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Fluorescencia. Biología celular 2017 Dra. Melisa Monteleone

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Academic year: 2021

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(1)

Fluorescencia

Biología celular 2017 Dra. Melisa Monteleone

(2)

Visualizar partes de la célula: membrana plasmática, núcleo, vacuolas, retículo endoplásmico, etc.

Estudiar la interacción entre moléculas in vivo

Localizar moléculas específicas: proteínas, lípidos, etc

Diferenciar partículas muy pequeñas que por contraste de fases no se resolverían.

Estudiar procesos celulares: división celular, muerte celular, cambios en el potencial de membrana, endocitosis y exocitosis.

(3)

¿Qué es?

Es un proceso de interacción entre la radiación y la materia en el

cual un material absorbe radiación de una fuente específica y

muy rápidamente emite luz cuya energía es menor (de mayor

longitud de onda) que la de la radiación que ha absorbido

Fuentes:

Excitación por absorción de fotones: fotoluminiscencia

Excitación por una reacción química: quimio-luminiscencia

Excitación por un ser vivo: bioluminiscencia

(4)

1) La absorción de la luz de excitación eleva la molécula del fluorocromo a un estado de excitación con un mayor contenido de energía, S1

2) En este estado de excitación se mantienen un tiempo determinado, en el

cual la molécula sufre cambios

conformacionales e interacciona con las moléculas de su entorno.

Como consecuencia, parte de la energía del estado S1 se disipa, creándose un estado S1’ de menor energía

3) Pasado este tiempo de excitación la molécula emite luz de menor energía volviendo a su estado fundamental, S0

S0 S1 S1’ 1 2 3

Diagrama de Jablonski

(5)

Fotoluminiscencia

Fluorescencia

Fosforescencia

La diferencia entre ambos fenómenos es la capacidad de almacenar la energía. La fluorescencia absorbe la energía

excitación e inmediatamente emite la radiación luminosa (singuete excitado)

La fosforescencia, comienza igual, absorbiendo energía de excitación, pero la almacena, retardando la emisión,

siendo capaz de emitir esa radiación luminosa poco a poco durante minutos u horas después de haber cesado la fuente de radiación excitadora inicial (triplete excitado).

Ambos procesos

emiten luz

(6)

Un fluorocromo es una molécula

capaz de absorber fotones y emitir

fotones de menor energía (mayor

longitud de onda). Un fluoróforo es

la

parte

del

fluorocromo

responsable de la emisión de la

fluorescencia.

Los materiales que fluorescen lo

hacen porque contienen estructuras

con configuraciones moleculares

particulares

conocidas

como

fluoróforos o fluorocromos.

(7)

1-Moléculas orgánicas: Los fluoróforos Alexa Fluor (derivados de la rodamina) han sido utilizados como marcadores de biomoléculas. La fotoestabilidad es una de las principales características de este tipo de colorantes, además barren todo el espectro.

Tipos de fluoróforos

2-Puntos cuánticos: son nanocristales (2-50 nm) semiconductores que al ser iluminados, re-emiten luz en una longitud de onda muy específica y que depende del tamaño de este. Cuanto más pequeños sean los puntos, menor es la longitud de onda y más acotadas las propiedades cuánticas de la luz que emiten. Por ello la luz emitida vira del azul al rojo a medida que el tamaño del punto se incrementa.

(8)

3-Proteicos: GFP posee un barril beta formado por 11 cadenas e incluye una hélice alfa central que atraviesa el barril en toda su longitud. En esta hélice hay tres aminoácidos consecutivos que forman un cromóforo natural, de forma que cuando la GFP es iluminada con luz ultravioleta, produce una brillante fluorescencia verde.

Mutaciones en residuos clave permitieron obtener variantes de la GFP (espectro de colores y estabilidad).

(9)

Debido a la diferente configuración electrónica de los fluorocromos cada uno presenta un espectro de excitación y de emisión característico y único.

Los fabricantes dan el pico de máxima excitación y el pico de máxima emisión o bien los espectros de excitación y emisión.

Espectros de excitación y emisión

(10)

Fluorímetro

¿Cómo se obtienen estos espectros?

La presencia de 2 monocromadores permiten el registro de dos tipos

de espectros: el espectro de absorción y el espectro de emisión

(11)

Espectro de excitación: Muestra la diferente intensidad de

fluorescencia observada en función de la longitud de onda de excitación, a una longitud de onda de emisión fija

Espectro de excitación

Variación de la IF al variar la λex a una λem constante

Eficacia de las diferentes λex para producir fluorescencia

(12)

Espectro de emisión: Muestra la intensidad de la emisión fluorescente en

función de la longitud de onda de emisión, con una longitud de onda de excitación fija (máxima).

Espectro de emisión

Variación de la IF al variar la λem a una λex constante

Intensidad de la radiación emitida a las diferentes λ

(13)

Espectro de excitación

Espectro de emisión

(14)

1- La intensidad de fluorescencia emitida varía con la longitud (λ) de excitación. La excitación a la λmax (A), produce la fluorescencia más intensa (A).

Características de los espectros

2- El perfil o aspecto del espectro de emisión no depende de la l de excitación.

3- El espectro de emisión es la imagen especular del espectro de absorción.

4- Los espectros se encuentran desplazados

(15)

Puntos 1 y 2: Regla de Kasha

La emisión siempre proviene del S1 con una intensidad proporcional al

número de fotones absorbidos.

Esto ocurre por la rápida conversión interna que

(16)

Punto 3: La regla del espejo

El espectro de absorción muestra los niveles vibracionales del estado excitado y el espectro de emisión los niveles vibracionales del estado basal, los cuales en la mayoría de los fluorocromos son

(17)

Cuando los electrones pasan del estado excitado al estado basal existe una pérdida de energía vibracional. Como consecuencia, el espectro de emisión es desplazado hacia longitudes de onda mayores respecto al espectro de excitación. A este desplazamiento se lo denomina corrimiento de Stokes.

Punto 4: Corrimiento de Stokes

La distancia entre los picos de excitación y emisión de un fluoróforo depende de su estructura electrónica.

Es fundamental para la sensibilidad dado que permite que los fotones de emisión sean detectados contra un fondo bajo, aislado de los fotones de excitación

(18)

http://www.lifetechnologies.com/ar/es/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html

(19)

Tipos de fluorescencia.

La

fluorescencia

primaria

(fluoróforos

intrínsecos) es la que se da porque existe una

configuración inherente a la estructura

molecular. Ejemplo: clorofila, GFP

La fluorescencia secundaria (fluoróforos

extrínsecos) ocurre cuando una molécula

específica o un grupo capaz de fluorescer, un

fluorocromo, se introduce en la estructura de

la muestra. Ejemplo: sondas catiónicas

planares como BrEt o DAPI que se agregan a

los ácidos nucléicos

Éste es el procedimiento para la mayoría de las

aplicaciones biológicas de la microscopía de

fluorescencia.

Aequorea victoria

DAPI intercalado en una molécula

(20)

Los fluoróforos extrínsecos pueden ser, a través de vectores de expresión, introducidos en bacterias, células u organismos para dirigir la expresión tanto de las proteínas fluorescentes solas como fusionadas a otra proteína de interés en el contexto del proceso biológico en estudio.

(21)
(22)

1) Photobleaching: Descomposición irreversible de las moléculas de los fluorocromos.

Está directamente relacionado con la intensidad de la excitación y con el tiempo durante el cual estamos excitando la muestra.

Se usan detectores altamente sensibles, objetivos y filtros ópticos optimizados.

2) Quenching: Disminución de la intensidad de la emisión debida a condiciones de temperatura o presión elevada, agentes oxidantes y algunas sales. También puede ser debida a interacciones entre moléculas de fluorocromo, por lo que aumentar la concentración de éste no siempre supone un aumento de fluorescencia.

Se debe trabajar con agentes secuestradores de oxígeno.

Comercialmente se han desarrollado productos con menor labilidad ante la estimulación lumínica (por ejemplo los fluoróforos Alexa). También se desarrollaron sustancias “antifade” que reducen el bleaching (Slow Fade, Vecta Shield, etc). Sin embargo estas sustancias no se pueden utilizar en células vivas

(23)

Cuando se solapan los espectros de emisión. Ejemplo GFP/Alexa 488

Problemas al utilizar dos (o más) fluoróforos

(24)
(25)

Cuando la emisión de un fluoróforo es capaz de excitar un segundo fluoróforo y es esta fluorescencia la que es detectada.

(26)

Usos de estos “problemas” como herramientas en

la investigación

(27)

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/spectralimaging/fretbiosensors/indexflash.html Nature

(28)

FRAP y FLIP

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) se decolora un área específica por altos pulsos de láser de intensidad. Posteriormente la cinética de recuperación de fluorescencia es registrada por imágenes de muestreo en intervalos de tiempo regulares con la iluminación de intensidad baja. Uso: Difusión y movilidad de macromoléculas.

Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) una célula fluorescente es decolorada por el láser sostenidamente en una única región mientras se registra la célula completa. Cualquier región en contacto con el área afectada será gradualmente decolorada por los movimientos laterales de las proteínas. En regiones sin conexión la fluorescencia permanecerá intacta. Uso: evaluar continuidad entre áreas, movimiento de proteínas

Referencias

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