SARS-COV-2 VARIANTS REALTIME PCR KIT

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Vircell Marketing Científico Marzo 2021

SARS-COV-2 VARIANTS REALTIME PCR KIT

Información de Producto

1. Nombre / referencias / Uso indicado / Estado regulatorio

Nombre: SARS-COV-2 VARIANTS REALTIME PCR KITS

Referencias: RTPCR010-R, RTPCR010-LP-R

Uso indicado: PCR en tiempo real para la detección de ácidos nucleicos de SARS-CoV-2 en

muestras respiratorias humanas e identificación de variantes de SARS-CoV-2.

Situación regulatoria: producto RUO. Producto CE/IVD disponible a finales de marzo.

2. Características principales del ensayo:

- El kit se basa en la detección del virus SARSCoV-2 enfocada en dos sitios diferentes del gen de la espícula (S) para la diferenciación de variantes y el gen N, común a todos los linajes identificados hasta la fecha.

- Dianas del ensayo para SARS CoV-2: la identificación de variantes del ARN del coronavirus se detecta en FAM (S - N501), HEX / VIC (S- H69 / V70). Texas Red / Rox (N) se utiliza para la detección genérica del SARS CoV-2, mientras que el control interno está marcado con Cy5 (ARNasa P humana).

- La Master mix contiene reactivos para la detección de un fragmento específico del gen N del SARS-CoV-2 y dos fragmentos del gen S para la diferenciación de variantes. La prueba detecta la presencia de residuos 69-70 en un canal óptico y la presencia del residuo de tipo silvestre N501 en otro canal. Estos residuos están ausentes o mutados en algunos linajes, por lo que la diferenciación variante se basa en la ausencia de amplificación.

- Se incluye un control de amplificación asociado a la extracción de la muestra (gen humano RNAse P) para comprobar la ausencia de carry-over de inhibidores de amplificación y la correcta configuración de amplificación. Detectado en el canal Cy5.

- PCR Multiplex en un solo tubo de reacción por muestra.

- Vial liofilizado que contiene todo el material necesario: transcriptasa inversa, Taq polimerasa, tampón y cebadores/sondas específicas para el virus SARS-CoV-2 (gen N y gen S). Además, como control interno, cebadores/sonda para el gen de la ARNasa P humana.

- El ensayo proporciona una asignación de variante preliminar, por lo que es necesario realizar una caracterización genómica completa mediante secuenciación.

Linaje Origen del primer caso informado

Mutaciones en la proteína de la espícula deleción HV-69/70 Mutación N501Y

B.1.1.7 Reino unido Presente Presente

B.1.351 Sudáfrica Ausente Presente

B.1.1.28.1 (P.1) Brasil Ausente Presente

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3. Ventajas

- Resultados rápidos y fiables en menos de 2 horas.

- Adecuado para termocicladores de cuatro canales: FAM, HEX/VIC, Texas Red/ROX and Cy5. - Master Mix y control positivo liofilizados para garantizar la estabilidad y reducir los costes de

transporte, en comparación con los productos con un formato congelado.

- Diferentes presentaciones del kit para una mayor comodidad del usuario: Vial de vidrio y tiras de plástico con Master Mix pre-dispensado.

- Uso de muestra de saliva para la detección de las variantes de SARS-CoV-2.

- Control endógeno humano ARNasa P (IC: Internal control) para detectar la presencia de muestra humana, la toma inadecuada de muestras o la degradación de la muestra.

- Dos dianas SARS-CoV-2 en cumplimiento de las directrices internacionales: OMS, CDC y ECDC* (Excepto para la variante UK).

* Organización Mundial de la Salud, Centro de control de enfermedades de Atlanta y Estados Unidos y el centro europeo de control de enfermedades.

4. Ejemplos de resultados de amplificación obtenidos con SARS-COV-2 VARIANTS

REALTIME PCR KITS

Figura 1. Ejemplo de curva de amplificación obtenida para una muestra biológica que contiene la variante del virus SARS-COV-2 del linaje B.1.1.7 (variante UK).

Figura 2.Ejemplo de curva de amplificación obtenida para una muestra biológica que contiene la variante del virus SARS-COV-2 del linaje B.1.351/P.1 (variante Sudáfrica/Brasil).

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Figura 3. Ejemplo de curva de amplificación obtenida para una muestra biológica que contiene la variante del virus SARS-COV-2 del linaje B.1.525 (variante Nigeria).

Figura 4. Ejemplo de curva de amplificación obtenida para una muestra biológica que contiene la cepa silvestre del virus SARS-COV-2.

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4. Tipo de muestra:

Las muestras más usadas son hisopo nasofaríngeo/orofaríngeo y saliva. Alternativamente, se pueden utilizar aspirados traqueales, lavado broncoalveolar.

5. Tecnología:

PCR en tiempo real en un solo paso, adecuado para termocicladores con 4 canales de detección fluorescente (FAM, HEX/VIC, Texas Red/ROX and Cy5).

6. Formato de ensayo y compatibilidad:

- RTPCR010-R: 6 viales de vidrio con Master Mix Liofilizada. Los tubos de reacción no están

incluidos.

- RTPCR010-LP-R: 12x8 tiras predispensadas con Master Mix Liofilizada. Los tapones de reacción

están incluidos.

7. Compatibilidad con sistemas PCR en tiempo real:

8. Sistemas de extracción:

- Qiagen (Viral RNA Mini Kit & MinElute Virus Spin Kit)

- BioMérieux (NucliSENS® easyMag®)

- Roche (MagNA Pure System)

- Tanbead (Maelstrom 9600)

- ThermoFisher (KingFisher Flex)

- Bruker (GenoXtract 12)

- Otros sistemas estándar también son compatibles

Referencia Termociclador PCR en tiempo real (5 canales de detección)

RTPCR010-R • MX3000P/MX4000/ Mx3005P/AriaMx (Agilent) • qTOWER (Analytik Jena)

• Mic (Bio Molecular Systems)

• LineGene 9600 Plus (Bioer Technology)

• CFX384 Touch™/ CFX96 Touch™/ iCycler iQ™/ iQ5 (Bio-Rad Laboratories)

• SmartCycler II (Danaher Corp. (Cepheid)) • Eco™ (Illumina)

• MyGo Pro (IT-IS Life Science Ltd.) • Rotor-Gene Q 5plex (Qiagen)

• Cobas® z 480/ LightCycler 96/LightCycler 480 (Roche)

• 7500/7500 Fast/ QuantStudio 5 /QuantStudio™ 6 Flex/QuantStudio™ 7 Flex/ ViiA™ 7 (Thermo Fisher Scientific)

RTPCR010-LP-R • CFX96 Touch™ (Bio-Rad Laboratories)

• Cobas® z 480/ LightCycler 96/LightCycler 480 (Roche) • AriaMx (Agilent)

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9. Otro material necesario, pero no suministrado

- Cámara de flujo laminar - Termociclador qPCR - Pipetas / Puntas con filtro - Microcentrífuga

- Cabina de seguridad (recomendable) - Vortex

10. Duración de la técnica

El tiempo de ensayo después de obtener el ARN purificado es de menos de 2 horas ya que el producto está liofilizado y sólo requiere reconstitución, dispensando en un solo tubo de PCR, tira o placa de pocillo y, por último, adición del ARN de la muestra. El tiempo del termociclador dependerá del modelo, aunque suele ser inferior a 2 horas.

11. Programación del instrumento Real Time PCR

Inserte los tubos/tiras PCR de los tubos en el termociclador en tiempo real y ejecute el siguiente programa*:

1 ciclo: 51°C 20 minutos 1 ciclo: 95°C 2 minutos 45 ciclos: 95°C 15 segundos

64°C 30 segundos*

*Deben capturarse datos de fluorescencia (FAM, HEX/VIC, Texas Red/ROX and Cy5).

12. Interpretación de resultados

Siempre debe incluirse un control negativo en cada ensayo. El control negativo es agua por lo que no debe detectarse amplificación en ninguno de los canales. El control negativo monitorizará la contaminación del reactivo o ambiental.

Debería incluirse un control positivo en cada ensayo. El control positivo monitoriza los fallos de los reactivos y el correcto funcionamiento del procedimiento esencial.

CONTROL S-N501 (FAM) S-H69/V70 (HEX/VIC) N (Texas/ROX) IC (Cy5) Interpretación VIRCELL SC2V POSITIVE CONTROL Amplificación (Ct < 40) Amplificación (Ct < 40) Amplificación (Ct < 40) Amplificación (Ct < 40) Correcto Sin Amplificación o Ct >40 Sin Amplificación o Ct >40 Sin Amplificación o Ct >40 Sin Amplificación o Ct >40 Invalido VIRCELL NEGATIVE CONTROL Sin Amplificación o Ct >40 Sin Amplificación o Ct >40 Sin Amplificación o Ct >40 Sin Amplificación o Ct >40 Correcto Amplificación (Ct < 40) Amplificación (Ct < 40) Amplificación (Ct < 40) Amplificación (Ct < 38) Invalido

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Vircell Marketing Científico Marzo 2021 RESULTADO S-N501 (FAM) S-H69/V70 (HEX/VIC) N (Texas/ROX) IC (Cy5)1 Interpretación

1 Sin Amplificación Sin Amplificación Sin Amplificación Sin Amplificación

Inválido2

(relacionado con la muestra/kit/equipo)

2 Sin Amplificación Sin Amplificación Sin Amplificación Amplificación

(Ct < 40) SARS-CoV-2 Negativo 3 Amplificación (Ct < 40) Amplificación (Ct < 40) Amplificación (Ct < 40) Amplificación (Ct < 40) o sin amplificación1 SARS-CoV-2 positivo

4 Sin Amplificación Sin Amplificación Amplificación

(Ct < 40) Amplificación/sin amplificación SARS-CoV-2 B.1.1.7 (Variante UK)

5 Sin Amplificación Amplificación

(Ct < 40) Amplificación (Ct < 40) Amplificación/sin amplificación SARS-CoV-2 B1.351/P.13 (Variante Sudáfrica/Brasil) 6 Amplificación (Ct < 40) Sin Amplificación Amplificación (Ct < 40) Amplificación/sin amplificación1 SARS-CoV-2 B1.5254 (Variante Nigeria) 7 Amplificación

(Ct < 40) Sin Amplificación Sin Amplificación

Amplificación/sin

amplificación No concluyente

8 Sin Amplificación Amplificación

(Ct < 40) Sin Amplificación Amplificación/sin amplificación No concluyente 9 Amplificación (Ct < 40) Amplificación (Ct < 40) Sin Amplificación Amplificación/sin amplificación SARS-CoV-2 positivo

Tabla 2: Interpretación de resultados de las muestras.

1_{En caso de un alto número de copias del ácido nucleico diana, la amplificación del control interno}

(IC) en los resultados 3 a 9 puede verse afectada. La amplificación o ausencia de amplificación del IC no cambia la interpretación del resultado.

2_{En caso de un resultado no válido, se recomienda volver a extraer el ARN de la muestra original y}

volver a analizarlo. En el caso de que falle la amplificación del control interno, se podría suponer una extracción inadecuada de ácidos nucleicos o una inhibición de la amplificación. Se recomienda probar una nueva muestra.

3_{Las variantes B.1.351 y P.1 no pueden diferenciarse en este ensayo porque comparten el mismo}

patrón de mutación.

4_{Además de B.1.525, hay otros linajes que presentan la deleción H69 / V70 y podrían compartir el}

mismo patrón como B.1.375 o B.1.346. Sin embargo, la expansión de tales linajes en este momento es muy limitada y restringida a un pequeño número de secuencias en los EE. UU.

En caso de un resultado no válido o no concluyente, se recomienda volver a extraer el ARN de la muestra original y volver a analizarlo. En el caso de que falle la amplificación del control interno, se podría suponer una extracción inadecuada de ácidos nucleicos o la ausencia de suficiente material celular humano. Se recomienda probar una nueva muestra.

13. Número de pruebas por Kit:

- 96 pruebas (RTPCR010-R)

- 12x 8-tiras con pocillos (RTPCR010-LP-R)

14. Necesidades para transporte:

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15. Reactivos incluidos en el kit:

Tabla 3. Lista de reactivos incluidos en los diferentes formatos del kit.

16. Controles externos recomendados:

- Controles positivos de extracción, AMPLIRUN® TOTAL SARS-CoV-2 CONTROL (SWAB) Cat. MBTC030-R (Vircell).

- Controles Positivos de RNA, AMPLIRUN® SARS CoV-2_B.1.1.7 RNA CONTROL Cat. MBC138-R (Vircell) y AMPLIRUN® SARS-CoV-2 B.1.351 RNA CONTROL Cat. MBC139-R.

- Controles negativos de extracción (NEC), RESPIRATORY SWAB MATRIX NEGATIVE CONTROL Cat. MC110 (Vircell), que es una matriz respiratoria sintética, simulando una muestra negativa del paciente recogida en Medio de Transporte Universal (UTM)

- Estos controles ayudan a monitorizar cualquier contaminación cruzada que se produzca durante el proceso de extracción, además de servir como herramientas de validación para los reactivos de extracción.

Viales (Ref. RTPCR010-R) Tiras (Ref. RTPCR010-LP-R)

Mix individual (x6 viales) 12x 8-pocillos en tira

Soluciones de reconstitución Soluciones de reconstitución Control Positivo Control Positivo

Control Negativo Control Negativo

12x 8 tapones para tubos en tiras