Síntesis de complejos derivados de azoles con metales de transición y evaluación in vitro de su actividad antimicrobiana

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Síntesis de complejos derivados de

azoles con metales de transición y

evaluación

in vitro

de su actividad

antimicrobiana

Néstor Julián Bello Vieda

Universidad de los Andes

Facultad de Ciencias, Departamento de Química Bogotá, Colombia

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Síntesis de complejos derivados de

azoles con metales de transición y

evaluación

in vitro

de su actividad

antimicrobiana

Néstor Julián Bello Vieda

Tesis de maestría presentada como requisito parcial para optar al título de: Magíster en Ciencias - Química

Director:

Dr. John Hurtado Belalcázar

Grupo de Investigación:

Grupo de Investigación en Química Inorgánica, Catálisis y Bioinorgánica (GUIQUICB)

Universidad de los Andes

Facultad de Ciencias, Departamento de Química Bogotá, Colombia

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“Intenta no volverte un hombre de éxito,

sino volverte un hombre de valor”

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Agradecimientos

A MI FAMILIA, en especial a mis padres y a mi hermano, por el acompañamiento y el apoyo durante mis estudios.

Al Dr. JOHN HURTADO por permitirme hacer parte de su grupo de investigación y por los consejos y constante acompañamiento durante el desarrollo de mi trabajo.

A ANDREA OJEDA por su apoyo incondicional y por enseñarme el significado de la constancia y el trabajo duro.

A NELSON NÚÑEZ por sus consejos personales y profesionales y por su gran aporte a los resultados de este trabajo.

A TODOS MIS COMPAÑEROS de maestría, doctorado y pregrado por su compañía y amistad durante este proceso.

A LA UNIVERSIDAD DE LOS ANDES y al DEPARTAMENTO DE QUÍMICA por la beca de asistente graduado de la que fui beneficiario.

A LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA que me dio las bases necesarias para cumplir con los objetivos de mis estudios de posgrado.

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Resumen

En este trabajo se realizó la síntesis y caracterización de complejos con metales de transición Co(II), Cu(II), Zn(II) y ligandos nitrogenados derivados de azoles como pirazol, triazol, indazol y benzotriazol. Los ligandos fueron caracterizados mediante punto de fusión, espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN: 1_H,13_{C) e infrarrojo (FTIR),}

análisis elemental y espectrometría de masas (QToF - ESI). Por su parte, los complejos fueron caracterizados por espectroscopía infrarroja (FTIR), análisis elemental, termogravimetría y UV-Vis. Se obtuvieron en total catorce compuestos nuevos; dos ligandos y doce complejos. Se realizó el estudio de actividad biológica de los complejos de Zn(II) para analizar la respuesta de los mismos a ciertas cepas hongos y bacterias de importancia clínica, encontrando actividad en todos los casos para estos compuestos. Se observó un incremento en la actividad de los complejos de Zn(II) sobre los ligandos libres y una mejor respuesta a bacterias que a hongos. Adicionalmente se realizaron estos mismos ensayos usando un complejo de Co(II) y uno de Cu(II) dando como resultado actividades mucho mayores que para sus correspondientes complejos de Zn(II), lo cual representa una importante perspectiva de trabajo con los demás complejos de estos dos últimos metales.

Palabras clave: Compuestos de coordinación, ligandos azólicos, antibacteriales, antifúngicos.

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X Síntesis de complejos derivados de azoles con metales de transición y evaluación in vitro de su actividad antimicrobiana

Abstract

In this work the synthesis and characterization of complexes with transition metals Co(II), Cu(II), Zn(II) and ligands derived from azoles such as pyrazole, triazole, indazole and benzotriazole was carried out. The ligands were characterized by melting point, nuclear magnetic resonance (NMR: 1H, 13C), elemental analysis, mass spectrometry (QTOF-ESI) and infrared (FTIR). Meanwhile, the complexes were characterized by infrared spectroscopy (FTIR), elemental analysis, thermogravimetry and UV-Vis. Were prepared fourteen new compounds in total, two ligands and twelve complexes. The study of biological activity of Zn(II) complexes was performed to analyze the response to certain bacteria and fungi strains with clinically importance, finding activity in all cases for these complexes. An increase in the activity of the complexes over the free ligands was observed and also better response to bacteria than fungi. Additionally, the tests were performed using a complex of Co(II) and Cu(II) getting activities much higher than for the corresponding Zn(II) complexes, which represents an important perspective of this work.

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Contenido

Pág. Resumen ... IX

Lista de figuras ... XV

Lista de esquemas ... XVII

Lista de tablas ... XVIII

Lista de símbolos y abreviaturas ... XIX

Introducción ... 1

1. Marco teórico ... 3

1.1 Generalidades ... 3

1.2 Actividad antifúngica de azoles ... 4

1.2.1 Mecanismos de acción ... 5

1.3 Actividad antibacteriana de azoles ... 7

1.4 Compuestos de coordinación con actividad antimicrobiana ... 8

1.5 Técnicas de caracterización ... 10

1.5.1 Espectroscopia ultravioleta-visible ... 10

1.5.2 Espectroscopia infrarroja (FT-IR) ... 11

1.5.3 Resonancia magnética nuclear ... 11

1.5.4 Espectrometría de masas ... 11

1.5.5 Análisis elemental (C, H, N) ... 12

1.5.6 Análisis térmico ... 12

1.6 Planteamiento del problema e hipótesis de trabajo ... 13

1.7 Objetivos ... 15

1.7.1 Objetivo general ... 15

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XII Síntesis de complejos derivados de azoles con metales de transición y evaluación in vitro de su actividad antimicrobiana

2. Síntesis y caracterización de ligandos y compuestos de coordinación con

Co(II), Cu(II) y Zn(II) ... 16

2.1 Sección experimental ... 17

2.1.1 Materiales y métodos ... 17

2.1.2 Síntesis de ligandos ... 18

2.1.2.1 Síntesis de bis(3,5-dimetil-1-pirazolil)metano (2) ... 18

2.1.2.2 Síntesis de 3,5-bis(3,5-dimetilpirazol-1-ilmetil)tolueno (3) ... 19

2.1.2.3 Síntesis de 1,3-bis(indazol-1-ilmetil)benceno (4) ... 19

2.1.2.4 Síntesis de bis(1,2,4-triazol-1-il)metano (5) ... 20

2.1.2.5 Síntesis de 1,3-fenilenbis(1,2,4-triazol-1-il)metanona (6) ... 20

2.1.2.6 Síntesis de 3,5-bis(benzotriazol-1-ilmetil)tolueno (7) ... 21

2.1.3 Síntesis de complejos de cobalto(II) ... 21

2.1.3.1 Síntesis de diclorobis(3,5-dimetil-1H-pirazol-N,N’)cobalto(II) (1a) ... 21

2.1.3.2 Síntesis de dicloro[bis(3,5-dimetil-1-pirazolil)metano-N,N’]cobalto(II) (2a) ... 22

2.1.3.3 Síntesis de dicloro[3,5-bis(3,5-dimetilpirazol-1-ilmetil)tolueno-N,N’]cobalto(II) (3a) ... 22

2.1.3.4 Síntesis de dicloro[1,3-bis(indazol-1-ilmetil)benceno-N,N’]cobalto(II) (4a) ... 23

2.1.3.5 Síntesis de dicloro[bis(1,2,4-triazol-1-il)metano-N,N’]cobalto(II) (5a) ... 23

2.1.3.6 Síntesis de dicloro[1,3-fenilenbis(1,2,4-triazol-1-il)metanona-N,N’]cobalto(II) (6a) ... 23

2.1.3.7 Síntesis de dicloro[3,5-bis(benzotriazol-1-ilmetil)tolueno-N,N’]cobalto(II) (7a) ... 24

2.1.4 Síntesis de complejos de cobre(II) ... 24

2.1.4.1 Síntesis de diclorobis(3,5-dimetil-1H-pirazol-N,N’)cobre(II) (1b) ... 24

2.1.4.2 Síntesis de dicloro[bis(3,5-dimetil-1-pirazolil)metano-N,N’]cobre(II) (2b) ... 25

2.1.4.3 Síntesis de dicloro[3,5-bis(3,5-dimetilpirazol-1-ilmetil)tolueno-N,N’]cobre(II) (3b) ... 25

2.1.4.4 Síntesis de dicloro[1,3-bis(indazol-1-ilmetil)benceno-N,N’]cobre(II) (4b) ... 25

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2.1.4.6 Síntesis de

dicloro[1,3-fenilenbis(1,2,4-triazol-1-il)metanona-N,N’]cobre(II) (6b) ... 26

2.1.4.7 Síntesis de dicloro[3,5-bis(benzotriazol-1-ilmetil)tolueno-N,N’]cobre(II) (7b) ... 27

2.1.5 Síntesis de complejos de zinc(II) ... 27

2.1.5.1 Síntesis de diclorobis(3,5-dimetil-1H-pirazol-N,N’)zinc(II) (1c) ... 27

2.1.5.2 Síntesis de dicloro[bis(3,5-dimetil-1-pirazolil)metano-N,N’]zinc(II) (2c) 28 2.1.5.3 Síntesis de dicloro[3,5-bis(3,5-dimetilpirazol-1-ilmetil)tolueno-N,N’]zinc(II) (3c) ... 28

2.1.5.4 Síntesis de dicloro[1,3-bis(indazol-1-ilmetil)benceno-N,N’]zinc(II) (4c) 28 2.1.5.5 Síntesis de dicloro[bis(1,2,4-triazol-1-il)metano-N,N’]zinc(II) (5c) ... 29

2.1.5.6 Síntesis de dicloro[1,3-fenilenbis(1,2,4-triazol-1-il)metanona-N,N’]zinc(II) (6c) ... 29

2.1.5.7 Síntesis de dicloro[3,5-bis(benzotriazol-1-ilmetil)tolueno-N,N’)zinc(II) (7c) ... 30

2.2 Resultados y discusión ... 30

2.2.1 Síntesis de ligandos ... 30

2.2.2 Síntesis de compuestos de coordinación de Co(II) ... 33

2.2.3 Síntesis de compuestos de coordinación de Cu(II) ... 34

2.2.4 Síntesis de compuestos de coordinación de Zn(II) ... 35

2.2.5 Análisis FT-IR de ligandos y complejos ... 37

2.2.6 Análisis térmico de complejos ... 40

2.2.7 Propiedades electrónicas (espectroscopía UV-Vis) ... 44

2.2.8 Estructura y geometrías moleculares probables ... 47

3. Estudio de actividad antimicrobiana de ligandos y complejos de Zn(II) ... 53

3.1 Sección experimental ... 53

3.1.1 Materiales y métodos ... 53

3.1.1.1 Cepas y asilamientos ... 53

3.1.1.2 Actividad antifúngica y antibacterial de sales metálicas, ligandos y complejos ... 54

3.1.1.3 Concentraciones mínimas inhibitorias (MIC) ... 55

3.2 Resultados y discusión ... 55

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XIV Síntesis de complejos derivados de azoles con metales de transición y evaluación in vitro de su actividad antimicrobiana

3.2.2 Actividad antifúngica ... 59

3.2.3 Determinación de MIC ... 60

4. Conclusiones y perspectivas ... 63

4.1 Conclusiones ... 63

4.2 Perspectivas ... 64

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Lista de figuras

Pág. Figura 1-1: Compuestos azólicos importantes usados como antifúngicos: a) Clotrimazol; b) Miconazol; c) Ketoconazol; d) Fluconazol; e) Voriconazol. ... 5 Figura 1-2: Sitios de acción de los compuestos antifúngicos [27] ... 6 Figura 1-3: Estructura propuesta de compuestos de coordinación usados para estudiar el mecanismo de acción contra hongos M = Cu(II); Mn(II) [28] ... 7 Figura 1-4: Estructura de metronidazol: R = H; secnidazol: R = Me; ornidazol: R = CH2Cl

[29] ... 7 Figura 1-5: Compuestos sintetizados por Singh et al. R=H, CH3; M = Co(II), Ni(II) y Zn(II)

[14] ... 8 Figura 1-6: Compuestos sintetizados por Abd El-Halim et al. M = Mn(II), Co(II), Ni(II), Cu(II), y Zn(II) [31] ... 9 Figura 1-7: Algunos compuestos sintetizados por Abd El-Halim et al. (No se muestran los contraiones) M1 = Cr(III), Fe(III); M2 = Co(II), Ni(II), Cu(II); M3 = Mn(II), Zn(II), Cd(II) [32] .. 9

Figura 2-1: Estructura de (1b) [58] ... 47 Figura 2-2: Estructuras optimizadas del ligando (6) y sus posibles complejos. a) =

Ligando (6); b) = coordinación por triazoles; c) = coordinación carbonilo-triazol; d) = coordinación carbonilos-triazoles. ... 49 Figura 2-3: Espectros infrarrojos simulados. Los compuestos corresponden a los

esquemas de la Figura 2-2. Izquierda = Espectros superpuestos (3000 cm-1_{– 5 cm}-1_),

Derecha = Espectros superpuestos 1950 cm-1_{– 1650 cm}-1_{). ... 49}

Figura 2-4: Estructura polimérica propuesta para (6) y sus complejos ... 50 Figura 2-5: Energías obtenidos para los complejos (7a-c) con diferentes puntos de coordinación ... 51 Figura 2-6: Energías obtenidas para (7a) usando multiplicidad doblete y formación de complejos por N2 y N3 ... 52 Figura 3-1: Zonas de inhibición de los complejos (1c), (2a) y (2b) contra A =

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XVI Síntesis de complejos derivados de azoles con metales de transición y evaluación in vitro de su actividad antimicrobiana

flavus. El control positivo fue gentamicina (50 µM) para bacterias y fluconazol (50 µM) para hongo ... 55 Figura 3-2: Resultados de actividad antimicrobiana in vitro por el método de difusión en agar para ligandos y complejos seleccionados. F.E. = Fármaco estándar, gentamicina 50 µM ... 57 Figura 3-3: Resultados de actividad antifúngica in vitro por el método de difusión en agar para ligandos y complejos seleccionados. F.E. = Fármaco estándar, fluconazol 50 µM .. 59

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Lista de esquemas

Pág. Esquema 1-1: Ligandos derivados de azoles a sintetizar ... 14 Esquema 1-2: Posibles estructuras de complejos a sintetizar. a: M = Co(II); b: M = Cu(II); c: M = Zn(II) ... 14 Esquema 2-1: Metodologías usadas para obtener (4) ... 32 Esquema 2-2: Metodologías usadas para obtener (6) ... 33

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Lista de tablas XVIII

Lista de tablas

Pág. Tabla 2-1: Lista de compuestos sintetizados junto con algunas propiedades físicas y resultados de análisis elemental ... 36 Tabla 2-2: Principales bandas en infrarrojo de complejos y ligandos. Pyr = pirazol; Ind = indazol; Tol = tolueno; vs = muy fuerte; s = fuerte; m = media; w = débil; vw = muy débil. ... 38 Tabla 2-3: Resultados termogravimétricos (TGA, DTG) de los complejos. n = número de pasos de descomposición ... 41 Tabla 2-4: Espectroscopía UV-Vis para ligandos y complejos de Co(II) y Cu(II).

Disolvente utilizado para cada grupo de compuestos (a) = ACN; (b) = MeOH; (c) = DMSO ... 45 Tabla 3-1: Actividad antibacterial y antifúngica (zona de inhibición, diámetro en mm) para ligandos y complejos seleccionados por el método de difusión en agar (Concentración usada 100 mM). F.E = Bacterias: Gentamicina (50µM); Hongos: Fluconazol (50µM) ... 56

Tabla 3-2: MIC50 (µM) de complejos. F.E = Bacterias: Gentamicina; Hongos: Fluconazol.

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Lista de símbolos y abreviaturas

Abreviaturas

Abreviatura Término ACN Acetonitrilo

BTBA Bromuro de tetrabutilamonio CFU Colony-forming units

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute DCM Diclorometano

DEPT 135 Distortionless Enhancement by Polarization Transfer 135 DMF Dimetilformamida

DMSO Dimetilsulfóxido

DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado

ESI Electrospray Ionization

FT-IR Fourier Transform Infrarred Spectroscopy HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

MeOH Metanol

MIC Minimum Inhibitory Concentration MOPAC Molecular Orbital Package

MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus NaOH Hidróxido de sodio

PM6 Parametric method number 6 RMN Resonancia magnética nuclear THF Tetrahidrofurano

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Introducción

El constante desarrollo de resistencia a los medicamentos clásicos utilizados para combatir enfermedades producidas por virus, bacterias, hongos y parásitos se ha constituido como uno de los problemas de mayor trascendencia en la sociedad actual, haciendo que la investigación y producción de nuevos compuestos con potencial acción antimicrobiana se haya incrementado considerablemente.

Hace algunos años, las sustancias utilizadas para el tratamiento de este tipo de enfermedades eran exclusivamente orgánicas, siendo obtenidas sintéticamente o de fuentes naturales como plantas, bacterias y hongos. Ejemplos típicos de este tipo de sustancias son la anfotericina B, que es un antimicótico de amplio espectro extraído de bacterias, y la penicilina, uno de los antibióticos más conocidos y utilizados que se puede obtener naturalmente de algunas especies de hongos. Actualmente los compuestos inorgánicos y metalorgánicos, como nanopartículas o compuestos de coordinación, están siendo utilizados, ya que el metal le confiere propiedades deseables a estos compuestos tales como mayor lipofilicidad, la cual facilita la difusión a través de las membranas de los organismos que se están atacando, produciendo un incremento en su actividad o derivando en mecanismos de acción adicionales.

Por esta razón, en el “Grupo de Investigación en Química Inorgánica, Catálisis y Bioinorgánica (GUIQUICB)” estamos interesado en desarrollar compuestos de

coordinación, con el fin de evaluar su actividad como antimicrobianos, específicamente contra algunas cepas de bacterias y hongos que están disponibles gracias a la cooperación del Grupo de Micología y Fitopatología de la Universidad de los Andes (LAMFU), y que son de gran interés debido a las dificultades que conlleva su tratamiento a nivel clínico en la actualidad.

Teniendo en cuenta la experiencia previa del grupo en la síntesis y caracterización de complejos usando ligandos con átomos de nitrógeno como principales puntos de

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2 Introducción

coordinación, se propuso sintetizar ligandos derivados de azoles, que son heterociclos con propiedades antimicrobianas conocidas, y unirlos a Co(II), Cu(II) y Zn(II) que son metales biocompatibles de baja toxicidad en humanos. Posterior a su síntesis se buscó realizar una caracterización completa de estos compuestos para finalmente hacer ensayos de actividad biológica contra una serie de hongos y bacterias de importancia clínica.

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1. Marco teórico

1.1 Generalidades

En los últimos años, el desarrollo de microrganismos (bacterias, hongos, virus y parásitos) resistentes a múltiples drogas se ha incrementado considerablemente y se ha establecido como un problema de salud pública alrededor del mundo [1]. Actualmente, las muertes relacionadas a este tipo de infecciones a nivel mundial llegan a 700.000 al año, y se proyecta para el 2050 que esta cifra se incremente a un total de 10 millones [2].

Bacterias como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Staphylococcus aureus, que producen enfermedades en el tracto urinario, neumonía e infecciones en la sangre respectivamente, han generado una creciente resistencia a los tratamientos convencionales en los últimos años. Por otro lado, hongos como Candida spp y Aspergillus spp, responsable de la candidiasis y la aspergilosis, están mostrando resistencia a los tratamientos con compuestos azólicos como el fluconazol [3]. Este tipo de hongos se presentan con frecuencia en pacientes inmunocomprometidos y tienen un alto porcentaje de casos fatales (33,9% y 12,4% respectivamente) [4].

Los hongos son patógenos comunes que atacan principalmente a pacientes inmunosuprimidos o con enfermedades críticas, las infecciones con este tipo de organismos suelen ser difíciles de tratar, inclusive si el hongo agresor es identificado y se aplica un tratamiento específico para este [5] ya que las células de los hongos son eucariotas al igual que las humanas, lo que hace difícil la producción de medicamentos que ataquen al patógeno específicamente sin producir daños al paciente. Estas infecciones con hongos pueden deberse a (a) reacciones alérgicas a las proteínas de los hongos, (b) reacciones tóxicas a las toxinas presentes en ciertos hongos y (c) infecciones (micosis) [6]. El riesgo de sufrir este tipo de infecciones aumenta en situaciones de vulnerabilidad como pacientes con cáncer que reciben quimioterapia, pacientes con trasplantes de órganos

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4 Síntesis de complejos derivados de azoles con metales de transición y evaluación in vitro de su actividad antimicrobiana

recientes o con quemaduras, así como personas con síndrome de inmunodeficiencias adquirida [7].

Los compuestos orgánicos sintéticos han sido históricamente una parte vital para el tratamiento de enfermedades relacionadas con infecciones por microorganismos como hongos o bacterias [8], pero en los últimos años el uso de compuesto de coordinación se ha perfilado como una solución nueva y eficiente a este problema [9–11]. Recientes

investigaciones han demostrado que la unión de un fármaco con un elemento metálico produce un incremento considerable en su actividad [12,13].

Se han realizado muchos estudios acoplando la actividad biológica de los compuestos azólicos junto con las propiedades de metales como cobalto, níquel, cobre, zinc, cadmio, y otros metales de transición, encontrándose un incremento considerable en el poder antimicrobiano de los complejos con respecto a los azoles libres [14–20]. El incremento de

las propiedades antimicrobianas de estos compuestos puede deberse a un aumento en la lipofilicidad, ya que la membrana que rodea la célula permite el paso exclusivo de sustancias liposoluble, esta teoría se conoce como el concepto de Overtone [21]. Del mismo modo es posible explicarlo usando la teoría de quelación de Tweedy, la cual propone que la polaridad del complejo se reduce por el solapamiento de los orbitales del ligando y el metal, y el aporte de electrones por parte de los grupos donores sobre el metal deficiente que deriva en un aumentando de su carácter lipofílico [14].

1.2 Actividad antifúngica de azoles

En la actualidad es de gran interés científico el desarrollo de nuevos compuestos para combatir eficientemente las enfermedades relacionadas con hongos, usando fármacos sintéticamente más económicos, menos tóxicos para el paciente y con un espectro de acción mucho más amplio. Las terapias antifúngicas eran bastante limitadas en el pasado, el tratamiento estándar era el uso de anfotericina B, un polieno antifúngico con una toxicidad considerable obtenido como producto de fermentación de la bacteria Streptomyces nodosus. Posteriormente, se desarrolló una formulación lipídica de este medicamento que permitió la administración de dosis más altas con un descenso importante en su toxicidad [22]. Años después se comenzó a explotar la importante actividad antifúngica de los azoles, principalmente con la introducción del fluconazol y

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algunos de sus derivados como el voriconazol y el itraconazol, que muestran un espectro de acción más amplio y son más efectivos que la anfotericina B, además de ser menos tóxicos [23].

Los primeros azoles que se utilizaron para este tipo de tratamientos fueron: el clotrimazol y el miconazol (Figura 1-1) en 1969. La actividad antifúngica de estos compuestos se atribuye al anillo imidazólico. A partir de la estructura del miconazol se han desarrollado medicamentos como el ketoconazol (1977), que fue el primer antifúngico azólico con suficiente biodisponibilidad para uso clínico en infecciones avanzadas. Dos cambios importantes se introdujeron en estos compuestos azólicos a principios de los ochentas; primero, se reemplazó el imidazol por triazol y adicionalmente se reemplazó el cloro por flúor como sustituyente del anillo bencénico que está unido al carbono asimétrico (Figura 1-1). Estos cambios están asociados a una mayor especificidad hacia el sitio activo de la enzima que inhiben estos compuestos [24].

Figura 1-1: Compuestos azólicos importantes usados como antifúngicos: a) Clotrimazol; b) Miconazol; c) Ketoconazol; d) Fluconazol; e) Voriconazol.

1.2.1 Mecanismos de acción

Los tratamientos para combatir las infecciones causadas por hongos se enfocan en atacar o interrumpir diferentes procesos metabólicos vitales para la célula. La Figura 1-2 resume los diferentes mecanismos que siguen los compuestos usados con este fin en la actualidad.

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La familia de los compuestos azólicos, descubierta y ampliamente usada desde los años sesentas, es una de las más importantes para el tratamiento de enfermedades relacionadas con hongos gracias a propiedades como su amplio espectro de acción, estabilidad química y posibilidad de aplicación oral y dérmica [25]. El principal efecto que tienen sobre las células es la inhibición del paso de lanosterol a ergosterol, el cual es un componente fundamental para la membrana celular, ya que le confiere estabilidad y fluidez, además de tener funciones de biorregulación [26].

Figura 1-2: Sitios de acción de los compuestos antifúngicos [27]

Gracias a la importancia de este tipo de compuestos, hay una variedad de medicamentos que contienen azoles en el mercado actual, haciendo que el desarrollo de nuevas moléculas resulte un tema de investigación de alto impacto a nivel mundial. Una aproximación reciente al desarrollo de este tipo de sustancias, es el acoplamiento de compuestos que contengan fragmentos azólicos con metales de transición que sean biocompatibles y poco tóxicos para los pacientes, ya que estos compuestos metálicos tienen mecanismos de acción adicionales que incrementan la actividad de la molécula.

El modo de acción de este tipo de compuestos se ha estudiado en complejos que contienen 1,10-fenantrolina como ligando nitrogenado y metales como cobre y manganeso (Figura 1-3). En este estudio se llevaron a cabo: (a) espectros diferenciales de los citocromos de

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las levaduras, (b) medidas de respiración celular y (c) extracción y análisis de ergosterol. Analizando estos factores se concluyó que los complejos tenían una actividad mixta, que no siempre involucra la interrupción de la síntesis de ergosterol sino también un incremento en el consumo de oxígeno que produce altas concentraciones de radicales libres. Adicionalmente se encontró una relación directa entre la inhibición de la biosíntesis de citocromos y la administración del complejo metálico. También fue posible concluir que los diferentes mecanismos de acción dependen de la naturaleza del centro metálico del compuesto [28].

Figura 1-3: Estructura propuesta de compuestos de coordinación usados para estudiar el mecanismo de acción contra hongos M = Cu(II); Mn(II) [28]

1.3 Actividad antibacteriana de azoles

Existe una gran variedad de compuestos antibacterianos sintéticos de uso clínico como beta-lactamas, macrólidos, aminoglucósidos, tetraciclinas, quinolonas, sulfamidas así como oxazolidonas. Sin embargo, como consecuencia de los cambios en la permeabilidad de la membrana bacteriana, la producción de enzimas que inactivan los antibióticos, y la mutación de los sitios activos, se producen cepas de bacterias resistentes [29]. Compuestos como los nitroimidazoles son usados eficientemente como antibacterianos frente Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica y Giardia intestinalis. Algunas de estas drogas son el metronidazol, secnidazol y ornidazol (Figura 1-4)

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Así como en los casos anteriores, es posible encontrar en reportes científicos una gran variedad de compuestos azólicos como carbazoles, imidazoles, oxazoles, pirazoles, tetrazoles, tiazoles y triazoles con una potente actividad antibacteriana frente a una gran variedad de cepas. Algunos de estos compuestos han sido desarrollados, comercializados y usados en tratamientos clínicos exitosamente dada su alta eficacia, baja toxicidad y pocos efectos secundarios, alta biodisponibilidad y biocompatibilidad, entre otras propiedades importantes [29].

1.4 Compuestos de coordinación con actividad

antimicrobiana

Los compuestos azólicos han sido estudiados como antifúngicos desde hace años, pero los compuestos de coordinación con este tipo de ligandos recientemente han captado el interés de los científicos por las interesantes propiedades encontradas en ellos para tratar este tipo de enfermedades [13,14,18,30–32]. Singh [14] en 2012 reportó la síntesis,

caracterización y actividad antifúngica de bases de Schiff 1,3-difenil-1H- pirazol-4-carboxaldehido (Figura 1-5) encontrando actividad de complejos con este ligando frente a bacterias como Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa yhongos como Aspergillus niger y Aspergillus flavus.

Figura 1-5: Compuestos sintetizados por Singh et al. R=H, CH3; M = Co(II), Ni(II) y Zn(II) [14]

Abd El-Halim publicó un estudio en el cual se analizada la actividad de algunos complejos metálicos con miconazol como ligando (Figura 1-6) [31]. El miconazol es un importante compuesto antifúngico utilizado en diversos tratamientos en la actualidad. Se encontró un aumento en la actividad en la mayoría de casos para los hongos estudiados y una

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inhibición del crecimiento de algunas bacterias, que no se ven afectadas por el miconazol libre.

Figura 1-6: Compuestos sintetizados por Abd El-Halim et al. M = Mn(II), Co(II), Ni(II), Cu(II), y Zn(II) [31]

Existen pocos ejemplos en literatura que reportan la actividad de compuestos de coordinación en donde el ligando solo contenga sustituyentes nitrogenados o azólicos sin la inclusión de átomos diferentes como azufre, oxígeno o halógenos. En este aspecto destaca el trabajo de Abd El-halim [32], quien reportó en 2011 un trabajo en donde utiliza ligandos tipos base de Schiff tridentados y sus complejos con Cr(III), Fe(III), Co(II), Ni(II), Cu(II), Th(IV), Mn(II), Cd(II) y Zn(II) y concluyen que la coordinación del ligando al centro metálico potencia la actividad antimicrobiana frente a Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus pyogones y Candida spp. La Figura 1-7 muestra la estructura de estos complejos.

Figura 1-7: Algunos compuestos sintetizados por Abd El-Halim et al. (No se muestran los contraiones) M1 = Cr(III), Fe(III); M2 = Co(II), Ni(II), Cu(II); M3 = Mn(II), Zn(II), Cd(II) [32]

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1.5 Técnicas de caracterización

Dada la comprobada e importante actividad antimicrobiana de los complejos de coordinación, es indispensable la determinación de la estructura, composición y geometría de los compuestos sintetizados previo a su uso en pruebas biológicas. Por esta razón, en química inorgánica es importante el uso de diversas técnicas analíticas que permitan la correcta identificación del compuesto. El principio de funcionamiento de algunas de estas técnicas se resume a continuación.

1.5.1 Espectroscopia ultravioleta-visible

En la espectroscopía UV-Vis se da la absorción de radiación electromagnética comprendida en el rango UV y visible del espectro. Se conoce como espectroscopía electrónica porque ésta energía se usa para excitar los electrones a mayores niveles de energía. El espectro UV-Vis de los compuestos se determina generalmente en solución y se realiza en una celda construida de un material transparente a la radiación utilizada, en este caso se usan celdas de cuarzo. La intensidad de absorción se mide por la absorbancia de la muestra A que se define como

𝐴 = 𝑙𝑜𝑔₁₀(𝐼𝑜 𝐼)

donde I0 es la intensidad incidente e I es la medida de la intensidad que pasa a través de

la muestra. La ley de Beer-Lambert se utiliza para relacionar la absorbancia con la concentración molar C y la longitud de la trayectoria óptica L.

𝐴 = 𝜀[𝐶]𝐿

donde ɛ es el coeficiente de absortividad molar. Valores de ɛ por encima de 105 _M-1_cm-1 _se

observan para transiciones electrónicas permitidas y valores por debajo de 1M-1_cm-1

(31)

1.5.2 Espectroscopia infrarroja (FT-IR)

La espectroscopía infrarroja o vibracional se usa para caracterizar compuestos en términos de fuerza, rigidez y número de enlaces presente. En esta técnica se utiliza la propiedad de los enlaces de las moléculas que hacen que se comporten como resortes, el estiramiento a una distancia 𝑥 produce una fuerza de restauración 𝐹. Para desplazamientos pequeños, la fuerza de restauración es proporcional al desplazamiento y 𝐹 = −𝑘𝑥 donde 𝑘 es la constante de fuerza del enlace. Dependiendo de esta fuerza de restauración y de las masas de los átomos involucrados se obtendrán diferentes frecuencias de vibración que se pueden relacionar a grupos funcionales en los compuestos [33] . En química de coordinación esta técnica permite comprobar la formación de complejos por medio del desplazamiento de las señales del ligando en el espectro debido a la interacción con el metal.

1.5.3 Resonancia magnética nuclear

La resonancia magnética nuclear (RMN) es la más poderosa y ampliamente usada técnica espectroscopía para la determinación de estructuras moleculares en solución. Una limitación común y de importancia en química inorgánica es la presencia de un momento cuadrupolar nuclear, una distribución no uniforme de la carga eléctrica que se presenta en

los núcleos con número cuántico de espín nuclear 𝐼 >1

2, el cual produce un

ensanchamiento de las señales. Por tanto, núcleos con electrones desapareados no pueden ser estudiados con esta técnica [33]. Bajo las condiciones apropiadas de campo magnético, una muestra puede absorber radiación electromagnética en la región de radio frecuencias, la absorción es función de cierto tipo de núcleos en la molécula. Un gráfica de los picos de absorción de estas frecuencias contra la intensidad de los picos constituye un espectro de RMN [34].

1.5.4 Espectrometría de masas

El concepto de esta técnica es relativamente sencillo, un compuesto es ionizado y estos iones son separados en función de su relación carga-masa, el número total de iones de cada una de estas relaciones carga-masa produce el espectro. Por ejemplo, usando un método de ionización común como el impacto electrónico, el espectrómetro bombardea

(32)

moléculas en fase gaseosa con electrones de alta energía, ionizando la muestra, muchas veces produciendo fragmentaciones en ella. La separación de estos iones genera el espectro de masas [34].

1.5.5 Análisis elemental (C, H, N)

Hay instrumentos que permiten el análisis automático de la cantidad de C, H, N, O y S en compuestos químicos. En general el proceso consiste en calentar las muestras sobre oxígeno a 900°C para producir una mezcla de dióxido de carbono, monóxido de carbono, agua, nitrógeno y óxidos de nitrógeno. Una corriente de helio lleva los productos a un horno a 750°C donde el cobre reduce los óxidos de nitrógeno a nitrógeno removiendo el oxígeno. Los óxidos de cobre convierten el monóxido de carbono en dióxido de carbono. La mezcla resultante es analizada pasando a través de una serie de detectores de conductividad térmica. Los datos obtenidos de esta técnica son los porcentajes en masa de cada elemento [33].

1.5.6 Análisis térmico

Un análisis térmico consiste en el cambio de ciertas propiedades producto del calentamiento de la muestra. El análisis del cambio de masa en la muestra debido al calentamiento se conoce como análisis termogravimétrico. Esta medida se lleva a cabo usando una termobalanza que consiste en una microbalanza electrónica, un horno con temperatura programable y un controlador que permite que la muestra sea simultáneamente calentada y pesada. La balanza y el horno están sellados herméticamente de modo que la atmósfera interna pueda ser controlada. Esta atmósfera puede ser inerte o reactiva dependiendo del tipo de análisis que se desee hacer. También es posible hacer un análisis térmico diferencial, en esta técnica la temperatura de la muestras se compara con un material de referencia mientras son sometidos a las mismas condiciones de temperatura. La diferencia de temperatura entre la muestra y la celda de referencia se grafica contra la temperatura del horno, si un evento endotérmico se produce en la muestra, la temperatura de esta será menor a la de la celda de referencia, si sucede un proceso exotérmico la temperatura de la muestra será mayor que la de la celda de referencia [33].

(33)

Basados en la información previa se decidió plantear una serie de premisas sobre las cuales se trabajó para desarrollar el presente proyecto de investigación, a continuación se describen las hipótesis que se tiene al respecto así como los objetivos que se buscaban alcanzar con el proyecto de investigación.

1.6 Planteamiento del problema e hipótesis de trabajo

Teniendo en cuenta la importancia que tiene en la actualidad el desarrollar nuevas sustancias antimicrobianas debido al incremento en la resistencia de hongos y bacterias frente a los medicamentos ampliamente usado, y los antecedentes que muestran que compuestos azólicos con metales de transición tiene propiedades antimicrobianas, este proyecto pretende diseñar una serie de ligandos orgánicos que contengan fragmentos azólicos como pirazol, indazol, triazol y benzotriazol (Esquema 1-1) y sintetizar a partir de ellos compuestos de coordinación con Co(II), Cu(II) y Zn(II) (Esquema 1-2).

Luego de determinar la posible estructura de los complejos obtenidos se realizará un estudio de actividad antimicrobiana in vitro contra bacterias: Staphylococcus aureus, MRSA, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Salmonella typhimurium y Shigella flexneri, y contra hongos: Candida albicans, Candida krusei, Candida parapsilosis, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Aspergillus flavus y Aspergillus fumigatus. Se espera que los compuestos sintetizados tengan actividad teniendo en cuenta los antecedentes reportados en literatura.

(34)

Esquema 1-1: Ligandos derivados de azoles a sintetizar

(35)

1.7 Objetivos

1.7.1 Objetivo general

Sintetizar, caracterizar y evaluar la actividad antimicrobiana in vitro de complejos con metales de transición derivados de ligandos azólicos.

1.7.2 Objetivos específicos

 Sintetizar ligandos derivados de pirazol, indazol, triazol y benzotriazol.

 Preparar complejos de Co(II), Cu(II) y Zn(II) con los ligandos previamente

obtenidos.

 Caracterizar los compuestos mediante punto de fusión, espectroscopía infrarroja,

resonancia magnética nuclear (1_H, 13_{C), espectrometría de masas, análisis}

elemental, termogravimetría y espectroscopía UV-Vis.

 Realizar cálculos computacionales usando métodos semiempíricos (PM6), para

proponer una posible estructura en los complejos sintetizados.

 Hacer estudios in vitro de la actividad antimicrobiana tanto de ligandos como

complejos en bacterias (Staphylococcus aureus, MRSA, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter

aerogenes, Salmonella typhimurium y Shigella flexneri) y hongos (Candida albicans, Candida krusei, Candida parapsilosis, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Aspergillus flavus y Aspergillus fumigatus).

(36)

2. Síntesis y caracterización de ligandos y

compuestos de coordinación con Co(II),

Cu(II) y Zn(II)

Se han reportado complejos de coordinación con Co(II), Cu(II) y Zn(II) que presentan actividad biológica [10,14,15,18,21,28,35–39]. Estos metales están involucrados en

muchos e importantes procesos biológicos. El zinc por ejemplo, es conocido por tener funciones estructurales y de regulación de genes en más de 300 metaloenzimas además de participar en la catálisis de importantes reacciones metabólicas [40]. Los ligandos orgánicos pueden contribuir a mejorar el transporte de los iones metálicos a través de las zonas lipofílicas de las membranas celulares, permitiendo la entrada de los metales que generan la toxicidad para las células atacadas. Se ha demostrado que altas concentraciones de metales en el interior de las células puede generar efectos como: (a) incremento en la concentración de especies reactivas de oxígeno como radicales libres que generan daños en el ADN microbiano, (b) daños en el funcionamiento de las proteínas y pérdida de su actividad catalítica, (c) daños en las membranas celulares, (d) interferencia con la acumulación de nutrientes y (e) genotoxicidad [41]. Todos estos procesos, sumados a los asociados a la actividad del ligando azólico, pueden producir actividades antimicrobianas considerablemente altas.

Los aspectos relacionados a la síntesis de los ligandos derivados de azoles y los complejos de Co(II), Cu(II) y Zn(II) que se obtuvieron en este trabajo se presentan en las siguientes secciones así como la caracterización de los mismos.

(37)

2.1 Sección experimental

2.1.1 Materiales y métodos

Los procedimientos experimentales se llevaron a cabo en atmósfera inerte de nitrógeno seco usando técnicas de Schlenk. Los disolventes que se requerían anhidros fueron secados, destilados y almacenados sobre tamices moleculares de 3Å y atmósfera de nitrógeno previo a su utilización. Los reactivos dimetilpirazol (Aldrich, 99%), 3,5-bis(bromometil)tolueno (Alfa Aesar, 99%), 1,3-bis(bromometil)benceno (Alfa Aesar, 97%), 1H-1,2,4-triazol (Alfa Aesar, 99%), cloruro de isoftaloílo (Alfa Aesar, 98%), 1H-indazol (Alfa Aesar, 99%), 1H-benzotriazol (Merck, 99%), BTBA (Alfa Aesar, 98%) cloruro de zinc(II) anhidro (Alfa Aesar, 98%), cloruro de cobalto(II) anhidro (Alfa Aesar, 97%) y cloruro de cobre(II) anhidro (Alfa Aesar, 98%) fueron utilizados sin purificación adicional.

Los análisis elementales (C,H y N) se realizaron en un equipo Thermo ScientificTM_FLASH

2000 CHNS/O. Los espectros infrarrojos se tomaron en un espectrofotómetro Thermo Nicolet NEXUS FTIR usando pastillas de KBr. Los puntos de fusión se tomaron en un equipo Mel-Temp® 1101D usando tubos capilares abierto y se reportan sin corregir.

Los espectros de resonancia magnética nuclear se tomaron en un equipo Bruker AscendTM

– 400, que opera a 400,13 MHz para RMN 1_{H y a 100,62 MHz para RMN}13_{C Los}

desplazamientos químicos se reportan en ppm y las constantes de acoplamiento J en Hz. Las multiplicidades se encuentran denotadas como (s = singlete, d = doblete, dd = doble doblete, m = multiplete, t = triplete). Se utilizó DMSO-d6 como disolvente y como referencia

SiMe4 (δ: 0,0 ppm), o la señal residual de (CD3)2SO (δ: 2,50 ppm en RMN 1H y δ: 40,9 ppm

en RMN 13_C).

Los espectros de masas se adquirieron en un espectrómetro de masas Agilent Technologies Q-TOF GG520 LC/MS usando ionización electrospray (ESI). Los análisis termogravimétricos se obtuvieron en un equipo Hitachi Sta 7200 usando una atmósfera de nitrógeno con un flujo de 60 mL/min y una rampa de calentamiento de 30-700°C con una velocidad de 10°C min-1_{. Las curvas de TG se analizaron para dar el porcentaje de pérdida}

de masas en función de la temperatura y adicionalmente sirvió para confirmar los puntos de fusión de los complejos. Los espectros UV-Vis se tomaron en un Cary 100 de Agilent

(38)

Technologies usando barridos de 200 nm a 800 nm, las muestras fueron medidas en disolución con diferentes disolventes en celdas de cuarzo de un 1 cm.

Los cálculos de modelamiento molecular se realizaron por medio de métodos semiempíricos (PM6) usando el programa MOPAC2012, versión 15.152W [42,43] y Gabedit versión 2.3.8 [44] como interfaz gráfica. La geometría fue optimizada en el vacío (fase gaseosa), usando el método RMS (raíz cuadrada media del gradiente) con un gradiente 0,01 kcal mol-1_Å-1

. Las frecuencias vibracionales fueron obtenidas de las

geometrías optimizadas.

2.1.2 Síntesis de ligandos

2.1.2.1 Síntesis de bis(3,5-dimetil-1-pirazolil)metano (2)

Esté compuesto se sintetizó utilizando modificaciones de protocolos reportados previamente [45]. En un balón Schlenk equipado con condensador, se agregaron 3,5-dimetil-1H-pirazol (31,2 mmol; 3,0 g), KOH (48,13 mmol; 2,7 g), carbonato de potasio (47,75 mmol; 6,6 g), BTBA (2,39 mmol; 0,77 g) y 30 mL de DCM. La mezcla se calentó a reflujo por 36 horas. Luego se realizaron 3 extracciones líquido-líquido usando 20 mL de agua en cada una. La fase orgánica se separó y se secó con sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se evaporó y el sólido blanco obtenido se purificó por cromatografía en columna usando sílica gel (tipo 60) y DCM:MeOH (30:1) como fase móvil. Rendimiento, 2,68 g (84%). P.F: 105-106°C. FTIR (KBr, cm-1_{): 2980w, 1557vs, 1353s, 1267vs, 1035m, 776s.}1_{H RMN (DMSO-}_d_{6, 295 K)}_𝛿

6,03 (s, 2H), 5,81 (s, 2H), 2,39 (s, 6H), 2,06 (s, 6H). Análisis calculado para C11H16N4: C,

64,68; H, 7,90; N, 27,43; encontrado: C, 64,64; H, 7,82; N, 27,42. MS-ESI (m/z, ES+_):

(39)

2.1.2.2 Síntesis de 3,5-bis(3,5-dimetilpirazol-1-ilmetil)tolueno (3)

El ligando se obtuvo por medio de modificaciones de un procedimiento reportado en literatura [46]. En un balón Schlenk equipado con un condensador, se agregó 3,5-dimetil-1H-pirazol (10,41 mmol; 1,001 g), KOH (28,96 mmol; 1,157 g) y agua (1 mL). Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente por 30 minutos, después se agregó BTBA (0,332 mmol; 107,0 mg) y 3,5-bis(bromometil)tolueno (4,82 mmol; 1,3406 g) en 20 mL de tolueno, la mezcla se mantuvo a reflujo por 48 horas. Posteriormente se retiró el disolvente obteniéndose un residuo sólido que se extrajo con 3 porciones de una mezcla DCM:agua (20 mL proporción 70:30). La fase orgánica se separó, se secó con sulfato de sodio anhidro y el producto se purificó por cromatografía en columna usando sílica gel (tipo 60) y DCM:acetato de etilo (7:3) como fase móvil. Rendimiento 1,004 g (68%). P.F: 92 °C. FTIR (KBr, cm-1_{): 2927m, 1605m, 1553s, 1462s, 1351m, 1214m, 775s.}1_{H RMN (CDCl}

3, 295 K):

δ 6,75 (s, 2H), 6,54 (d, J = 11,1 Hz, 1H), 5,82 (s, 2H), 5,10 (d, J = 8,1 Hz, 4H), 2,44-1,81

(m, 15H). Análisis calculado para C19H24N4: C, 73,99; H, 7,84; N, 18,17; encontrado: C,

74,01; H, 7,82; N, 18,17%. MS-ESI (m/z, ES+_{): 309,2100 (M+H}+_).

2.1.2.3 Síntesis de 1,3-bis(indazol-1-ilmetil)benceno (4)

En un balón Schlenk equipado con condensador y burbujeador se agregó 3,5-bis(bromometil)benceno (1,20 mmol; 317,9 mg), 1H-indazol (2,61 mmol; 308,5 mg) y tolueno (15 mL), la mezcla se mantuvo a reflujo por 72 horas. El disolvente se retiró y el sólido obtenido se trató con 20 mL de agua y se llevó a pH neutro con aproximadamente 3 mL de sulfato de sodio al 10%. La mezcla acuosa se extrajo con 3 porciones de 10 mL de DCM. La fase orgánica se recuperó, se secó con sulfato de sodio anhidro. La solución se concentró y se dejó en la nevera a -5°C por 24 horas. El compuesto se obtuvo por cristalización en DCM-pentano. Rendimiento: 324,1 mg (79%). P.F: 175-176 °C. FTIR (KBr, cm-1_{): 3117s, 1625s, 1511s, 1468m, 1386w, 1320w, 1135w, 1007s, 789w,}

757s. La numeración de los átomos que se asignan en el RMN se encuentra en la figura.

1_{H RMN (400 MHz, DMSO-}_d

6) δ 8,45 (s, 2H, 12,12’), 7,63 (dd, J = 49,9, 8,5 Hz, 4H,

7,7’,10,10’), 7,38 (s, 1H, 4), 7,35-7,26 (m, 1H, 1), 7,25-7,18 (m, 4H, 8,8’,9,9’), 7,06-6,99 (m, 2H, 2,2’), 5,61 (s, 4H, 5,5’). 13_{C RMN (101 MHz, DMSO-d}

(40)

(C3,C3’), 129,37 (C1), 127,53 (C4), 127,50 (C8,C8’), 125,47 (C9, C9’), 124,03 (C12, C12’),

121,54 (C11, C11’), 121,06 (C2, C2’), 120,63 (C7, C7’), 117,01 (C10, C10´), 56,09 (C5, C5’). Análisis calculado para C22H18N4: C, 78,08; H, 5,36; N, 16,56; encontrado: C, 77,59;

H, 5,33; N, 16,48%. MS-ESI (m/z, ES+_{): 339,1632 (M+H}+_).

2.1.2.4 Síntesis de bis(1,2,4-triazol-1-il)metano (5)

El ligando se obtuvo por medio de modificaciones de un reporte previo [47]. En un balón Schlenk con condensador de reflujo se agregó 1 H-1,2,4-triazol (13,3 mmol; 920,6 mg), KOH (44,85 mmol; 2,5167 g) y agua (1 mL), la mezcla fue agitada a temperatura ambiente por 60 minutos, después se adicionó BTBA (0,473 mmol, 152,8 mg) y DCM (50 mL), la mezcla se mantuvo a reflujo por 48 horas luego de las cuales se filtró, la solución se trató con 5 porciones de 10 mL de agua, la fase orgánica se recolectó y se secó con sulfato de sodio anhidro. La solución se evaporó a sequedad produciendo un sólido blanco. El compuesto fue purificado por cromatografía en columna usando sílica gel (tipo 60) y acetona como fase móvil. Rendimiento 1,004 g (66%). P.F: 142-143. FTIR (KBr, cm-1_{): 3115s, 3021m, 1812m, 1507s, 1422s, 1275s, 1202s, 1131s,}

1021s, 876m, 673s. 1_{H RMN (DMSO-}_d

6, 295 K): δ 8,83 (s, 1H), 8,04 (s, 1H), 6,65 (s, 1H).

Análisis calculado para C5H6N6: C, 40,00; H, 4,03; N, 55,97; encontrado: C, 39,97; H, 3,95;

N, 55,92%. MS-ESI (m/z, ES+_{): 151,0743 (M+H}+_).

2.1.2.5 Síntesis de 1,3-fenilenbis(1,2,4-triazol-1-il)metanona (6)

En un balón Schlenk con condensador para reflujo y burbujeador se agregó cloruro de isoftaloílo (2,46 mmol; 499,5 mg), 1H-1,2,4-triazol (4,98 mmol; 344,4 mg), 0,8 mL de trietilamina anhidra y 20 mL de tolueno. La mezcla se mantuvo a reflujo por 36 horas. Luego se filtró en caliente, el filtrado se evaporó por completo, al sólido obtenido se le realizaron 2 extracciones líquido-líquido con 25 mL de una mezcla DCM:agua (70:30) cada una. La fase orgánica se secó con sulfato de sodio anhidro, el disolvente se retiró y el producto blanco resultante se lavó con n-pentano y se secó a 80°C durante 5 horas. Rendimiento 354,6 mg (53,7%). P.F: 322°C. FTIR (KBr, cm-1_{): 3120s, 2925s, 2809s, 2625s, 1710vs,}

1525m, 1377s, 1272s, 1121m, 955s, 723m, 665m, 518w. La numeración de los átomos que se asignan en el RMN se encuentra en la figura. 1_{H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9,49 (s,}

(41)

2H, 2, 2’), 8,76 (t, J = 1,7 Hz, 1H, 4), 8,42 (dd, J = 8,1, 1,8 Hz, 4H, 6, 6’, 7, 7’), 7,85 (t, J =

7,9 Hz, 1H, 1). 13_{C NMR (101 MHz, DMSO)}_{δ 164,36 (C5, C5’), 154,22 (C7, C7’), 147,59}

(C2, C2’), 136,86 (C6, C6’), 134,38 (C4), 131,25 (C3, C3’), 129,32 (C1). Análisis calculado

para C12H8N6O2: C, 53,73; H, 3,01; N, 31,33; O, 11,93; encontrado: C, 52,57; H, 3,94; N,

25,65%. MS-ESI (m/z, ES+_{): 291,062471 (M+Na}+_).

2.1.2.6 Síntesis de 3,5-bis(benzotriazol-1-ilmetil)tolueno (7)

Este ligando se obtuvo siguiendo una metodología previamente reportada [48]. En un balón Schlenk con condensador y burbujeador se agregó 1H-benzotriazol (2,83 mmol; 336,8 mg), 3,5-bis(bromometil)tolueno (1,41 mmol; 391,9 mg) y tolueno (10 mL). La mezcla se mantuvo a reflujo durante 48 horas. Luego de este tiempo la mezcla se filtró y la solución en tolueno se enfrío a -15°C por 48 horas. El producto precipitado fue filtrado, lavado con n-pentano y secado a presión reducida. Rendimiento 214,5 mg (43%). P.F: 147-148°C. FTIR (KBr, cm-1_{): 1613m, 1495m, 1453s, 1308w, 1221s,}

1130w, 1093m, 781s, 745s. 1_{H RMN (400 MHz, DMSO}_-d

6) δ 8,03 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,70

(d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,46 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,41–7,33 (m, 2H), 7,15 (s, 1H), 7,09 (s, 2H), 5,89 (s, 4H), 2,19 (s, 3H). Análisis calculado para C21H18N6: C, 71,17; H, 5,12; N, 23,71;

encontrado: C, 71,12; H, 5,10; N, 23,60%. MS-ESI (m/z, ES+_{): 355,1685 (M+H}+_).

2.1.3 Síntesis de complejos de cobalto(II)

2.1.3.1 Síntesis de diclorobis(3,5-dimetil-1H-pirazol-N,N’)cobalto(II) (1a)

Este compuesto se obtuvo realizando modificaciones de un protocolo previamente descrito [49]. A una suspensión de cloruro de cobalto(II) anhidro (3,87 mmol; 501,9 mg) en 15 mL de THF se le agregó gota a gota una solución de 3,5-dimetil-1H-pirazol (1) (7,70 mmol; 740,5 mg), la mezcla de reacción se calentó a reflujo por 4 horas luego de las cuales se filtró para remover los restos de sal. La disolución se secó a presión reducida obteniéndose un compuesto azul oscuro que fue purificado por recristalización en etanol. Rendimiento: 438,2 mg (43,8%). P.F 222 °C FTIR (KBr, cm-1_{): 3344vs, 3312vs, 2923w, 2359vw, 1568vs, 1471m, 1271m, 1049s, 820m, 586m,}

(42)

427w. Análisis calculado para C10H16Cl2CoN4: C, 37,29; H, 5,01; N, 17,39; encontrado C,

36,50; H, 4,90; N, 17,04%.

2.1.3.2

Síntesis de dicloro[bis(3,5-dimetil-1-pirazolil)metano-N,N’]cobalto(II)

(2a)

Este compuesto se obtuvo siguiendo un reporte de literatura [50]. Una solución de bis(3,5-dimetil-1-pirazolil)metano (2) (0,5 mmol; 101 mg) en 3 mL de MeOH fue adicionada sobre una solución de cloruro de cobalto anhidro (0,53 mmol; 126 mg) en 2 mL de MeOH. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 60 minutos, el sólido azul obtenido se filtró y se lavó con MeOH frío y éter etílico y finalmente se secó a 80°C por 5 horas. Rendimiento: 58,2 mg (57%). P.F: 308 °C. FTIR (KBr, cm-1_{): 3133m, 1556s, 1465s, 1390s, 1278vs, 1051m, 807s, 677s,}

493w. Análisis calculado para C11H16Cl2N4Co: C, 39,54; H, 4,83; N, 16,77; encontrado: C,

39,52; H, 4,76; N, 16,74%.

2.1.3.3 Síntesis de

dicloro[3,5-bis(3,5-dimetilpirazol-1-ilmetil)tolueno-N,N’]cobalto(II) (3a)

A una solución de 3,5-bis(3,5-dimetilpirazol-1-ilmetil)tolueno (3) (0,33 mmol; 101,4 mg) en 2 mL de ACN se agregó una solución de cloruro de cobalto(II) anhidro (0,38 mmol; 49,8 mg) en 5 mL de ACN. La mezcla se calentó a reflujo durante 12 horas. El disolvente se retiró a presión reducida el sólido azul obtenido se disolvió en DCM, posteriormente la solución se filtró y el disolvente fue retirado obteniéndose el complejo puro que se secó a presión reducida usando un rotavapor. Rendimiento: 127,9 mg (88,8%). P.F: 192-194°C. FTIR (KBr, cm-1_{): 2921m, 1553s, 1468s, 1421s, 1368s, 1271w, 1047m, 799m, 729s.}

Análisis calculado para C19H24Cl2CoN4: C, 52,07; H, 5,52; N, 12,78; encontrado: C, 51,57;

(43)

2.1.3.4 Síntesis de dicloro[1,3-bis(indazol-1-ilmetil)benceno-N,N’]cobalto(II)

(4a)

Una solución de 1,3-bis(indazol-1-ilmetil)benceno (4) (0,29 mmol; 99,6 mg) en 3 mL de ACN se adicionó sobre una solución de cloruro de cobalto(II) anhidro (0,30 mmol; 38,5 mg) en 3 mL de ACN. La reacción se calentó a reflujo por 3 horas, el precipitado obtenido se filtró y se lavó con ACN y éter etílico y finalmente se secó usando vacío. Rendimiento: 91,3 mg (66,2%). P.F: 328°C. FTIR (KBr, cm-1_{): 3094m, 1628m, 1519m,}

1438m, 1310m, 1150m, 1030w, 852m, 758vs, 740m, 435w. Análisis calculado para C22H18Cl2CoN4: C, 56,43; H, 3,87; N, 11,97; encontrado: C, 60,84; H, 3,79; N, 13,63%.

2.1.3.5 Síntesis de dicloro[bis(1,2,4-triazol-1-il)metano-N,N’]cobalto(II) (5a)

Se siguió la metodología reportada por Lobbia [51]. A una solución de cloruro de cobalto(II) anhidro (0,67 mmol; 86,8 mg) en 2 mL de etanol se le agregó gota a gota una solución de bis(1,2,4-triazol-1-il)metano (5) (0,67 mmol; 101,0 mg) en 5 mL de acetona. Inicialmente se observó la formación de un precipitado de color rosado que posteriormente se homogenizó y se tornó completamente azul cuando la concentración de ligando en solución incrementó. La mezcla de reacción se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 10 horas. El sólido azul resultante se filtró y se lavó repetidamente con etanol, acetona y éter etílico y posteriormente se secó con vacío. Rendimiento: 154,4 mg (82,5%). P.F: 307-309°C. FTIR (KBr, cm-1_{): 3115m,}

2094m, 1518s, 1405w, 1283s, 1209s, 1126vs, 983m, 888w, 737m, 676m, 418vw. Análisis calculado para C5H6Cl2CoN6: C, 21,45; H, 2,16; N, 30,02; encontrado: C, 22,10; H, 3,46;

N, 34,01%.

2.1.3.6 Síntesis de

dicloro[1,3-fenilenbis(1,2,4-triazol-1-il)metanona-N,N’]cobalto(II) (6a)

A una solución de cloruro de cobalto(II) anhidro (0,38 mmol; 49,5 mg) en 5 mL de acetona se le adicionó una solución de 1,3-fenilenbis(1,2,4-triazol-1-il)metanona (6) (0,38 mmol; 100,8 mg) en 4 mL de una mezcla acetona:etanol (1:1). Se observó la precipitación de un sólido azul

(44)

claro que se filtró y se lavó con acetona y etanol. El compuesto se secó a 80°C obteniéndose un sólido de color lila. Rendimiento: 97,0 mg (64,8%). P.F: >400°C. FTIR (KBr, cm-1_{): 3126vs, 3017m, 2912m, 2827m, 2361w, 1700w, 1521m, 1422s, 1312m,}

1064m, 884m, 618s, 419w. Análisis calculado para C12H8Cl2CoN6O2: C, 36,21; H, 2,03; N,

21,11; encontrado: C, 22,53; H, 1,97; N, 28,84%.

2.1.3.7 Síntesis de

dicloro[3,5-bis(benzotriazol-1-ilmetil)tolueno-N,N’]cobalto(II) (7a)

Una solución de 3,5-bis(benzotriazol-1-ilmetil)tolueno (7) (0,28 mmol; 99,5 mg) en 10 mL de THF se le agregó una solución de cloruro de cobalto(II) anhidro (0,31 mmol; 40,8 mg) en 4 mL de THF. La mezcla se calentó a reflujo durante 20 horas, el sólido azul obtenido se lavó con THF, éter etílico y se secó a 80°C por 12 horas. Rendimiento: 111,9 mg (82,3%). PF: 212-215°C. FTIR (KBr, cm-1_{): 3092w, 1610m, 1456m,}

1318m, 1229m, 1169w, 749s, 434w. Análisis calculado para C21H18Cl2CoN6: C, 52,09; H,

3,75; N, 17,36; encontrado: C, 52,85; H, 3,86; N, 16,39%.

2.1.4 Síntesis de complejos de cobre(II)

2.1.4.1 Síntesis de diclorobis(3,5-dimetil-1H-pirazol-N,N’)cobre(II) (1b)

La síntesis se llevó acabo modificando un procedimiento reportado previamente [52]. A una solución de cloruro de cobre(II) anhidro (1,03 mmol; 138,9 mg) en 10 mL de acetona se adicionó una solución de 3,5-dimetil-1H-pirazol (1) (2,08 mmol; 199,6 mg) en 3 mL de acetona. Se observó la formación de un precipitado verde brillante una vez mezcladas las soluciones, la mezcla se mantuvo en agitación durante 1 hora, el producto se filtró, se lavó con acetona y se secó a presión reducida. Rendimiento 148,3 mg (44,0%). P.F: 197 °C. FTIR (KBr, cm-1): 3265vs, 3199vs, 2921s, 2360w, 1570vs, 1412s, 1275s, 1171s, 1043s, 795s, 819s, 795s, 686s, 431m. Análisis calculado para C10H16Cl2CuN4: C, 36,76; H, 4,94; N, 17,15;

(45)

2.1.4.2

Síntesis de dicloro[bis(3,5-dimetil-1-pirazolil)metano-N,N’]cobre(II)

(2b)

Este compuesto se obtuvo siguiendo un reporte de literatura [53]. Una solución de bis(3,5-dimetil-1-pirazolil)metano (2) (1,47 mmol; 300 mg) en 6 mL de acetona se añadió a una solución de cloruro de cobre(II) anhidro (1,48 mmol; 253 mg) en 2 mL de acetona. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 30 minutos, el sólido amarillo formado se filtró y se lavó con acetona y éter etílico y se secó a 80°C durante 6 horas. Rendimiento: 243 mg (78%). P.F: 206-207 °C. FTIR (KBr, cm-1_{): 3027m, 1558s, 1467s, 1386s, 1279vs, 1044m, 785s, 677s,}

492w. Análisis calculado para C11H16Cl2CuN4: C, 39,01; H, 4,76; N, 16,54; encontrado: C,

39,01; H, 4,75; N, 16,44 %.

2.1.4.3 Síntesis de

dicloro[3,5-bis(3,5-dimetilpirazol-1-ilmetil)tolueno-N,N’]cobre(II) (3b)

Se adicionó una solución de 3,5-bis(3,5-dimetilpirazol-1-ilmetil)tolueno (3) (0,65 mmol; 200,5 mg) en 3 mL de acetona sobre una solución de cloruro de cobre(II) anhidro (0,65 mmol; 87,4 mg) en 5 mL de acetona. Se observó la formación inmediata de un precipitado verde, la mezcla se mantuvo 12 horas en agitación a temperatura ambiente. El sólido obtenido se filtró, se lavó con acetona y se secó usando vacío. Rendimiento: 251,5 mg (87,4%). P.F: 185-186 °C. FTIR (KBr, cm-1_{): 3445w, 2926m,}

1608m, 1556vs, 1469s, 1424s, 1385s, 1302m, 1055m, 843m, 799m, 786m, 470w Análisis calculado para C19H24Cl2CuN4: C, 51,53; H, 5,46; N, 12,65; encontrado: C, 51,70; H, 6,13;

N, 13,15 %.

2.1.4.4 Síntesis de dicloro[1,3-bis(indazol-1-ilmetil)benceno-N,N’]cobre(II)

(4b)

Una solución de 1,3-bis(indazol-1-ilmetil)benceno (4) (0,59 mmol; 199,0 mg) en 5 mL de acetona se agregó sobre una solución de cloruro de cobre(II) anhidro (0,60 mmol; 80,7 mg) en 5 mL del mismo disolvente. Luego de 30 minutos de reacción se

(46)

observó la formación de un precipitado rojo, la mezcla se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 12 horas. El sólido obtenido se lavó con acetona y se secó a 80°C por 6 horas. Rendimiento: 182,8 mg (65,7%). P.F: 205 °C. FTIR (KBr, cm-1_{): 3446w,}

3098m, 1628m, 1520s, 1431m, 1375m, 1152s, 914m, 755vs, 615w, 432w. Análisis calculado para C22H18Cl2CuN4: C, 55,88; H, 3,84; N, 11,85; encontrado: C, 55,30; H, 4,64;

N, 12,41 %.

2.1.4.5 Síntesis de dicloro[bis(1,2,4-triazol-1-il)metano-N,N’]cobre(II) (5b)

La síntesis de este compuesto se logró siguiendo una metodología previamente reportada [51]. Una solución de bis(1,2,4-triazol-1-il)metano (5) (1,33 mmol; 199,9 mg) en 3 mL de acetona se adicionó sobre una solución de cloruro de cobre(II) anhidro (1,36 mmol; 182,5 mg) en 10 mL de acetona. Se produjo la precipitación inmediata de un compuesto azul claro que se lavó con acetona y se secó a 80°C por 12 horas. Rendimiento: 344,0 mg (91,0%). P.F: 267 - 269 °C. FTIR (KBr, cm-1_{): 3448w, 3137m, 1525m, 1460w, 1387w, 1287m, 1212m, 1135s, 1114vs,}

1032m, 961m, 780m, 739s, 668s, 633w. Análisis calculado para C5H6Cl2CuN6: C, 21,10;

H, 2,13; N, 29,53; encontrado: C, 20,16; H, 2,01; N, 30,33 %.

2.1.4.6 Síntesis de

dicloro[1,3-fenilenbis(1,2,4-triazol-1-il)metanona-N,N’]cobre(II) (6b)

A una solución de 1,3-fenilenbis(1,2,4-triazol-1-il)metanona (6) (0,74 mmol; 199,7 mg) en 3 mL de acetona se le agregó una solución de cloruro de cobre(II) anhidro (0,75 mmol; 100,7 mg), en la mezcla de reacción se formó un precipitado azul inmediatamente, se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 5 horas y el sólido obtenido se filtró y se lavó con acetona, diclorometano y éter etílico, finalmente se secó en la estufa a 80°C por 12 horas. Rendimiento: 145,6 mg (48,6%). P.F: descomposición a 340 °C. FTIR (KBr, cm-1_{): 3448w, 3135s, 3024m, 2926m, 1708vs, 1519m, 1427m, 1373vs, 1215vs,}

1079vs, 955m, 876m, 717vs, 620vs. Análisis calculado para C12H8Cl2CuN6O2: C, 35,79; H,

(47)

2.1.4.7 Síntesis de

dicloro[3,5-bis(benzotriazol-1-ilmetil)tolueno-N,N’]cobre(II) (7b)

A una solución de cloruro de cobre(II) anhidro (0,28 mmol; 37,5 mg) en 3 mL de acetona se le agregó una solución de 3,5-bis(benzotriazol-1-ilmetil)tolueno (7) (0,28 mmol; 100,7 mg) en 5 mL de acetona. Al mezclar las soluciones se observó un precipitado verde, la mezcla se dejó en agitación a temperatura ambiente por 5 horas. El compuesto se lavó con acetona y se secó a presión reducida. Rendimiento: 116,0 mg (85,1%). P.F: 236 - 238°C. FTIR (KBr, cm-1_{): 3131w, 2358w, 2343w, 1609w, 1457m, 1233s, 746vs, 669w, 432w. Análisis}

calculado para C21H18Cl2CuN6: C, 51,60; H, 3,71; N, 17,19; encontrado: C, 50,62; H, 3,36;

N, 17,52%.

2.1.5 Síntesis de complejos de zinc(II)

2.1.5.1 Síntesis de diclorobis(3,5-dimetil-1H-pirazol-N,N’)zinc(II) (1c)

La estructura cristalina de este complejo ya está reportada [54], pero no se encontraron detalles de la metodología sintética para obtenerlo, se siguió el siguiente protocolo. En un balón Schlenk con un equipo de reflujo se agregó 3,5-dimetil-1H-pirazol (1) (6,24 mmol; 600,1 mg), cloruro de zinc(II) (2,74 mmol; 374,1 mg) y etanol (15 mL), la mezcla se calentó a reflujo durante 7 horas luego de las cuales se dispuso en la nevera a -5 °C por 24 horas obteniéndose un sólido blanco que se lavó con etanol frío y se secó usando vacío. Rendimiento 679,5 mg (76%). P.F: 229-230 °C. FTIR (KBr, cm-1_{): 3346vs, 3316s, 3144w, 2925w, 1570s, 1471w, 1409m, 1272m, 1168m, 1048vs,}

820m, 427w. 1_{H RMN (DMSO-}_d_{6, 295 K)}_𝛿_{12,13 (s, 1H), 5,82 (s, 1H), 2,15 (s, 6H). Análisis}

calculado para C10H16Cl2N4Zn: C, 36,56; H, 4,91; N, 17,05; encontrado: C, 36,50; H, 4,90;

(48)

2.1.5.2 Síntesis de dicloro[bis(3,5-dimetil-1-pirazolil)metano-N,N’]zinc(II) (2c)

La síntesis de este compuesto se realizó siguiendo una metodología reportada [55]. A una solución de bis(3,5-dimetil-1-pirazolil)metano (2) (0,518 mmol; 105,9 mg) en 2 mL de etanol se le adicionó una solución de cloruro de zinc(II) (0,489 mmol; 66,7 mg) en 2 mL de etanol. Se observó la formación inmediata de un precipitado blanco. El producto se filtró y se lavó con etanol y hexano y posteriormente se secó a 80°C por 6 horas. Rendimiento: 125,7 mg (75%). P.F: 314-315 °C. FTIR (KBr, cm-1_{): 3015w, 1558s, 1466m, 1392s, 1280vs, 1051m, 1006w,}

829m, 805m, 677m, 494w. 1_{H RMN (DMSO-}_d_{6, 295 K)}_𝛿_{6,04 (s, 2H), 5,82 (s, 2H), 2,39 (s,}

6H), 2,06 (s, 6H). Análisis calculado para C11H16Cl2N4Zn: C, 38,80; H, 4,74; N, 16,45;

encontrado: C, 38,76; H, 4,72; N, 16,43%.

2.1.5.3 Síntesis de

dicloro[3,5-bis(3,5-dimetilpirazol-1-ilmetil)tolueno-N,N’]zinc(II) (3c)

Una solución de 3,5-bis(3,5.dimetilpirazol-1-ilmetil)tolueno (3) (1,07 mmol; 330,8 mg) en 5 mL de acetona, se añadió a una solución de cloruro de zinc(II) (1,10 mmol; 151,9 mg) en 5 mL de acetona. La reacción se mantuvo en agitación a temperatura ambiente por 5 horas. El sólido blanco obtenido se filtró y se lavó con acetona, etanol y se secó usando vacío. Rendimiento: 208,5 mg (44%). P.F: 190-191 °C. FTIR (KBr, cm-1_):

1712s, 1607w, 1556s, 1469m, 1422s, 1364m, 1221m, 1047m, 787w, 419w. 1_{H RMN}

(DMSO-d6, 295 K): δ 6,80 (s, 2H), 6,55 (s, 1H), 5,82 (s, 2H), 5,10 (d, J = 7,5 Hz, 4H), 2,22

(s, 3H), 2,13-2,04 (m, 12H). Análisis calculado para C19H24Cl2N4Zn: C, 51,32; H, 5,44; N,

12,60; encontrado C, 51,32; H, 5,34; N, 12,52%. MS-ESI (m/z, ES+_{): 445,03 (M+H}+_).

2.1.5.4 Síntesis de dicloro[1,3-bis(indazol-1-ilmetil)benceno-N,N’]zinc(II) (4c)

A una solución de 1,3-bis(indazol-1-ilmetil)benceno (4) (0,181 mmol; 61,2 mg) en 5 mL de etanol se le adicionó una solución de cloruro de zinc(II) (0,177 mmol; 24,2 mg) en 2 mL de etanol. Un sólido blanco se produjo inmediatamente, la mezcla de reacción se dejó en agitación por 30 minutos a temperatura ambiente, el producto se filtró y se lavó con etanol, éter etílico y se secó durante 5 horas a 80°C. Rendimiento: 37,0 mg (44%).