Caracterización molecular de bacterias asociadas a las microalgas Isochrysis galbana y Chaetoceros gracilis utilizadas en cultivo de moluscos bivalvos

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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

FACULTAD DE PESQUERÍA

“CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE BACTERIAS ASOCIADAS A

LAS MICROALGAS Isochrysis galbana Y Chaetoceros gracilis,

UTILIZADAS EN CULTIVO DE MOLUSCOS BIVALVOS”

Presentado por:

LUCÍA NATALÍ RÍOS CASTRO

Tesis para optar por el título de:

INGENIERO PESQUERO

Lima - Perú

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AGRADECIMIENTO

En primer lugar, agradezco a Incabiotec, por darme la oportunidad de desarrollar esta tesis y de forma muy especial a Benoit Diringer, por compartir sus conocimientos, guiarme, aconsejarme y brindarme su amistad.

A Krizia Pretell, Karina Zapata, José González, Joselyn Zavala, Abrahán Flores y Angelita Ramos, por enseñarme, ayudarme y compartir conmigo, siendo más que compañeros de trabajo, amigos.

A Reproducción y Comercialización of Scallops Company por proporcionar los ambientes necesarios para la realización de esta tesis.

A la profesora Patricia Gil-Kodaka por asesorarme y ayudarme en todo este tiempo.

A mi familia, por siempre estar presente, brindándome su apoyo, aconsejándome, preocupándose por mí y motivándome a ser mejor persona.

Y en general, a todas la personas que de una u otra forma me ayudaron de manera profesional o personal a concluir este proceso exitosamente.

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I. ÍNDICE

I. ÍNDICE ... 5

I.1. Índice de tablas ... 7

I.2. Índice de figuras ... 8

I.3. Índice de anexos ... 9

II. RESUMEN ... 10 III. GLOSARIO ... 11 IV. INTRODUCCIÓN ... 13 V. REVISIÓN DE LA LITERATURA ... 15 V.1. Microalgas y bivalvos ... 15 V.2. Relaciones microalga-bacteria ... 17

V.3. Bacterias cultivables asociadas a microalgas ... 20

V.4. Cultivos de microalgas con bacterias ... 21

VI. MATERIALES Y MÉTODOS ... 23

VI.1. Lugar de Ejecución ... 23

VI.2. Materiales ... 23

VI.2.1. Material biológico ... 23

VI.2.2. Materiales de laboratorio ... 23

VI.2.3. Reactivos Químicos ... 24

VI.2.4. Equipos ... 24

VI.3. Metodología ... 25

VI.3.1. Aislamiento de bacterias cultivables ... 27

VI.3.2. Extracción de ADN bacteriano ... 27

VI.3.3. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) ... 28

VI.3.4. Electroforesis ... 28

VI.3.5. Preparación de las bacterias ... 28

VI.3.6. Evaluación del crecimiento de microalgas ... 29

VI.3.7. Análisis Estadístico... 30

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VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 31

VII.1. Aislamiento de las bacterias cultivables ... 31

VII.2. Preparación de las bacterias ... 32

VII.3. Evaluación del crecimiento de microalgas ... 32

VII.4. Electroforesis en gel de agarosa ... 42

VII.5. Secuenciación y análisis ... 43

VII.6. Análisis estadístico ... 45

VII.7. Aplicación en la alimentación de larvas de moluscos bivalvos ... 48

VIII. CONCLUSIONES... 51

IX. RECOMENDACIONES ... 52

X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 53

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I.1. Índice de tablas

Cuadro 1: Morfología de las bacterias cultivables aisladas de Isochrysis galbana y

Chaetoceros gracilis……….... 31

Cuadro 2: Tinción de Gram de las bacterias cultivables aisladas de Isochrysis galbana y

Chaetoceros gracilis……….32

Cuadro 3: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Isochrysis galbana en la etapa 1………...…….…33 Cuadro 4: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Isochrysis galbana en la etapa 2………..…..33 Cuadro 5: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Chaetoceros gracilis en la etapa 1……….…34 Cuadro 6: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Chaetoceros gracilis en la etapa 2……….…34 Cuadro 7: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Isochrysis galbana en la etapa 3………...…35 Cuadro 8: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Isochrysis galbana en la etapa 4……….35 Cuadro 9: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Chaetoceros gracilis en la etapa 3.……….………...36 Cuadro 10: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Chaetoceros gracilisen la etapa 4.………36 Cuadro 11: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Chaetoceros gracilis en la etapa 5……….…………38 Cuadro 12: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Isochrysis galbana en la etapa 5……….40

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Cuadro 13: Cálculo del total de microalgas (L) a utilizar con el tratamiento con

Lysinibacillus sp…………….49

I.2. Índice de figuras

Figura 1: Imágenes de microscopía electrónica de barrido de Pavlova viridis en cultivo puro (A) y en co-cultivo con la bacteria Citrobacter freundii (B) (Ahamed et al., 2015)……….17 Figura 2: Esquema general de la metodología empleada..………...…23 Figura 3: Esquema de la evaluación del crecimiento de microalgas. El color amarillo representa la microalga Isochrysis galbana y el color naranja la microalga Chaetoceros

gracilis..……….………...26

Figura 4: Cultivos mixtos de microalgas y bacterias. Observado con un microscopio digital PentaView LCD (Celestron) a 40X. A) Cultivo de Isochrysis galbana, inoculado con la bacteria BM6. B) Cultivo de Chaetoceros gracilis, inoculado con la bacteria G6.……….……...…………..….……….…….37 Figura 5: Cultivo de Chaetoceros gracilis, día 4. A) Etapa 4: Control, G3, G4 y G6. B) Etapa 5: G3.1, Control y G3.2. C) Etapa 5: G4.1, Control y G4.2. D) Etapa5: G6.1, Control y G6.2...……….38 Figura 6: Curva de crecimiento del cultivo de Chaetoceros gracilis en las etapas 4 y 5………...………...….39 Figura 7: Cultivo de Isochrysis galbana. A) Etapa 4: BM6, Control e I4. B) Etapa 5: Control, I4.1 e I4.2. C) Etapa 5: BM6.1, Control y BM6.2..……….………..…….…...41 Figura 8: Curva de crecimiento del cultivo de Isochrysis galbana en la etapa 5..…………41 Figura 9: Gel de electroforesis. CE: Control de extracción, C-: Control de PCR, C+: Control positivo, MP: Marcador de peso. ………..……….….42

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Figura 10: Análisis estadístico del cultivo de Chaetoceros gracilis. A) Etapa 4. B) Etapa 5………...…..46 Figura 11: Análisis estadístico del cultivo de Isochrysis galbana, etapa 5………...…..47

I.3. Índice de anexos

ANEXO 1: Secuencias de ADN obtenidas a partir del gen 16S ARNr. ……….60 ANEXO 2: Análisis estadístico. ………...64 ANEXO 3: Tabla de alimentación (Modificada de MAGAP y Concepto Azul, 2015)…...72 ANEXO 4: Cálculos para determinar el ahorro en L del cultivo de microalgas al inocular las cepas bacterianas. ………...…....73

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II. RESUMEN

Se aislaron, purificaron y caracterizaron cepas bacterianas asociadas a dos especies de microalgas utilizadas en la larvicultura de la concha de abanico Argopecten purpuratus. Estas cepas fueron inoculadas individualmente a cada cultivo de microalgas para comprobar si presentaban un efecto promotor en el crecimiento. La inoculación se realizó en cinco etapas que permitieron seleccionar las mejores cepas; las dos primeras a nivel de cultivo puro, en un volumen de 10 ml, las siguientes dos en un volumen de 500 ml con aireación constante y en la última etapa se realizó el traspase de 500 ml a 2L, separándose en dos grupos, el primero continuó sin ninguna modificación y en el segundo hubo una re-inoculación de las bacterias. Se aislaron en total diez cepas bacterianas, dos de ellas, Lysinibacillus sp. y Bacillus cereus, evidenciaron una mejora en la producción de Isochrysis galbana con 45 y 31% más densidad, comparado con el tratamiento control. Y tres de ellas, Psychrobacter sp., Lysinibacillus sp. y Staphylococcus saprophyticus incrementaron el crecimiento en el cultivo de Chaetoceros gracilis en 47, 52 y 47%, respectivamente. Logrando dichas diferencias significativas (α=0.05) en la última etapa, con una nueva adición de bacterias cuando se efectuó el traspase. Si bien los resultados mostrados en este experimento son alentadores, se debe comprobar que el efecto continúe en el cultivo masivo.

Palabras clave: Isochrysis galbana, Chaetoceros gracilis, aislamiento, bacterias,

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III. GLOSARIO

- ADN (Ácido Desoxirribonucléico): Es el nombre químico de la molécula que contiene la información genética en todos los seres vivos. La molécula de ADN consiste en dos cadenas que se enrollan entre ellas para formar una estructura de doble hélice. Cada cadena tiene una parte central formada por azúcares (desoxirribosa) y grupos fosfato. Enganchado a cada azúcar hay una de las siguientes 4 bases: adenina (A), citosina (C), guanina (G), y timina (T) (Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano). - Amplicón: Producto de una reacción de amplificación de ADN. Amplificación de ADN:

Multiplicación repetida de una secuencia concreta de ADN, tanto in vivo, en un plásmido, fago u otro vector, como in vitro, por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (Zaid et al., 2004).

- Cepa: Cultivo puro de microrganismos de una especie, caracterizado por una o más propiedades fenotípicas o genotípicas, tales como tipo serológico o reacción bioquímica, que se mantienen en forma relativamente estable durante sucesivos subcultivos (Bennington, 2000).

- Chaetoceros gracilis: Es un alga unicelular perteneciente al grupo de diatomeas (Bacillariophyceae) planctónicas, generalmente marina. Sin movilidad, con una pared celular gruesa y setas conformadas de silicio. Volumen celular: 80 µm3. Se cultivan como alimento para las diferentes etapas del cultivo en criaderos de moluscos de valor comercial (Helm et al., 2006).

- Cultivo axénico: Cultivo libre de contaminantes externos y de simbiontes internos; generalmente no se consiguen tales requisitos con una esterilización de superficie; a veces se utiliza incorrectamente como sinónimo de cultivo aséptico (Zaid et al., 2004). - Electroforesis: Es una técnica utilizada para separar el ADN, el ARN, o moléculas o

proteínas en base a su tamaño y carga eléctrica. Se utiliza una corriente eléctrica para mover las moléculas y que se separen a través de un gel. Los poros del gel actúan como un colador, permitiendo que las moléculas más pequeñas se muevan más rápido que las grandes (Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano).

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- Ficósfera: Zona que se extiende hacia afuera de una célula o colonia de algas, con una distancia indefinida, en la que el crecimiento bacteriano es estimulado por productos extracelulares del alga (Bell y Mitchell, 1972).

- Gen 16S ARNr: Es una macromolécula de aproximadamente 1.500 nucleótidos, a partir de cuya secuencia se puede obtener información filogenética y taxonómica. Es un componente de la subunidad pequeña 30S de los ribosomas procariotas, es altamente conservado, presentando regiones comunes a todos los organismos. (Rodicio y Mendoza, 2003).

- Inóculo: Una pequeña cantidad de material celular tomada de un cultivo en suspensión, que se transfiere a un medio fresco para continuar su crecimiento en un cultivo (Zaid, et al., 2004).

- Isochrysis galbana: Alga unicelular perteneciente a las Haptophytas, flagelada pequeña, con un volumen de 40µm3. Se cultivan como alimento para las diferentes etapas del cultivo en criaderos de moluscos de valor comercial (Helm et al., 2006).

- PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa): Es una técnica de laboratorio utilizada para amplificar secuencias de ADN. El método utiliza secuencias cortas de ADN llamados cebadores para seleccionar la parte del genoma a amplificar. La temperatura de la muestra se sube y se baja repetidamente para ayudar a la enzima de replicación del ADN a duplicar la secuencia del ADN que está siendo copiada (Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano).

- Primer (Iniciador o cebador): Es una secuencia corta de ADN de cadena simple que se utiliza en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para hibridar con el ADN de la muestra y definir la región del ADN que será amplificada (Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano).

- Secuenciación de ADN: Es una técnica de laboratorio utilizada para determinar la secuencia exacta de las bases (A, C, G y T) en una molécula de ADN. La secuencia de bases de ADN lleva la información que una célula necesita para ensamblar proteínas y moléculas de ARN (Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano).

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IV. INTRODUCCIÓN

En la última década la producción del molusco bivalvo concha de abanico (Argopecten purpuratus), se ubicó regularmente como el primer recurso de producción acuícola del país con un récord en volumen de exportaciones de US$ 160 millones en el 2013. Sin embargo las exportaciones fluctuaron fuertemente con disminuciones de la producción por mortalidades en los cultivos y escasez de semilla en el 2011 15%), 2012 53%), 2014 (-18%) (PromPeru, 2015), 2015 (-51%) (Adex, 2015) y en el primer trimestre del 2016 se reporta solo US$ 21.7 millones, aproximadamente la mitad de lo exportado el mismo periodo en el 2105 (Adex, 2016).

Las mortalidades han sido relacionadas al bloom algal, caídas de oxígeno y se sospecha eventos de virosis por un malacoherpesvirus (Diringer et al., 2012), mientras que la escasez de semilla es reportada como el cuello de botella del cultivo de A. purpuratus (González, 2010). Para dar solución a dicha escasez, se implementó la producción de semilla en laboratorio. Los hatcheries tienen varias ventajas, siendo algunas de ellas, la posibilidad de cubrir el requerimiento de semillas de los moluscos bivalvos durante todo el año, la utilización de técnicas de mejoramiento genético y prevención de enfermedades.

Dentro del laboratorio, los cultivos de microalgas, son primordiales para el éxito de los cultivos larvarios de bivalvos, representan alrededor del 40% de los gastos de producción y del espacio total del hatchery, siendo su cantidad y calidad limitante en muchos casos (Uriarte et al., 2002; Helm et al., 2006). Además de ser costosos, también demandan una gran cantidad de tiempo y personal calificado, ya que es un procedimiento laborioso que se debe realizar con sumo cuidado y dedicación.

Al mismo tiempo, el cultivo de moluscos bivalvos en laboratorio es afectado frecuentemente por algunas enfermedades, sobre todo relacionadas con infecciones bacterianas. La principal fuente de entrada de bacterias al cultivo de moluscos, es a través de las microalgas. En consecuencia, es de suma importancia mantener el cultivo microalgal en las mejores condiciones posibles y de esta manera, asegurar la buena calidad de la semilla.

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Sin embargo, en los sistemas de producción acuícola es imposible producir cultivos microalgales axénicos en grandes volúmenes, primero porque muchas cepas supuestamente axénicas, tienen bacterias que no son detectadas por los medios de cultivo estándares (bacterias no cultivables o co-cultivables), en segundo lugar, debido a la complejidad de esterilizar completamente todos los entrantes y finalmente, porque las células de microalgas secretan sustancias que estimulan el crecimiento bacteriano y viceversa (Riquelme y Avendaño-Herrera, 2003). Por ello, el alimento utilizado es en realidad una mezcla de microalgas y de una o más bacterias asociadas.

Las interacciones entre microalga-bacteria(s) pueden ser benéficas y mejorar la estabilidad, crecimiento, productividad, etc. o al contrario, antagónicas, bacterias compitiendo por los nutrientes y siendo capaces incluso de lisar las microalgas, provocando el colapso del cultivo (Amin et al., 2012; Avendaño-Herrera et al., 2001; Croft et al., 2005; Fukami et al., 1997; Riquelme y Avendaño-Herrera, 2003).

Es primordial, para los laboratorios, disponer de cepas de microalgas de calidad y estables para el éxito y rentabilidad del cultivo. Para ello, las nuevas tendencias son de crear un ecosistema equilibrado entre microalgas y bacterias benéficas. El primer paso para lograrlo es conocer la flora microbiana total asociada a la cepa de microalga cuando el cultivo este sano. Una vez identificadas, se determinarán que bacterias pueden ser utilizadas como probióticos, para mejorar la productividad del cultivo. La estabilidad del consorcio debe estar monitoreado para asegurarse de su sostenibilidad entre cada etapa de repicaje.

El objetivo principal de la presente investigación, fue aislar y caracterizar molecularmente cepas bacterianas asociadas a dos cultivos de microalgas, Isochrysis galbana y Chaetoceros gracilis. Como objetivo secundario, se quiso evaluar el efecto que dichas cepas ocasionaban al cultivo de microalgas, inoculándolas y realizando un conteo diario de la densidad para comprobar si aumentaba la producción.

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V. REVISIÓN DE LA LITERATURA V.1. Microalgas y bivalvos

Las microalgas son especies unicelulares que viven en ambientes continentales o marinos y que miden de pocas micras a milímetros. Deben poseer ciertos atributos para ser útiles en acuicultura, como el tamaño y forma de la célula, tasas de crecimiento rápidas, estabilidad del cultivo ante fluctuaciones de luz, temperatura y nutrientes, fácil ingestión y digestión, composición bioquímica y la ausencia de toxinas (Brown, 2002). Siendo las más utilizadas para el cultivo de moluscos bivalvos los flagelados: Isochrysis galbana, Pavlova lutheri, Tetraselmis suecica y las diatomeas: Chaetoceros gracilis, Chaetoceros calcitrans, Thalassiosira pseudonana y Skeletonema costatum (Helm et al., 2006).

La composición bioquímica puede variar según la fase del ciclo de cultivo en la que se encuentren. Durante la fase de crecimiento logarítmico, las microalgas contienen entre 30 - 40% de proteína, 10 - 20% de lípidos y 5 -15 % de carbohidratos (Brown et al., 1997), sin embargo, cuando el cultivo se prolonga hasta la fase estacionaria, la composición proximal de las microalgas puede variar significativamente. Así mismo, mediante variaciones en los parámetros de cultivo como temperatura, exposición a la luz o cantidad de nutrientes en el medio, las proporciones de carbohidratos, lípidos y proteínas pueden ser manipuladas (Fábregas et al., 2004; Renaud et al, 2002). Por ejemplo cuando el nitrato es limitante, los niveles de carbohidratos pueden duplicarse a expensas de la proteína (Harrison et a.l, 1990) y viceversa, cuando se le agrega más nitrógeno al medio de cultivo, el contenido de proteínas de las células se elevan casi en un 50%, lo que conlleva a un aumento en la cantidad de huevos de Argopecten purpuratus en el desove y mejora el crecimiento de las larvas y postlarvas hasta los 5 mm (Uriarte y Farías, 1999). Otra investigación interesante es la de De Castro y García (2005) en la que comprueban que el contenido de lípidos y carbohidratos de Chaetoceros wighamii fue más alto a temperaturas más bajas (20-25°C, respecto a 30°C); con la adición de CO2, las proteínas aumentan y los carbohidratos

disminuyen, y al contrario, se observó mejora de la cantidad de carbohidratos y disminución de lípidos y proteínas con una salinidad de 35 ppt (respecto a 25 ppt).

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En cuanto a los aminoácidos, las microalgas marinas presentan los diez que se consideran esenciales para cubrir la demanda alimenticia de los bivalvos y están presentes en porcentajes muy similares entre las diferentes especies de algas (Brown 1997).

Las larvas en desarrollo tienen requerimientos nutricionales específicos como lo son los ácidos grasos altamente insaturados (HUFAs). Dentro de los HUFAs más importantes, se encuentran el ácido docosahexaenóico (DHA, 22:6n-3) y el ácido eicosapentaneóico (EPA, 20:5n-3), por lo tanto, necesitan una mezcla de microalga que les proporcione ambos. Coutteau y Sorgeloos (1992) indican que Isochrysis galbana (clone T-Iso) y Chaetoceros gracilis son las especies más utilizadas en la nutrición de pectínidos, esto se debe a que de la primera especie se pueden obtener niveles altos de lípidos totales y de ácido docosahexanoico (DHA), mientras que Chaetoceros gracilis complementa los requerimientos con los niveles elevados de carbohidratos, ácido eicosapentanoico (EPA) y riboflavina (Brown, 2002; Farias y Uriarte, 2002). Por lo tanto, una combinación de dos o tres especies de microalgas altamente nutricionales, incluyendo una diatomea de tamaño adecuado y un flagelado, proporcionan mejores tasas de crecimiento y desarrollo larvario que las dietas de una sola especie (Aranda-Burgos et al., 2014; Helm et al., 2006).

Para apoyar esta idea, se han realizado diversos estudios, como el de Vivanco et al. (2014), quienes evaluaron el efecto de diferentes dietas de microalgas y dietas artificiales sobre el crecimiento y supervivencia de larvas de almeja Mulinia edulis, obteniendo como resultado que la dieta con una mezcla de Isochrysis galbana y Chaetoceros calcitrans fue la que generó la mayor supervivencia y mayor tasa de crecimiento del cultivo. Asimismo, Carreño et al. (2012), estudiaron la influencia de la dieta sobre el desarrollo larvario del pectínido Argopecten nucleus, utilizaron las especies de microalgas Isochrysis galbana, Chaetoceros calcitrans y Tetraselmis suecica, con tratamientos monoalgales y mezclas en relación 1:1. Las variables estudiadas fueron supervivencia, crecimiento, aparición de la mancha ocular y estado de condición (larvas llenas, semillenas y vacías). La dieta que comprendía la mezcla entre Isochrysis galbana y Chaetoceros calcitrans fue la que obtuvo mejores resultados. Dichos resultados, concluyen los autores, se debe básicamente a que los nutrientes aportados por cada microalga se complementan.

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V.2. Relaciones microalga-bacteria

Históricamente las bacterias han sido conocidas como contaminantes de los cultivos de microalgas, sin embargo, ahora se acepta que algunas bacterias también desempeñan un papel en la promoción del crecimiento de las algas, estableciendo interacciones que van desde el mutualismo hasta el parasitismo (Ramanan, 2016). Dichas interacciones se dan en la ficósfera, la cual se ha definido como «una zona que se extiende hacia afuera de una célula o colonia de algas, con una distancia indefinida, en la que el crecimiento bacteriano es estimulado por productos extracelulares del alga» (Bell y Mitchell, 1972). Es análoga a la rizósfera en los suelos y tiene implicaciones directas para los flujos de nutrientes desde y hacia las células algales (Amin et al., 2012). En este espacio, las bacterias pueden vivir libremente alrededor de las microalgas e interactuar a través de los flujos metabólicos, en relación con el medio ambiente o en una asociación más estrecha con las células: bacterias epífitas, que se adhieren a la superficie de la microalga o bacterias endófitas, las cuales se desarrollan dentro de las células de las microalgas (Lupette et al, 2016). Por ejemplo, se visualizó la adhesión directa de la bacteria Citrobacter freundii en la superficie de las células de microalgas Pavlova viridis (Figura 1) con el método de microscopía electrónica de barrido (SEM) cuando se realizó un co-cultivo, el cual mostró mayor crecimiento y una fase exponencial más larga que ambos cultivos individuales (Ahamed et al., 2015).

Figura 1: Imágenes de microscopía electrónica de barrido de Pavlova viridis en cultivo puro (A) y en co-cultivo con la bacteria Citrobacter freundii (B)(Ahamed, et al., 2015).

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Las interacciones entre algas y bacterias se clasifican en intercambio de nutrientes y transducción de señales, siendo el primero el tipo más común (Kouzuma y Watanabe, 2015). Uno de los sustratos más importantes proporcionados por las algas autótrofas a las bacterias heterótrofas es el carbono orgánico disuelto (DOC), excretado como parte de las sustancias orgánicas fotosintetizadas (Amin, 2012). Se ha demostrado además que el carbono orgánico de la lisis celular de microalgas muertas y senescentes promueve el crecimiento bacteriano, así la densidad bacteriana es mayor en cultivos de algas en fase estacionaria en comparación con cultivos de fase exponencial, y es proporcional a la densidad de microalgas senescentes (Grossart et al., 2005).

Otro elemento significativo es el nitrógeno, un ejemplo documentado, es la simbiosis entre diatomeas (Hemiaulus , Rhizosolenia y Chaetoceros) y cianobacterias diazótrofas (aquellas que convierten el nitrógeno gaseoso en formas biológicamente más disponibles, como el amoníaco), como Richelia y Calothrix, las cuales mostraron una tasa de fijación de N2

entre 171-420 veces más al igual que una tasa de crecimiento mayor, cuando se cultivaron con las diatomeas respecto a cuándo se cultivaron solas. Los autores sugieren que las cianobacterias fijan nitrógeno en exceso y la mayoría es trasferido a las diatomeas (Foster et al., 2011).

El hierro es un micronutriente requerido por toda la vida en la Tierra, excepto por un grupo de bacterias Lactobacillus (Imbert y Blondeau, 1998), al ser un nutriente necesario para la fotosíntesis y la respiración. Se requiere hierro en porcentajes relativamente mayores que los demás metales de transición debido a su capacidad de catalizar reacciones redox, transferir electrones y unirse reversiblemente y así transportar ligandos tales como el O2 (Amin et al., 2012). Aunque las algas y las bacterias compiten a menudo por este nutriente, se conocen algunos casos de mutualismo. Muchas bacterias marinas sintetizan y excretan pequeños compuestos orgánicos llamados sideróforos, que se unen al ión férrico, aumentando su solubilidad. Una bacteria del género Marinobacter, asociada a dinoflagelados presenta un sideróforo funcional llamado Vibrioferrina (VF), el cual proporciona a las algas el hierro necesario para soportar la fijación fotosintética del carbono, este carbono fijo posteriormente ayuda al crecimiento y la reproducción tanto del algas como de sus bacterias asociadas y finalmente se usa para sintetizar nuevamente el

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sideróforo (Amin et al., 2009). Halomonas sp., se cultivaron con Dunaliella bardawil, las bacterias aumentaron la solubilidad del Fe, mejorando así la disponibilidad para las algas, como resultado, la tasa de crecimiento de algas aumentó (Keshtacher-Liebson, 1995). Otro grupo importante de micronutrientes son las vitaminas B, que actúan como cofactores de las enzimas del metabolismo celular. A pesar de su estilo de vida fotosintético, de 306 microalgas estudiadas por Croft et al. (2006), más del 50% de las especies tienen un requisito obligatorio de una fuente exógena de vitamina B12 (Cobalamina) para el crecimiento, el 22% requieren vitamina B1 (Tiamina) y un 5% B7 (Biotina). Los autores manejan la hipótesis que dicha auxotrofía se deba a la pérdida de un gen implicado en la biosíntesis de ese cofactor. La cobalamina se requiere en organismos que carecen de la metionina sintasa independiente de cobalamina (MetE), como el alga roja Porphyridium purpureum y el dinoflagelado Amphidinium operculatum. Croft et al. (2005) demostraron que el dinoflagelado obtuvo exclusivamente la vitamina de bacterias pertenecientes al género Halomonas asociadas a ellos. Para confirmar si la bacteria era la responsable de suministrar B12, fue inoculada nuevamente a los cultivos de Porphyridium purpureum y Amphidinium operculatum. Los resultados para ambos casos fueron positivos. Debido a que el medio de estos co-cultivos no contenía una fuente de carbono orgánico, se presume que las bacterias usaban los productos de la fotosíntesis de algas para crecer. Una indicación adicional de la relación íntima se obtuvo cuando Halomonas sp. se cultivó en un medio con presencia y ausencia de fucoidina, un extracto de algas. El extracto aumentó la tasa de crecimiento bacteriano, y al mismo tiempo aumentó significativamente la cantidad de vitamina B12 producida.

La transducción de señales es otra forma de interacción entre algas y bacterias. En este caso, los productos químicos utilizados para sus interacciones no sirven como nutrientes sino que activan o inhiben la expresión génica y/o las actividades fisiológicas, modificando así su comportamiento y crecimiento. La transducción de señales entre las algas y las bacterias se clasifica como “Señalización Interkingdom” (Kouzuma y Watanabe, 2015). La capacidad de muchas bacterias marinas para secretar autoinductores y de diatomeas para sintetizar y secretar moléculas como las feromonas, con funcionalidades similares, sugiere que estos tipos de compuestos podrían funcionar como señales bidireccionales entre las

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diatomeas y las bacterias (Amin et al., 2012). Las microalgas pueden interferir con la detección del quorum bacteriano, produciendo compuestos que pueden obstaculizar los receptores de señal bacterianos y/o los reguladores de respuesta (Natrah et al., 2011a). Lumicromo, un derivado de la vitamina B2 (riboflavina) es producido por Chlamydomonas reinhardtii y tiene una actividad estimulante de detección de quorum (Teplitski et al., 2004; Rajamani et al., 2008). Por el contrario, Natrah et al. (2011b) informaron que la microalga Chlorella saccharophila y cinco microalgas marinas produjeron actividad inhibidora de detección de quorum; sin embargo, los compuestos activos aún no han sido identificados. En condiciones de estrés, el óxido nítrico liberado por las diatomeas a la ficósfera puede atraer bacterias carroñeras que detectan este óxido y atacan las células estresadas o moribundas; en condiciones sin estrés, el óxido nitrico liberado puede actuar como una señal para las bacterias sinérgicas (Amin et al., 2012).

V.3. Bacterias cultivables asociadas a microalgas

Schwenk et al. (2014) obtuvieron 40 colonias aisladas a partir de los cultivos de microalgas de Chlorella pyrenoidosa, Scenedesmus obliquus, Isochrysis sp., y Nitzschia microcephala (10 de cada cepa), todas las colonias aisladas resultaron Gram negativas y fueron identificadas mediante análisis de secuencias del gen 16S rRNA y agrupadas en cuatro familias. En los cultivos de las microalgas Chlorella pyrenoidosa, Scenedesmus obliquus y Nitzschia microcephala, las familias de bacterias identificadas fueron Rhodobacteriaceae y Rhizobacteriaceae. En el cultivo de la microalga Isochrysis sp., las principales familias de bacterias aisladas fueron Rhodobacteriaceae, Erythrobacteriaceae y en menor prevalencia Flavobacteraceae y Flexibacteraceae.

Las bacterias encontradas en Nitzschia microcephala: Loktanella sp. y Agrobacterium sp., en Isochrysis sp: Flexibacter sp., Rhodobacteraceae bacterium JAMALO110, Seohaeicola saemankumensis SD-15, Roseobacter sp. y Erythromicrobium sp. B04. En Chlorella pyrenoidosa: Agrobacterium vitis M63038 y Loktanella vestfoldensis IMCC6033. En Scenedesmus obliquus: Agrobacterium vitis M63038, Rhizobium sp. W7 y Loktanella vestfoldensis IMCC6033.

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Para identificar la microbiota presente en los cultivos de las microalgas: Chaetoceros ceratosporum, Chaetoceros muelleri, Thalassiosira sp., Thalassiosira weisflogii, Amphora sp., Navicula sp. y Tetraselmis suecica, Hernández-Zulueta et al. (2011) aislaron un total de 70 bacterias. En todos los cultivos de microalgas se encontró una gran cantidad del género Bacillus, lo cual, explican los autores, podría deberse a que estas bacterias forman esporas y dicha estructura les brinda una mayor capacidad de adaptarse. Sugieren, además, que existe una microbiota específica para cada especie de microalga; por ejemplo, la microbiota del cultivo de Chaetoceros muelleri está conformada por siete géneros: Aeromonas, Bacillus, Burkholderia, Micrococcus, Pasteurella, Pseudomonas y Staphylococcus; mientras que el cultivo de Chaetoceros ceratosporum, sólo consta de tres: Aeromonas, Bacillus y Moraxella; siendo las dos microalgas del mismo género, la única bacteria que comparten es Bacillus subtilis. Estos resultados son similares a los de Suminto e Hirayama (1996), quienes aislaron las bacterias presentes en un cultivo de Chaetoceros gracilis y obtuvieron los géneros Flavobacterium, Coryneform, Alteromonas, Micrococcus, Vibrio, Moraxella y Bacillus. Estos últimos resultados, a su vez, concuerdan con los alcanzados por Riquelme et al. (1988); Fukami et al. (1997), y Avendaño-Herrera y Riquelme (1999), quienes observaron que las bacterias Flavobacterium sp., Pseudomonas sp. y Xanthomona sp. son promotoras de crecimiento de algunas microalgas, como Isochrysis galbana, Asterionella gracilis, Oscillatoria sp. y Nitzschia sp. Por el contrario, Sakata (1990); Imai et al. (1991) y Fukami et al. (1992) demostraron que bacteria Flavobacterium sp. 5N-3, además de Cytophaga sp.y Saprospira sp., presentaron actividad alguicida ante Isochrysis sp., Chaetoceros sp., Chattonella antiqua y Chattonella marina.

V.4. Cultivos de microalgas con bacterias

Suminto e Hirayama (1996), aislaron 12 cepas (7 géneros diferentes) de los tanques de cultivo masivos de Chaetoceros gracilis y evaluaron su inoculación en el cultivo axénico de la ditaomea. Cepas del género Moraxella, Alteromonas y Micrococcus no tuvieron efecto aparente y la adición de las cepas de Corineformes, Moraxella, Bacillus, Vibrio y Micrococcus afectó negativamente el cultivo. Únicamente la cepa Flavobacterium DN-10 promovió fuertemente el crecimiento de la diatomea, con una tasa de crecimiento 2.8 veces

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mayor, respecto a los cultivos control. En estudios posteriores, los mismos autores probaron la cepa de Flavobacterium en cultivos de Isochrysis galbana, Pavlova lutheri y nuevamente Chaetoceros gracilis; sin embargo, la bacteria no tuvo un claro efecto promotor en las dos primeras microalgas (Suminto e Hirayama, 1997).

Por otro lado, con respecto al cultivo de Isochrysis galbana, Parhuayo (2015) evaluó la capacidad inhibitoria de esta microalga sobre Vibrio furnisii, el cual es reportado como un patógeno en acuicultura. En el experimento se comprobó que la adición de Vibrio furnisii, incrementó ligeramente el crecimiento de la microalga Isochrysis galbana, obteniéndose una densidad celular máxima de 3.57 x107 células/ml contra 1.41 x107 células/ml del cultivo axénico. Otro experimento (Planas et al, 2015) muestra el efecto que tuvieron siete cepas de bacterias ácido lácticas de origen terreste, sobre el cultivo de Isochrysis galbana, todas las bacterias mejoraron la tasa de crecimiento en un volumen de 100 ml, siendo las mejores Leuconostoc mesenteroides spp. mesenteroides y Pediococcus acidilactici. A continuación se probaron estas dos bacterias en un volumen de 4L, se separaron en dos grupos, con y sin nutrientes. En el grupo con nutrientes se obtuvieron 40 y 16% mayor densidad con la inoculación de cepas, respecto al control. En el grupo sin nutrientes, las densidades de Isochrysis galbana con inoculación de las bacterias fueron 3 veces más altas que el control.

Ahamed et al. (2015) aislaron cinco cepas bacterianas del cultivo de Pavlova viridis, para luego inocularlas y probar su efecto. El crecimiento de la microalga aumentó aproximadamente dos veces en comparación al control gracias a la inoculación de Citrobacter freundii y entre 0.5 y 1.5 veces para los cultivos con Kocuria marina, Staphylococcus cohnii, Micrococcus yunnanensis y Staphylococcus haemolyticus.

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VI. MATERIALES Y MÉTODOS VI.1. Lugar de Ejecución

El presente trabajo de investigación se desarrolló en el laboratorio de microalgas de la empresa Reproducción y Comercialización of Scallops Company S.A.C., ubicado en Sechura, Piura y en el laboratorio de Incabiotec S.A.C., ubicado en la región de Tumbes. Siendo uno de los componentes del proyecto Innovate PITEI-2-P-200-071-14: “Desarrollo de un paquete tecnológico para el abastecimiento de semillas de concha de abanico (Argopecten purpuratus) mediante el uso de bacterias nativas probióticas”.

VI.2. Materiales

VI.2.1. Material biológico

La materia prima empleada, fueron las microalgas Isochrysis galbana y Chaetoceros gracilis, utilizadas como parte de una producción comercial destinadas a alimentar cultivos larvarios de Argopecten purpuratus de la empresa Reproducción y Comercialización of Scallops Company S.A.C. Dichas microalgas fueron obtenidas del IMARPE (Instituto del Mar del Perú).

VI.2.2. Materiales de laboratorio - Placas Petri - Tubos de ensayo - Pipetas Pasteur - Probeta - Micropipetas digitales de 0.5-10, 20-200, 100-1000 ul

- Puntas con filtro de 0.5-10, 20-200, 100-1000 ul - Asas de Kolle - Espátula de Drigalsky - Tubos Eppendorf de 0.2 y 1.5 ml - Tubos Falcon de 15 y 50 ml - Matraces Erlenmeyer de 500 ml y 2 L - Gradillas par tubos de 0.2 ml y 1.5 ml - Porta pipetas

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VI.2.3. Reactivos Químicos - Triptona Soja Agar (Scharlau) - Triptona Soja Broth (Scharlau)

- Cloruro de Sodio (Panreac Applichem) - Kit para tinción de Gram (Chemical) - Kit de extracción de ADN (Incabiotec

SAC)

- Kit de PCR (Incabiotec SAC) - Primers 27F, 1492R, 518F y 800R - Agarosa (Cleaver)

- TAE (Tris, Ácido acético glaciar, EDTA)

- Azul de Bromofenol 6X-Promega - Bromuro de etidio (Gen Lab)

- Agua destilada (Purísima) - Nitrato de sodio

- Fosfato de sodio - Metasilicato - Cloruro férrico

- Vitaminas: Biotina, Tiamina, Cianocobalamina

- Metales traza: Molibdato de sodio, Sulfato de cobre, Sulfato de zinc, Cloruro de cobalto, Cloruro de manganeso

- Glicerol - Alcohol 96°

VI.2.4. Equipos

- Refrigeradora -20 °C - Balanza analítica digital - Baño María - Microscopio óptico - Microscopio digital - Espectrofotómetro - Centrífuga - Centrífuga refrigerada - Agitador Vortex - Cámara electroforética - Termociclador - Trasiluminador - Cámara de flujo - Autoclave - Bomba de vacío - Cámara de Neubauer

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25 VI.3. Metodología

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Figura 3: Esquema de la evaluación del crecimiento de microalgas. El color amarillo representa la microalga Isochrysis galbana y el color naranja la microalga Chaetoceros gracilis.

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VI.3.1. Aislamiento de bacterias cultivables

El cultivo de microalgas se realizó en tubos de ensayo con 9 ml del medio de cultivo Guillard F/2 y 1 ml de cada una de las cepas, Isochrysis galbana y Chaetoceros gracilis, por separado. Para el óptimo crecimiento, los tubos se mantuvieron a 18 °C y con una luz artificial fluorescente de 40 watts.

Se prepararon placas Petri con Triptona Soja Agar (TSA) con 2% de sal. Se realizaron tres diluciones del cultivo de microalgas y se sembraron por esparcido 20 µl de cada una de las cepas en cada placa, por duplicado. Se dejaron crecer las bacterias en una incubadora a 37°C por 24 horas. Se observaron las colonias y se seleccionaron según sus diferencias morfológicas. Cada colonia fue transferida a una nueva placa con TSA y 2% de sal, sembradas por el método de rayado en placa. Este procedimiento se repitió hasta obtener cepas puras. Una vez terminada la purificación, se sembraron las colonias de bacterias en medio líquido, Triptona Soja Broth (TSB) y se dejaron crecer por 24 horas. Una vez crecidas, se realizó una tinción de Gram para determinar si eran Gram positivas o Gram negativas y para corroborar si las cepas estaban realmente puras. Se prepararon duplicados de cada bacteria pura en TSB con 10% de glicerol y se guardaron a -20°C para su posterior uso.

VI.3.2. Extracción de ADN bacteriano

Se tomó 1 ml de cada cepa pura y se centrifugó para obtener el ADN del cultivo bacteriano. El buffer de lisis utilizado fue la solución CTAB (Tris HCl 100mM pH 8, NaCl 1.4 M, EDTA 20 mM, CTAB 2 %), complementado con proteinasa K (0.2 mmol/mL). Luego se realizó el tratamiento con RNAasa (0.4 mg/mL) a 55 °C por 10 minutos. El proceso de purificación fue con fenol, cloroformo y alcohol isoamílico en una proporción de 25:24:1, respectivamente. Para el paso de la precipitación de ADN se utilizó etanol al 96% con un lavado posterior en etanol al 75 %. Finalmente, el pellet de ADN fue resuspendido en 30 µl de TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM) y conservado a -20 °C. (Modificado de Wilson, 2001).

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VI.3.3. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)

Al ADN extraído se le aplicó la técnica de PCR, dirigida al gen 16S ARNr. Para esta prueba se utilizaron 20 pmol de los iniciadores universales 27F (5'- AGAGTTTAGTCMTGGCTCAG-3) - 1492R (GGYTACCTTGTTACGACTT) que generan amplicones de un tamaño esperado de 1500 pb. El mix de PCR utilizado, con un volumen final de 25 μL, consistió en 2.5 μL buffer 10 X, 2.5 μL de MgCl2 25 mM, 0.6 μL

de dNTP 10 mM y 2 U de Taq DNA polymerase (Thermo scientific) y agua ultra pura. Las condiciones utilizadas para la PCR fueron, una temperatura inicial de 94°C por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, una temperatura de hibridación de 58°C por 45 segundos, una temperatura de elongación de 72°C por 1 minuto y 30 segundos y una elongación final de 72°C por 6 minutos. (Innis et al., 1999). Se guardaron los amplicones a -20°C.

Además de las muestras de ADN bacteriano, se colocaron, un control de extracción, un control de PCR y un control positivo, para asegurar que las pruebas se realizaron correctamente.

VI.3.4. Electroforesis

Para observar los resultados de la amplificación por PCR, se utilizó la técnica de electroforesis horizontal. Se preparó un gel de agarosa al 1.5% de concentración, añadiendo 3µl de bromuro de etidio para 60ml del gel. Por cada pocillo en el gel se colocó 8µl de la muestra (amplicones de PCR diluídos 1:20) y 2µl de tampón de depósito. Se migraron los amplicones a un voltaje de 70 voltios por 30 minutos. Se observó el resultado en el transluminador (Fierro, 2014).

VI.3.5. Preparación de las bacterias

Se reactivaron los 10 cultivos bacterianos guardados en TSB con glicerol a -20°C y se dejaron crecer por 24 horas a 37°C. Se tomó 1 ml del cultivo de cada bacteria y se

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centrifugó a 12 000 g por un periodo de 10 minutos, se retiró el sobrenadante para eliminar el caldo TSB que podría interferir en el cultivo de microalgas y se resuspendió en agua de mar estéril a 30 ppt. La resuspensión se mantuvo refrigerada por 48 h. Se midió el OD y se hicieron los cálculos respectivos para obtener 8 x 104 cel/ml de cada bacteria en el volumen final correspondiente. Para esto se asumió que 1 OD = 8 x 108 cel/ml. (https://www.genomics.agilent.com/biocalculators/calcODBacterial.jsp)

VI.3.6. Evaluación del crecimiento de microalgas

Se evaluó el crecimiento del cultivo de ambas microalgas en presencia de cada una de las 10 cepas bacterianas resuspendidas, durante cinco etapas. Las pruebas se realizaron por triplicado (con excepción de la etapa 4, donde fue sextuplicado) y con las mismas condiciones de salinidad (30 ppt), luz (40 watts) y temperatura (18°C). Se tomaron muestras diarias con pipetas Pasteur de vidrio estéril y se contaron las células de microalgas con una cámara de Neubauer, en un microscopio.

Etapa 1: El cultivo se realizó en un volumen de 10 ml, inoculando las 10 bacterias por separado en cada una de las dos microalgas. Las densidades iniciales de la microalgas fueron 2.5 x 105 y 1.5 x 105 cel/ml para Isochrysis galbana y Chaetoceros gracilis, respectivamente.

Etapa 2: Se eligieron los tratamientos con mejor crecimiento para cada una de las microalgas de la etapa 1 y se volvieron a probar en un volumen de 10 ml. Las densidades iniciales de la microalgas fueron 3 x 105 y 4 x 105 cel/ml para Isochrysis galbana y Chaetoceros gracilis, respectivamente.

Etapa 3: El cultivo se realizó en un volumen de 500 ml, con aireación constante, probándose las 10 bacterias por separado en cada una de las dos microalgas. Las densidades iniciales de la microalgas fueron 6 x 105 y 9 x 105 cel/ml para Isochrysis galbana y Chaetoceros gracilis, respectivamente.

Etapa 4: Se eligieron los tratamientos con mejor crecimiento de cada una de las microalgas en la etapa 3 y se probaron nuevamente en un volumen de 500 ml, con aireación constante.

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La densidad inicial para las dos microalgas fue 1 x 106 cel/ml. Esta etapa se realizó por sextuplicado, para poder continuar en la etapa 5. En esta etapa no se pudo registrar el conteo del día 1 para ninguna de las dos microalgas.

Etapa 5: Se traspasaron todos los matraces de la etapa 4 a un volumen de 2L, con una densidad inicial de 1 x 106 cel/ml, para cada microalga. Las 6 repeticiones de cada tratamiento, se separaron en dos grupos, al primer grupo no se le agregó nada y al segundo grupo se le inoculó 8 x 104 cel/ml más de la bacteria correspondiente (re-inoculación). El objetivo en esta etapa era comprobar si las bacterias inoculadas en la etapa 4 seguían mejorando el crecimiento luego del traspase o era necesario agregar más bacteria.

VI.3.7. Análisis Estadístico

Para evaluar el efecto del crecimiento de las microalgas en presencia de las bacterias seleccionadas se aplicó el análisis de varianza (ANOVA). En los experimentos donde se encontraron diferencias significativas, se aplicó la prueba de Tukey para comprobar cuál de los tratamientos era mejor. Se utilizó el programa R studio.

VI.3.8. Secuenciación y análisis

Se alicuotaron 15 µl de los amplicones pertenecientes a las cinco cepas bacterianas que mostraron diferencias significativas positivas en la producción de las microalgas, respecto al control. Se enviaron a secuenciar a MACROGEN USA. Las secuencias de ADN obtenidas fueron alineadas y comparadas con una base de datos, empleando el software online BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

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VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN VII.1. Aislamiento de las bacterias cultivables

Se aislaron y purificaron un total de 10 bacterias asociadas a los dos cultivos de microalgas, cuatro cepas bacterianas de la microalga Isochrysis galbana: I2, I3, I4, I5, y seis cepas de Chaetoceros gracilis: G1, G2, G3, G4, G6 y BM6. En el Cuadro 1 se describe la morfología de las colonias de cada una de las cepas y los resultados de la tinción de Gram se muestran en el Cuadro 2.

Cuadro 1: Morfología de las colonias de bacterias cultivables aisladas de Isochrysis galbana y Chaetoceros gracilis.

BACTERIA MORFOLOGÍA DE LA COLONIA I2 Mediana, redonda, rosada I3 Pequeña, redonda, crema I4 Mediana, redonda, crema I5 Pequeña, redonda, blanca G1 Pequeña, redonda, transparente G2 Mediana, redonda, crema G3 Pequeña, redonda, transparente G4 Pequeña, redonda, blanca G6 Mediana, redonda, rosada BM6 Grande, redonda, crema

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Cuadro 2. Tinción de Gram de las bacterias cultivables aisladas de Isochrysis galbana y Chaetoceros gracilis.

BACTERIA TINCIÓN DE GRAM

I2 Cocos grandes Gram negativo I3 Cocobacilos Gram negativo I4 Cocobacilos Gram positivo I5 Cocobacilos Gram negativo G1 Cocobacilos Gram negativo G2 Cocos agrupados Gram negativo

G3 Bacilos Gram negativo

G4 Cocobacilos Gram positivo G6 Cocos grandes Gram positivo

BM6 Bacilos Gram positivo

VII.2. Preparación de las bacterias

En evaluaciones preliminares a los resultados presentados en esta tesis, las bacterias eran inoculadas directamente con su medio de cultivo (TSB). Sin embargo, al ser las diferencias de crecimiento con los controles no significativas, se optó por centrifugar los cultivos bacterianos, eliminando el medio TSB, para luego resuspender las bacterias en agua de mar estéril (Planas et al., 2015), descartando así la posibilidad de que otras bacterias puedan beneficiarse con la adición del TSB al medio de cultivo.

VII.3. Evaluación del crecimiento de microalgas Etapa 1 y 2

Para la etapa 1 con Isochrysis galbana, fueron las cepas bacterianas I3, I4, I5, G6 y BM6 las que tuvieron entre 25% y 40% de mayor crecimiento que el cultivo control, en el tercer día (Cuadro 3). Al probar nuevamente esas 5 bacterias en la etapa 2, la I4 y la G6 mostraron el mayor porcentaje de crecimiento, con 36 y 34%, respectivamente (Cuadro 4).

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Cuadro 3: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Isochrysis galbana en la etapa 1 (Los cuadros sombreados corresponden a resultados superiores al 15% con respecto al control).

Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Control 250,000 400,000 883,333 1,533,333 1,783,333 I2 250,000 516,667 983,333 1,533,333 2,133,333 I3 250,000 516,667 1,050,000 2,016,667 2,133,333 I4 250,000 450,000 1,000,000 1,933,333 2,000,000 I5 250,000 400,000 933,333 2,050,000 2,116,667 G1 250,000 333,333 1,233,333 1,900,000 2,116,667 G2 250,000 300,000 1,250,000 1,866,667 2,016,667 G3 250,000 583,333 1,300,000 1,816,667 2,000,000 G4 250,000 400,000 1,033,333 1,583,333 1,850,000 G6 250,000 550,000 1,200,000 2,133,333 2,150,000 BM6 250,000 366,667 1,183,333 2,150,000 2,200,000

Cuadro 4: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Isochrysis galbana en la etapa 2 (Los cuadros sombreados corresponden a resultados superiores al 15% con respecto al control).

Día 0 Día 1 Día 2 Día 3

Control 300,000 516,667 1,466,667 1,783,333 I3 300,000 400,000 1,216,667 1,833,333 I4 300,000 416,667 1,350,000 2,416,667 I5 300,000 450,000 983,333 1,883,333 G6 300,000 366,667 933,333 2,383,333 BM6 300,000 466,667 1,050,000 2,016,667

Para Chaetoceros gracilis, en la etapa 1, el mayor aumento se mostró en el segundo día, con la inoculación de las bacterias G3 (51%), G4 (42%), I3 (39%) y G2 (36%) (Cuadro 5). En la etapa 2 para esta microalga, no hubo mucha diferencia positiva en el crecimiento de los tratamientos respecto al control (Cuadro 6).

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Cuadro 5: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Chaetoceros gracilis en la etapa 1 (Los cuadros sombreados corresponden a resultados superiores al 15% con respecto al control).

Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Control 150,000 833,333 1,283,333 1,800,000 2,000,000 I2 150,000 516,667 1,200,000 1,950,000 2,033,333 I3 150,000 1,016,667 1,783,333 1,850,000 1,600,000 I4 150,000 750,000 1,700,000 1,750,000 1,900,000 I5 150,000 1,200,000 1,500,000 1,733,333 1,666,667 G1 150,000 1,083,333 1,316,667 1,500,000 1,800,000 G2 150,000 633,333 1,750,000 1,583,333 2,150,000 G3 150,000 1,600,000 1,933,333 1,900,000 1,983,333 G4 150,000 583,333 1,816,667 2,033,333 2,450,000 G6 150,000 483,333 1,400,000 1,833,333 1,633,333 BM6 150,000 783,333 1,033,333 1,350,000 1,516,667

Cuadro 6: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Chaetoceros gracilis en la etapa 2 (Los cuadros sombreados corresponden a resultados superiores al 15% con respecto al control).

Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Control 400,000 850,000 2,633,333 3,050,000

G2 400,000 1,000,000 2,450,000 3,066,667 G3 400,000 1,200,000 2,483,333 3,250,000 G4 400,000 816,667 2,550,000 3,000,000 BM6 400,000 1,150,000 2,333,333 2,300,000

Luego de estos primeros resultados, se prosiguió a probar nuevamente las mismas bacterias en ambas microalgas, pero esta vez en mayor volumen (500 ml) y con aireación constante, comprobando que los resultados seguían una tendencia similar respecto a las primeras etapas.

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Etapa 3 y 4

Isochrysis galbana tuvo un aumento del 31% con la inoculación de la bacteria BM6 y 18% con I4, en el día 3 de la tercera etapa (Cuadro 7). En la etapa 4, se probaron las dos bacterias nuevamente, consiguiendo un 38% y 30% de crecimiento con I4 y BM6, respectivamente, al tercer día de cultivo (Cuadro 8).

Cuadro 7: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Isochrysis galbana en la etapa 3 (Los cuadros sombreados corresponden a resultados superiores al 15% con respecto al control).

Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4

Control 600,000 1,200,000 2,333,333 3,550,000 6,983,333 I2 600,000 1,083,333 2,400,000 3,000,000 5,416,667 I3 600,000 683,333 1,516,667 4,066,667 5,800,000 I4 600,000 1,250,000 2,283,333 4,200,000 6,650,000 I5 600,000 1,116,667 2,433,333 3,783,333 4,600,000 G1 600,000 766,667 1,833,333 3,133,333 4,783,333 G2 600,000 916,667 1,550,000 2,350,000 3,083,333 G3 600,000 833,333 1,700,000 2,516,667 3,616,667 G4 600,000 866,667 2,433,333 4,016,667 5,350,000 G6 600,000 666,667 2,033,333 3,383,333 4,583,333 BM6 600,000 1,016,667 2,633,333 4,650,000 8,833,333

Cuadro 8: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Isochrysis galbana en la etapa 4 (Los cuadros sombreados corresponden a resultados superiores al 15% con respecto al control).

Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Control 1,000,000 - 3,150,000 6,233,333 8,850,000

I4 1,000,000 - 3,566,667 8,616,667 11,450,000 BM6 1,000,000 - 3,950,000 8,100,000 10,600,000 -: No se realizó conteo.

El cultivo de Chaetoceros gracilis alcanzó 48% más densidad respecto al control, con la adición de la cepa bacteriana G6, en el segundo día de la etapa 3. Mientras que el tratamiento con la bacteria G3 mostró un aumento del 34%, 32% y 31% entre los días 2 y 4. En el día 4, en el tratamiento con G4, se observó 33% mayor crecimiento (Cuadro 9). Al

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repetir los mejores tratamientos, en la etapa 4, las mayores diferencias se encontraron en el segundo día, G6 con 34% G4 25% y G3 24%, más que el tratamiento control (Cuadro 10). En la Figura 4 podemos observar el cultivo mixto de microalgas y bacterias.

Cuadro 9: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Chaetoceros gracilis en la etapa 3 (Los cuadros sombreados corresponden a resultados superiores al 15% con respecto al control).

Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Control 900,000 3,050,000 5,350,000 7,733,333 9,166,667 I2 900,000 3,066,667 5,833,333 7,916,667 11,066,667 I3 900,000 2,933,333 5,783,333 6,483,333 9,300,000 I4 900,000 2,650,000 6,050,000 8,000,000 9,216,667 I5 900,000 2,833,333 6,483,333 8,383,333 10,516,667 G1 900,000 2,716,667 6,350,000 7,433,333 8,700,000 G2 900,000 2,800,000 7,316,667 9,500,000 10,250,000 G3 900,000 2,116,667 7,166,667 10,200,000 12,033,333 G4 900,000 3,283,333 6,866,667 9,350,000 12,233,333 G6 900,000 3,233,333 7,900,000 8,983,333 10,700,000 BM6 900,000 3,066,667 6,200,000 7,750,000 9,616,667

Cuadro 10: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Chaetoceros gracilis en la etapa 4 (Los cuadros sombreados corresponden a resultados superiores al 15% con respecto al control).

Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Controlb 1,000,000 - 4,166,667 5,350,000 6,733,333

G3a 1,000,000 - 5,191,667 6,250,000 7,550,000 G4a 1,000,000 - 5,175,000 6,725,000 8,416,667 G6a 1,000,000 - 5,600,000 6,808,333 7,691,667 -: No se realizó conteo.

Las letras a y b representan la agrupación de la prueba de Tukey. Letras desiguales son estadísticamente diferentes (α=0.05).

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Figura 4: Cultivos mixtos de microalgas y bacterias. Observado con un microscopio digital PentaView LCD (Celestron) a 40X. A) Cultivo de Isochrysis galbana, inoculado con la bacteria BM6. B) Cultivo de Chaetoceros gracilis, inoculado con la bacteria G6.

Etapa 5

Los resultados de estas pruebas mostraron que, si bien podía mantenerse el efecto de mejora en algunos casos, el porcentaje de crecimiento era mayor cuando se realizaba una segunda inoculación. En el tratamiento con G4 observamos que, al tercer día, el crecimiento de Chaetoceros gracilis fue del 18% en el primer grupo (G4.1, sin nueva inoculación de bacteria) mientras que el segundo grupo (G4.2, con nueva inoculación de bacteria) alcanzó un 52% más respecto al control. Para los tratamientos con G3 los valores fueron de 20% y 47%, así mismo, para el tratamiento con G6 se obtuvo 26% y 47% (Cuadro 11). En la figura 5 podemos observar los matraces con los diferentes tratamientos en el último día de cultivo, de las etapa 4 y 5. Y en la figura 6, la curva de crecimiento correspondiente a ambas etapas.

Bacterias

Bacterias

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Cuadro 11: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Chaetoceros gracilis en la etapa 5 (Los cuadros sombreados corresponden a resultados superiores al 15% con respecto al control).

Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4

Controld 1,000,000 1,416,667 2,716,667 3,383,333 3,966,667 G3.1cd 1,000,000 1,383,333 2,900,000 4,066,667 4,450,000 G3.2abc 1,000,000 1,533,333 3,683,333 4,966,667 4,466,667 G4.1cd 1,000,000 1,583,333 2,850,000 3,983,333 4,250,000 G4.2a 1,000,000 1,866,667 3,733,333 5,150,000 4,933,333 G6.1bcd 1,000,000 1,583,333 3,333,333 4,266,667 4,200,000 G6.2ab 1,000,000 1,900,000 4,100,000 4,983,333 4,533,333 Grupo 1: Sin nueva inoculación de bacterias

Grupo 2: Con nueva inoculación de bacteria

Las letras a, b, c y d representan la agrupación de la prueba de Tukey. Letras desiguales son estadísticamente diferentes (α=0.05).

Figura 5: Cultivo de Chaetoceros gracilis. A) Etapa 4: Control, G3, G4 y G6. B) Etapa 5: G3.1, Control y G3.2. C) Etapa 5: G4.1, Control y G4.2. D) Etapa5: G6.1, Control y G6.2.

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Figura 6: Curva de crecimiento del cultivo de Chaetoceros gracilis en las etapas 4 y 5 (El día 1 de la etapa 4 no se realizó conteo).

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Para el caso de Isochrysis galbana (Cuadro 12), los resultados fueron similares, 17% y 45% en el tratamiento con la bacteria I4 y 14% y 31% con BM6, para el primer y segundo grupo, respectivamente. En las figuras 7 y 8 se presentan los matraces con los tratamientos realizados y la curva de crecimiento, respectivamente, para la etapa 5.

El crecimiento del cultivo de Isochrysis galbana ha sido estimulado anteriormente por bacterias acido lácticas de origen terrestre, las siete cepas probadas lograron incrementar la densidad, obteniendo hasta 40% más, respecto al control, con la cepa Leuconostoc mesenteroides spp. mesenteroides (Planas et al., 2015). Otra cepa con actividad promotora hacia Isochrysis galbana es Vibrio sp. C33, la cual fue aislada del agua de cultivo larval de Argopecten purpuratus, e inoculada en el cultivo axénico de la microalga, alcanzando 46% mayor densidad que la obtenida con el control (Avendaño y Riquelme, 1999).

Cuadro 12: Conteo diario de la densidad (en cel/ml) de Isochrysis galbana en la etapa 5 (Los cuadros sombreados corresponden a resultados superiores al 15% con respecto al control).

Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Controlc 1,000,000 2,100,000 3,750,000 5,900,000 8,150,000

I4.1bc 1,000,000 1,700,000 3,483,333 6,883,333 9,716,667 I4.2a 1,000,000 2,316,667 4,633,333 8,583,333 10,450,000 BM6.1bc 1,000,000 2,133,333 4,483,333 6,700,000 8,416,667

BM6.2a 1,000,000 2,183,333 4,800,000 7,700,000 8,766,667 Grupo 1: Sin nueva inoculación de bacterias

Grupo 2: Con nueva inoculación de bacteria

Las letras a, b y c representan la agrupación de la prueba de Tukey. Letras desiguales son estadísticamente diferentes (α=0.05).

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Figura 7: Cultivo de Isochrysis galbana. A) Etapa 5: Control, I4.1 e I4.2. B) Etapa 5: BM6.1, Control y BM6.2.

Figura 8: Curva de crecimiento del cultivo de Isochrysis galbana en la etapa 5.

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VII.4. Electroforesis en gel de agarosa

En la figura 9 podemos observar las bandas (fragmentos de ADN) correspondientes a cada uno de los amplicones, alineados en 1500 pb. No se observaron bandas en el control de extracción y el control negativo, con lo que se comprueba que la extracción y amplificación de ADN por PCR de las muestras fueron correctas.

Figura 9: Gel de electroforesis. CE: Control de extracción, C-: Control de PCR, C+: Control positivo, MP: Marcador de peso.

C -

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VII.5. Secuenciación y análisis

La caracterización molecular mediante el análisis del gen 16S ARNr, permitió identificar las cinco cepas que demostraron mejorar el crecimiento de las microalgas cuando fueron inoculadas; una cepa aislada de Isochrysis galbana (I4) y 4 provenientes de Chaetoceros gracilis (G3, G4, G6 y BM6). Las secuencias obtenidas fueron comparadas en el software BLAST (Anexo 1). Las secuencias de ADN de I4 y G4 mostraron 99% de identidad con dos cepas de Lysinibacillus fusiformis (KY910256.1 y MG650805.1). Mientras que las cepas G3, G6 y BM6 obtuvieron un 99%, 100% y 100% de identidad con Psychrobacter celer (KP640590.1), Staphylococcus saprophyticus (MF776606.1) y Bacillus cereus (CP023245.1), respectivamente. Sólo se tomará en cuenta a nivel de especie aquellas secuencias que obtuvieron 100% de identidad.

Se aislaron dos cepas de Lysinibacillus sp., I4 fue hallada en Isochrysis galbana y G4 en Chaetoceros gracilis. A pesar de pertenecer al mismo género, cada cepa sólo tuvo un efecto promotor del crecimiento en la microalga original a la que fue asociada y no para la otra, lo que confirma que las relaciones entre microalga y bacteria son específicas (Amin et al., 2012; Fukami et al., 1997; Hernández-Zuloeta et al., 2011; Kouzuma y Watanabe, 2015). Debido a esta alta especificidad microalga-bacteria, es poco probable que las bacterias aisladas en este trabajo promuevan el crecimiento de otras microalgas, como lo demostraron experimentalmente Suminto e Hirayama (1996), quienes aislaron una cepa de Flavobacterium sp. a partir de un tanque de cultivo masivo de Chaetoceros gracilis, la cual mostró un efecto positivo únicamente sobre el crecimiento de cultivos axénicos de Chaetoceros gracilis, pero no de las flageladas Isochrysis galbana y Pavlova lutheri (Suminto e Hirayama, 1997).

La cepa Psychrobacter sp., aislada de Chaetoceros gracilis, pertenece a la familia γ-Proteobacteria, este resultado concuerda con un análisis de las interacciones entre diatomeas y bacterias (Amin et al., 2012), el cual sugiere que existen dos filos observados constantemente: Bacteroidetes y Proteobacteria, particularmente las clases α-Proteobacteria y γ -Proteobacteria. Así mismo, un meta análisis de bacterias asociadas a 40 micro y macroalgas, encontró que las cepas aisladas se distribuyeron entre seis filos: Bacteroidetes (42 géneros), Proteobacteria (32), Firmicutes (7), Actinobacteria (8),

(42)

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Verrucomicrobia (3) y Planctomicetos (1) (Goecke et al., 2013). Las cepas Lysinibacillus sp., Staphylococcus saprophyticus y Bacillus cereus, aisladas de la diatomea, pertenecen al filo Firmicutes, también mencionado en dicho estudio.

Hernández-Zuloeta et al. (2011) encontraron Bacillus cereus presente en cultivos de Thalassiosira sp., Tetraselmis suecica, Navicula sp., Amphora sp. y Chaetoceros muelleri, más no en Chaetoceros ceratosporum. También fue encontrado en Navicula germanopolonica (Hernández-Zuloeta, 2014), los autores afirman que es común encontrar el género Bacillus asociado a los cultivos de microalgas, ya que estas bacterias son formadoras de esporas, lo que les otorga una gran capacidad de adaptación. Sin embargo, esto no quiere decir que todas las cepas de dicho género mejoren el crecimiento en las microalgas, Suminto e Hirayama (1996) aislaron dos cepas de Bacillus sp. del cultivo masivo de Chaetoceros gracilis pero ninguna de las dos promovió el crecimiento cuando fueron inoculadas en el cultivo axénico, por el contrario, tuvieron un efecto negativo. Varios estudios han demostrado que las interacciones entre microalgas y bacterias pueden favorecer el crecimiento de la microalga debido al intercambio de nutrientes entre ambas, como vitaminas, además las bacterias convierten los nutrientes en formas más biodisponibles para que las microalgas puedan asimilarlas, como el nitrógeno o el hierro; en reciprocidad, las algas les proporcionan carbono orgánico disuelto, como parte de las sustancias orgánicas que excretan en la fotosíntesis (Amin et al., 2012; Croft et al., 2005; Foster et al., 2011; Fuentes et al., 2016; Kouzuma y Watanabe, 2015; Lupette et al., 2016; Natrah, 2014; Ramanam et al., 2016). En un estudio posterior se debería analizar cuál es la interacción específica entre las microalgas y bacterias estudiadas. Para llegar a entender la naturaleza de estas interacciones, se debería aplicar herramientas como la genómica: estudio de la información genética contenida en un organismo, a través de la detección e identificación de genes de interés implicados en las interacciones; la proteómica: estudio y caracterización de todo el conjunto de proteínas expresadas de un genoma (proteoma) o metabolómica: estudio de los metabolitos (moléculas pequeñas como hormonas, toxinas, etc.) producidos en una célula, tejido, u organismo que son producto de los procesos celulares.

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Este estudio se revela muy importante si consideramos que los resultados “positivos” presentados en esta tesis fueron obtenidos a partir de cultivos bacterianos incubados en solución salina por varios días en contraste a experimentaciones previas donde la inoculación se realizaba directamente después de la resuspensión de las cepas bacterianas. Esta importante diferencia podría deberse a los metabolitos excretados por las bacterias, los cuales quedarían en el medio que se descarta. Justamente, Ahamed et al (2015) evaluaron el crecimiento de la microalga flagelada Pavlova viridis, cultivada con una bacteria probiótica o con su filtrado libre de bacterias, es decir utilizaron el sobrenadante luego de centrifugar las bacterias, en el cual estarían presentes los metabolitos producidos. El tratamiento con el filtrado libre de bacteria obtuvo el doble de crecimiento, respecto al control, resaltando la importancia de los metabolitos bacterianos. En un estudio posterior se debería evaluar el efecto del sobrenadante sobre los cultivos de microalgas, y de los diferentes parámetros que controlan su producción.

VII.6. Análisis estadístico

Los resultados mostrados en este estudio corresponden al promedio de números de células/ml obtenidos a partir de triplicados. Si bien estos promedios son en muchos casos alentadores con ganancias que oscilan del 30 al 50% en comparación con los controles, los análisis estadísticos generales indican que los tratamientos no son significativamente diferentes al control en las primeras etapas del cultivo debido a las importantes fluctuaciones observadas intra-triplicados. En todo caso, estas tendencias de incremento del crecimiento sirvieron para seleccionar a cada paso las mejores cepas bacterianas que fueron utilizadas en los experimentos finales.

En los experimentos con Chaetoceros gracilis, en la etapa 4, los tratamientos con las bacterias G3, G4, G6 (Psychrobacter sp., Lysinibacillus sp. y Staphylococcus saprophyticus) resultaron estadísticamente diferentes al control (α=0.05) de forma positiva, pero sin diferencias entre sí, lo que quiere decir que los tres tratamientos mejoraron por igual el crecimiento del cultivo de microalgas, respecto al control (Figura 10A). En la etapa 5, el grupo que recibió una nueva dosis de las bacterias G3, G4, G6, fue el que se diferenció

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del control, sin tener diferencias entre dichos tratamientos, más sí con los del grupo que no recibió la nueva inoculación (Figura 10B).

A)

B)

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En los experimentos con Isochrysis galbana, sólo la etapa 5 muestra resultados que difieren estadísticamente del control (α=0.05), al igual que con Chaetoceros gracilis, los tratamientos del grupo que tuvo una nueva inoculación de las bacterias fueron los que lograron mejorar el crecimiento significativamente, en este caso las bacterias I4 y BM6 (Lysinibacillus sp. y Bacillus cereus) fueron con las que se obtuvieron mejores resultados (Figura 11).

Figura 11: Análisis estadístico del cultivo de Isochrysis galbana, etapa 5.

La estrategia de re-inoculación aplicada en este estudio demostró entonces ser muy beneficiosa, multiplicando por 2 la ganancia obtenida sin re-inoculación frente al control. Este fenómeno podría deberse a que a temperaturas de 18-20°C, las microalgas se multiplican más eficientemente que las bacterias, limitando así el efecto probiótico en el tiempo. La aplicación de una dosis inicial de bacterias más elevada debería ser evaluada, sin embargo es importante recordar que las asociaciones bacterias - microalgas reposan sobre un equilibro y que se ha reportado que bacterias probióticas se vuelven alguicidas cuando su concentración es mayor a 106 cel/ml (Fukami et al., 1992).

Un interesante complemento a este estudio residiría en el seguimiento por metagenómica (estudio de la información genética que está contenida en todos los microorganismos que se encuentran en una comunidad o muestra ambiental) de las evoluciones de las poblaciones

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