Fluorescencia
Biología celular 2017 Dra. Melisa Monteleone
Visualizar partes de la célula: membrana plasmática, núcleo, vacuolas, retículo endoplásmico, etc.
Estudiar la interacción entre moléculas in vivo
Localizar moléculas específicas: proteínas, lípidos, etc
Diferenciar partículas muy pequeñas que por contraste de fases no se resolverían.
Estudiar procesos celulares: división celular, muerte celular, cambios en el potencial de membrana, endocitosis y exocitosis.
¿Qué es?
Es un proceso de interacción entre la radiación y la materia en el
cual un material absorbe radiación de una fuente específica y
muy rápidamente emite luz cuya energía es menor (de mayor
longitud de onda) que la de la radiación que ha absorbido
Fuentes:
Excitación por absorción de fotones: fotoluminiscencia
Excitación por una reacción química: quimio-luminiscencia
Excitación por un ser vivo: bioluminiscencia
1) La absorción de la luz de excitación eleva la molécula del fluorocromo a un estado de excitación con un mayor contenido de energía, S1
2) En este estado de excitación se mantienen un tiempo determinado, en el
cual la molécula sufre cambios
conformacionales e interacciona con las moléculas de su entorno.
Como consecuencia, parte de la energía del estado S1 se disipa, creándose un estado S1’ de menor energía
3) Pasado este tiempo de excitación la molécula emite luz de menor energía volviendo a su estado fundamental, S0
S0 S1 S1’ 1 2 3
Diagrama de Jablonski
Fotoluminiscencia
Fluorescencia
Fosforescencia
La diferencia entre ambos fenómenos es la capacidad de almacenar la energía. La fluorescencia absorbe la energía
excitación e inmediatamente emite la radiación luminosa (singuete excitado)
La fosforescencia, comienza igual, absorbiendo energía de excitación, pero la almacena, retardando la emisión,
siendo capaz de emitir esa radiación luminosa poco a poco durante minutos u horas después de haber cesado la fuente de radiación excitadora inicial (triplete excitado).
Ambos procesos
emiten luz
Un fluorocromo es una molécula
capaz de absorber fotones y emitir
fotones de menor energía (mayor
longitud de onda). Un fluoróforo es
la
parte
del
fluorocromo
responsable de la emisión de la
fluorescencia.
Los materiales que fluorescen lo
hacen porque contienen estructuras
con configuraciones moleculares
particulares
conocidas
como
fluoróforos o fluorocromos.
1-Moléculas orgánicas: Los fluoróforos Alexa Fluor (derivados de la rodamina) han sido utilizados como marcadores de biomoléculas. La fotoestabilidad es una de las principales características de este tipo de colorantes, además barren todo el espectro.
Tipos de fluoróforos
2-Puntos cuánticos: son nanocristales (2-50 nm) semiconductores que al ser iluminados, re-emiten luz en una longitud de onda muy específica y que depende del tamaño de este. Cuanto más pequeños sean los puntos, menor es la longitud de onda y más acotadas las propiedades cuánticas de la luz que emiten. Por ello la luz emitida vira del azul al rojo a medida que el tamaño del punto se incrementa.
3-Proteicos: GFP posee un barril beta formado por 11 cadenas e incluye una hélice alfa central que atraviesa el barril en toda su longitud. En esta hélice hay tres aminoácidos consecutivos que forman un cromóforo natural, de forma que cuando la GFP es iluminada con luz ultravioleta, produce una brillante fluorescencia verde.
Mutaciones en residuos clave permitieron obtener variantes de la GFP (espectro de colores y estabilidad).
Debido a la diferente configuración electrónica de los fluorocromos cada uno presenta un espectro de excitación y de emisión característico y único.
Los fabricantes dan el pico de máxima excitación y el pico de máxima emisión o bien los espectros de excitación y emisión.
Espectros de excitación y emisión
Fluorímetro
¿Cómo se obtienen estos espectros?
La presencia de 2 monocromadores permiten el registro de dos tipos
de espectros: el espectro de absorción y el espectro de emisión
Espectro de excitación: Muestra la diferente intensidad de
fluorescencia observada en función de la longitud de onda de excitación, a una longitud de onda de emisión fija
Espectro de excitación
Variación de la IF al variar la λex a una λem constante
Eficacia de las diferentes λex para producir fluorescencia
Espectro de emisión: Muestra la intensidad de la emisión fluorescente en
función de la longitud de onda de emisión, con una longitud de onda de excitación fija (máxima).
Espectro de emisión
Variación de la IF al variar la λem a una λex constante
Intensidad de la radiación emitida a las diferentes λ
Espectro de excitación
Espectro de emisión
1- La intensidad de fluorescencia emitida varía con la longitud (λ) de excitación. La excitación a la λmax (A), produce la fluorescencia más intensa (A).
Características de los espectros
2- El perfil o aspecto del espectro de emisión no depende de la l de excitación.
3- El espectro de emisión es la imagen especular del espectro de absorción.
4- Los espectros se encuentran desplazados
Puntos 1 y 2: Regla de Kasha
La emisión siempre proviene del S1 con una intensidad proporcional al
número de fotones absorbidos.
Esto ocurre por la rápida conversión interna que
Punto 3: La regla del espejo
El espectro de absorción muestra los niveles vibracionales del estado excitado y el espectro de emisión los niveles vibracionales del estado basal, los cuales en la mayoría de los fluorocromos son
Cuando los electrones pasan del estado excitado al estado basal existe una pérdida de energía vibracional. Como consecuencia, el espectro de emisión es desplazado hacia longitudes de onda mayores respecto al espectro de excitación. A este desplazamiento se lo denomina corrimiento de Stokes.
Punto 4: Corrimiento de Stokes
La distancia entre los picos de excitación y emisión de un fluoróforo depende de su estructura electrónica.
Es fundamental para la sensibilidad dado que permite que los fotones de emisión sean detectados contra un fondo bajo, aislado de los fotones de excitación
http://www.lifetechnologies.com/ar/es/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
Tipos de fluorescencia.
La
fluorescencia
primaria
(fluoróforos
intrínsecos) es la que se da porque existe una
configuración inherente a la estructura
molecular. Ejemplo: clorofila, GFP
La fluorescencia secundaria (fluoróforos
extrínsecos) ocurre cuando una molécula
específica o un grupo capaz de fluorescer, un
fluorocromo, se introduce en la estructura de
la muestra. Ejemplo: sondas catiónicas
planares como BrEt o DAPI que se agregan a
los ácidos nucléicos
Éste es el procedimiento para la mayoría de las
aplicaciones biológicas de la microscopía de
fluorescencia.
Aequorea victoria
DAPI intercalado en una molécula
Los fluoróforos extrínsecos pueden ser, a través de vectores de expresión, introducidos en bacterias, células u organismos para dirigir la expresión tanto de las proteínas fluorescentes solas como fusionadas a otra proteína de interés en el contexto del proceso biológico en estudio.
1) Photobleaching: Descomposición irreversible de las moléculas de los fluorocromos.
Está directamente relacionado con la intensidad de la excitación y con el tiempo durante el cual estamos excitando la muestra.
Se usan detectores altamente sensibles, objetivos y filtros ópticos optimizados.
2) Quenching: Disminución de la intensidad de la emisión debida a condiciones de temperatura o presión elevada, agentes oxidantes y algunas sales. También puede ser debida a interacciones entre moléculas de fluorocromo, por lo que aumentar la concentración de éste no siempre supone un aumento de fluorescencia.
Se debe trabajar con agentes secuestradores de oxígeno.
Comercialmente se han desarrollado productos con menor labilidad ante la estimulación lumínica (por ejemplo los fluoróforos Alexa). También se desarrollaron sustancias “antifade” que reducen el bleaching (Slow Fade, Vecta Shield, etc). Sin embargo estas sustancias no se pueden utilizar en células vivas
Cuando se solapan los espectros de emisión. Ejemplo GFP/Alexa 488
Problemas al utilizar dos (o más) fluoróforos
Cuando la emisión de un fluoróforo es capaz de excitar un segundo fluoróforo y es esta fluorescencia la que es detectada.
Usos de estos “problemas” como herramientas en
la investigación
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/spectralimaging/fretbiosensors/indexflash.html Nature
FRAP y FLIP
Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) se decolora un área específica por altos pulsos de láser de intensidad. Posteriormente la cinética de recuperación de fluorescencia es registrada por imágenes de muestreo en intervalos de tiempo regulares con la iluminación de intensidad baja. Uso: Difusión y movilidad de macromoléculas.
Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) una célula fluorescente es decolorada por el láser sostenidamente en una única región mientras se registra la célula completa. Cualquier región en contacto con el área afectada será gradualmente decolorada por los movimientos laterales de las proteínas. En regiones sin conexión la fluorescencia permanecerá intacta. Uso: evaluar continuidad entre áreas, movimiento de proteínas