Diseño de primers para PCR
Repasemos primero cómo trabaja la reacción de PCR. En la primera etapa, llamada de
desnaturalización, las dobles cadenas del ADN se separan en cadenas simples por efecto del calor. En la segunda etapa, llamada de asociación, y también conocida por su nombre en inglés “annealing”, la temperatura de la reacción desciende y los primers se unen a las regiones complementarias en las cadenas de ADN de simple cadena. En la tercera etapa, o de extensión, la temperatura de la reacción aumenta y la ADN polimerasa utiliza los extremos oxhidrilo-3' libres de los primers como soporte desde donde extender las cadenas complementarias de los ADN de cadena simple y obtener moléculas de ADN de cadena doble.
Esta secuencia de pasos se repite entre 25 y 45 veces, dependiendo del nivel de amplificación, la especificidad de los primers, etc. Un perfil de temperaturas podría ser, por ejemplo, 94ºC, 60ºC y 70ºC para las fases de desnaturalización, asociación y extensión respectivamente.
Primer3
Primer3 (http://primer3.sourceforge.net/) es uno de los programas más utilizados para el diseño de primers para PCR. Existen varios servidores web desde donde se puede correr, también viene incluido en varias aplicaciones y paquetes de bioinformática y además hay una versión Windows para ejecutar el programa directamente en una PC. Esta última opción corre muy rápido pero no tiene interfaz de usuario y se debe ejecutar desde una ventana de línea de comandos.
La página web original de los autores del programa es http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm, pero existe otra interfaz más fácil de utilizar y que ofrece la opción de preseleccionar los primers para diferentes tareas, como detección, clonado, secuenciado, etc. El url de este sitio y que es el utilizado en este tutorial es http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi
• Detección (Detection): estos son los primers necesarios para un ensayo típico de detección de o para amplificar una secuencia que se va a utilizar como sonda de hibridación, Por ejemplo, amplificar una sonda de hibridación para utilizar en un Southern-blot.
• Clonado (Cloning): con esta opción se pueden diseñar primers que comiencen o terminen exactamente en el límite de una región seleccionada. Esto es útil para cuando se quiere amplificar una región codificante para después insertarla en un vector de clonado, porque se puede especificar el límite exacto del extremo 5'.
• Secuenciado (Sequencing): ajustando las condiciones de la reacción de PCR es posible amplificar un producto de por ejemplo 2000-bp de largo, pero hoy en día no es posible
secuenciar una secuencia de ese largo. Con la opción “sequencing” se pueden diseñar primers que van a amplificar productos de alrededor de 500-bp y que se superpongan parcialmente hasta cubrir toda la extensión de la secuencia de 200-bp. Además, se puede especificar un espaciado entre el punto donde se inicia la amplificación y el lugar que realmente queremos secuenciar, porque las primeras bases de una secuencia son de mala calidad y no se pueden utilizar.
• Lista de primers (Primer-List): a partir de una secuencia diseña todos los primers posibles y el usuario puede seleccionar a mano cuál es el más conveniente.
• Revisión de primers (Primer-Check): esta no es una opción de diseño, si no que sirve para determinar la calidad de un primer.
Selección de primers para detección
A continuación vamos a diseñar primers para detectar en ADN genómico de tomate el exón 4 del gen LE-ACS-3. La secuencia mostrada más abajo corresponde a la región que va entre los nucléotidos 2900 y 4200 de la región genómica. El exón 4 se encuentra entre los nucleótidos 3161 y 4130 (la zona
sombreada en gris)
La motivación para este trabajo podría ser, por ejemplo, que existe un alelo de este gen que consiste en una deleción de 40 pares de bases en una zona interna del exón 4 (la región resaltada en amarillo). Si diseñamos primers que amplifiquen la región genómica y que incluyan la deleción, podriamos
diferenciar los diferentes genotipos, porque el alelo con la deleción amplificaría un producto más corto que el wild type (normal).
>gi|508608 gen 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase (LE-ACS3) de Solanum lycopersicum, exon 4 y regiones genomicas flanqueantes
CCGACAAAAAATTCACAAAGAAATACATCTCTGAAAATCAGAAGAGGCTAAAGAAACGACATGCAATGCT TGTTAAAGGTCTTAAAAGTGCTGGTATTAACTGCCTTGAAAGCAATGCTGGTTTGTTTTGTTGGGTAGAC ATGCGACATCTACTAAGTTCCAATAATTTTGACGCTGAAATGGACTTATGGAAGAAAATAGTGTACGATG TTGGCCTAAACATTTCTCCTGGATCATCATGCCATTGTACCGAACCAGGCTGGTTCCGTGTATGTTTTGC TAACATGTCCGAAGATACGTTAGACTTAGCCATGCGACGTATAAAGGATTTTGTCGAGTCCACTGCTCCC AACGCAACTAATCACCAGAATCAACAACAATCTAACGCAAATTCAAAGAAGAAGTCATTCTCCAAGTGGG TTTTTCGACTATCGTTCAATGACCGTCAAAGAGAACGATAGTCCTGCAAGTGTGAACATTCCCTTGTCCA CAAATCCAGATTATTTTTTTTCTCAATATTCACATATTGAG
1. Copiamos o cargamos desde un archivo la secuencia, pueden ser en formato FASTA o sólo los nucleótidos. En el primer caso, conviene que la línea de identificación de la secuencia fasta sea corta. Si optamos por copiar sólo los nucleótidos, tenemos que ingresar alguna identificación en “Sequence ID”.
2. Para poder diferenciar los alelos, el producto de amplificación tiene que incluir a la región donde está la deleción. Para lo cual, tenemos que seleccionar esa región y marcarla como “target” rodeándola con corchetes o presionando el botón “target”. Podemos copiar la región resaltada y buscarla con la función buscar del navegador, así la podemos encontrar fácilmente. 3. Vamos a la sección “General Settings” y modificamos los tamaños esperados de los productos
(“Product Size Ranges”). Como queremos detectar dos productos que se diferencian en 40-bp no nos conviene utilizar rangos esperados de productos muy grandes. Si el producto del alelo normal fuese de 1000-bp puede ser díficil distinguirlo en un gel de agarosa del producto de 960-bp del alelo con la deleción. Por otra parte, si el tamaño del alelo normal fuese de 100-bp, el producto con la deleción tendría 60-bp. Los productos chicos no son fáciles de detectar en un gel de agrosa. Podemos fijar los rangos esperados de productos en 250-300 301-400 401-500 501-600.
Si Primer3 pudo encontrar pares de primers adecuados, el programa nos devuelve una página con uno o más pares de primers. Para el primer par indica la posición donde se ubican los primers y la región “target”, donde se encuentra la deleción. También señala el tamaño del producto de amplificación, en este caso para el alelo normal, y las temperaturas de fusión (Tm) de los primers, que sirve para calcular la temperatura del paso de annealing de la PCR (aproximadamente 5ºC menos que la Tm más baja).
S
elección de regiones en la secuencia
Primer3 tiene tres opciones de marcado de regiones. Si la secuencia que estamos introduciendo tiene regiones donde no deben ubicarse los primers, tenemos que rodearlas con los símbolos “<” y “>”, para indicar que son regiones excluidas. Como vimos en el ejemplo de diseño anterior, si necesitamos que una región esté presente en el producto de amplificación, la marcamos como “target” utilizando corchetes. Finalmente, si necesitamos que los primers se ubiquen dentro de una región específica, la marcamos como incluida.
Ajuste de otros parámetros
el rango por defecto de Primer3 es mucho más amplio, 20-80%.
De la misma forma, si con los parámetros por defecto no Primer3 no encuentra ningún par de primers, tendríamos que relajar los requisitos de los primers, por ejemplo, aumentando la concentración de Mg2+
en el buffer de reacción, lo que indicamos en la caja “concentration of divalent cation”, expresando la concentración en mM. También podemos considerar primers de menor Tm. De esta manera
aumentamos las probabilidades de poder diseñar al menos un par de primers, pero hay que tener en cuenta que las reacciones de PCR pueden tener menor especificidad o señales de fondo más fuertes.
Es posible ajustar otros parámetros, en la sección de ayuda de Primer3plus se ofrece alguna información extra.
Selección de primers para clonado
Uno de los requisitos de los primers para reacciones de PCR cuyo objetivo es clonar el producto de la amplificación es que al menos uno de los extremos del fragmento a amplificar está fijo de antemano. Por ejemplo, si queremos clonar una región codificante a partir de una secuencia de ADN genómico, tenemos que fijar el extremo 5', especialmente si vamos a clonar ese fragmento en un vector de expresión.
En Primer3plus, una vez que seleccionamos la opción de primers para clonado, copiamos la secuencia y marcamos dónde está la región que se debe amplificar. En este caso, es conveniente dejar los
parámetros más relajados que ofrece por defecto el programa, porque debido a las restricciones de la secuencia, los primers generalmente no son de buena calidad. Se puede definir que extremos de los primers tiene que quedar fijo, el 3'o el 5'. La opción por defecto en “General Settings” es dejar fijo el extremo 5' de los primers, que es lo correcto para amplificar marcos de lectura abiertos a partir de secuencias genómicas.
Si el programa devuelve un par de primers pero indica que no son de buena calidad, es necesario trabajar un poco, modificando los rangos de Tm de los primers o los largos permitidos. Si no se puede mejorar, en el laboratorio hay que chequear con cuidado los productos de la reacción de PCR o
modificar algunos de los parámetros de corrida, por ejemplo, utilizando una temperatura de annealing más baja o más alta, agregando más Mg2+, utilizando estrategias de touch-down, etc.
Para practicar se puede utilizar la misma secuencia del gen LE-ACS3 que utilizamos en la sección anterior, con el objetivo de amplificar específicamente el exón 4, que se extiende entre los nucleótidos 3161 y 4130.
Selección de primers para secuenciado
En este caso queremos diseñar una serie de primers que amplifiquen productos que se superponen a lo largo de la secuencia. Además, necesitamos que el primer se ubique a una distancia de 35 a 50
nucleótidos del inicio de la secuencia que efectivamente se pueda leer.
En la sección “Advanced settings” aceptamos los valores por defecto o modificamos estos parámetros:
• Lead: es la distancia entre el primer primer y el inicio de la secuencia legible.
• Interval: es la distancia entre los sucesivos primers sobre la otra cadena.
• Accuracy: una vez que diseña el primer primer, el programa salta hasta la posición que marca el parámetro “spacing” y busca el siguiente primer en una región delimitada por el parámetro “accuracy”.
• Pick reverse primers: es la opción para seleccionar los primers sobre la otra cadena.
La herramienta para diseño de primers con chequeo de especificidad del
NCBI
Una situación que aparece con cierta frecuencia es tener que amplificar una secuencia que pertenece a genes que están duplicados o que existe similitud con otras secuencias en el mismo genoma. En una situación así debemos diseñar los primers con cuidado, de forma que amplifiquen solamente nuestro gen de interés. Una situación análoga puede ocurrir cuando queremos determinar la presencia de un parásito en un organismo hospedador, ya que es frecuente que las similitudes entre genes se extiendan a especies muy separadas entre sí.
Dentro de las herramientas que ofrece la sección BLAST del NCBI hay una especializada para este tipo de tareas, Primer-Blast. Este programa realiza dos operaciones, la primera es diseñar primers para una secuencia utilizando Primer3, luego realiza una verificación de especificidad que revisa si los pares de primers diseñados amplifican algún otro producto en el mismo genoma o en otro.
Por ejemplo, la secuencia de la subunidad 1 del factor de liberación de la cadena peptídica del parásito
Babesia bovis (número de acceso en el NCBI: XM_001609460) tiene una homología parcial con un gen de Bos taurus. Si tuvieramos que diseñar un par de primers de PCR para detectar el gen de B. bovis
en muestras de tejido bovino, también deberíamos verificar que no amplifique la secuencia similar de
Bo. taurus.
La página para trabajar con Primer-Blast es http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
Primero indicamos cuál es la secuencia para la que queremos diseñar los primers. Además podemos determinar zonas donde deben ubicarse los primers, definir el rango de tamaño de los productos y los Tm de los primers. Si ya tuviéramos los primers diseñados y directamente queremos verificar su especificidad, se pueden entrar sus secuencias. Luego, debemos determinar contra qué queremos hacer la verificación de especificidad, puede ser el mismo genoma o el de otra especie, o las bases de datos nr y RefSeq, en estos últimos dos casos la búsqueda será mucho más lenta. Finalmente debemos indicar para el caso en que que hubiera amplificación cruzada y no fuera posible diseñar primers que sólo amplifiquen nuestra secuencia, cuál es la diferencia en largo que debería el producto específico y el o los productos no específicos.
Otras sitios en la web para primers especiales
En la sección sobre diseño de primers en la página web del curso podrán encontrar un listado de otros sitios que permiten diseñar primers para PCR sobre alineamientos múltiples, diseños en batch, etc.:
