CARACTERIZACIÓN REOLÓGICA Y FISICOQUÍMICA DE SOLUCIONES Y GELES
DE ALGINATO DE SODIO, GLUCODELTALACTONA (GDL) Y CARBONATO DE
CALCIO, PARA USO COMO POTENCIAL ADHESIVO DE HUESOS
JESSICA PAOLA MORENO BORDA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ D.C.
CARACTERIZACIÓN REOLÓGICA Y FISICOQUÍMICA DE SOLUCIONES Y GELES
DE ALGINATO DE SODIO, GLUCODELTALACTONA (GDL) Y CARBONATO DE
CALCIO, PARA USO COMO POTENCIAL ADHESIVO DE HUESOS
JESSICA PAOLA MORENO BORDA
Trabajo de grado para optar por el título de Ingeniero Químico
Asesor:
FELIPE SALCEDO GALÁN
Departamento de Ingeniería Química
Coasesor:
DIANA MARCELA TABIMA MARTINEZ
Departamento de Ingeniería Biomédica
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ D.C.
AGRADECIMIENTOS
A Dios por darme la oportunidad de estudiar en esta Universidad y permitirme formarme
no solamente como profesional sino como persona, por darme fortaleza en cada
momento en que la necesité, por guiarme cuando creía no encontrar la salida y por poner
en mi camino tantas oportunidades y personas maravillosas que han hecho esta
experiencia inolvidable.
A mis padres, Israel y Fabiola, por su infinito amor, paciencia, comprensión y apoyo, por
acompañarme en cada etapa del camino y darme la confianza y seguridad para salir
adelante, por sus consejos que me ayudaron a ser quien soy, por entregarlo todo para que
yo pueda alcanzar mis sueños y por llenar mi vida de felicidad con su presencia.
A Yissel, Sandra, Oscar y Camilo porque su ayuda, sabiduría y apoyo me dieron fuerza
cuando lo necesité, porque su compañía y palabras siempre me alentaron a seguir
adelante y no rendirme y por esa inagotable paciencia que sólo un buen amigo puede
tener.
A mi asesor Felipe Salcedo y mi coasesora Diana Tabima porque su conocimiento, guía,
confianza y paciencia me permitieron culminar este proyecto, por creer en mí y por
impulsarme a ser mejor en todo momento.
TABLA DE CONTENIDO
TABLA DE CONTENIDO ... 4
LISTA DE TABLAS... 7
RESUMEN ... 8
OBJETIVOS ... 9
Objetivo General ... 9
Objetivos Específicos ... 9
1. INTRODUCCIÓN ... 10
2. ESTADO DEL ARTE ... 12
2.1 Polímeros biodegradables ... 12
2.1.1 Alginato ... 12
2.1.2 Otros biopolímeros ... 13
2.2 Pegamentos de huesos ... 14
2.2.1 Pegamentos de huesos a base de alginato ... 14
2.2.2 Otros pegamentos de huesos ... 16
3. MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES ... 18
3.1 Caracterización alginato de sodio ... 18
3.1.1 Determinación de la relación porcentual másica entre monómeros M y G mediante hidrólisis parcial ... 18
3.1.2 Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR) ... 18
3.2 Formulación y preparación de geles de alginato. ... 19
3.3 Pruebas reológicas ... 20
3.3.1 Tiempo de gelificación ... 21
3.3.2 Barrido de frecuencia ... 21
3.3.3 Prueba reológica de estabilidad ... 21
3.4 Caracterización fisicoquímica ... 21
3.4.1 Densidad aparente ... 21
3.4.2 Pruebas de compresión ... 21
3.5 Estabilidad de los geles ... 22
3.5.1 Pérdida de masa ... 22
3.5.2 Hinchamiento ... 22
4. RESULTADOS Y ANÁLISIS ... 24
4.1 Determinación monómeros M y G de los alginatos ... 24
4.2 FTIR ... 25
4.3 Caracterización reológica ... 26
4.3.1 Efecto alginato de sodio ... 26
4.3.2 Efecto del carbonato de calcio ... 27
4.3.3 Efecto glucodeltalactona ... 28
4.4 Caracterización fisicoquímica ... 31
4.4.1 Densidad aparente ... 31
4.4.2 Prueba de compresión ... 32
4.5 Estabilidad de los geles en el tiempo ... 32
4.5.1 Pérdida de masa ... 32
4.5.2 Hinchamiento ... 34
4.5.3 pH ... 35
5. CONCLUSIONES ... 37
6. BIBLIOGRAFÍA ... 39
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Conformación estructural alginato: monómeros G y M (University of Oslo, 2011). ... 10
Figura 2. Ejemplo de nomenclatura para el gel A2BB. ... 20
Figura 3. Espectro alginato Sigma, composición mayoritaria de monómero M ... 25
Figura 4. Espectro alginato Sigma, composición mayoritaria de monómero G ... 25
Figura 5. Efecto de la concentración de alginato en el tiempo de gelificación y módulo máximo ... 27
Figura 6. Separación de fases de los geles A4MA, A4AM Y A4AA ... 27
Figura 7. Prueba reológica de estabilidad gel A4BB ... 28
Figura 8. Barrido de tiempo para los geles A4BB, A4BM Y A4BA ... 29
Figura 9. Tiempo de gelificación de los geles con bajo carbonato de calcio y GDL variable (A4BB, A4BM Y A4BA) ... 29
Figura 10. Valores máximos del módulo elástico de los geles con bajo carbonato de calcio y GDL variable (A4BB, A4BM Y A4BA) ... 30
Figura 11. Barrido de frecuencia para los geles A4BB, A4BM Y A4BA ... 31
Figura 12. Densidad aparente en función de la GDl para geles con bajo carbonato de calcio (A4BB, A4BM Y A4BA) ... 31
Figura 13. Módulo de Young [kPa] de los geles A4BB, A4BM Y A4BA ... 32
Figura 14. Porcentaje de pérdida de masa de los geles A4BB, A4BM Y A4BA ... 33
Figura 15. Pérdida de masa de los geles A4BB, A4BM A4BA durante los primeros 420 minutos ... 33
Figura 16. Perfil de hinchamiento de los geles A4BB, A4BM Y A4BA ... 34
Figura 17. Perfil de hinchamiento de los geles A4BB, A4BM Y A4BA durante los primeros 420 minutos ... 35
Figura 18. Variación de pH de los geles A4BB, A4BM Y A4BA a través del tiempo en un medio acuoso ... 36
Figura 19. Montaje sugerido para la prueba de hinchamiento ... 38
Figura 20. Montaje realizado para la hidrólisis parcial del alginato ... 42
Figura 21. Montaje realizado para la decantación de los solutos puros en la hidrólisis parcial ... 43
Figura 22. Picnómetro utilizado para la medición de la densidad aparente. ... 44
Figura 23. Geles con geometría controlada para realizar las pruebas de compresión ... 45
Figura 24. Geles después de los 6000 minutos de seguimiento de la pérdida de masa ... 46
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Composición química fraccional de alginatos de sodios extraídos de varias algas marinas (Zhang,
Ortiz, Goyal, & Kohn, 2014) ... 12
Tabla 2. Diseño experimental formulaciones de alginato a estudiar ... 19
Tabla 3. Nomenclatura de los componentes en la formulación ... 19
Tabla 4. Comparación másica porcentual de monómeros M y G para alginato chino y Sigma-Aldrich ... 24
Tabla 5. Comparación picos característicos monómeros M y G obtenidos en el trabajo actual y en la literatura (Mendoza, 2012) ... 26
RESUMEN
El uso de biopolímeros en aplicaciones médicas ha despertado un creciente interés debido a la dificultad de los tratamientos convencionales. Un ejemplo de lo anterior es el posible uso de alginato de sodio como pegamento de huesos para tratamiento de fracturas conminuta. En el presente trabajo se produjeron y caracterizaron geles de alginato de sodio, carbonato de calcio y glucodeltalactona (GDL). Se realizó una caracterización cualitativa y cuantitativa del alginato de sodio mediante realización de hidrólisis parcial y pruebas de espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier (FTIR). Se obtuvo un resultado replicable con el protocolo establecido para la hidrólisis y los espectros FTIR mostraron diferencias en el ancho del pico característico del grupo hidroxilo (3400 cm-1) debido a diferencias en la cantidad de puentes de hidrógeno presentes en los monómeros estructurales de ácido manurónico (M) y ácido gulurónico (G). Por medio de caracterización reológica del proceso de gelificación se obtuvieron las concentraciones más adecuadas de alginato (4%) y carbonato de calcio (nivel bajo: proporción p/p CaCO3/alginato=30/30) para desarrollar el pegamento de huesos. Adicionalmente, se determinó que mayores concentraciones de GDL generan tiempos de gelificación menores y valores más altos del módulo elástico (G’) de los geles. Se analizó la pérdida de masa, hinchamiento y cambio de pH de los geles en el tiempo. Se logró obtener estabilidad sólo para la pérdida de masa mientras que las otras pruebas no brindaron información concluyente. Finalmente, la información obtenida permite sugerir la formulación A4BA con bajo carbonato de calcio (proporción p/p 30/70) y alta GDL (proporción molar CaCO3:GDL= 1:0.7) como la indicada para trabajos futuros ya que presenta un balance entre su comportamiento fisicoquímico y sus propiedades viscoelásticas haciéndolo un buen candidato para su uso como pegamento de huesos.
OBJETIVOS
Objetivo General
Caracterización reológica y fisicoquímica de soluciones y geles de alginato de sodio, carbonato de calcio y glucodeltalactona (GDL).
Objetivos Específicos
Caracterización del alginato de sodio.
Estudio de la gelificación y caracterización de los geles.
Estudio de la estabilidad de los geles en el tiempo a condiciones de humedad y temperatura similares a las del cuerpo humano.
1.
INTRODUCCIÓN
Una fractura es una condición médica en la cual se presenta ruptura del hueso y de su continuidad; generalmente es causada cuando una fuerza externa ejecutada en el hueso, impacto de alta fuerza o esfuerzo, es mayor a la que el hueso puede soportar (Browner, Jupiter, Levine, Trafton, & Krettek, 2009). Un tipo de fractura común es la fractura conminuta la cual se presenta cuando el hueso se fragmenta en múltiples piezas (Li & Li, 2011). Estas fracturas son difíciles de tratar y tienen complicaciones al momento de implementar el uso de material de osteosíntesis tradicional como placas, tornillos, agujas, etc. (Kuo & Ma, 2001) (Wang, Shelton, Cooper, Lawson, Triffitt, & Barralet, 2003) (Futran, 2008). Debido a la complejidad de la intervención quirúrgica y a la alta incidencia de resultados insatisfactorios se ha propuesto el uso de pegamentos a partir de biopolímeros para el tratamiento de fracturas conminuta (Shimizu, y otros, 2012) (Zhao, y otros, 2010) (Abou Neel, Salihh, Revell, & Young, 2011). Gracias al creciente interés en la aplicación de biopolímeros en la medicina se hace necesario tener un mayor entendimiento de su estructura, propiedades macroscópicas, su efecto en el uso del polímero y de la manera como se puede alterar su estructura y funcionalidad para optimizar su aplicación (Hian Foh, Sia Heng, & Wah Cahn, 2012) (Nunamaker, Purcell, & Kipke, 2007) (Esser & Tessmar, 2013).
El alginato de sodio es un biopolímero y un polielectrolito que se considera como no trombogénico, no tóxico, no inmunogénico, biodegradable y con efectos antimicrobianos (Tam, Dusseault, Bilodeau, Langlois, Halle, & Yahia, 2011) (Russo, Malinconico, & Santagata, s.f.). Adicionalmente, es un polímero lineal compuesto por dos monosacáridos de ácido urónico: ácido manurónico (bloque M) y ácido gulurónico (bloque G) (Fu, y otros, 2010), como se observa en la Figura 1.
Figura 1. Conformación estructural alginato: monómeros G y M (University of Oslo, 2011).
El proceso de gelificación del alginato de sodio debe estar mediado no sólo por el carbonato de calcio, sino también por glucodeltalactona (GDL) que es el agente entrecruzante usado en esta investigación. Ésta se convierte en ácido glucónico mediante hidrólisis, liberando protones e
induciendo a la formación del gel tras la acidificación de la muestra (Mession, Blanchard, Mint-Dah, Lafarge, & Assifaoui, 2013). El gel de alginato es ampliamente investigado y utilizado en diversas aplicaciones médicas (Pereira, Carvalho, Vaz, Gil, Mendes, & Bartolo, 2013). Sin embargo, es poco lo que se conoce acerca de la aplicación del gel de alginato como pegamento para huesos. Es posible encontrar en anteriores proyectos de investigación realizados en la Universidad de los Andes, formulaciones sugeridas del pegamento, junto con la caracterización fisicoquímica y reológica de las diferentes muestras (Mendoza, 2012) (Talero & Tabima, 2013). Sin embargo, ya que las propiedades del gel cambian de acuerdo con la composición monomérica del alginato, la metodología de preparación del gel y su composición, es de interés comprender el entrecruzamiento en la etapa de síntesis del pegamento y su efecto en las diferentes etapas de formación del gel (Fu, y otros, 2010) (Lee & Mooney, 2012). Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es la caracterización reológica y fisicoquímica de soluciones y geles de alginato de sodio, carbonato de calcio y GDL. Específicamente, se desea estudiar los tiempos de gelificación de las soluciones, realizar la caracterización fisicoquímica del alginato y de los geles y determinar la estabilidad de los geles en el tiempo en condiciones de humedad (80%) y temperatura (40°C) similares a las del cuerpo humano.
2.
ESTADO DEL ARTE
2.1 Polímeros biodegradables
Los polímeros biodegradables son una variedad de polímeros naturales, sintéticos y biosintéticos que son ambientalmente degradables. Un polímero basado en una estructura de carbonos (C-C) tiende a resistir la degradación mientras que un polímero con estructuras que contienen heteroatómos confiere biodegradabilidad (Zhang. X, Mattheus, Goosen, & Wyss, 2006). Los polímeros biológicamente derivados son materiales creados por organismos vivientes, contrario a los materiales sintéticos. Estos pueden estar clasificados en péptidos y proteínas, polisacáridos, polihidroxialcanoatos y polinucleóticos (Zhang, Ortiz, Goyal, & Kohn, 2014).
2.1.1 Alginato
El alginato es un polisacárido natural encontrado en las algas pardas marinas como Laminaria digitata, Laminaria hyperborea, Laminaria japónica, Ascophyllum nodosum y Macrocystis pyrifera
entre otras (Lee & Mooney, 2012). Está compuesto por monosacáridos de ácido urónico: ácido manurónico (bloque M) y ácido gulurónico (bloque G), los cuales pueden estar organizados al azar como secuencias homogéneas o heterogéneas como se observa en la Figura 1. En su cadena polimérica el alginato tiene regiones ricas en unidades de ácido manurónico, regiones ricas en ácido gulurónico y regiones en las cuales se encuentran presentes las dos unidades; la conformación estructural del alginato dependerá de la fuente de extracción y el tratamiento del mismo (Zhang, Ortiz, Goyal, & Kohn, 2014), en el caso de la fuente de extracción se presentan algunos ejemplos de su composición en la Tabla 1.
Tabla 1. Composición química fraccional de alginatos de sodios extraídos de varias algas marinas (Zhang, Ortiz, Goyal, & Kohn, 2014)
Uno de los principales usos del alginato es la formación de un hidrogel altamente compatible a nivel celular. Este puede formar geles fuertes en presencia de cationes divalentes como el calcio o el bario que interactúan con los grupos carboxilos presentes en la estructura del alginato y así formar uniones iónicas. Sin embargo se cree que sólo los bloques G participan en las uniones intermoleculares. La gelificación ionotrópica del alginato de sodio con cationes de calcio se describe convencionalmente como el modelo de “caja de huevo” donde los cationes calcio interactúan con los monómeros de ácido gulurónico en las cavidades formadas al emparejar la
secuencia de monómeros G en las cadenas de alginato. Algunos estudios sugieren tres pasos sucesivos para la unión del calcio al alginato: (1) interacción del calcio con un monómero G; (2) formación de dímeros de caja de huevo, (3) asociaciones laterales de dímeros para formar multímeros (Fu S. , y otros, 2011) . Por ende, la composición de bloques M y G, la longitud de la secuencia de monómero G y el peso molecular serán factores críticos que afectan las propiedades físicas de los geles (Lee & Mooney, 2012).
2.1.2 Otros biopolímeros
Los péptidos y proteínas son polímeros derivados naturalmente. Los péptidos son usualmente cadenas más cortas de aminoácidos unidos vía enlaces de amidas, mientras que las proteínas son cadenas más largas de cientos de aminoácidos individuales. Tanto los péptidos como las proteínas tienen propiedades biológicas remarcables por lo cual son ideales para la ingeniería de tejidos. Algunos ejemplos son:
Colágeno: Es el mayor componente del tejido conectivo mamífero siendo aproximadamente el 30% de la proteína en el cuerpo humano. Se han identificado 14 tipos de colágeno, siendo el tipo I el más abundante; este ha sido ampliamente utilizado en la formulación de materiales biomédicos. Es el componente clave de la arquitectura de tejido, provee fuerza mecánica, y permite la unión y crecimiento celular (Zhang, Ortiz, Goyal, & Kohn, 2014).
Gelatina: Es utilizada en la industria alimenticia, es ampliamente explorada como matriz tridimensional para crecimiento celular y como componente importante de matrices para ingeniería de tejidos debido a su biodegradabilidad enzimática y biocompatibilidad. Existen dos tipo: gelatina acídica y alcalina. La gelatina acídica puede ser usada como un agente transportador de proteínas in vivo, mientras que la gelatina básica puede ser usada para la liberación controlada de proteínas acídicas bajo condiciones fisiológicas (Zhang, Ortiz, Goyal, & Kohn, 2014).
Seda: Es ampliamente utilizada en la industria textil por su extraordinaria fuerza. También ha sido estudiada como un componente en matrices para ingeniería de tejidos y como sustrato en cultivos celulares (Zhang, Ortiz, Goyal, & Kohn, 2014).
Proteoglicanos: Son un componente importante de la matriz extracelular. Consisten en una o más cadenas de glucosaminoglicanos que están unidas a residuos de serina dentro de la proteína. Es usado en investigaciones de interacciones entre matriz-células,
interacciones entre matriz-matriz, proliferación y migración de células (Zhang, Ortiz, Goyal, & Kohn, 2014).
Otro tipo de polímeros son los polisacáridos, los cuales están formados de varias unidades de azúcar. Los monosacáridos más comunes son la glucosa y la fructosa. Algunos polisacáridos utilizados son:
Celulosa: Es el material polimérico más abundante en la naturaleza. Es un material fibroso e insoluble en agua. Está compuesto de unidades D-glucosa que están unidos por enlaces
glicosídicos β(1-4). La mayor aplicación comercial de la celulosa es en papel, madera e industrias textiles (Zhang, Ortiz, Goyal, & Kohn, 2014).
Almidón: Está compuesta de unidades D-glucosa que están unidos por enlaces glicosídicos α(1-4). La química del almidón es complicada debido a que consiste en cadenas lineales y ramificadas (Zhang, Ortiz, Goyal, & Kohn, 2014).
Quitosán: Es un polisacárido de alto peso molecular derivado del exoesqueleto de los crustáceos por desacetilación de quitina. También es un polímero lineal compuesto de glucosamina y N-acetil glucosamina. En solución, la sal de quitosán tiene una carga positiva por la protonización de los radicales libres amino en la glucosamina. Reactividad con superficies de carga negativa es una función directa de la densidad de carga positiva del quitosán. Su naturaleza catiónica le da propiedades mucoadhesivas (Dornish, Kaplan, & Skaugrud, s.f).
2.2 Pegamentos de huesos
Para los cirujanos ortopédicos de trauma existe una necesidad insatisfecha relacionada con la falta de un ‘pegamento para huesos’. Algunas de las razones por las que los cirujanos preferirían el adhesivo al uso de material de osteosíntesis tradicional son: (1) El pegamento provee un método simple y rápido de arreglar las fracturas especialmente las fracturas conminuta; (2) El adhesivo sería invaluable para reparar fracturas alrededor de articulaciones donde la reparación utilizando metal interfiere con el funcionamiento de la articulación; (3) El uso de pegamento no requeriría retirar los implantes de metal, (4) Por último el adhesivo permitiría al cirujano el pre-ensamblaje de las piezas para ser usado igual con metal (Farrar, 2012).
A pesar de existir varios cementos para huesos no existe ningún producto que se caracterice en sí como un adhesivo de huesos. Algunas de las propiedades esperadas de un adhesivo para huesos son: (1) Alto nivel de adhesión al hueso incluso en presencia de contaminantes como grasas, proteínas, etc.; (2) Unión a superficies húmedas/ unión estable en un ambiente húmedo, (3) Estabilidad mecánica bajo tensión, compresión y esfuerzo; (4) Fácil y rápido de preparar y aplicar en una sala de operaciones; (5) Tiempo de trabajo adecuado para que el cirujano pueda aplicarlo y formar la unión; (6) Tiempo rápido de establecimiento (típicamente 1-10 minutos); (7) No tóxico y biocompatible; (8) Que permita la curación de la factura; (9) Que su elaboración comercial sea viable; (19) Adhesión a aleaciones quirúrgicas; (11) biodegradable en una escala controlable; (12) No necesidad de almacenamiento especial y (13) Habilidad de entrega de agentes bioactivos/medicamentos, por ejemplo agentes para estimular la curación del hueso o para prevenir la infección, etc. (Farrar, 2012).
2.2.1 Pegamentos de huesos a base de alginato
El uso de matrices de alginato en la ingeniería de tejidos, especialmente en la regeneración de huesos, es limitado debido a sus débiles propiedades mecánicas, a su falta de interacciones celular y a su degradación incontrolable. Debido a que el alginato es hidrofílico sus matrices tienen una capacidad limitada de absorción, por lo tanto las células no se adhieren fácilmente en el medio. Pese a lo anterior, algunos de los adhesivos existentes basados en alginato son:
Matriz de alginato/Hidroxiapatita (HAP): La hidroxiapatita es el mayor componente mineral del hueso. In vivo puede ser reabsorbida en el tejido de hueso debido a la acción de los osteoclastos. Una de sus ventajas es que es un material osteoconductor y puede aumentar la tasa de regeneración ósea. En este estudio se realiza la producción y caracterización de una matriz tridimensional realizada en tres pasos. El primero es la gelificación de la solución alginato-HAP para formar un gel con cationes divalentes,. Segundo, se congeló la solución y finalmente fue secada por liofilización para producir una esponja porosa tridimensional. Las matrices preparadas en este estudio tenían una estructura porosa y bien interconectada con un tamaño de poro promedio de 150 µm y cerca de 82% de porosidad. El alginato preparado a -40°C con 50/50 alginato/HAP presentó las mejores propiedades mecánicas (Lin & Yeh, 2004).
Matriz de alginato/quitosán: El quitosán es un polímero catiónica natural, es biológicamente renovable, biodegradable, biocompatible, antigénico, no tóxico y biofuncional. A diferencia del alginato, su superficie es hidrofílica lo cual promueve la adhesión, proliferación y diferenciación celular. El uso de matrices híbridas de este tipo permite obtener matrices con mejores propiedades mecánicas comparadas con las matrices elaboradas individualmente. Se obtuvo una matriz de aproximadamente 92% de porosidad con un módulo de compresión de 8.16 MPa el cual es aproximadamente el triple del valor que se obtiene con una matriz puramente de quitosán. Los estudios in vivo sugieren que esta matriz promueve la rápida vascularización. Las anteriores características apoyan la potencial aplicación de este material como matriz para ingeniería ósea (Li, Ramay, Hauch K, Xiao, & Zhang , 2005).
En algunos casos se está analizando la interacción alginato – otros componentes para observar el resultado sinérgico de sus geles, sin embargo aún sólo se está en proceso de investigación sin tener una aplicación biomédica aún. Algunos ejemplos son:
Alginato/Gelatina: Dentro del estudio realizado se estudió el carbonato de calcio como agente entrecruzante para el alginato y el glutaraldehído (GTA) para la gelatina. Se encontró que sólo el gel con iguales proporciones de los dos precursores (50/50) presenta propiedades beneficiosas en su red con alta miscibilidad, homogeneidad, hinchamiento suficiente y buenas propiedades mecánicas. Por ende, se identificó la mejor opción para las matrices asegurando la prevención de heridas por la acumulación de fluidos. Sin embargo, en el estudio resaltan que debido a la toxicidad conocida del GTA los geles entrecruzados con carbonato son sustancias más viables para la aplicación biomédica (Saarai, Kasparkova, Sedlacek, & Saha, 2013).
Alginato/Pectina: Se estudió la interacción sinérgica entre el alginato y la pectina usando muestras con diferente composición química. Las muestras de pectina con alto y bajo grado de esterificación (DE) se mezcló con alto de alta y baja razón de monómeros estructurales M/G (ácido manurónico/ácido gulurónico). El sinergismo más fuerte se encontró en las muestras con baja razón M/G y bajo DE: estos geles mostraron el módulo de almacenamiento más alto y la cinética de formación más rápida. Se encontró que la
naturaleza de la muestra de alginato no tenía una influencia observable en la microestructura de la matriz (Walkenströn, Kidman, Hermansson, Rasmussen, & Hoegh, 2003).
2.2.2 Otros pegamentos de huesos
El desarrollo de pegamentos o adhesivos para huesos puede ser clasificado en dos grupos: (1) sintéticos y (2) biológicamente derivados. Entre algunos de los adhesivos estudiados en la actualidad se encuentran (Farrar, 2012):
Adhesivos sintéticos
Poli (metil-metacrilato): Estos sistemas han sido utilizados para reparar articulaciones y prótesis totales de cadera y rodilla. Estos consisten en una fase sólida de polimetilmetacrilato (PMMA) y un iniciador, el cual es mezclado con una fase líquida que comprende monómero de metilmetacrilato, un inhibidor y un activador. El cemento de PMMA tiene poca adhesión intrínseca al hueso, particularmente si esta mojado, pero en el reemplazo de articulaciones actúa más como una lechada, formando una interfaz entre el hueso y el implante (Farrar, 2012).
Cianocrilatos: Son el grupo más estudiado de adhesivos para hueso. Se ha reportado la adhesión de un gran rango de cianocrilatos variando las condiciones y tiempo de almacenamiento. A pesar de su uso en cierre de heridas no existe ningún reporte para el campo ortopédico. Esto puede deberse a reportes de citotoxicidad y otras reacciones biológicas adversas así como la pérdida de adhesión con el tiempo (Farrar, 2012).
Poliuretanos: Este grupo representa uno de los primeros intentos de desarrollar un adhesivo para huesos. “Ostamer” fue una espuma rígida y biodegradable utilizada en los años 50. Desafortunadamente los resultados obtenidos no fueron los esperados ya que se presentó rompimiento del polímero, pérdida de la unión al hueso, altas tasas de infección y reacción inmune por parte del cuerpo. Sin embargo en los años 90 se desarrolló un sistema denominado Kryptonite. Este adhesivo se basa en el uso de polioles a base de aceite de castor, un isocianato reactivo, y carbonato de calcio lo cual puede ser mezclado para formar una pasta antes de formar un polímero rígido y poroso (Farrar, 2012).
Sistemas basados en fosfato de calcio y magnesio: El atractivo de estos materiales recae en la similaridad del fosfato de calcio y el componente mineral del hueso. Sin embargo, estos materiales son débiles y quebradizos y se cree que tienen poca adhesión al hueso. Hasta el momento existe un producto comercial (OsteoCrete) utilizado para rellenar vacíos en los huesos, sin embargo aún no ha sido aprobado para su uso como adhesivo (Farrar, 2012).
Cementos de policarboxilato de zinc: Son un adhesivo proveniente de la odontología. En este sistema un ácido polimérico está reticulado con iones metálicos, en este caso zinc. El atractivo de estos sistemas está en el potencial del ácido poliacrílico de unirse a iones de calcio en el hueso o en la superficie del diente (Farrar, 2012).
Adhesivos derivados y/o inspirados biológicamente
Sistemas de fibrina, GRF y aldehído-proteína: Los adhesivos de fibrina son probablemente los más usados. Estos explotan la acción de coagulación del fibrinógeno, el cual es responsable de la coagulación de la sangre. La mayoría de sistemas tienen fibrinógenos, trombina, factor XIII e iones calcio. Aunque tienen una buena biocompatibilidad y biodegradabilidad la adhesión al hueso es baja comparada a algunos adhesivos sintéticos. Por otro lado, la gelatina es derivada del colágeno, el cual es la proteína estructural de los tejidos conectivos. La gelatina puede ser entrecruzada con formaldehído para producir un sistema adhesivo. Sin embargo, su uso ha sido más hacia el uso de tejidos y no como pegamento de huesos (Farrar, 2012).
Proteínas adhesivas de mejillón y polímeros miméticos: Los mejillones son capaces de anclarse en diferentes sustratos por la secreción de proteínas adhesivas (MAPs) las cuales forman fuertes uniones a una gran diversidad de superficies. Se conoce que estas proteínas tienen altos niveles de 3,4-dihidroxifelinalanina (DOPA) y se cree que este aminoácido es responsable por sus propiedades adhesivas y de entrecruzamiento. No obstante, debido a la dificultad de extracción se crearon proteínas miméticas al DOPA para ser incorporadas en polímeros sintéticos (Farrar, 2012).
“Pegamento de la rana”: La rana australiana Notaden bennetti secreta un pegante cuando es provocada, probablemente como agente disuasivo en contra de los predadores. El pegamento ha sido evaluado ex vivo donde se comportó significativamente mejor que la fibrina o la gelatina. Sin embargo, a pesar de tener características promisorias, el desarrollo del pegamento está en una etapa temprana (Farrar, 2012).
3.
MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES
Con el fin de estudiar el comportamiento de las soluciones de alginato de sodio, CaCO3 y GDL se realizó la caracterización del alginato como materia prima, el fenómeno de gelificación de las soluciones y la respuesta de los geles ante determinadas condiciones. Para esto, se utilizaron los siguientes materiales: alginato de sodio (Sigma-Aldrich, Estados Unidos), alginato de sodio (Procedencia china), carbonato de calcio (Panreac), glucodeltalactona GDL (Alfa Aesar, Estados Unidos) y agua desionizada.
3.1 Caracterización alginato de sodio
Par asegurar la reproducibilidad de la elaboración del adhesivo y de posteriores estudios se prepararon las muestras con alginato comercial (Sigma-Aldrich). Sin embargo, para comparar nuestros resultados con los obtenidos en proyectos anteriores (Mendoza, 2012) se obtuvo información sobre la composición monomérica tanto del alginato sigma como del empleado en estudios anteriores (procedencia china).
3.1.1 Determinación de la relación porcentual másica entre monómeros M y G mediante hidrólisis parcial
Para cuantificar la composición porcentual másica del alginato se realizó una hidrólisis parcial con la cual se separan los monómeros M y G como solutos puros. Dicha composición afecta el comportamiento del gel de acuerdo a la proporción de cada uno de los monómeros (Baysal, Aroguz, Adiguzel, & Baysal, 2013).
La hidrólisis se realizó siguiendo el protocolo establecido por Mendoza (2012): Se disolvió el alginato de sodio en HCl [0.3 M] y se calentó 2.5 horas a 100°C en presencia de nitrógeno para evitar su oxidación. El precipitado fue centrifugado a 4500 rpm durante 20 min. De esta centrifugación se obtuvo un nuevo precipitado, el cual fue nuevamente disuelto en 100 ml de NaOH [0.15 M] y su pH se ajustó a 2.87 mediante adición de HCl [1 M]. Esta solución se centrifugó y se recolectó el precipitado, siguiendo los pasos anteriormente descritos. Finalmente, se tomó el último precipitado y se reajustó su pH, se centrifugó nuevamente, y se conservaron tanto sobrenadante como precipitado.
Tanto para el sobrenadante como para el precipitado se agregaron 100 ml de H2O desionizada y 200 ml de etanol para acelerar el proceso de precipitación. Las dos soluciones se dejaron decantar por 7 días, se tomaron las fases para cada una de las soluciones, y se calentaron con el fin de obtener los solutos secos, los cuales corresponderán a las composiciones másicas de los monómeros. El procedimiento se replicó para cada uno de los alginatos.
3.1.2 Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR)
Como complemento de la cuantificación de los monómeros M y G en el alginato, se realizó un análisis FTIR. Esta técnica se utiliza para obtener espectros infrarrojos de absorción. Como resultado se obtienen longitudes de onda absorbidas por la muestra; la absorción varía de acuerdo a los grupos funcionales presentes en la molécula (Hardinger, s.f.). Esta prueba se realizó para
determinar cualitativamente los grupos funcionales que se encontraban en el alginato, y en sus respectivos monómeros. Adicionalmente, se obtuvieron los picos característicos de los monómeros estructurales M y G y se compararon con los resultados obtenidos por Mendoza; esto con el fin de verificar que los picos obtenidos para los monómeros coinciden con lo esperado según la literatura (Mendoza, 2012).
3.2 Formulación y preparación de geles de alginato.
Teniendo en cuenta las formulaciones de los trabajos realizados anteriormente (Mendoza, 2012) (Talero & Tabima, 2013), se decidió realizar las formulaciones de acuerdo al diseño experimental mostrado en la Tabla 2.
Tabla 2. Diseño experimental formulaciones de alginato a estudiar
Alginato CaCO3 GDL
4% Bajo (B) Bajo (B) Medio (M) Alto (A) Medio (M) Bajo (B) Medio (M) Alto (A) Alto (A) Bajo (B) Medio (M) Alto (A)
La proporción peso a peso (p/p) de CaCO3 y alginato y la proporción molar de GDL y CaCO3 están dadas como se presenta en la Tabla 3.
Tabla 3. Nomenclatura de los componentes en la formulación
CaCO3-Alginato
Proporción (p/p) GDL-CaCO3 Proporción molar Bajo (B) (30/70) Bajo (B) (1:0.3) Medio (M) (50/50) Medio (M) (1:0.5) Alto (A) (70/30) Alto (A) (1:0.7)
De acuerdo con lo anterior la nomenclatura de los geles estará dada de la siguiente manera, ej.: A2BB. La letra A corresponde al componente (alginato), la segunda posición indica la concentración de alginato (en este caso 2%). En tercera posición, se encuentra la proporción de CaCO3 (en este caso bajo). Finalmente, se tiene la proporción de GDL (en este caso bajo), como se muestra en la Figura 2.
Alginato [ ] CaCO3 GDL A 2 B B
Figura 2. Ejemplo de nomenclatura para el gel A2BB.
La preparación de los geles fue realizada de acuerdo al procedimiento implementado por Talero y Tabima (Talero & Tabima, 2013). En primer lugar, se prepara la solución de alginato en agua, de acuerdo a la concentración se agrega la cantidad requerida de alginato y se afora con H2O desionizada según la cantidad de gel a preparar. Esta solución es agitada a 600 rpm durante aproximadamente 40 min, o hasta homogenización. Este proceso debe realizarse a 37°C.En segundo lugar se agrega el carbonato de calcio a la solución de acuerdo con la proporción que se desee. Es importante resaltar que la solución de alginato de sodio debe estar a temperatura ambiente al momento de adicionar el CaCO3 ya que la temperatura puede acelerar la reacción de entrecruzamiento y variar las propiedades del gel. Una vez agregado, se agita a 600 rpm durante 40 minutos aproximadamente o hasta homogenizar. Por último, se disuelve la cantidad requerida de GDL en 5 ml de H2O desionizada y esta mezcla se agrega a la solución de alginato con carbonato de calcio. Una vez agregada se agita durante 30 segundos a 600 rpm.
3.3 Pruebas reológicas
Para determinar el comportamiento reológico de los geles se estudiaron sus módulos elástico (G’) y viscoso (G’’) así como el tiempo de gelificación. El módulo elástico o de almacenamiento cuantifica la energía almacenada mientras que el módulo viscoso o de pérdida cuantifica la energía disipada. Para esto, se realizó una prueba de barrido de tiempo a las soluciones de alginato (dejando fijos el porcentaje de deformación (1%) y la frecuencia de oscilación (1Hz)) para caracterizar el proceso de gelificación. Igualmente se hizo un barrido de frecuencia a los geles formados para estudiar su viscoelasticidad (dejando fijo el porcentaje de deformación (1%)). Por último se realizó una prueba de estabilidad a los geles formados para estudiar su estabilidad en el tiempo (dejando fijos la frecuencia (10 rad/s y la deformación (1%)). Las pruebas reológicas dinámicas (de oscilación) se llevaron a cabo en un reómetro Discovery Hybrid Rheometer (DHR1) TA Instruments. Para todos los ensayos se utilizó una geometría de platos paralelos de 20 mm, un “gap” de 1000µm y la temperatura se mantuvo constante a 37oC. Es importante mencionar que se seleccionó el módulo elástico (G’) cómo criterio de comparación en todas las pruebas reológicas, debido que permitía observar mejor el comportamiento de los geles mientras que el módulo viscoso no presentaba variaciones comparables que permitieran realizar un buen análisis del comportamiento viscoelástico de los geles.
3.3.1 Tiempo de gelificación
Para caracterizar el proceso de gelificación de las soluciones y estudiar el valor del módulo elástico (G’) y el tiempo de gelificación se realizó un barrido de tiempo. Esta prueba se llevó a cabo con los siguientes parámetros fijos: frecuencia (1 Hz), temperatura (37°C) y deformación (1%). La prueba se corrió por un tiempo de 15 minutos (900 segundos).
3.3.2 Barrido de frecuencia
Una vez formados los geles se desea estudiar su viscoelasticidad; adicionalmente se desea observar si el comportamiento de los geles corresponde al de un sólido que es lo que se espera. Para esta prueba se mantuvieron fijos los parámetros de temperatura (37°C) y deformación (1%). La prueba se realizó en un rango de 100 a 0.1 rad/s. Cabe mencionar que el barrido de frecuencia se realizó a los geles después de terminar el barrido de tiempo. Es decir, la formación del gel ocurre en el reómetro durante los primeros 15 minutos, correspondientes a la duración del barrido de tiempo.
3.3.3 Prueba reológica de estabilidad
Para verificar la estabilidad de los geles después del tiempo de gelificación (15 minutos), se realizó un segundo barrido de tiempo con los siguientes parámetros fijos: frecuencia (1.59 Hz o 10 rad/s), temperatura (37 °C) y deformación (1%). Al igual que el barrido de frecuencia esta prueba se realizó a los geles después de terminar el barrido de tiempo. La prueba se corrió por un tiempo de 15 minutos (900 segundos).
3.4 Caracterización fisicoquímica
Una vez realizada la caracterización reológica de las soluciones (barrido de tiempo) y de los geles (barrido de frecuencia y prueba reológica de estabilidad) se realizó la caracterización fisicoquímica. Esto se realizó con el fin de determinar la influencia de los componentes en las características del gel, y la relación de estas con el comportamiento reológico.
3.4.1 Densidad aparente
Esta prueba se realizó con el fin de evaluar el efecto de las diferentes variables en la densidad de los geles y comparar dichos valores entre las distintas formulaciones. Para esto se utilizó un picnómetro para líquidos viscosos con un volumen conocido de 11.5 ml, y masa conocida de 50.14 g. Se prepararon las soluciones y se depositaron en el picnómetro, el cual fue cerrado para garantizar que el volumen depositado fuera el correcto. Es importante resaltar que la gelificación de las soluciones se llevó a cabo en el picnómetro. El tiempo de gelificación fue de 15 minutos, correspondiente a la duración del barrido de tiempo. Una vez alcanzada la gelificación se pesó el picnómetro y se obtuvo el valor de la densidad puesto que la masa y el volumen del picnómetro son valores conocidos.
3.4.2 Pruebas de compresión
Estas pruebas se realizaron con el fin de observar el esfuerzo y deformación que soportan las muestras y de esta manera conocer la elasticidad de los diferentes geles. Se usó la máquina de ensayos biaxial Bose Electroforce Biaxial Testbench y se empleó una geometría de placas de 1.5 cm de ancho y 8 cm de alto. Se prepararon los geles siguiendo el procedimiento descrito para las
anteriores pruebas. Una vez preparadas las soluciones se dejaron gelificar durante 15 minutos en moldes cuadrados de 5 cm por 1.5 cm de grosor. Por último se cortó el gel de las siguientes dimensiones: 1.5 cm de grosor, 5 cm de largo y 1.25 cm de ancho. En primer lugar, se realizó un barrido inicial de 6 mm de desplazamiento para determinar el rango indicado para cada muestra. Posteriormente se realizó la prueba de compresión para cada uno de los geles.
3.5 Estabilidad de los geles
3.5.1 Pérdida de masa
Para determinar el comportamiento de los geles en condiciones similares a las del cuerpo humano se realizó el seguimiento de la masa para observar la estabilidad de los geles en el tiempo. Se utilizó una cámara de estabilidad Thomson RGX 250 E a las siguientes condiciones: 80% humedad y 40°C, las cuales se eligieron según proyectos anteriores (Talero & Tabima, 2013) (Mendoza, 2012). Se prepararon las muestras, se dejaron gelificar (en moldes de 3 cm de radio inferior, 2 cm de radio superior y 1.5 cm de alto para tener una geometría controlada) durante el tiempo determinado por las pruebas reológicas (15 minutos). Una vez gelificadas las muestras, se registró el peso en el tiempo 0, se introdujeron los geles a la cámara de estabilidad y se tomó el peso cada 10 minutos durante la primera hora. Posteriormente, se hizo el seguimiento cada hora hasta completar 7 horas. Finalmente, se realizó un seguimiento diario. Para determinar el porcentaje de pérdida de masa se empleó la siguiente ecuación:
En donde Pesotcorresponde al peso en el tiempo t y Peso0corresponde al peso en el tiempo 0, es decir cuando se inició la prueba.
3.5.2 Hinchamiento
Para comprender el comportamiento de los geles (pérdida o ganancia de masa) en medio acuoso se estudió el hinchamiento de los geles en el tiempo. Para esto se utilizó la misma cámara de estabilidad con las mismas condiciones que en las pruebas de pérdida de masa. Se prepararon las muestras y se dejaron gelificar durante 15 minutos en moldes cilíndricos de 2 cm de diámetro y 0.8 cm de alto. Se colocó cada gel en una lámina de vidrio y se introdujo en una caja de Petri con 40 ml de agua desionizada. Se registró el peso antes del hinchamiento y después en los mismos tiempos que en la pérdida de masa. Es importante mencionar que al momento de extraer la lámina de vidrio, ésta se secó con papel al igual que la superficie de los geles para evitar sesgo en los datos producido por el agua superficial. Para determinar el perfil de hinchamiento de las muestras se empleó la Ecuación 2, que se muestra a continuación:
En donde Peso0 corresponde al peso de la muestra antes de iniciar la prueba de hinchamiento y Pesot corresponde al peso de la muestra en el tiempo.
3.5.3 pH
Se realizó el seguimiento del cambio de pH del medio (en el cual se encuentran sumergidos los geles) en el tiempo ya que la variación de este podría afectar tanto las propiedades de los geles como la respuesta inmunológica del cuerpo humano (Yong Lee & Mooney, 2012) Para esto se prepararon los geles siguiendo el procedimiento descrito en la sección 2.2.5 Pérdida de masa. Las soluciones se dejaron gelificar 15 minutos en los moldes y se introdujeron los geles en beakers con 40 ml de agua desionizada. Finalmente se cubrió el beaker con papel transparente y papel aluminio para evitar la evaporación del agua. El registro de pH se realizó cada media hora durante las primeras 5 horas, posterior a esto se realizó un seguimiento diario.
4.
RESULTADOS Y ANÁLISIS
4.1 Determinación monómeros M y G de los alginatos
Para separar los solutos puros se realizaron varias centrifugaciones (600 rpm) en el proceso de hidrólisis parcial: en el primer procedimiento se obtuvo el alginato con una conformación al azar de grupos M y G, en la segunda centrifugación se consiguió una fase soluble rica en monómero M y una fase insoluble rica en monómero G (Chandía, Matsuhiro, & Vásquez, 2001). Las fases, soluble e insoluble, se secaron y se pesaron para así obtener la composición másica porcentual que se presenta en la Tabla 4.
Tabla 4. Comparación másica porcentual de monómeros M y G para alginato chino y Sigma-Aldrich
Muestra % másico monómero M % másico monómero G Relación M/G Alginato
Chino 78.8 21.2 3.7
Alginato Chino. Réplica
83.3 16.7 5.0
Promedio 81.1 19.0 4.4
Desviación
Estándar 3.2 3.2 0.9
Alginato
Sigma 79.2 20.8 3.8
Alginato Sigma. Replica 1
68.8 31.2 2.2
Alginato Sigma. Replica 2
76.2 23.8 3.2
Promedio 74.7 25.3 3.1
Desviación
Estándar 5.4 5.4 0.8
Al observar los resultados obtenidos para cada uno de los alginatos es posible inferir que la composición monomérica es similar entre estos ya que están conformados principalmente por monómeros M (aproximadamente 80%). Los geles gobernados por monómeros M tendrán interacciones moleculares débiles mientras que la presencia mayoritaria de monómeros G genera
interacciones moleculares fuertes (Rioux, Turgeon, & Beaulieu, 2007). Adicionalmente, es importante mencionar que se obtuvo resultados replicables, por lo cual se puede afirmar que el protocolo utilizado es confiable y permite reproducibilidad del experimento, situación que no ocurría en anteriores proyectos de investigación (Talero & Tabima, 2013).
4.2 FTIR
Para caracterizar cualitativamente los monómeros estructurales M y G del alginato Sigma se realizó una espectroscopia para los solutos secos obtenidos de la hidrólisis parcial. Lo que se esperaba con los espectros FTIR era obtener espectros similares en los dos casos ya que su el tipo y cantidad de grupos funcionales en los dos monómeros son iguales. Los resultados para los monómeros M y G se presentan en las Figuras 3 y 4 respectivamente.
Figura 3. Espectro alginato Sigma, composición mayoritaria de monómero M
Figura 4. Espectro alginato Sigma, composición mayoritaria de monómero G
En las Figuras 3 y 4 se puede observar que los dos espectros presentan una tendencia similar como era de esperarse. Sin embargo, se presenta una diferencia notoria en el ancho del pico presente en 3400 cm-1 aproximadamente, correspondiente a la vibración generada por el grupo hidroxilo (O-H). De acuerdo a lo anterior, se observa un mayor ancho del pico en el espectro del monómero
G. El ancho del pico incrementa cuando hay una mayor cantidad de puentes de hidrógeno ya que la energía necesaria para generar vibraciones en los enlaces es menor (Hardinger, s.f.). Con base en lo anterior, es posible afirmar que el soluto rico en monómeros G presenta un mayor número de puentes de hidrógeno que el soluto rico en monómeros M.
Además de la comparación de los espectros de cada monómero se realizó la identificación y comparación de los picos característicos obtenidos en este trabajo con los reportados en la literatura, con el fin de verificar la validez de los valores obtenidos, como se muestra en la Tabla 5.
Tabla 5. Comparación picos característicos monómeros M y G obtenidos en el trabajo actual y en la literatura (Mendoza, 2012)
Mendoza (2012) Resultados obtenidos Bloque M Bloque G Bloque M Bloque G COO- 1060 1100 1102.3 1103.9 O-H 3450 3400 3448.1 3471.7 C=O 1645 1740 1750 1745
Debido a la alta similitud de los valores obtenidos en estudios anteriores y en el presente estudio es posible afirmar que tanto el protocolo de obtención de los solutos puros, como el FTIR realizado se llevaron a cabo de manera correcta puesto que los resultados se ajustan a lo esperado.
4.3 Caracterización reológica
4.3.1 Efecto alginato de sodio
Con el fin de comprender el efecto de la cantidad de alginato de sodio en el proceso de gelificación se elaboraron cuatro geles con concentraciones diferentes de dicho componente; 2, 4, 6 y 10%. La caracterización de los geles se realizó mediante una prueba de barrido de tiempo para conocer cuál es el tiempo de gelificación y el valor del módulo elástico (G´) al finalizar el proceso de gelificación (módulo máximo). El tiempo de gelificación se toma a partir del momento en el cual se observa estabilización del módulo elástico (G’) y está expresado en la Ecuación 3 donde ti corresponde al valor del módulo elástico en determinado tiempo; el módulo máximo está dado por el valor máximo que alcanza el módulo elástico a lo largo del barrido de tiempo.
Se seleccionó el tiempo de gelificación y el módulo máximo como los criterios de caracterización del gel debido que era la información evaluada en estudios anteriores en los cuales se obtuvo una formulación sugerida que presentaba buenos resultados como pegamento de huesos (Talero & Tabima, 2013). Por lo tanto, con este estudio se pretendía encontrar una formulación que permitiera obtener tiempos de gelificación iguales o menores a 800 segundos y valores máximos de G’ alrededor de 500-600 Pa (Talero & Tabima, 2013). Los resultados obtenidos para las
diferentes concentraciones de alginato se muestran en la figura 5, en la que se observa que el módulo elástico aumenta a medida que se incrementa la concentración de alginato.
Figura 5. Efecto de la concentración de alginato en el tiempo de gelificación y módulo máximo
Adicionalmente, es posible observar que al aumentar la concentración de alginato el tiempo de estabilización es menor a excepción del gel con 10% de alginato. Con base en los criterios de selección establecidos una buena concentración de alginato para trabajar sería 6%, ya que se asemeja al comportamiento buscado. Sin embargo, no se seleccionó esta concentración debido a que su tiempo de gelificación es muy corto y no permitiría la manipulación del gel durante una cirugía. Teniendo en cuenta lo anterior, la concentración de alginato seleccionada es la del 4% porque presenta un tiempo de gelificación (400 segundos) y un valor del módulo máximo (aprox. 300-400 Pa) similar al que se buscaba.
4.3.2 Efecto del carbonato de calcio
Una vez seleccionada la concentración adecuada de alginato se realizó la caracterización de las soluciones con diferentes niveles de carbonato de calcio. Sin embargo, a partir de la formulación A4MM se obtenían geles con separación de fases como se observa en la Figura 6.
Figura 6. Separación de fases de los geles A4MA, A4AM Y A4AA
0,1 1 10 100 1000
0 200 400 600 800 1000
M
ó
d
u
lo
G' [Pa]
Tiempo [s]
A2BM A4BM A6BM A10BM
Dicho comportamiento puede explicarse por un fenómeno conocido como sinéresis, el cual genera la separación de fases por medio de la expulsión del líquido de la matriz o del gel (Davidovich & Bianco, 2010). Para este caso la sinéresis se presenta cuando la concentración de carbonato de calcio excede la cantidad de residuos de ácido gulurónico en el gel. De acuerdo a lo anterior se evidencia que a partir del nivel medio de carbonato, la sinéresis presentada sugiere inestabilidad por parte de los geles, por lo cual, la posterior caracterización sólo se realizó a geles con nivel bajo de carbonato de calcio (30/70).
Para verificar que los geles con carbonato de calcio eran estables se elaboró una prueba reológica de estabilidad en donde se espera que el valor de los módulos elástico (G’) y viscoso (G’’) permanezca estable en el tiempo. Los resultados se presentan en la Figura 7.
Figura 7. Prueba reológica de estabilidad gel A4BB
En la Figura 7 es posible evidenciar que se presentó un comportamiento constante después de 900 segundos, correspondiente al barrido de tiempo, para los geles con bajo carbonato de calcio, lo cual sugiere que el gel es estable después de su tiempo de gelificación y que conserva su comportamiento de sólido.
4.3.3 Efecto glucodeltalactona
4.3.3.1 Barrido de tiempo
Para observar el efecto de la glucodeltalactona (GDL) en el proceso de gelificación se varió la concentración del agente entrecruzante. El análisis del barrido de tiempo permitirá obtener información acerca del efecto de la GDL en el tiempo de gelificación y el valor del módulo máximo como se muestra en la figura 8, en la cual se observa que a medida que aumenta la concentración de GDL en los geles se obtiene un menor tiempo de gelificación y un mayor módulo elástico
1 10 100 1000
0 200 400 600 800 1000
M
ó
d
u
lo
s
[Pa]
Tiempo [s] G' G''
Figura 8. Barrido de tiempo para los geles A4BB, A4BM Y A4BA
. Adicionalmente, se evidencia que una vez finalizado el proceso de gelificación, los geles presentan estabilización de sus módulos indicando que el comportamiento del gel es estable. Pese a que el tiempo de gelificación disminuye en cada uno de los niveles de GDL, la relación de estas variables no es lineal como se presenta en la Figura 9.
Figura 9. Tiempo de gelificación de los geles con bajo carbonato de calcio y GDL variable (A4BB, A4BM Y A4BA)
Es posible observar en la Figura 9 que entre el nivel bajo de GDL y el nivel medio de GDL se presenta una disminución del tiempo de gelificación de aproximadamente 100 segundos, mientras que entre el nivel medio y el nivel alto de GDL la disminución no es estadísticamente significativa (sólo 10 segundos aproximadamente). Esta diferencia en los tiempos puede ser causada por una mayor interacción de la GDL a medida que aumenta su concentración, sin embargo, puede darse que entre el nivel medio y alto ocurra una saturación de GDL que impida que el tiempo de
400 450 500 550 600 650
Baja GDL Media GDL Alta GDL
Ti
e
m
p
o
G
e
lifi
cac
ió
n
gelificación siga disminuyendo. Para comprobar está hipótesis se sugiere examinar más a fondo el cambio estructural y la interacción química entre los componentes del gel.
En cuanto al módulo máximo es posible observar que a mayor concentración de GDL se obtiene un mayor valor del módulo G’ como se observa en la Figura 8. Esto puede explicarse, ya que al actuar como agente entrecruzante, la GDL permite que se genere la unión entre los iones calcio y el alginato, al haber mayor GDL en el medio, mayor será la interacción de los iones y mayor será la rigidez obtenida en los geles.
A diferencia del tiempo de gelificación, la relación entre la concentración de GDL y el módulo máximo tiene una diferencia menos marcada entre los niveles bajo y medio de GDL como se muestra en la Figura 10.
Figura 10. Valores máximos del módulo elástico de los geles con bajo carbonato de calcio y GDL variable (A4BB, A4BM Y A4BA)
Es posible observar que entre el nivel bajo y medio el valor del módulo aumenta en aproximadamente 60 Pa mientras que entre el nivel medio y alto el valor incrementa en aproximadamente 200 Pa. Al igual que en el caso del tiempo de gelificación se recomienda examinar las interacciones químicas y los cambios estructurales del gel para dilucidar el cambio de magnitud del módulo G’ obtenido entre los niveles.
4.3.3.2 Barrido de Frecuencia
Para determinar las propiedades viscoelásticas de los geles formados se realizó un barrido de frecuencia de 100 a 0.1 rad/s tomando 7 puntos por década. Los resultados se presentan en la Figura 11.
174,99 241,43
442,02
10 100 1000
Baja GDL Media GDL Alta GDL
M ó d u lo G ´M áxi m o [ Pa]
Figura 11. Barrido de frecuencia para los geles A4BB, A4BM Y A4BA
Es posible corroborar que las formulaciones evaluadas A4BB, A4BM Y A4BA presentan valores de G’ mayores a medida que se aumenta la concentración de GDL. Adicionalmente, las formulaciones presentaron valores del módulo G’ independientes de la frecuencia, lo cual indica que el comportamiento de los geles corresponde al comportamiento esperado para un sólido, que es lo que se esperaba confirmar con esta prueba.
4.4 Caracterización fisicoquímica
4.4.1 Densidad aparente
Al observar la tendencia de la densidad en los diferentes niveles de GDL se puede afirmar que la adición de GDL a los geles aumenta la densidad de estos. Dicho comportamiento se observa en la Figura 12.
Figura 12. Densidad aparente en función de la GDl para geles con bajo carbonato de calcio (A4BB, A4BM Y A4BA)
El comportamiento observado corresponde a lo deseado ya que al ser un agente entrecruzante se espera que genere mayor entrecruzamiento y por ende una mayor densidad. Sin embargo, se
1,027 1,029 1,031 1,033 1,035 1,037 1,039 1,041
Baja GDL Media GDL Alta GDL
De
n
sid
ad
[g/
m
puede observar que el cambio entre los niveles no es gradual. Es decir, el valor de la densidad entre el nivel bajo y medio de GDL aumenta aproximadamente 0,01 g/ml mientras que entre el nivel medio y alto de GDL el cambio no es estadísticamente significativo (es menor a 0,001). Cabe resaltar que el comportamiento de la densidad es similar al obtenido para el tiempo de gelificación. Esto sugiere que entre el nivel medio y alto de GDL ocurre una saturación de GDL y no es posible aumentar el entrecruzamiento y por ende la densidad del gel. Sin embargo, se recomienda estudiar si existe alguna relación entre el tiempo de gelificación y la densidad de los geles.
4.4.2 Prueba de compresión
Al realizar la prueba de compresión se obtuvieron los valores del esfuerzo soportado para cada uno de los geles antes de su ruptura y los valores de la deformación alcanzada en cada uno de los geles antes de su punto de quiebre. Estos valores se utilizaron para obtener el módulo de Young [KPa] el cual indicará la elasticidad de los geles. Los resultados se presentan en la Figura 13.
Figura 13. Módulo de Young [kPa] de los geles A4BB, A4BM Y A4BA
De acuerdo a lo esperado, los geles con mayor concentración de GDL presentan un mayor entrecruzamiento y mayor rigidez, lo cual se evidencia en el valor del módulo de Young. Es posible afirmar que el esfuerzo soportado por el gel con alta GDL es mayor al soportado por los otros dos geles. Al comparar el valor de los módulos G’ máximos obtenidos de las pruebas reológicas para los geles evaluados se puede observar un comportamiento similar entre el valor del módulo G´ (de corte) máximo y el módulo de Young de la prueba de compresión. A mayor módulo G’ mayor es el módulo de Young como se observa en las Figuras 10 y 13 respectivamente. Como era de esperarse, un alto valor de G’ sugiere mayor rigidez en el gel lo cual se comprobó mediante el comportamiento mecánico de los geles según el ensayo de compresión.
4.5 Estabilidad de los geles en el tiempo
4.5.1 Pérdida de masa
Se calculó el porcentaje de pérdida de masa de los geles durante 6000 min para observar el efecto de la GDL como se presenta en la Figura 14.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Baja GDL Media GDL Alta GDL
M ó d u lo d e Yo u n g [kPa]
Figura 14. Porcentaje de pérdida de masa de los geles A4BB, A4BM Y A4BA
Fue posible determinar que los geles presentan una tendencia similar de pérdida de masa a pesar de la concentración de GDL. Adicionalmente, se observa que los geles alcanzan la estabilización a partir del minuto 4000 aproximadamente. En este punto, ya se ha perdido aproximadamente el 93% de la masa como se muestra en la Figura 14. Los primeros 420 minutos de la pérdida de masa se observan con más detalle en la Figura 15, la cual presenta la pérdida de masa para los tres geles. Es posible observar que estos presentan un comportamiento similar y que a los 420 minutos presentan una pérdida aproximada del 30-35% del total de su masa. Una posible explicación puede ser el resultado de la hidrólisis de los enlaces glicosídicos y el intercambio de iones calcio, lo cual genera pérdida de peso en el tiempo por la pérdida de agua (Morais, y otros, 2013).
Figura 15. Pérdida de masa de los geles A4BB, A4BM A4BA durante los primeros 420 minutos
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
Pér d id a d e m asa Tiempo [min]
A4BB A4BM A4BA
0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 45%
0 10 20 30 40 50 60 120 180 240 300 360 420
Pér d id a d e m asa Tiempo [min]
Al analizar la Figura 14 y 15 es posible afirmar que a mayor concentración de GDL en los geles, menor es la pérdida de masa. Sin embargo, la diferencia entre el porcentaje de pérdida no es estadísticamente significativa en los niveles bajo y medio de GDL en comparación con el nivel alto. No obstante, dichos resultados son consistentes con lo esperado puesto que a mayor cantidad de GDL mayor será el entrecruzamiento en los geles y por ende menor la pérdida de masa.
4.5.2 Hinchamiento
Por medio del registro y seguimiento del peso de las muestras se calculó el porcentaje de hinchamiento de los geles durante los 6000 minutos de estudio, cuyos resultados se presentan en la Figura 16.
Figura 16. Perfil de hinchamiento de los geles A4BB, A4BM Y A4BA
Es posible determinar que los geles se hinchan en diferentes porcentajes desde 20% en el caso del gel A4BB hasta más de 40% en el caso del gel A4BM. De acuerdo a lo reportado por Davidovich (2010) la ganancia de peso por parte de los geles es esperada debido que estos son capaces de hincharse en medios acuosos ya que la presión osmótica del medio es mayor que las fuerzas de entrecruzamiento que mantienen la red estable. Las regiones vacías del gel se llenan hasta que se alcanza un equilibrio con el medio. Teniendo en cuenta lo anterior, es de esperar que a mayor entrecruzamiento de los geles, menor sea el hinchamiento debido a una menor capacidad de recibir agua. Sin embargo, los resultados obtenidos no concuerdan con lo esperado ya que el gel A4BB debería tener el mayor porcentaje de hinchamiento debido a su bajo entrecruzamiento. Pese a lo anterior, el gel A4BB es el que menor ganancia de masa registra. En la Figura 17 se observa con más detalle el comportamiento de los geles durante los primeros 420 minutos. .
8% 13% 18% 23% 28% 33% 38% 43% 48% 53%
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
H in ch am ie n to Tiempo [min]
Figura 17. Perfil de hinchamiento de los geles A4BB, A4BM Y A4BA durante los primeros 420 minutos
Mediante el análisis del hinchamiento en los primeros 420 minutos es posible observar que la desviación estándar obtenida para el hinchamiento del gel A4BB es mayor que la de los otros geles. La alta variación de esta prueba puede deberse a que se presentó desprendimiento de fragmentos del gel que pudieron generar errores en los resultados obtenidos. Para las otras dos formulaciones este problema no se presentó por lo tanto su desviación estándar es menor. Una de las preguntas que surgió durante el estudio era si el hinchamiento de las muestra era algo deseable para la aplicación de pegamento de huesos. De acuerdo a estudios realizados in vitro se indica que el hinchamiento es deseable ya que el aumento en el tamaño de poro facilita la fijación de células y el crecimiento tridimensional de las estructuras (Lin & Yeh, 2004). Una vez los geles han ganado masa se esperaría encontrar un equilibrio. Sin embargo, al final de la prueba de hinchamiento no se presenta estabilización para ninguna muestra, y los resultados obtenidos son contrarios a lo que se esperaba por lo cual no fue posible encontrar una relación entre la concentración de GDL y el hinchamiento de las muestras.
4.5.3 pH
La estabilidad de los geles no sólo se estudia mediante los perfiles de pérdida de masa e hinchamiento sino que también es importante estudiar las variaciones de pH con el fin de evitar respuestas inmunes no deseadas. Los valores de pH obtenidos para los geles se presentan en la Figura 18.
0% 10% 20% 30% 40% 50%
0 10 20 30 40 50 60 120 180 240 300 360 420
H
in
ch
am
ie
n
to
Tiempo [min]
Figura 18. Variación de pH de los geles A4BB, A4BM Y A4BA a través del tiempo en un medio acuoso
El cambio de pH es similar en las tres formulaciones, sin embargo, no existe una tendencia clara que permita relacionar la GDL con el cambio de pH a lo largo del tiempo. No obstante, durante los primeros 3000 minutos aproximadamente se evidencia que a menor concentración de GDL se tiene un pH más básico, lo cual es consistente debido al papel que juega la GDL de acidificar el medio. Este cambio rápido de pH puede deberse a la pérdida de cationes que no hacen parte de la red, tales como iones calcio o sodio. Es importante mencionar que la toma de los últimos datos para las tres formulaciones no es comparable con el resto del experimento debido que las condiciones de almacenamiento cambiaron, porque el porcentaje de humedad disminuyó de 80 a 40%, lo cual pudo generar sesgo en el resultado. Pese a esto, los valores finales para el pH oscilan alrededor de 8.3. Según Gómez-Ordóñez (2011) el alginato es estable en un rango de pH de 6 a 9. En un rango de pH ácido se forma un precipitado insoluble compuesto principalmente por ácido algínico (Lee & Mooney, 2012). De acuerdo a lo anterior, el gel será estable en las condiciones a las cuales será sometido.
6 6,5 7 7,5 8 8,5 9
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
pH
Tiempo [min]
