Vanda Isabel Roldão
Canelas Vaz Serra
Novos derivados porfirínicos: síntese e potenciais
aplicações na detecção de neoplasias
Vanda Isabel Roldão
Canelas Vaz Serra
Novos derivados porfirínicos: síntese e potenciais
aplicações na detecção de neoplasias
dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Química de Produtos Naturais, realizada sob a orientação científica do Professor Doutor José Abrunheiro da Silva Cavaleiro, Professor Catedrático do Departamento de Química da Universidade de Aveiro e da Professora Doutora Maria do Amparo Ferreira Faustino, Professora Auxiliar do Departamento de Química da
o júri
presidente Prof. Dr. Artur Manuel Soares da Silva
Professor Catedrático da Universidade de Aveiro
Prof. Dr. José Abrunheiro da Silva Cavaleiro
Professor Catedrático da Universidade de Aveiro
Prof. Dr. Alice Maria Esteves Dias
Professora Auxiliar da Escola de Ciências da Universidade do Minho
Prof. Dr. Maria do Amparo Ferreira Faustino
agradecimentos Desejo expressar os mais sinceros agradecimentos a todos os que contribuiram para o desenvolvimento deste trabalho:
Aos meus orientadores: Professor Doutor José Abrunheiro da Silva Cavaleiro, e Doutora Maria do Amparo Faustino, por me terem permitido a entrada no doce mundo da Química Orgânica e por todo o acompanhamento e conhecimento científico transmitido ao longo destes dois últimos anos. À Professora Doutora Graça Neves para a qual não existem palavras que descrevam toda a dedicação, apoio, incentivo e amizade concedida. Muito obrigado por me ajudar a “crescer”.
Ao Professor Doutor Artur Silva pela sua constante disponibilidade, paciência e boa disposição, a qualquer hora do dia, na tão preciosa ajuda na interpretação os espectros de RMN.
À Doutora Diana Pinto, pela prontidão com que “me arranjava mais uma calconazita!”
À Doutora Rosarinho, pelo apoio e persistência na análise dos espectros de massa.
Ao Dr. Hilário Tavares e à Drª Cristina Barros, técnicos responsáveis pela espectroscopia de RMN e espectrometria de massa, pela colaboração prestada.
À Sandra e à Fátima agradeço a estreita colaboração neste projecto, nomeadamente na realização dos estudos de avaliação biológica.
À Eduarda e à Mafalda , as minhas “companheiras de guerra”, pelas horas de estudo passadas, que marcaram o início de uma grande amizade. Nunca vos esquecerei.
À Joana e à Maria pela incansável amizade em todos os momentos difíceis. Às restantes “pombas-brancas” do laboratório Francesca, Cristina, Guida e João Tomé e aos mais recentes “brasileirinhos” Anderson e Rodrigo, por tudo. Aos meus pais e irmão por toda a confiança “Calma e cabecinha no lugar...” Ao Paulo pelo carinho, confiança, apoio incondicional e paciência infinita. À Universidade de Aveiro e ao Departamento de Química por me terem proporcionado as condições necessárias para o desenvolvimento deste trabalho. Ao projecto “CTS-17”, agradeço a bolsa de investigação científica concedida.
palavras-chave Porfirinas, flavonóides, aminoácidos, fotodiagnóstico, neoplasias.
resumo O trabalho descrito nesta dissertação envolveu a síntese, caracterização estrutural e avaliação biológica de novos macrociclos porfirínicos com potencial aplicação em fotodiagnóstico de neoplasias.
Na primeira parte da dissertação, são abordadas as reacções que envolvem a funcionalização de meso-tetra-arilporfirinas, nas posições meso e β-pirrólicas, com moléculas de flavonóides.
Alguns dos compostos sintetizados foram sujeitos a estudos de fotoestabilidade e avaliação biológica, nomeadamente citotoxicidade, localização e acumulação celular. Os resultados obtidos mostram que estes derivados além de fotoestáveis e fluorescentes apresentam acumulação celular e não são citotóxicos, e por isso poderão ser moléculas promissoras no fotodiagnóstico/diagnóstico de tecidos neoplásicos.
Na segunda parte desta dissertação é descrita a síntese de novos derivados porfirínicos acoplados a aminoácidos.
A estrutura dos compostos sintetizados foi estabelecida com recurso a técnicas espectroscópicas actuais nomeadamente ressonância magnética nuclear (RMN de 1H, 13C, 19F, COSY, HSQC e HMBC) e espectrometria de
massa em FAB+ e UV-Vis. Os conjugados de tipo porfirina-aminoácido foram também caracterizados por espectrometria de massa em Electrospray.
keywords Porphyrins, flavonoids, amino acids, photodiagnosis, neoplastic diseases.
abstract The work reported in this thesis involves the synthesis, structural
characterization and biological evaluation of new porphyrin derivatives with potencial application in the diagnosis of neoplastic diseases.
In the first part are mentioned reactions of funcionalization of meso-tetraarylporphyrins, in meso and β-pyrrolic positions, with flavonoids. Studies of photobleaching and biologycal evaluation, namely citotoxicity, celular localization and celular uptake were carried out with some of the synthesized compounds. The results show that these compounds are photostable, fluorescent and exibit a reasonable uptake, so they can be promising molecules to be used in the photodiagnosis/diagnosis of neoplastic diseases.
In the second part of this thesis is described the synthesis of new porphyrin-aminoacid conjugates.
The structural analysis of the synthesized compounds was made by using several spectroscopic techniques mainly nuclear magnetic ressonance ( 1H,
13C, 19F, COSY, HSQC e HMBC), mass spectrometry and UV-Visible. The
porphyrin-amino acid conjugates were also characterized by Electrospray Tandem Mass Spectrometry.
Índice
Capítulo I
... 5
Introdução
... 5
1.1- Macrociclos tetrapirrólicos: considerações gerais... 7
1.2- Propriedades fisico-químicas ... 8
1.3- Aplicações ... 11
1.4- Terapia Fotodinâmica e Fotodiagnóstico ... 15
1.4.1-Conceitos fotofísicos: nota introdutória ... 15
1.4.2- Princípios básicos de PDT e de FD... 17
1.4.3- Principais características de um bom fotossensibilizador em PDT e FD... 19
1.4.4- Incorporação e localização celulares... 20
1.4.5- Fotodiagnóstico via ácido 5-aminolevulínico ... 23
1.4.5.1- Metabolismo do ALA ... 23
1.5- Referências... 27
Capítulo II
...29
Síntese e avaliação biológica de porfirinas
...29
acopladas a flavonóides
...29
2.1-Flavonóides: considerações gerais ... 31
2.2- Acoplamento de porfirinas a 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona ... 37
2.2.1- Acoplamento da 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina a 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona ... 37
2.2.1.1- Estudo das condições de acoplamento ... 38
2.2.2- Acoplamento de 5-(4-carboxifenil)-10,15,20- tris(3-metoxifenil)porfirina a 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona ... 40
2.2.3 Caracterização estrutural dos derivados de tipo porfirina-calcona... 43
2.2.3.1- Derivados 2 e 3... 43
2.2.3.2- Derivado 6... 49
2.3- Porfirinas como dipolarófilos em reacções de cicloadição 1,3-dipolar ... 50
2.3.1- Acoplamento de 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina 1 a derivados de N-flavonilglicina... 53
2.3.1.1- Caracterização estrutural dos derivados de tipo porfirina-flavona... 59
2.3.1.1.1- Caracterização por UV-Vis dos derivados 10, 13 e 16... 59
2.3.1.1.2- Caracterização por RMN de 1H, 13C e 19F das clorinas 10, 13 e 16... 61
2.4- Actividade biológica ... 67
2.4.1- Estudos de fotoestabilidade... 68
2.4.2- Estudos de viabilidade, morfologia e localização celulares... 75
2.4.3- Determinação da quantidade de fotossensibilizador associado às células COS-7...79
2.4.4- Conclusão e discussão de resultados... 81
2.5- Parte experimental da síntese ... 83
2.5.1- Reagentes, solventes e equipamento ... 83
2.5.2- Síntese das porfirinas 1 e 4... 85
2.5.3- Acoplamento de macrociclos porfirínicos a 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona.... 85
2.5.3.1- Acoplamento de 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina a 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona- síntese do derivado 2... 85
2.5.3.2- Acoplamento de 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina a 2’-hidroxi-4-benzioloxicalcona- síntese do derivado 3... 86
2.5.4- Acoplamento de 5-(4-carboxifenil)-10,15,20-tris(3-metoxifenil)porfirina a 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona- síntese do derivado 6... 87
2.5.4.1- Activação do grupo carboxilo com N-hidroxi-succinimida ... 87
2.5.4.2.- Acoplamento do éster activado 5 a 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona ... 88
2.5.5- Acoplamento de 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina a derivados de N-flavonilglicina... 89
2.5.5.1-Procedimento geral... 89
2.5.5.2- Acoplamento de 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina a N-(4-flavonil)glicina 7- síntese do derivado 10... 90
2.5.5.3- Acoplamento de 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina a N-(3-flavonil)glicina 8- síntese do derivado 13... 91
2.5.5.4- Acoplamento de 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina a N-(4-flavonil)glicina 9- síntese do derivado 16... 92
2.6- Referências... 93
Síntese e caracterização por espectrometria de massa de
porfirinas ligadas a aminoácidos
...97
3.1- Introdução ... 99
3.2- Síntese de porfirinas ligadas a aminoácidos... 101
3.2.1- Estudo das condições de acoplamento: acoplamento de glicinato de metilo à porfirina 4. ... 101
3.2.2- Acoplamento de outros aminoácidos a 5-(4-carboxifenil)-10,15,20-tris(3-metoxifenil)porfirina ... 104
3.2.2.1- Acoplamento de glicina... 104
3.2.2.2- Acoplamento de tirosina ... 105
3.2.2.4- Acoplamento de serinato de metilo... 109
3.2.2.5- Acoplamento de metioninato de metilo ... 112
3.2.2.6- Acoplamento de cisteína ... 114
3.3- Caracterização por espectrometria de massa de derivados de porfirina acoplados a aminoácidos... 115
3.3.1- Espectrometria de massa: considerações gerais ... 115
3.3.2- Ionização por Electrospray (ESI) ... 116
3.3.3- Quadrupolos ... 118
3.3.4- Analisadores de tempo de voo (TOF) ... 118
3.3.5- Espectrometria de massa Tandem (MS/MS)... 119
3.4- Caracterização por ESI-MS/MS dos derivados 17-23... 120
3.4.1- Resultados de ESI-MS e discussão ... 121
3.4.1.1- Fragmentação da porfirina 26... 121
3.4.1.2-Estudo das fragmentações dos conjugados de tipo porfirina-aminoácido 17 -21... 122
3.4.1.2.3- Estudo das fragmentações dos derivados de tipo diporfirinilo 22 e 23.133 3.5- Conclusão... 142
3.6- Parte experimental... 142
3.6.1- Reagentes, solventes e equipamento experimental ... 142
3.6.2- Síntese de porfirinas acopladas a aminoácidos-procedimento geral... 143
3.6.2.1- Acoplamento de glicinato de metilo ... 144
3.6.2.3- Acoplamento de tirosina ... 145
3.6.2.4- Acoplamento de serinato de metilo... 146
3.6.2.5- Acoplamento de metioninato de metilo ... 147
3.6.2.6- Acoplamento de cisteína. ... 148
Capítulo I
1.1- Macrociclos tetrapirrólicos: considerações gerais
Os macrociclos tetrapirrólicos, responsáveis por importantes funções biológicas como a respiração e a fotossíntese, englobam uma vasta gama de compostos constituídos por quatro anéis pirrólicos ligados entre si por quatro pontes metínicas.
A designação das suas estruturas como porfirinas, clorinas, bacterioclorinas e isobacterioclorinas encontra-se relacionada com o grau de insaturação dos anéis pirrólicos, assim como com a posição relativa dessa insaturação, caso exista (Esquema 1.1). No caso específico em que os anéis pirrólicos se apresentam totalmente insaturados, o macrociclo tetrapirrólico é denominado de porfirina. As clorinas são caracterizadas por apresentarem um dos anéis pirrólicos com dois centros sp3 e as bacterioclorinas assim como as isobacterioclorinas são definidas estruturalmente pela presença de dois anéis pirrólicos com dois centros sp3. Nas bacterioclorinas estes centros apresentam-se em posições opostas; já nas isobacterioclorinas, estes encontram-se em posições adjacentes.
HN N N NH Clorina HN N N NH Bacterioclorina HN N NH N Isobacterioclorina N N N NH H Porfirina Esquema 1.1
Relativamente à aromaticidade destes compostos tetrapirrólicos ainda há a referir que, apesar do diferente número de electrões π presentes, todos eles apresentam carácter aromático. As porfirinas, têm na sua estrutura vinte e dois electrões π. No entanto, essencialmente dezoito destes participam directamente na aromaticidade do macrociclo
(Esquema 1.2). Desta forma, também as clorinas, isobacterioclorinas e bacterioclorinas apresentam carácter aromático, de acordo com a regra de Huckel para a aromaticidade (4n+2 electrões π).1 HN N N NH Porfirina N HN NH N Porfirina Esquema 1.2
O sistema de numeração proposto pela IUPAC é apresentado no Esquema 1.3. Durante a realização deste trabalho e, sempre que possível, recorreu-se a este sistema de numeração na designação dos derivados apresentados. No entanto, recorre-se também de forma a facilitar a exposição, às designações de meso para denominar as posições 5, 10, 15 e 20 do sistema IUPAC e posições β-pirrólicas relativamente às posições 2, 3, 7, 8, 12, 13, 17 e 18 do macrociclo (Esquema 1.3). HN N N NH N HN NH N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1819 20 21 22 23 24 posição β-pirrólica posição α-pirrólica posição meso Esquema 1.3
1.2- Propriedades fisico-químicas
Os macrociclos tetrapirrólicos são compostos fortemente corados, apresentando portanto bandas típicas de absorção na zona do visível do espectro electromagnético.
São caracterizados pela presença de uma forte banda de absorção, na região dos 400 nm, designada por banda Soret, e por quatro bandas satélite menos intensas, na região dos 450-750 nm, designadas por bandas Q. A banda Soret reflecte a presença dos dezoito electrões π deslocalizados, responsáveis pelo carácter aromático deste tipo de compostos. Assim, é a banda de maior intensidade nos espectros de visível de compostos de tipo porfirina, clorina, bacterioclorina e isobacterioclorina.2
Os espectros de absorção dos derivados reduzidos, apresentam diferenças significativas face aos espectros de absorção das porfirinas, nomeadamente a nível da intensidade relativa das bandas Q (Esquema 1.4). Desta forma, a espectroscopia de UV-Vis é uma das técnicas habitualmente usadas na identificação destes compostos, permitindo distinguir claramente porfirinas, clorinas, bacterioclorinas e isobacterioclorinas. Nas clorinas, a banda QI, apresenta-se mais intensa do que a banda Q das porfirinas na mesma região dos 650 nm, enquanto que nas bacterioclorinas não só esta banda apresenta uma intensidade superior à das clorinas e porfirinas como se encontra deslocada para a região dos 750 nm. Por último, as isobacterioclorinas, apresentam três bandas Q de intensidade crescente na região dos 500-600 nm e, em contraste aos restantes macrociclos reduzidos, a banda de absorção que surge a maiores comprimentos de onda (QI) é a banda de menor intensidade em todo o espectro de absorção.
N HN NH N R R R R N HN NH N R R R R N HN NH N R R R R N HN NH N R R R R
Banda Soret
Bandas Q
I II III IV N HN NH N R R R R N HN NH N R R R R N HN NH N R R R R N HN NH N R R R R N HN NH N R R R R N HN NH N R R R R N HN NH N R R R R N HN NH N R R R RBanda Soret
Bandas Q
I II III IVEsquema 1.4- Representação gráfica do espectro de visível de macrociclos tetrapirrólicos
meso-substituídos em diferentes estados de oxidação: a) porfirina; b) clorina c) bacterioclorina; d) isobacterioclorina. Adaptado de [3].
Ainda há a referir que o espectro de visível das porfirinas é dependente da natureza do macrociclo e dos seus grupos substituintes. Apesar da banda Soret ser sempre a banda de maior intensidade, as bandas Q podem apresentar intensidades variáveis. As porfirinas de origem natural apresentam normalmente espectros do tipo “etio” (IV>III>II>I). No entanto, espectros do tipo “rhodo” (III>IV>II>I) “oxo-rhodo” (III>II>IV>I) e “phylo” (IV>II>III>I), são também característicos deste tipo de compostos.
A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é uma técnica valiosa que fornece informação estrutural importante acerca deste tipo de derivados. Os espectros de RMN de 1H das porfirinas são normalmente caracterizados pela presença de um sinal a desvios químicos na região dos –2 a –3 ppm, gerados pela ressonância dos protões internos
NH.Já a ressonância dos protões das posições β-pirrólicas surgem normalmente na zona aromática a desvios químicos na região dos 8-9 ppm enquanto que a 10-11 ppm surgem normalmente os sinais devidos à ressonância dos protões meso.4 Também a nível dos espectros de RMN de 1H se observam alterações significativas para os derivados reduzidos. A ausência de ligações duplas relativamente ao macrociclo porfirínico conduz a uma diminuição do fluxo da corrente electrónica o que provoca um aumento do desvio químico para o sinal gerado pela ressonância dos protões internos NH e numa diminuição do desvio químico para o(s) sinal (ais) gerado(s) pela ressonância dos protões meso e β -pirrólicos.
1.3- Aplicações
O grande impulso na Química dos compostos tetrapirrólicos surgiu pela mão de Hans Fischer e da sua escola quando, após intensos anos de pesquisa, caracterizaram estruturalmente o grupo heme via síntese total, e relacionaram a sua estrutura com a estrutura da clorofila.5 N N N N Me Me Me CO2H HO2C N N N N Me Me Et Me Me O MeO2C H Me C O O H Mg Fe a) b)
Figura 1.1- Grupo heme (a) e clorofila a (b)
Estavam assim estabelecidas as estruturas dos compostos responsáveis pelo desenvolvimento de funções vitais essenciais à vida como a respiração e fotossíntese, justificando o facto destes compostos serem normalmente designados como “pigmentos da vida”.
Desde então, inúmeros investigadores dedicaram o seu trabalho à síntese e ao estudo das propriedades e reactividade dos macrociclos tetrapirrólicos, referindo-os como compostos com enormes potencialidades em diversas áreas. Salientam-se as suas aplicações na área da medicina, nomeadamente em terapia fotodinâmica (PDT) e fotodiagnóstico (FD) de situações tumorais.
De uma forma geral, estas duas técnicas tiram partido da acumulação preferencial destes compostos em tecidos neoplásicos e da acção conjugada destes com o oxigénio e com radiação de comprimento de onda adequado. No caso da PDT, a absorção de radiação incidente pelo fotossensibilizador exógeno dá início a uma série de processos que culminam na morte das células neoplásicas. Por sua vez, no processo de diagnóstico, a absorção de radiação pelo fotossensibilizador conduz à emissão de fluorescência característica, permitindo desta forma a visualização da área afectada pela neoplasia. O mecanismo de acção destas duas técnicas será discutido com algum pormenor na secção 1.4.2.
Ainda a nível do processo terapêutico, algumas formulações que têm no seu princípio activo compostos de tipo porfirínico, mereceram já a aprovação de vários organismos que tutelam e vigiam a sua utilização em vários países. A primeira formulação usada foi designada por Photofrin® e o seu uso clínico foi aprovado pela primeira vez no Canadá, em 1993. Posteriormente, esta formulação foi também aprovada na Holanda, Japão, Estados Unidos, França, Finlândia, Alemanha, Portugal, Inglaterra, e mais recentemente em Itália, na Irlanda e na Suécia.6 No entanto, apesar da sua eficiência no tratamento de alguns tipos de neoplasias, Photofrin® apresenta algumas desvantagens: trata-se de uma mistura complexa e variável de macrociclos porfirínicos, contendo espécies oligoméricas; a sua aplicabilidade medicinal é limitada por não ser possível identificar os componentes activos responsáveis pela sua actividade biológica. Por outro lado, os doentes tratados com esta formulação apresentam elevados riscos de fotossensibilidade cutânea mediante exposição à luz.7
Actualmente, outras formulações baseadas em derivados porfirínicos, já foram aceites para aplicação clínica em PDT (Esquema 1.5), como o ácido 5-aminolevulínico (Levulan), precursor da protoporfirina-IX e os seus ésteres metílico (Metvix), hexílico (Hexvix) e benzílico (Benzvix) e também fotossensibilizadores exógenos como a m
-tetrahidroxifenilclorina (m-THPC, Foscan) e o complexo de lutécio de texafirina (Lutex, Motexafin Lutetium).8 NH N N HN Me Me Me CO2H HO2C Me OR H2N O O Protoporfirina IX Levulan R=H Metvix R= Me Benzvix R= CH2Ph Hexvix R= n-C6H13 NH N N HN OH m-THPC OH HO HO
Esquema 1.5- Alguns fotossensibilizadores usados em PDT.
Dado que todos estes fotossensibilizadores apresentam, quando excitados, emissão de fluorescência, têm sido utilizados simultaneamente em PDT e em fotodiagnóstico; a fluorescência exibida pelos fotossensibilizadores permite visualizar a área ainda afectada durante o tratamento.
De facto, um dos principais problemas associados às doenças oncológicas é a ausência de sintomas específicos no início do seu desenvolvimento. Este factor contribui para que, na maioria dos casos, o diagnóstico seja efectuado em fases avançadas de doença o que, quando associado à localização do tumor em áreas de difícil acesso, diminui substancialmente as hipóteses de cura. Apesar do cenário pouco favorável, sabe-se que a probabilidade de cura deste tipo de situações malignas aumenta consideravelmente quando efectuado um diagnóstico atempado e eficaz. Existe pois, uma enorme necessidade de fotossensibilizadores específicos para diagnóstico. A síntese de derivados porfirínicos
adequadamente substituídos que, de forma análoga aos usados em PDT, se acumulem preferencialmente em tecidos tumorais mas que sejam simultaneamente bons fluóforos e que não provoquem morte celular é, sem dúvida, um dos caminhos a explorar.
Actualmente, o precursor da protoporfirina IX, o ácido 5-aminolevulínico (ALA), bem como os respectivos ésteres são também usados para a detecção de situações cancerígenas.8 No entanto, estudos desenvolvidos com outras moléculas porfirínicas, apresentam-se também como alternativas credíveis para fotodiagnóstico. A título de exemplo, salientam-se alguns dos trabalhos desenvolvidos nesta área, nomeadamente os que se basearam no acoplamento de moléculas de carotenóides a porfirinas.9-12 Estes
trabalhos fundamentaram-se no importante papel dos carotenóides no processo fotossintético.13-15 Estas moléculas actuam como supressores do estado tripleto das moléculas de clorofila que, sendo este estado muito reactivo, poderia culminar em reacções de fotossensibilização do oxigénio molecular com consequente formação de oxigénio singuleto. Esta espécie é altamente citotóxica e responsável, no caso da PDT, pelo processo de morte das células tumorais. No entanto, estudos farmacocinéticos revelam que estes derivados de tipo porfirina-carotenóide apresentam como grande desvantagem o facto de se acumularem no fígado.10 Esta acumulação, que não diminui significativamente ao longo do tempo, poderá perturbar o bom funcionamento do fígado e conduzir ao aparecimento de alguns efeitos secundários indesejáveis.
Publicações mais recentes revelam a possibilidade do diagnóstico de neoplasias ser efectuado com base no aumento de fluorescência exibida pelo sangue.16 Este aumento deve-se ao facto de pessoas portadoras de neoplasias apresentarem níveis superiores de porfirinas acumuladas em células tumorais relativamente a pessoas saudáveis, sendo estas porfirinas facilmente arrastadas pelo fluxo sanguíneo. Contudo, este tipo de diagnóstico apenas detecta estados de doença e não permite distinguir tipos de tumores.
O desenvolvimento de novas técnicas espectroscópicas e de imagem,
nomeadamente ressonância magnética nuclear de 19F in vivo, assume um papel essencial no que concerne à aplicação de derivados porfirínicos fluorados em diagnóstico de neoplasias.17-20 As vantagens da aplicação desta técnica prendem-se com o facto de
compostos orgânicos fluorados serem raros em sistemas biológicos, o que diminui a probabilidade da existência de diagnósticos positivos falsos devido à presença destes compostos em sistemas não afectados pela doença.
1.4- Terapia Fotodinâmica e Fotodiagnóstico
1.4.1-Conceitos fotofísicos: nota introdutória
Tal como já foi referido, a PDT e o FD tiram partido da acção conjugada de um fotossensibilizador e de radiação de um determinado comprimento de onda.
Será portanto importante referir, de forma sucinta, alguns parâmetros fotofísicos que envolvem a absorção de radiação e que são relevantes na avaliação do potencial de um fotossensibilizador na aplicação em fotodiagnóstico e/ou tratamento.
O trajecto percorrido por uma molécula desde que absorve radiação até retomar ao estado fundamental, mais estável e de menor energia, é representado pelo diagrama de Jablonski (Figura 1.3). Vários processos podem estar envolvidos neste decaimento energético e são classificados em dois grupos: os que ocorrem com emissão de radiação (processos radiativos: fluorescência e fosforescência) e os que ocorrem na ausência de emissão de radiação (processos não radiativos: conversão intersistemas, conversão interna e reacções de fotossensibilização).
Figura 1.3- Diagrama de Jablonski modificado.
Basicamente, quando uma molécula absorve um fotão e um dos electrões é promovido para uma orbital de maior energia ele poderá ocupar, desde que possua energia suficiente, qualquer um dos estados excitados singuleto (Sn). Quando o estado singuleto
ocupado corresponde a n>1, podem ocorrer processos de conversão interna que o conduzem ao estado excitado singuleto de menor energia (S1).21
Os processos de decaimento energético de S1 para S0 podem ocorrer com emissão
de radiação (processo radiativo) ou com perda de energia sob a forma de calor (processo térmico). O primeiro é designado por fluorescência. Neste caso, o comprimento de onda da radiação emitida é superior ao comprimento de onda da radiação absorvida, uma vez que a molécula ao retomar o estado fundamental poderá ocupar níveis de energia vibracionais e rotacionais superiores aos ocupados previamente à absorção de radiação.
No processo térmico, o calor emitido corresponde à diferença de energia entre o nível ocupado no estado excitado e o nível final no estado fundamental.
Por outro lado, uma molécula no seu estado excitado singuleto pode seguir a via de conversão de intersistemas para o estado excitado tripleto de menor energia. De forma similar ao decaimento do estado singuleto excitado para o estado fundamental, a perda energética com origem no estado excitado tripleto, pode ser acompanhada por perda de energia sob a forma de calor ou por emissão de radiação (fosforescência). No processo de fosforescência, o comprimento de onda da radiação emitida é muito superior ao comprimento de onda da radiação absorvida e ao comprimento de onda da radiação emitida por fluorescência. Este facto é facilmente justificado com base nas diferenças energéticas entre os três estados supra mencionados: a diferença de energia entre o estado excitado tripleto e o estado fundamental singuleto é inferior à diferença de energia entre o estado excitado singuleto e o estado fundamental singuleto.
Por último, uma molécula no estado excitado tripleto pode ainda transferir a sua energia para uma molécula no estado fundamental, promovendo a excitação desta última a um estado de maior energia. Este tipo de reacções é designado por reacções de fotossensibilização e é responsável pela participação de moléculas orgânicas em reacções fotoquímicas quando estas são irradiadas com radiação de um certo comprimento de onda onde não é característica a sua absorção. Este processo pode ser considerado um processo catalítico dado que após transferência energética ocorre regeneração do fotossensibilizador.6
3 A + 1 B 1 A + 3 B
Uma das grandezas que explica o comportamento fotofísico de moléculas é definida como rendimento quântico e representa, para qualquer processo, a razão entre o número de fotões usados (nfp) e o número total de fotões absorvidos pela molécula (nfa).
Esta grandeza assume valores compreendidos no intervalo 0-1, uma vez que, exceptuando o caso das reacções em cadeia, cada fotão absorvido excita apenas uma molécula orgânica.
φ = n fp/n fa
Por exemplo, um rendimento quântico de fluorescência de 0,5 significa que 50 % dos fotões absorvidos por uma dada molécula orgânica conduziram ao seu decaimento energético directamente do estado excitado singuleto para o estado fundamental com emissão de radiação (fluorescência).
Ainda há a referir que a soma dos rendimentos quânticos dos processos que envolvem directamente a participação de fotões (fluorescência φF, fosforescência φP, estado
singuleto φs, estado tripleto φT e conversão intersistemas φisc) é inferior ou igual à unidade:8
∑ φ ≤ 1
Esta lei fotofísica comprova a necessidade de encontrar fotossensibilizadores específicos para aplicação em fotodiagnóstico. Como será explicado nas secções seguintes, um fotossensibilizador adequado para aplicação em PDT deverá apresentar um elevado rendimento quântico de estado tripleto. Em contrapartida, um fotossensibilizador ideal para aplicação em fotodiagnóstico deverá apresentar um rendimento quântico fluorescência bastante superior ao apresentado para o estado tripleto. Desta forma, e dado que a soma de todos estes processos deverá ser inferior à unidade, a mesma molécula não poderá satisfazer estes dois requisitos. Assim a aplicação da mesma molécula no processo terapêutico e no processo de diagnóstico, apesar de ser possível, poderá ocorrer com eficiência limitada para um ou mesmo para ambos os processos.
1.4.2- Princípios básicos de PDT e de FD
O modo terapêutico (PDT) é iniciado pela absorção de radiação pelo fotossenssibilizador, que o promove ao estado excitado singuleto. Se o decaimento energético deste estado excitado ocorrer preferencialmente via uma interconversão de
sistemas, origina o estado excitado tripleto do fotossensibilizador. A reacção de fototoxicidade pode-se desenrolar por dois mecanismos distintos: 21-24
1- Mecanismo do tipo I- envolve reacções entre o estado tripleto do fotossensibilizador e substractos biológicos. Este mecanismo envolve a abstracção de átomos de hidrogénio ou a transferência electrónica entre o fotosensibilizador excitado e o substracto em questão, conduzindo ao aparecimento de espécies radicalares, que causam danos celulares.
2.- Mecanismo do tipo II- O decaimento energético do estado tripleto do fotossensibilizador ocorre por transferência de energia para o 3O2, culminando com a
formação de 1O2 , espécie muito reactiva capaz de causar também danos a nível celular.
É de relembrar que o oxigénio molecular no estado fundamental é o oxigénio tripleto (3O2). O oxigénio no estado singuleto (1O2) apresenta um carácter electrofílico
superior ao oxigénio molecular. Sendo um oxidante muito poderoso, é usado em química laboratorial para promover a oxidação de fenóis, grupos amina, entre outros e pode participar ainda como dienófilo em reacções de cicloadição [4+2].23 Quando presente em substratos biológicos, reage rapidamente com os sistemas celulares, nomeadamente ao nível da mitocôndria, retículo endoplasmático, sistema de Golgi e lisossomas.10,11 A reacção em locais de insaturação e outros presentes nas biomoléculas pode conduzir à morte celular. É este efeito citotóxico, apresentado pelo oxigénio singuleto, o responsável pela actividade necrótica.
O fotodiagnóstico de neoplasias rege-se pelos mesmos princípios da terapia fotodinâmica, tirando partido da acumulação preferencial de um fotossensibilizador em tecidos tumorais e da posterior irradiação com luz de um comprimento de onda adequado. Para este tipo de aplicação, como já foi referido, o estado excitado de maior importância é estado excitado singuleto, assumido pelo fotosensibilizador após absorção da radiação incidente. O seu decaimento energético via emissão de radiação (fluorescência) deve ser preferencial face aos restantes processos de decaimento e a formação do oxigénio singuleto deverá ser minimizada ou, idealmente, eliminada. Este requisito é compatível com o objectivo do fotodiagnóstico: a visualização atempada e de forma não evasiva de tecidos
cancerígenos mediante a observação da emissão de fluorescência de um marcador que revele acumulação preferencial neste tipo de tecidos.
1.4.3- Principais características de um bom fotossensibilizador em PDT e FD
Os compostos que se destinam a aplicações nestas duas áreas deverão apresentar algumas características comuns que passamos a enunciar:22, 25
1- Elevado coeficiente de absorção na região do espectro electromagnético correspondente ao comprimento de onda de excitação pretendido.
2- Composto puro, de síntese fácil, elevada reprodutibilidade e bons rendimentos. 3- Apresentar acumulação preferencial em células tumorais (face a células saudáveis). 4- Não ser tóxico na ausência de luz.
5- Facilmente solúvel nos fluidos corporais e de rápida eliminação.
Os compostos com aplicação potencial em PDT devem também apresentar outras características que favoreçam a formação de 1O2 de forma a promover a actividade
terapêutica. Assim, são esperados elevados rendimentos quânticos de formação de estado tripleto (φT) e elevados tempos de vida de estado excitado tripleto (τT).
Por seu turno, fotossensibilizadores com potencial aplicação em fotodiagnóstico, devem, em adição às características mencionadas anteriormente, ser maus geradores de 1O2,
de forma a que seja favorecido o processo de fluorescência. Relativamente aos tempos de vida do estado excitado tripleto, alguns estudos efectuados prevêem que compostos com tempos de vida de estado tripleto superiores a 1 ms encontrem aplicação em PDT, enquanto que compostos que apresentem tempos de vida de estado tripleto da ordem dos 1 µs sejam indicados para FD.26, 27
Esta regra baseia-se na equação que define o rendimento quântico de formação de
1O
2 (
φ
∆)
, quando estamos na presença de um mecanismo do tipo II:em que ket representa a constante de velocidade de transferência de energia do estado
tripleto do fotossenssibilizador para o oxigénio molecular, representando [3O2] a
concentração efectiva de oxigénio no meio e kp a soma das constantes de velocidade dos
processos de decaimento energético radiativo e não radiativo na ausência de oxigénio. Sabendo que kp = 1/τp, em que τp representa o tempo de vida do estado tripleto na ausência
de O2 e, procedendo à sua substituição na expressão anterior, verifica-se que φ∆ varia na razão inversa de kp e na razão directa de τp. Efectivamente, o estado excitado tripleto dum
fotossensibilizador apresenta um tempo de vida superior ao seu estado excitado singuleto, o que permite a ocorrência de reacções de transferência de energia entre as duas moléculas, neste caso entre o fotossensibilizador e o oxigénio molecular.
Ainda há a referir que estas conclusões podem também ser aplicadas a mecanismos do tipo I, uma vez que o estado tripleto do fotossensibilizador é o estado de partida de ambos os mecanismos.
1.4.4- Incorporação e localização celulares
A incorporação e a localização celular dos fotossensibilizadores são também factores determinantes para a sua eficiência.
As porfirinas, assim como os seus derivados, possuem a capacidade de serem preferencialmente retidos pelas células de tecidos neoplásicos face a células normais dos tecidos circundantes. Esta é uma das características mais importantes evidenciada pelos macrociclos tetrapirrólicos e uma das que viabiliza a sua aplicação em áreas medicinais como o diagnóstico e terapia de cancro.
O mecanismo que torna esta acumulação preferencial ainda não se encontra completamente esclarecido. Nas últimas décadas, diversos estudos realizados relacionam a acumulação de porfirinas pelos tecidos tumorais com a presença de proteínas lipídicas de baixa densidade, designadas por LDL, e com o pH do meio intra e extracelular de células tumorais e de células normais.28-30
O percurso do macrociclo porfirínico após administração intravenosa (até às células tumorais) apresenta-se dependente de características como a sua solubilidade. Apenas porfirinas hidrofílicas podem circular livremente através do fluxo sanguíneo.31 Contudo,
porfirinas anfifílicas ou lipofílicas possuem elevada afinidade para as LDL (Figura 1.4).29 Uma das características das células cancerígenas é a de apresentarem um metabolismo catabólico de colesterol acelerado, que lhes confere uma elevada concentração de receptores LDL. Desta forma as proteínas lipídicas de baixa densidade podem funcionar como transportadores deste tipo de fotossensibilizadores e assegurar a sua retenção em tecidos tumorais.
Figura 1.4- Provável mecanismo de interacção entre LDL e fotossensibilizadores com carácter anfifílico.29
A interacção entre o macrociclo porfirínico e a parede celular (Figura 1.5) ocorre de forma a orientar as componentes hidrofóbica e hidrofílica do macrociclo com a cauda carbonada e a cabeça polar da primeira camada fosfolipídica da parede celular, respectivamente. Um mecanismo de “flip-flop” acompanhando a constituição da parede celular de forma a manter a mesma orientação, permite a progressão do fotossensibilizador em direcção ao meio intracelular.
Membrana celular Expulsão Fracção apolar Cabeça polar Cauda apolar Cadeia polar Expulsão Cabeça polar Incorporação Macrociclo porfirínico
Figura 1.5- Mecanismo provável de incorporação de porfirinas nas células tumorais.18
Este estudo permite concluir que os substituintes da cadeia lateral do macrociclo porfirínico, assim como a simetria da molécula, poderão desempenhar um papel fundamental na sua incorporação na célula.
O pH é outro factor que poderá desempenhar um papel importante na incorporação destes compostos em células tumorais. O pH de tecidos tumorais é significativamente mais baixo do que o pH de tecidos normais. Porfirinas do tipo da deuteroporfirina (Figura 1.6) com as características anfifílicas e de simetria adequadas para serem incorporadas em células, encontram-se no meio extracelular na forma neutra o que facilita a sua entrada na membrana celular. No meio intracelular, os grupos carboxilos encontram-se nas formas mono e/ou dianiónicas, tornando a molécula menos lipofílica o que dificulta a sua eliminação. NH N N HN CH3 H H H3C H3C CH3 COOH COOH Figura 1.6- Deuteroporfirina
A baixa incorporação de porfirinas protonadas também se justifica pela sua hidrofilicidade. Outra característica que também poderá contribuir para a acumulação dos fotossenssibilizadores nas células hiper-proliferativas é a reduzida drenagem linfática apresentada pelos tecidos doentes.
Relativamente à localização destes compostos nos organelos celulares, verifica-se que as características referidas anteriormente assumem também um papel importante. Moléculas lipofílicas apresentam maior tendência para se localizarem em componentes lipofílicos, como membranas celulares de vários organelos, enquanto que macrociclos aniónicos acumulam-se preferencialmente na membrana citoplasmática (os de carácter mais lipofílico) ou em lisossomas (os mais hidrofílicos).
Relativamente a estados de agregação, vários estudos realizados revelam que os agregados diméricos apresentam tendência a difundirem-se por toda a célula, apresentado uma maior acumulação na membrana plasmática, enquanto que os monómeros se localizam em vários organelos, nomeadamente no núcleo e mitocôndria.32
1.4.5- Fotodiagnóstico via ácido 5-aminolevulínico
A aplicação do ácido 5-aminolevulínico em fotodiagnóstico de neoplasias é feita mediante uma técnica designada por fotossensibilização endógena em que o fotossensibilizador é biossintetizado por administração externa de um dos seus precursores naturais.
O ácido 5-aminolevulínico é um precursor natural do grupo prostético Heme (Figura 1.7). Desta forma, seria suposto que a sua administração externa culminasse na acumulação de heme, o que não se verifica. Mediante a aplicação externa (tópica ou sistémica) de ácido 5-aminolevulínico, este é rapidamente metabolizado pelo organismo verificando-se uma acumulação rápida de um marcador fluorescente, a protoporfirina IX, nos tecidos doentes.
1.4.5.1- Metabolismo do ALA
A biossínte de ALA ocorre na mitocôndria mediante a condensação de uma unidade de glicina e de uma unidade de succinil CoA. Esta reacção é catalisada pela enzima ALA sintase. A formação enzimática do porfobilinogénio ocorre mediante a condensação de duas moléculas de ALA acompanhada da libertação de duas moléculas de água. A condensação de quatro moléculas de porfobilinogénio e posterior ciclização culminam na formação de um outro intermediário - o uroporfirinogénio III. A descarboxilação de todas as cadeias de ácido acético a grupos metilo é catalisada pela enzima uroporfirinogénio descarboxilase e promove a síntese do coproporfirinogénio III.
O coproporfirinogénio III entra na mitocôndria onde ocorrem diversas transformações enzimáticas que envolvem a descarboxilação e oxidação de dois grupos propiónicos formando o protoporfirinogénio, precursor da protoporfirina IX. A síntese deste derivado ocorre por oxidação do protoporfirinogénio. O passo final na síntese do
grupo prostético heme pressupõe a incorporação de ferro no interior do macrociclo porfirínico processo catalisado pela enzima heme sintase.33-37 A concentração do grupo prostético heme assume um papel importante no controle desta biossíntese não permitindo a acumulação de porfirinas no organismo que conduziria a distúrbios metabólicos.
Succinil CoA+ Glicina
Ala sintase N CO2H CO2H NH2 HO2C CO2H NH2 ALA Porfobilinogénio HN HN NH NH H2N HN HN NH NH HN HN NH NH HN HN NH NH
UroporfirinogénioIII Coproporfirinogénio III Protoporfirinogénio HN N N NH Protoporfirina IX Me Me Me Me Me Me EM Me P P P P P P Me Me Me Me N N N N Me Me Me Me Fe Heme MITOCÔNDRIA P P P P P P P P A A A A A A A A A=CH2CO2H P=CH2CH2CO2H O P P P P H CONTROLO
Figura 1.7- Biossíntese do grupo prostético Heme
A administração exógena de ALA ocorre num dos pontos deste ciclo em que o sistema responde apenas à sua presença, permitindo assim a biossíntese de protoporfirina
IX. Alguns dos factores que poderão impedir a biossíntese e acumulação do grupo prostético Heme poderão ser a administração de um elevado excesso de ALA aliada a uma biodisponibilidade limitada de ferro e de enzima heme sintase.
Desta forma a fluorescência exibida pela acumulação de protoporfirina IX nos tecidos doentes é suficiente para permitir a sua detecção mediante a aplicação de técnicas de fluorescência.
A maior vantagem da administração exógena de ALA relativamente a outros fotossensibilizadores é o seu rápido metabolismo que tem como consequência clínica imediata a diminuição drástica do período de fotossensibilidade cutânea. Por exemplo, doentes que foram sujeitos a tratamento com HpD deverão evitar o contacto com a luz solar durante um período que abrange duas semanas a três meses. No caso de doentes tratados com ALA, a fotossensibilização é apenas manifestada durante um período de cerca de vinte e quatro horas.
Outros estudos têm sido realizados com o intuito de aumentar o desempenho da fotossensibilização endógena.34 A esterificação dos grupos carboxilos do ALA aumenta a lipofobicidade da molécula o que é uma vantagem relativamente ao transporte e incorporação destes derivados nas células alvo. No entanto, é necessário que ocorra a clivagem enzimática dos grupos éster antes da entrada do ALA na biossíntese da protoporfirina IX. Desta forma, a biodisponibilidade da esterease poderá influenciar o sucesso deste processo. No entanto, se se verificar uma incorporação superior com estes derivados, poder-se-á obter uma maior concentração de protoporfirina IX a uma menor concentração de droga administrada, aumentando desta forma a fluorescência observada e facilitando o diagnóstico.
O objectivo do trabalho realizado foi o de contribuir para o desenvolvimento de novas moléculas de tipo porfirínico com potencial aplicação em fotodiagnóstico. Dedicámo-nos portanto ao estudo da síntese, caracterização estrutural e avaliação biológica de moléculas resultantes do acoplamento de unidades estruturais com propriedades biológicas conhecidas e relevantes, de forma a inferir acerca da introdução de alterações estruturais no macrociclo porfirínico tornando-o mais específico para a aplicação requerida.
Desta forma, na primeira parte deste trabalho, foram preparados novos derivados porfirínicos resultantes do acoplamento de moléculas de porfirina a uma calcona, nas
posições meso do macrociclo porfirínico, procedendo de seguida à sua avaliação biológica. A última, teve como base a avaliação do efeito do número de substituintes de tipo calcona e do tipo de substituintes do macrociclo porfirínico na citotoxicidade apresentada, assim como nas alterações na morfologia, localização e acumulação para uma dada linha celular. Uma vez que os resultados obtidos foram interessantes, ainda na primeira parte do trabalho é descrita a síntese de novos macrociclos porfirínicos acoplados a derivados de N -flavonilglicinas desta vez na posição β-pirrólica.
Na segunda parte, e na sequência de outros estudos realizados no nosso grupo de investigação, foram sintetizados conjugados de tipo porfirina-aminoácido e diporfirina-aminoácido, resultantes do acoplamento de aminoácidos naturais e ésteres de aminoácidos também a macrociclos porfirínicos. A caracterização estrutural por espectrometria de massa em electrospray conduziu a resultados interessantes relativamente ao tipo de fragmentação destes novos derivados, pelo que será também um assunto abordado em pormenor.
1.5- Referências
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Capítulo II
Síntese e avaliação biológica de porfirinas
acopladas a flavonóides
2.1-Flavonóides: considerações gerais
Os flavonóides são compostos fenólicos isolados de várias plantas. São conhecidos por serem biologicamente activos actuando como antialérgicos, antivirais, antioxidantes, anti-inflamatórios, e vasodilatadores.1-8 Estes compostos apresentam estruturas policíclicas
com dois anéis aromáticos (A e B), ligados em alguns casos por um anel central (anel C). A família dos flavonóides é subdividida em subclasses (calconas, flavonas, isoflavonas, flavanonas e flavonóis), de acordo com o nível de saturação e a abertura/fecho do anel central (Figura 2.1). O O O O O OH O O OH O O OH O O O Calcona
Flavona Flavonol Isoflavona
Flavanona Flavanonol Flavan-3-ol
1 2 3 7 5 6 8 4 1' 2' 3' 4' 5' 6' A C B A 2' B 3' 4' 5' 6' 1'
Figura 2.1- Estrutura base de núcleos de algumas subclasses da família dos flavonóides e numeração recomendada pela IUPAC para esta família de compostos.
Face ao interesse na procura de novas moléculas para o tratamento e diagnóstico de neoplasias, centrámos a nossa atenção nas propriedades anticancerígenas e antioxidantes destes compostos.
Nas últimas décadas, alguns estudos realizados sugerem a existência de correlação directa entre a ingestão de flavonóides e o decréscimo de risco de aparecimento de
cancro.1-3 A relação entre estrutura/actividade deste tipo de compostos parece estar dependente do número, tipo e posição dos grupos substituintes.1, 5-9
Os flavonóides parecem desenvolver a sua actividade anticancerígena através da inibição, reversão ou retardamento da hiperproliferação celular. Estes compostos são particularmente eficientes na inibição das enzimas que catalisam a formação de espécies reactivas de oxigénio (ciclo-oxigenase, lipo-oxigenases) e na inibição da enzima ornitina descarboxilase responsável pela síntese de nucleótidos. A inibição destas enzimas limita a síntese de DNA e a actividade proliferativa de células cancerígenas.2 São também efectivos na inibição de enzimas envolvidas na regulação de proliferação celular como as PTK (proteína tirosina cinase), PCK (proteína C cinase) e PIP3 (fosfoinoisitidina 3-cinases).3
Por outro lado, os flavonóides podem eliminar vários factores que poderão dar início ao estado de doença, complexando metais e podem também reagir como captadores de espécies reactivas de oxigénio.3,5,6 Aliada a esta enorme vantagem, apresentam citotoxidade muito baixa (em alguns casos até mesmo nula) para as células humanas saudáveis.3
Outro mecanismo envolvido na actividade anticancerígena apresentada pelos flavonóides poderá estar relacionado com a indução de apoptose (forma activa de morte celular que desempenha um papel importante na eliminação de células danificadas).
O grande desafio a que nos propusemos neste trabalho, foi o de sintetizar compostos orgânicos não citotóxicos (quer na presença, quer na ausência de luz), com acumulação preferencial em células cancerígenas face a células normais e que apresentem rendimentos quânticos de fluorescência razoáveis de forma a permitir a visualização da área afectada.
Tal como vimos anteriormente, as porfirinas são macrociclos tetrapirrólicos que por si só obedecem a algumas das características estruturais exigidas para uma molécula com aplicação em fotodiagnóstico: são, de facto, moléculas fluorescentes que se acumulam preferencialmente em células hiperproliferativas face a células normais, possibilitando um diagnóstico eficaz por monitorização da fluorescência emitida após irradiação. No entanto, um dos principais problemas exibidos pelos macrociclos do tipo porfirínico e que condiciona a sua aplicação nesta vertente medicinal é o facto de serem, geralmente, bons geradores de oxigénio singuleto após irradiação. A presença de oxigénio singuleto no meio
celular, apesar de ser a base do processo fototerapêutico (PDT) é indesejável no processo de fotodiagnóstico.
Na tentativa de tirar partido da selectividade demonstrada pelas porfirinas e da sua fluorescência, assim como da importante actividade biológica dos flavonóides, dedicámo-nos à síntese de novas moléculas contendo estas duas unidades estruturais.
Em primeiro lugar, e tendo como objectivo a funcionalização das posições meso de porfirinas, preparámos compostos que resultaram do acoplamento da 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona a 5,10,15,20- tetraquis(pentafluorofenil)porfirina 1 e a 5-(4-carboxifenil)-10,15,20-tris(3-metoxifenil)porfirina 4, através de ligações éter e éster, respectivamente (Esquema 2.1).
O O CH2 O C H H NH N N HN F F F F F F F F F F F F F F F F F F F O O R1 NH N N HN F F F F F F O F F F F F F F F F F O O R1 O O R1 NH N N HN F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F 2'-hidroxi-4-benziloxicalcona 1 NH N N HN OCH3 C O O O R1 H3CO H3CO 1 2 3 4 6 1 O O R1 NH N N HN C O OH OCH3 H3CO H3CO 4 OH R1 O Esquema 2.1
Outro dos factores a ter em conta quando se pretende preparar compostos com possível aplicação em fotodiagnóstico de neoplasias é a zona de absorção no espectro electromagnético. Nas últimas décadas, vários estudos relacionados com terapia fotodinâmica (PDT) foram orientados para a procura de novos derivados com absorção
intensa de radiação na zona do vermelho. Este requisito relaciona-se com o grau de penetração da radiação nos tecidos, que aumenta com o aumento do comprimento de onda da radiação incidente,9 permitindo não só o tratamento de tumores localizados em zonas menos acessíveis do organismo como também tumores de maiores dimensões. Desta forma, macrociclos reduzidos de tipo clorina, bacterioclorina e isobacterioclorina têm sido extensamente estudadas para aplicação em PDT. Inclusivamente, a degeneração macular da retina relacionada com a idade (DMRI) tem sido tratada usando uma formulação baseada num macrociclo porfirínico de tipo clorina.10
Sabendo que, de forma análoga ao processo de PDT, o fotodiagnóstico envolve absorção de radiação, estes macrociclos porfirínicos reduzidos poderão ser úteis, por monitorização de fluorescência emitida, na detecção de situações tumorais em zonas menos acessíveis.
Atendendo aos factos supra-mencionados, foram também preparadas clorinas resultantes do acoplamento da N-(4-flavonil)glicina 7, da N-(3-flavonil)glicina 8 e da
N-(2-flavonil)glicina 9 a 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina 1 via reacção de cicloadição 1,3-dipolar (Esquema 2.2).
NH N N HN NH N N HN N NH N N HN N O O NH N N HN N O O F5 F5 F5 F5 O O F5 F5 F5 F5 O O NHCH2CO2H F5 F5 F5 F5 F5 F5 F5 F5 O O NHCH2CO2H O O NHCH2CO2H 1 7 8 9 10 11 12 7 8 9 Esquema 2.2
A escolha destes macrociclos tetrapirrólicos para a síntese dos novos derivados, está relacionada com os grupos substituintes que apresentam e com alguns aspectos práticos; a 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina é uma porfirina simétrica de fácil síntese e purificação, que pode ser derivatizada por substituição nucleofílica de átomos de flúor e que é considerada um bom dipolarófilo em reacções de cicloadição 1,3-dipolar.11 Por outro lado, o recente desenvolvimento de técnicas de ressonância magnética nuclear de 19F para aplicação em diagnóstico de neoplasias, indica que esta é mais uma das áreas de possível aplicação destes derivados.12-14 Sabendo que as m-metoxifenilporfirinas têm
demonstrado uma maior afinidade para os tecidos tumorais levou-nos a seleccionar a 5-(4-carboxifenil)-10,15,20-tris(3-metoxifenil)porfirina como a precursora de novos derivados de tipo porfirina-calcona.15-19
Estas porfirinas precursoras foram sintetizadas mediante a condensação de pirrol com os aldeídos adequados para cada um dos casos, segundo uma metodologia descrita por Gonsalves et al.20 A porfirina 1 é uma porfirina simétrica com quatro anéis fenilo pentafluorados nas posições meso e foi preparada por condensação de pirrol com pentafluorobenzaldeído na proporção de 1:1. Já a porfirina 4, foi preparada por condensação de pirrol com 4-carboxibenzaldeído e 3-metoxibenzaldeído, em proporções relativas que favoreçam a formação do macrociclo desejado (1:3). Em ambos os casos, a condensação foi conduzida numa mistura de ácido acético/nitrobenzeno a refluxo (secção 2.5.2).
2.2- Acoplamento de porfirinas a 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona
2.2.1- Acoplamento da 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina a 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona
A primeira evidência da ocorrência de substituição nucleofílica regiosselectiva de átomos de flúor na 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina, data de 1990 quando Kadish et al sintetizaram a 5,10,15,20-tetraquis(2,3,5,6-tetrafluoro-4-dimetilaminofenil)porfirina a partir da reacção daquela porfirina em dimetilformamida (DMF) a refluxo.21 A presença de dimetilamina no meio reaccional é atribuída à decomposição da DMF nas condições reacionais usadas.
Mais tarde, outros autores centraram os seus estudos nas reacções de acoplamento da 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina (e de alguns dos seus complexos metálicos) a nucleófilos como aminas secundárias, alcóxidos e tióis.22 A regiosselectividade apresentada em todos os casos é mediada pela alteração da reactividade do anel aromático após a substituição do átomo de flúor da posição mais reactiva. A substituição na posição para desactiva o anel aromático substituído, tornando-o menos reactivo do que os restantes.
Dada a versatilidade deste tipo de reacções, propusemo-nos a utilizar esta abordagem sintética para a substituição dos átomos de flúor das posições para dos fenilos, com vista ao acoplamento da calcona à porfirina 1.
2.2.1.1- Estudo das condições de acoplamento
O estudo das condições de acoplamento da 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona à 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina 1 foi iniciado usando como solvente o tolueno e como base o carbonato de sódio (Esquema 2.3). À solução de calcona em tolueno adicionou-se um excesso de base, seguido da adição de porfirina 1 (Esquema 2.3). A mistura reaccional foi mantida a refluxo durante 24 horas, ao fim das quais o controle por TLC mostrou que os reagentes de partida continuavam por reagir.
Numa segunda abordagem, resolveu-se substituir o solvente por DMF, mantendo a mesma base e modo de adição. Nestas condições, verificou-se a formação de vários compostos. No entanto, a análise das várias fracções isoladas por espectrometria de massa e por RMN de 1H levou-nos a concluir que não eram os compostos pretendidos.
A terceira tentativa para o acoplamento foi realizada em DMSO (Esquema 2.3). Neste caso, ao adicionar o excesso de base à 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona em DMSO, verificou-se alteração de cor da solução de amarelo para rosa (indicativa de formação do ião fenóxido). Em seguida, adicionou-se a porfirina 1 (2 equivalentes para 1 equivalente de calcona), e manteve-se a mistura reaccional a 50 ºC. Ao fim de três horas verificou-se por TLC que praticamente 50% da porfirina 1 tinha sido convertida num composto novo, de cor rosa, mais polar. A mistura reaccional foi então lavada com água destilada, extraída com clorofórmio, a fase orgânica foi seca através de sulfato de sódio anidro e, posteriormente, concentrada a pressão reduzida. De seguida, procedeu-se à separação por cromatografia em coluna de sílica gel, de acordo com o procedimento descrito na parte experimental (secção 2.5.3.1). Após cristalização numa mistura de diclorometano/metanol, o produto maioritário foi obtido com um rendimento de 44%. A sua caracterização estrutural foi efectuada por RMN (1H, 19F e 13C), espectrometria de massa (FAB+), UV-Vis e análise elementar. Os estudos efectuados estão de acordo com a estrutura proposta para o derivado 2.
NH N N HN F F F F F F F F F F F F F F F F F F F O O R1 2 NH N N HN F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F NH N N HN F F F F F F O F F F F F F F F F F O O R1 O O R1 3 O R1 O O R1 1 a), b) d) c) 44% 33%
X
O C H Ha) Tolueno, refluxo, Na2CO3, 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona, 24 horas; b) DMF, refluxo, Na2CO3, 24 horas; c) DMSO, 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona, Na2CO3, 50 ºC, 3 horas; d) DMSO, 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona, Na2CO3, 100 ºC, 3 horas.
Esquema 2.3
Tendo encontrado as condições experimentais para ligar a porfirina 1 à 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona, propusemo-nos a sintetizar o derivado 3 (Esquema 2.3), resultante da reacção da porfirina 1 com quatro moléculas de calcona.
Com o intuito de forçar a reacção para que ocorra a substituição regiosselectiva de todos os átomos de flúor nas posições para dos quatro fenilos, usou-se um excesso de calcona (6 equivalentes) e aumentou-se a temperatura da reacção para 100 ºC. De forma semelhante ao procedimento anterior, a adição da porfirina 1 à solução de calcona só foi efectuada após alteração da cor da solução. A reacção foi mantida sob agitação, atmosfera inerte e a 100 ºC durante 3 horas, findas as quais se observou por TLC o consumo total do reagente de partida. Após arrefecimento, a mistura reaccional foi lavada com água, extraída com clorofórmio e a fase orgânica foi seca através de sulfato de sódio anidro. De seguida procedeu-se à purificação da mistura reaccional recorrendo a técnicas de cromatografia de acordo com o descrito na parte experimental (secção 2.5.3.2). O produto maioritário da reacção foi caracterizado por RMN (1H, 19F e 13C), espectrometria de massa (FAB+), espectroscopia de UV-Vis e análise elementar, e revelou tratar-se do derivado 3 pretendido. Após cristalização numa mistura de diclorometano/éter de petróleo este derivado foi obtido com um rendimento de 33%.
2.2.2- Acoplamento de 5-(4-carboxifenil)-10,15,20- tris(3-metoxifenil)porfirina a 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona
O acoplamento de 5-(4-carboxifenil)-10,15,20-tris(3-metoxifenil)porfirina a 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona através de uma ligação éster envolveu uma metodologia sintética previamente estudada no nosso grupo para acoplar porfirinas com grupos carboxilo a açúcares e aminoácidos. Segundo esta metodologia, o grupo carboxilo foi activado com N-hidroxi-succinimida. Para tal, fez-se reagir a porfirina 4 com SOCl2 em piridina seca tendo-se verificado por TLC, após 30 minutos de reacção à temperatura ambiente, a conversão total da porfirina de partida no cloreto de acilo correspondente (4A). Findo este período, adicionou-se a N-hidroxi-succinimida e colocou-se a mistura reaccional sob agitação a 50 ºC. Ao fim de 3 horas observou-se, por TLC, a formação de um composto novo de cor rosa. Após arrefecimento, o solvente foi evaporado a pressão reduzida e a mistura reaccional, após retomada em clorofórmio, foi lavada com uma solução básica saturada de hidrogenocarbonato de sódio, extraída com clorofórmio e seca através de sulfato de sódio anidro. De seguida, procedeu-se à purificação da mistura reaccional por cromatografia em coluna de sílica gel usando diclorometano como eluente.
Após cristalização numa mistura de diclorometano/éter de petróleo, este produto de cor rosa, foi caracterizado por RMN de 1H e EM (FAB+) e revelou tratar-se do intermediário 5 pretendido (Esquema 2.4). Há ainda a referir que este composto foi obtido com um rendimento de 97%. NH N N HN C O OH NH N N HN OCH3 C O O N O O OCH3 H3CO H3CO H3CO H3CO a) b) 4 5 NH N N HN OCH3 C O Cl H3CO H3CO 4A 97% a) SOCl2, piridina seca. b) N-hidroxi-succinimida, 50 ºC.
Esquema 2.4
Uma vez sintetizado o éster activado 5, procedeu-se ao seu acoplamento à referida calcona. Um dos factores essenciais para que a síntese ocorra com bons rendimentos é garantir que esta decorra em condições anidras. A presença de água no meio reaccional promove a hidrólise do éster originando o ácido de partida 4.
Também aqui foram testadas várias condições experimentais para o acoplamento destas duas unidades estruturais (Esquema 2.5), encontrando-se os resultados obtidos compilados na Tabela 2.1.
Tabela 2.1- Condições experimentais testadas para a síntese do derivado 6. Solvente Temperatura (ºC) Tempo de reacção (h) Base Rendimento (%) Tolueno 50 5,5 K2CO3 91 THF 50 2,5 K2CO3 93 DMSO ambiente 1,5 K2CO3 97 NH N N HN OCH3 C O O O R1 H3CO H3CO NH N N HN OCH3 C O O N O O H3CO H3CO a) O C H H 5 6
a) DMSO, K2CO3, 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona, temperatura ambiente. Esquema 2.5
Estes estudos foram iniciados em tolueno, na presença de K2CO3, tendo-se verificado que só a 50 ºC, a transformação ocorria de forma eficiente (91%). Na segunda experiência, quando se utilizou THF como solvente, a reacção foi mais rápida e o derivado 6 também foi obtido com óptimo rendimento. Na terceira experiência, onde usámos DMSO como solvente (Esquema 2.5), verificou-se que a reacção ocorre à temperatura ambiente e que ao fim de 1 h e 30 min a conversão foi praticamente total.
A diferença de reactividade observada nas diferentes condições experimentais poderá estar relacionada com a solubilidade do ião fenóxido em cada um dos solventes. De facto, logo após a adição de base à solução de 2’-hidroxi-4-benziloxicalcona em DMSO à temperatura ambiente, verificou-se a rápida alteração de cor da solução de amarelo para rosa, o que não foi observado para as soluções da mesma calcona em tolueno e em THF. A
