnatal temprano, cuando la mayor parte de la porción rostral del hipocampo, particularmente la hoja medial, de la capa de células granulares se está formando (Bayer, 1980).. 27.

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(45) aprovechamiento autólogo (Sohur, et al. 2006) como para terapias de trasplante celular (Goldman & Windrem, 2006). 2.2 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA NEUROGÉNESIS La neurogénesis involucra diferentes procesos: proliferación, falla celular, migración, diferenciación, supervivencia e integración, todos ellos están altamente regulados por factores intrínsecos y extrínsecos (Cuadro 1) (Gheusi, et al. 2009). La neurogénesis adulta es regulada por el ambiente y los estímulos fisiológicos; factores como el estrés crónico, el envejecimiento y la exposición repetida a drogas opiáceas de abuso decrecen la neurogénesis adulta hipocampal (Eisch, et. al. 2000), mientras que el ejercicio, los tratamientos antidepresivos, y el aprendizaje dependiente del hipocampo la incrementan (Eisch & Nestler, 2002), estos factores ambientales pueden afectar también la neurogénesis embrionaria, siendo la madre la que se somete a los estímulos adversos o beneficiosos para el proceso neurogénico (Kolb & Gibb, 2011) El nicho de las células madre es vital en el proceso neurogénico, este nicho consiste en los precursores celulares y las células alrededor que forman un microambiente permisivo. En esta área ocurre comunicación célula – células y es donde las células precursoras reciben las señales reguladoras locales. (Balu & Lucki, 2009). Los factores liberados por otros componentes celulares del nicho neurogénico como GABA y glutamato, regulan el proceso neurogénico (Hsieh & Eish, 2010) y otros neurotransmisores como la serotonina estimulan factores neurotróficos como el BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro) que incrementan la neurogénesis (Hagg, 2009). En general, los factores endocrinos regulan la proliferación de precursores de células granulares en el giro dentado adulto (Gould, et al. 1999). Gould, et al. En el 1998 encontraron que en roedores y primates, la acción supresora de los glucocorticoides en la neurogénesis es biológicamente relevante porque las condiciones que están asociadas con elevadas hormonas adrenales, como el estrés o el envejecimiento, también están acompañados por la disminución de la producción de células granulares. Otros moduladores de la neurogénesis son los factores de crecimiento: El factor de crecimiento fibroblástico (FGF-2), factor de crecimiento epidermal (EGF), factor de crecimiento transformante (TGF), Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y el factor neurotrófico ciliar (CNTF) influencian la proliferación celular en la Zona Subventricular (Bath & Lee, 2010). Factores como las experiencias sensorimotoras, estimulan la neurogénesis en etapa prenatal y postnatal y pueden influenciar poderosamente la organización 29.

(46) cerebral durante el desarrollo y la adultez (Kolb & Gibb, 2011). La exposición a drogas prescritas o por abuso tienen profundos efectos en el desarrollo prefrontal y los comportamientos asociados a esta zona, estos efectos pueden ser duraderos, permanentes y pueden influenciar la plasticidad en el adulto (Kolb & Gibb, 2011). En este sentido, estudios realizados en rata mostraron que la privación del sueño puede reducir la proliferación celular y suprimir la neurogénesis en el hipocampo, el sueño, está relacionado con la consolidación de la memoria cuando el hipocampo envía la información de la memoria al neocortex para almacenaje permanente (Taki & Kawashima, 2012). Así mismo la alimentación durante las etapa prenatal y postnatal son importantes en el desarrollo del Sistema Nervioso Central, la deficiencia de macro y micronutrientes puede influenciar profundamente el proceso neurogénico (Taki & Kawashima, 2012). Cuadro 1. Factores que influencian la neurogénesis. Factores. Neurogénesis. Estrés Enriquecimiento Ambiental Ejercicio Pruebas de Memoria y aprendizaje Envejecimiento Experiencias sensorimotoras Opiáceos Epilepsia Lesión cerebral traumática Isquemia Enfermedad de Huntington Enfermedad de Alzheimer Corticoesterona Factores de Crecimiento Medicamentos Antidepresivos Glutamato Serotonina Estrógeno BDNF Fuente: Adaptado de Taupin 2006, Eisch & Nestler 2002, Gould, et al., 2001, y Bath & Lee, 2010. Las flechas indican el aumento o disminución de la neurogénesis de acuerdo con cada factor.. 30.

(47) 2.3 VITAMINAS Las vitaminas son nutrientes esenciales (Spitzer, 2007), y a diferencia de otros nutrientes no cumplen funciones estructurales ni aportan energía, en cambio, son altamente específicos, por lo que son requeridas en pequeñas cantidades en el organismo y muchas veces requieren una activación metabólica para ser funcionales (Combs, 2008). Muchas vitaminas funcionan como cofactores: A, K y C, tiamina, niacina, riboflavina, piridoxina, biotina, ácido pantoténico, folato y cianocobalamina; Otras vitaminas funcionan como antioxidantes: Vitaminas E y C, y muchas vitaminas funcionan como cofactores metabólicos en reacciones oxido-reductoras: E, K y C, niacina, riboflavina, y ácido pantoténico; Dos vitaminas, A y D, funcionan como hormonas y una de ellas, la vitamina A también funciona como cofactor fotoreceptivo en la visión (Combs, 2008). 2.4 COMPLEJO B Las vitaminas del complejo B son hidrosolubles, esenciales para el funcionamiento normal del metabolismo (Kaneda, et.al. 1997), y están implicadas en muchos desórdenes neuropsiquíatricos y neurodegenerativos (Lalonde, 2008). La vitamina B1 (Figura 4), es requerida para el metabolismo de carbohidratos y las funciones neurológicas (Herrmann & Geisel, 2002), es utilizada como cofactor para la oxidación del ácido pirúvico y el ácido α cetoglutárico en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y en la conjunción con transcetolasa en la ruta de las pentosas fosfato para la glicólisis no oxidativa (Frank, et. al. 2000; Higdon, 2000). Esta vitamina es conocida por sus beneficios al sistema nervioso y la actitud mental (Mindell, 1998). La tiamina no es sintetizada por los humanos y no es almacenada en grandes cantidades en el organismo (Smithline, et al. 2012), por lo tanto, se requiere el consumo diario de 1.2 a 1.5mg, aunque se requieren niveles ligeramente más altos durante el embarazo, la lactancia, la enfermedad o el estrés y en procesos quirúrgicos (Dis Mon, 2003). Está presente en una amplia variedad de alimentos de origen animal y vegetal (Laforenza, et. al. 1997), las mejores fuentes naturales de vitamina B1 incluye levadura seca, cáscara de arroz, trigo integral, avena, cacahuetes, carne de cerdo, la mayoría de las verduras, salvado y leche (Manore, 2000).. 31.

(48) Figura 4. Estructura de la Tiamina... Fuente: Suasti, 2012. La deficiencia de tiamina puede causar beriberi y el síndrome de WernickeKorsakoff y su consumo oral puede usarse para el tratamiento de condiciones fisiopatológicas asociadas con diabetes, fallas cardíacas, y estados hipermetabólicos (Smithline, et al. 2012). También es importante resaltar que la deficiencia de la B1 puede afectar el cerebro en desarrollo, ya que existen enzimas dependientes de tiamina que juegan un papel importante en el metabolismo de energía celular para la síntesis de lípidos y nucleótidos del cerebro en desarrollo (Butterworth, 1990) La riboflavina o vitamina B2 es esencial para la producción de energía en la cadena respiratoria mitocondrial, participa en reacciones metabólicas de carbohidratos, ácidos grasos y proteínas, está presente en las coenzimas flavinmononucleótido (FMN) y flavin adenin dinonucleótido (FAD) (Delgadillo & Ayala, 2009); la vitamina B2 también promueve el crecimiento normal, y asiste la producción de esteroides, glóbulos rojos, y glicógeno (Spitzer, 2007), ayuda a mantener la integridad de las membranas mucosas, piel, ojos, y el sistema nervioso y está involucrada en la producción de adrenalina por las glándulas adrenales (Spitzer, 2007). La vitamina B2 se puede hallar en la levadura, el hígado, leche y sus derivados, huevos, vegetales de hojas verdes y cereales; la deficiencia de riboflavina puede producir alteraciones del crecimiento, alopecia, alteraciones de la visión, mucosa, malformación y sangrados que pueden llevar a la muerte (Delgadillo & Ayala, 2009) La niacina o vitamina B3, hace parte de la coenzima Nicotinamida adenín dinucleótido (NAD) que está involucrada en muchas de las reacciones oxidoreductoras principalmente en la generación de energía a partir de la degradación química de carbohidratos, grasas y proteínas (Spitzer, 2007). Se puede encontrar en la levadura, hígado, pollo, carnes, frutos secos y las legumbres contribuyen con la mayor parte de la niacina obtenido a partir alimentos, la leche y verduras de hojas verdes contribuyen cantidades menores (Spitzer, 2007). La deficiencia de niacina pueden incluir: insomnio, pérdida del apetito, pérdida de masa y peso muscular, indigestión, dolor abdominal, vértigo y/o dolores de. 32.

(49) cabeza; el requerimiento diario de vitamina es de 2mg en los infantes, 14mg para adultos y 18mg para madres gestantes (Spitzer, 2007). El ácido pantoténico ó vitamina B5 es un precursor importante del cofactor enzimático Coenzima A (CoA), la vitamina es ampliamente utilizada en la industria cosmética (Saliba, et al. 2005). Igualmente la Biotina (B8) actúa como cofactor de cuatro carboxilasas: CoA, piruvato carboxilasa, propionil CoA carboxilasa y βmetilcrotonil-CoA carboxilasa, además, cumple un papel importante en la proliferación y diferenciación celular, así como en la regulación de la síntesis de ciertas proteínas (Rodríguez, 2000). Aunque la deficiencia de biotina es muy rara, ocasiona alopecia, dermatitis, resequedad e infecciones, además, algunas alteraciones neurológicas como depresión, somnolencia, dolor muscular y ataxia (Rodríguez, 2000) La vitamina B6 o piridoxina (Figura 5) cumple un papel crucial en el funcionamiento normal del sistema nervioso central (Merrill & Burnham, 1990). Se han observado anormalidades comportamentales y funcionales en animales con deficiencia de vitamina B6 (Wei, et. al. 1999), sugiriendo que la deficiencia de esta vitamina cambia la actividad funcional de estructuras cerebrales o regiones que modulan el movimiento, la cognición, y el aprendizaje (Wei, et. al. 1999), y se han reportado alteraciones bioquímicas y morfológicas en ciertas regiones del cerebro en la progenie de ratas alimentadas con dietas bajas de vitamina B6 durante el embarazo y la lactancia (Wei, et. al. 1999). Figura 5. Estructura de la Piridoxina.. Fuente: Zamora, 2013. La piridoxina juega un rol esencial como cofactor de un amplio rango de reacciones bioquímicas, predominantemente en el metabolismo amino ácido (Havaux, et al. 2009). Junto con la vitamina B2, la vitamina B6 está asociada con la disminución en el riesgo de padecer cáncer colon-rectal (Eussen, et al. 2010). Los mamíferos, adquieren la vitamina B6 en su dieta, el requerimiento diario de la vitamina para adultos es de 2.0 mg y para niños 0.3 mg (Hansen, et.al. 1996). La deficiencia dietaria de piridoxina ha sido implicada en enfermedades cerebrovasculares, cáncer (Mackraj, et. al. 2009), producción de radicales libres, neurotoxicidad (Kuypers & Hoane, 2010), y formas activas de la vitamina B6 han demostrado ser neuroprotectoras luego de un daño de isquemia inducido (Kuypers. 33.

(50) & Hoane, 2010), además, la función cognitiva puede beneficiarse de la suplementación con ácido fólico, vitamina B6 y B12 (Uffelen, et al. 2005). En conjunto, las deficiencias en ácido fólico, vitamina B6 y B12 resultan en elevados niveles del amino ácido homocisteína, por estar vinculados al metabolismo de ella (Selhub, et al. 2003), en este caso, la homocisteína es rápidamente metabolizada a S-adenosylhomocysteina, un potente inhibidor de las reacciones que requieren metilación, adicionalmente la homocisteína puede ser directamente tóxica para las células endoteliales vasculares (Ariogul, et al. 2005), y se han encontrado asociaciones negativas entre el incremento de los niveles de homocisteína y el desempeño cognitivo global, memoria, velocidad psicomotora, habilidades espaciales (Riggs, et al. 1996), la enfermedad de Alzheimer (Ramesh, et al. 2010) y el 1% de los casos de demencia (Ariogul, et al. 2005) El folato, ácido fólico o vitamina B9 es un nutriente esencial para la replicación del ADN y es un substrato para ciertas reacciones enzimáticas que involucran síntesis de aminoácidos, es muy requerida durante el embarazo por ser necesaria para el crecimiento y desarrollo del feto (Greenberg, et al. 2011). La deficiencia de ácido fólico puede causar anemia, neuropatía periférica y anormalidades congénitas (Greenberg, et al. 2011). Se halla fácilmente en alimentos como: carne, hígado, huevo, vegetales, cereales, frutas y se recomienda la ingesta diaria de entre 30 y 40µg dependiendo de la edad o condición (Rodríguez, 1998) La vitamina B12 o cianocobalamina, es un nutriente esencial para el desarrollo de todas las células y el crecimiento humano (Kumar, et al. 2009). Está compuesta por un átomo central de cobalto unido a un grupo dimetilbencimidazol, cuatro átomos de nitrógeno cada uno pertenecientes a cuatro anillos pirrólicos, y un grupo R (-CN, -OH, -CH3, o grupo adenosil) que denota el tipo específico de cobalamina (Werder, 2010) (Figura 6). Esta vitamina soporta el proceso de eritropoyesis durante el embarazo (Carretti, et al. 1998), actúa como coenzima en la síntesis del ADN y juega un rol integral en el desarrollo de la vaina de la mielina (Herbert, 1996). Figura 6. Estructura de la Cianocobalamina.. Fuente: Forrelat, et al., 1999. 34.

(51) La cianocobalamina es una forma no fisiológica de la cobalamina, en el organismo se transforma de forma espontánea en metil y 5-desoxiadenosil que son las formas fisiológicamente activas de la vitamina B12 (Forrelat, et al. 1999). El requerimiento diario es de 2.0µg o entre 0,3 y 1,5 para niños y lactantes y se puede obtener únicamente de fuentes animales (Carmel, 1997). La deficiencia de la vitamina B12 puede resultar en daños irreversibles para el sistema nervioso central (Fujii, et al. 1996), puede llevar a la degeneración del nervio, anemia perniciosa, enfermedad cardiovascular, debilidad, y/o fatiga (Bernard, et al. 1998), además los infantes con deficiencias en vitamina B12 han sido asociados con desmielinización y atrofia cerebral (Black, 2008) Al igual que el folato, la deficiencia de vitamina B12 disminuye los niveles del metabolito 5-hydroxytryptamina importante en el líquido cefalorraquídeo (Botez, et al. 1982). Otros efectos de la deficiencia de la cianocobalamina incluyen la deficiencias de espermidina que está involucrada en la señalización del glutamato (Adachi, et al. 2003), la modulación de citoquinas / factores de crecimiento (Scalabrino & Peracchi, 2006), y altera las uniones GABA transportador/receptor (Brennan, et al. 1981). Un rol de esta vitamina en las transmisiones sinápticas se ha indicado para hallazgos en methil-cobalamina (un análogo de la vitamina B12) mejorando los potenciales exitatorios post-sinápticos en zonas hipocampales (Ikeuchi & Nishizaki, 1995). 2.5 COMPVIT-B® El COMPVIT-B® es un complejo vitamínico liofilizado compuesto por 100 mg de clorhidrato de tiamina (B1), 100 mg de clorhidrato de piridoxina (B6) y 5 mg de cianocobalamina (B12) producido por la Empresa de Productos Biológicos Carlos J. Finlay de La Habana, Cuba. El COMPVIT-B® ha sido utilizado en tratamientos de neuritis y polineuritis de origen múltiple, neuropatías periféricas, ciáticas, parálisis facial, padecimientos con aumento de la utilización de energía como el estrés y el cáncer (Bonilla, et al. 2008). El complejo vitamínico ha demostrado tener una influencia, experimentalmente demostrada en ratas Wistar, en la recuperación de una lesión en nervio periférico, acelerando la recuperación funcional de la extremidad afectada, con lo cual se atribuye la regeneración del nervio dañado (González, et al. 2011) y en la recuperación de lesiones de fimbria – fornix, que causan deprivación colinérgica al hipocampo y en consecuencia un impacto negativo a la hora de desempeñarse en pruebas de aprendizaje espacial como el laberinto acuático de Morris, los animales tratados con Compvit-B® mostraron mejores latencias de escape (González, et al. 2011a). 35.

(52) Del COMPVIT-B® se ha probado también, que mejora la habilidad de animales en la respuesta de pruebas comportamentales, luego de ser aplicado en etapa neonatal. Los animales que recibieron COMPVIT-B® probaron tener latencias de escape menores comparadas con el grupo control, con un rápido progreso en el proceso de aprendizaje (Bonilla, et al. 2008). Estos resultados pueden suponer, que el complejo vitamínico está influyendo en la neurógenesis de los animales tratados; Esta conclusión podría ser verificada y comparada realizando inmuno marcaje de células en división, dilucidando nuevas aplicaciones del COMPVIT-B® en el aporte y mejoramiento de la calidad de vida. 2.6 LABERINTO ACUÁTICO DE MORRIS (LAM) Las pruebas comportamentales aportan información acerca de los mecanismos neurobiológicos y los sustratos neuroanatómicos de la memoria y el aprendizaje en roedores (Sharma, et al. 2010). El Laberinto Acuático de Morris, es una de las pruebas comportamentales mas utilizadas que permite el estudio de la memoria de referencia, la memoria de trabajo espacial y el aprendizaje (Dudchenko, 2004) El aparato consiste de una piscina circular con una pequeña plataforma oculta a dos centímetro bajo el nivel del agua (D’Hooge & De Deyn, 2001). El animal debe aprender a localizar la plataforma de escape partiendo desde distintos puntos seleccionados al azar (Sharma, et al. 2010); El animal puede usar tres estrategias para hallar la plataforma: Praxis, cuando el animal aprende la secuencia de movimientos que los llevan a la plataforma, Taxis, cuando el animal usa pistas cercanas al objetivo para hallar la plataforma, y la estrategia espacial, en la que el animal llega usando la información acerca de la ubicación espacial de la plataforma de acuerdo con la configuración espacial de las pistas distantes (Sharma, et al. 2010). Con el tiempo, el animal aprende dónde está la plataforma y el tiempo que le toma en llegar va disminuyendo (Simpson & Kelly, 2011). Para la ejecución de la prueba deben controlarse muchas características que pueden influir en los resultados: el sexo, la edad, la cepa de los animales, la alimentación y el estrés son determinantes a la hora de planificar el LAM (D’Hooge & De Deyn, 2001). Esta prueba, ha demostrado ser muy sensible a los daños producidos en el hipocampo, es de rápido aprendizaje probablemente debido al estímulo de aversión, no requiere de una preparación previa y elimina la posibilidad de que el animal use pistas aromáticas para orientarse hacia la plataforma de escape (Sharma, et al. 2010).. 36.

(53) 2.7 BrdU La Bromodeoxiuridina es un marcador universalmente usado para detectar células en proliferación en estudios de neurogénesis (Kee, et. al. 2007), que cuando es administrada, se incorpora al ADN durante la fase S del ciclo celular y es transmitida a sus células hijas, tanto, como no se diluya a través de muchos ciclos de proliferación (Karpowicz, et al. 2005). Para el marcaje de nuevas células vía inmnohistoquímica, el BrdU permitió ir más allá en estudios de co-marcaje con marcadores neuronales específicos (Miller & Nowakowski, 1988) y es ampliamente usado en modelos animales para cuantificar el número de células en división en un tejido y para el seguimiento a su progenie (Sierra, et al., 2011). La mayor ventaja del marcaje con BrdU es la sensibilidad para detectar células en proliferación en comparación con otros métodos (Sierra, et al. 2011). BrdU no es un marcador de proliferación celular; es un marcador de síntesis de ADN. Esto tienen profundas consecuencias en el estudio y análisis de la neurogénesis en adultos, así como puede permitir falsos resultados y malinterpretación si los controles apropiados no son implementados (Taupin, 2007). El BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridina) es una halopirimidina (Fig. 4) usada terapéuticamente como agente antiviral y antineoplástico (Begg, et al. 2000; Freese, et al., 1994). Puede ser detectada por inmunohistoquímica, usando directamente anticuerpos monoclonales contra la cadena sencilla de ADN que contiene el BrdU. Este marcaje fue desarrollado como una alternativa para la determinación del índice proliferativo de tumores (Struikmans, et al. 1997), y fue introducida para el estudio de la proliferación celular en el desarrollo del sistema nervioso por Nowakowski, et al. (1989). Figura 7. BrdU (5-bromo- 2’-deoxyuridina) Bromodeoxiuridina.. Fuente: Taupin, 2007. El BrdU cruza la barrera hemato encefálica, y puede ser aplicada vía intracerebroventricular (I.C.V), intraperitoneal (ip.), inyección intravenosa (I.V.), u oralmente para el estudio de neurogénesis adulta (Taupin, 2007). La Bromodeoxiuridina es metabolizada a través de deshalogenación cuando es 37.

(54) integrada en el ADN, una vez deshalogenada, los residuos de uracilo se expulsan del ADN por el sistema de reparación uracil glucosilasa (Hume & Saffhill, 1986). Cuando es administrado vía ip., la concentración del análogo de timidina que alcanza el cerebro es una fracción de la dosis administrada, la inyección I.C.V permite grandes concentraciones en el cerebro a diferencia de la entrega periférica, y es empleada cuando una gran concentración local en el cerebro es requerida (Zhao, et al. 2003). Sin embargo, inyecciones ip. o I.V son los métodos de administración más comunes en roedores y primates para el estudio de neurogénesis, porque obvian la necesidad de cirugía (Gould, et al. 2001; Kornack & Rakic, 2001). El BrdU es una sustancia tóxica y la administración puede tener menos toxicidad para el Sistema Nervioso Central (SNC) adulto que para el SNC embrionario y neonatal, porque la Barrera Hemato Encefálica (BHE) está más desarrollada en el adulto (Taupin, 2007). Sin embargo, y a pesar de sus limitaciones es una de las metodologías más utilizadas para el marcaje de células en división, por minimizar los riesgos y falencias que presenta el marcaje por 3H Timidina.. 38.

(55) 0(72'2/2*Ë$  )LJXUD$JUXSDFLyQGHORVWUDWDPLHQWRVH[SHULPHQWDOHV . 'LYLVLyQGHORVJUXSRVGXUDQWHODVHWDSDVH[SHULPHQWDOHVSUH\SRVWQDWDO  . . 68-(726(;3(5,0(17$/(6  3DUDODLQYHVWLJDFLyQVHXWLOL]DURQLQLFLDOPHQWHUDWDVKHPEUDV GHVWLQDGDVSDUD HO WUDWDPLHQWR SUHQDWDO \  IXHURQ ODV PDGUHV GH ORV DQLPDOHV WUDWDGRV SRVWQDWDOPHQWH

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(63) 3.2 GRUPOS EXPERIMENTALES – TRATAMIENTO PRENATAL En la primera etapa del proyecto, se realizó la aplicación prenatal del Compvit-B® en ratas durante los últimos 15 días de gestación, los animales se agruparon como se muestra en el cuadro 2. Cuadro 2. Distribución y actividades en los grupos de la primera etapa experimental Grupo Compvit Pre. Grupo Vhl Pre. 2 Ratas Wistar hembras. 2 Ratas Wistar hembras. Pareja. Pareja. Citología Vaginal Exfoliativa. Citología Vaginal Exfoliativa. Día 0 de embarazo. Día 0 de embarazo. Seguimiento de peso e Inyección ip. de 0.1ml de Compvit-B® durante los últimos 15 días de gestación. Seguimiento de peso e Inyección ip. de 0.1ml de agua estéril durante los últimos 15 días de gestación. 3.2.1 Seguimiento al Ciclo Estral. Las hembras de rata Wistar fueron sometidas a Citología Vaginal Exfoliativa con el procedimiento descrito en el Protocolo de normalización de Trabajo (PNT) 2 (Anexo B), y el frotis obtenido, fue teñido con Hematoxilina – Eosina, una tinción que permite el marcaje diferencial de núcleos y citoplasma con el procedimiento descrito en el PNT 3 (Anexo C). A partir de estos resultados, se estableció el día 0 de gestación, como el día en que se encontraba por primera vez espermatozoides en la cavidad vaginal, posteriormente se continuó con un seguimiento de peso en las hembras para controlar cualquier eventualidad dentro de la gestación. 3.2.2 Inyección Intraperitoneal (ip.). Una vez establecido el día 0 de gestación, se comenzó un registro diario de peso en las ratas. A partir del día 7 las hembras de del tratamiento prenatal fueron inyectadas Intraperitonealmente mediante el protocolo descrito en el PNT 4 (Anexo D) con 0.1ml de Compvit-B® y agua estéril, respectivamente durante los 15 días siguientes o hasta el nacimiento de las crías. Las hembras del Grupo postnatal no se inyectaron, sólo sirvieron de control para el seguimiento de peso hasta el nacimiento de sus crías. 41.

(64) 3.3 GRUPOS EXPERIMENTALES – TRATAMIENTO POSTNATAL El nacimiento de los animales determinó el tamaño de los grupos experimentales en la segunda etapa. Los grupos experimentales se distribuyeron y se trabajaron como se muestra en el cuadro 3. Cuadro 3. Distribución y actividades en los grupos durante la segunda etapa experimental Neonatos de 15 días Grupo Compvit Post. Seguimiento de peso e Inyección ip. de 0.1ml de Compvit-B® durante 15 días Neonatos de 15 días. Grupo Vhl Post. Seguimiento de peso e Inyección ip. de 0.1ml de agua estéril durante 15 días. Una vez nacidas todas las crías de los grupos, se realizaron controles de peso en los animales y 15 días después de su nacimiento los animales del grupo experimental postnatal, recibieron una inyección ip. de 0.1ml de Compvit-B® ó 0.1ml de agua estéril (vehículo) según correspondiera. Al finalizar la aplicación del tratamiento postnatal, estos animales, junto con las crías de las hembras tratadas durante el periodo prenatal, fueron sometidos a procedimientos comunes, que se describen en los siguiente acápites, en el siguiendo orden: 1. 2. 3. 4. 5.. Test neurológico Laberinto Acuático de Morris (LAM) Inyección ICV de BrdU Perfusión Inmunofluorescencia. 3.3.1 Test Neurológico. El Test neurológico consiste en una serie de pruebas que permiten determinar el estado del sistema nervioso central (Bures & Buresova, 1983), se realizan con el fin de determinar que los animales estén en condiciones normales para la ejecución del experimento. Las pruebas que se realizaron se encuentran consignadas en el cuadro 4. 42.

(65) Cuadro 4. Descripción de los procedimientos realizados en el Test Neurológico. Prueba. Procedimiento. Reflejo de Flexión. Se levanta al animal y se estira suavemente una de sus extremidades y se evalúa la flexión de su pata. Reflejo de corrección de posición. Se ubica al animal sobre una superficie plana y su cuerpo se gira hasta dejarlo con las extremidades hacia arriba. Se evalúa la corrección de la posición del animal. Reacción de Ubicación. Se suspende el animal de la cola y se acerca al borde de una mesa. Se evalúa la ubicación de las patas delanteras sobre la mesa. Test de Equilibrio. Se ubica el animal sobre una vara de madera durante un minuto. Se evalúa el equilibrio, permanencia y posición del cuerpo en el animal. Reflejo de Córnea. Se toca gentilmente el animal con una fibra suave sobre su córnea y se evalúa el pestañeo de la rata. Impresión Auditiva. Se realiza un fuerte aplauso y se evalúa la retracción repentina de las patas y orejas. Agitación de la cabeza. Se sopla el oído del animal, se evalúa la agitación de la cabeza posterior al soplo. Fuente: Modificado de Ávila, 2008. 3.3.2 Laberinto Acuático de Morris (LAM). Después del Test Neurológico, los animales fueron entrenados en el Laberinto acuático de Morris, para evaluar la memoria y el aprendizaje espacial. El aparato del LAM consiste en una piscina entre 150 – 180 cm de diámetro (Morris, 1984), 70 cm de altura y llena de agua hasta 50cms, en dicha piscina se esconde a 2cms por debajo del agua una plataforma de escape de aproximadamente 7cms de diámetro (Figura 9b), la plataforma se ubicó en el centro de uno de los cuatro cuadrantes imaginarios (Figura 9a). En la habitación donde se realizó el procedimiento se mantuvo con baja iluminación, utilizando para esto un bombillo incandescente de 50W y se establecieron una serie de pistas extra – laberínticas que le permitieron al animal su orientación espacial, por lo que 43.

(66) HQ QXHVWUR SDUDGLJPD QL ODV SLVWDV LQFOXVR OD XELFDFLyQ GHO H[SHULPHQWDGRU QR FDPELDURQGXUDQWHHOH[SHULPHQWR  )LJXUD'HVFULSFLyQGHODVFDUDFWHUtVWLFDVGHODSDUDWRSDUDUHDOL]DU/$0 . D. E. D&RRUGHQDGDV\XELFDFLyQGHODSODWDIRUPDGHHVFDSHE)RWRJUDItDGHOSURFHGLPLHQWRHODQLPDO OOHJDDODSODWDIRUPDGHHVFDSH)XHQWH(ULND0D\RUJD.  'XUDQWHXQDSULPHUDIDVHDGTXLVLFLyQORVDQLPDOHVVHHQWUHQDURQSDUDHQFRQWUDU OD SODWDIRUPD GH HVFDSH HVWD IXH XELFDGD HQ OD SDUWH FHQWUDO GHO  FXDGUDQWH 6XUHVWH (O DQLPDO IXH SXHVWR HQ XQ SXQWR FDUGLQDO 1RUWH 6XU (VWH 2HVWH

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