FCEyN-INTI
Docente a cargo:
SANTAGAPITA, Patricio
CEBI_E1_8: Espectrometría de masa
Materia de Especialización CEBI_E1
Técnicas de análisis en biotecnología
Módulo I: Moléculas pequeñas.
Módulo II: Macromoléculas.
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Es una técnica instrumental sofisticada que separa y
detecta iones en fase gaseosa. Se basa en ionizar
moléculas
gaseosas
convirtiéndolas
en
iones
(generalmente
cationes),
que
se
separan
al
ser
acelerados por un analizador de masa:
la separación se
basa en la distinta relación m/z de los iones.
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Componentes del instrumento
Introducción de
la muestra
Fuente de
ionización
Separador de
masas
Detector
iónico
Procesador
de señal
Registrador
En este punto sucede el
Patricio Santagapita_CEBI_E1
❖
Ionización por impacto electrónico
❖
Ionización química
❖
Fuente de bombardeo con átomos rápidos
❖
Desorción con láser
❖
Ionización a presión atmosférica:
- Electronebulización asistida con un gas: electrospray
- Ionización química a presión atmosférica
- Fotoionización a presión atmosférica
HPLC
Fuentes de ionización
Ionización por impacto electrónico
placa de repulsión
placas focalizadoras
haz de electrones (70 eV) moléculas neutras moléculas neutras placas aceleradoras (4000 V) filamento de W iones
M + e M.
++ 2e
ion molecularFragmentación del ión molecular
Molécula hipotética ABCD (A, B, C y D = átomos)
Fragmentación del
ion molecular
ABCD.
++ ABCD (ABCD)
2.+
BCD. + ABCDA
+Colisión seguida de
fragmentación
ABCD.
+ADBC.
+BC. + AD
+AD. + BC
+Reordenamiento seguido de
fragmentación
ABCD + e ABCD.
++ 2 e
ABCD.
+A
++ BCD.
A. + BCD
+BC
++ D
CD. + AB
+AB. + CD
+B + A
+A + B
+D + C
+C + D
+Ionización química
CH
4++ CH
4CH
5++ CH
3CH
3++ CH
4C
2H
5++ H
2CH
5++ MH MH
2++ CH
4C
2H
5++ MH M
++ C
2H
6CH
4+ e (alta energía) CH
4+y CH
3+Gas reactivo
metano, isobutano, amoníaco (cámara de
ionización de “alta” presión a 10 torr)
Patricio Santagapita_CEBI_E1
❖
Espectrómetro de masas de sector magnético
❖
Espectrómetro de masas de cuadrupolo
❖
Espectrómetro de masas de tiempo de vuelo
❖
Espectrómetro de masas de trampa iónica
¿cómo se separan los iones de distinta masa?
m
: masa
v
: velocidad de la partícula
m
: masa
z
: carga
V
: diferencia de potencial
F
M= Bzv
F
C= mv
2/r
mv
2/r = Bzv
v = Bzr/m
F
M: fuerza centrípeta
F
C: fuerza centrífuga
B
: campo magnético
r
: radio de curvatura
Bzr/m = (2zV/m)
½m/z = B
2r
2/2V
E
cinética= ½ mv
2= zV
v = (2zV/m)
½Patricio Santagapita_CEBI_E1
Espectrómetro de masas de cuadrupolo
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Patricio Santagapita_CEBI_E1 Po ten cia l corri en te di recta tiempo masa Po ten cia l de rad io frecu en cia
Relación de voltajes durante un barrido de masa con un
analizador cuadrupolo
Patricio Santagapita_CEBI_E1
EM de tiempo de vuelo (TOF: time of flight)
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Espectros de masas
Energía de ionización de la molécula
Grupos funcionales de la molécula
Método de ionización
Presión y temperatura de trabajo
Diseño instrumental
Espectros de masas obtenidos por impacto electrónico
En este ejemplo el pico base se forma por pérdida de CH3Etilbenceno
pico baseion molecular (ion “parent”)
M+ → fragmento de
mayor masa
molécula con número par de N → M+ con masa par
molécula con número impar de N→ M+ con masa impar 4 H → M-4 F → M-19 CH3→ M-15 HF → M-20 NH3 → M-17 C2H2 → M-26 H2O → M-18 Átomos y grupos frecuentemente desplazados
Espectros de masas
de
cloruro de metileno
13C1H 235Cl2 (m= 85) 12C1H 235Cl37Cl (m= 86) 13C1H 235Cl37Cl (m= 87) 12C1H 237Cl2 (m= 88) Picos isotópicos 12C1H 235Cl2 (m= 84)pico base → pérdida de Cl
Patricio Santagapita_CEBI_E1
El ion molecular (m/z = 226) prácticamente no se distingue
Impacto electrónico
Espectros de masas de
pentobarbital (sedante)
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Ionización química
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Separador de chorro (columnas rellenas)
Sistema de
acople
MS-HPLC
Sistema de ionización
Formación de iones gaseosos a partir de analitos en solución
❖
Electronebulización asistida con un gas: electrospray (ESI)
❖
Ionización química a presión atmosférica (APCI) ***
❖
Fotoionización a presión atmosférica (APPI)
Ionización a presión atmosférica
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Electronebulización asistida con un gas o Electrospray (ESI)
1. La fase móvil y el analito se nebulizan (dispersados en pequeñas gotas)
2. El solvente de la fase móvil se evapora de las gotas (desolvatación)
3. La densidad de carga en las gotas aumenta hasta alcanzar el límite Raleigh (108 V/cm3) y luego la gota sufre
explosiones de Coulomb y se rompe en gotas más pequeñas.
4. Bajo la influencia de potenciales electrostáticos en la cámara de spray (nube), el ion analito se desorbe de la gota.
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Patricio Santagapita_CEBI_E1
¿Cuándo es apropiado trabajar en ESI?
-
Solutos ionizables de alto y bajo peso molecular. El analito de
interés debe ser capaz de portar carga en solución
Ejemplos:
a) Muestras que contienen heteroátomos: carbamatos, benzodiacepinas
b) Ácidos o bases
c) Especies iónicas: fosfatos, conjugados con grupos sulfato, aminas, etc
d) Muestras que se multi-cargan en solución (ej: péptidos, proteínas,
oligonucleótidos)
e) Compuestos que pueden aceptar carga inducida
A evitar
: muestras con grupos no polares en los que la inducción de
carga no sea un proceso eficiente
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Fotoionización a presión atmosférica -
APPI
APPI (modo positivo)
El solvente y la muestra se
nebulizan y son completamente
vaporizados por calefacción.
• La ionización del solvente y la
muestra ocurre por bombardeo
con fotones a partir de una
La molécula de analito M se ioniza a ion molecular (si el potencial de ionización del analito es menor a la energía del fotón).
El ion M.+ puede extraer un hidrógeno del solvente para formar
[M+H]+
Un dopante fotoionizable en exceso: rinde muchos iones moleculares.
El analito se ioniza por transferencia protónica a partir del dopante o solvente
El ión molecular del dopante ioniza al analito por transferencia electrónica
Patricio Santagapita_CEBI_E1
¿Cuándo usar APPI?
•
Puede ionizar compuestos que no se ionizan bien con ESI
o APCI (ej: PAHs).
•
Tiene mejor sensibilidad global para algunos compuestos
(THC-tetrahidrocanabinol, ácido benzoico, vitaminas no
hidrosolubles).
•
Tiene mejor sensibilidad a bajas velocidades de flujo que
APCI.
Selección del sistema CL/EM
1.000
No polar
Muy polar
10.000
100.000
Peso
mol
ec
ul
ar
Polaridad del analito
ESI
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Registros gráficos CG-EM y CL-EM
❖
Cromatograma de corriente iónica total
❖
Cromatograma de ión seleccionado
❖
Arreglo tridimensional: señal en función del tiempo (información
cromatográfica) y en función de la relación m/z (información
espectroscópica)
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Combustión de tela tratada con producto ignífugo
Cromatograma de
corriente iónica
total (TIC)
EM de pico 12
(benceno)
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Confirmación presencia de cocaína en orina por CG-masa
Cromatograma de corriente iónica totalEM del pico a 11.5 min
EM de testigo de cocaína (m = 303) a igual tiempo de elución
Cromatograma convencional con detección UV
Mezcla de 6 herbicidas
resuelta por HPLC-masas
Cromatograma de masas de corriente iónica total
Detección de un ion seleccionado m/z = 312 (corresponde a MH+ formado a partir de imazaquina de masa = 311)
Representación de la estructura tridimensional de datos CG-EM en
modo barrido completo (full-scan)
Se obtiene: el cromatograma iónico total, el cromatograma iónico de un ión seleccionado (a determinada masa) y los espectros de masas (a determinados tiempos de retención)
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Varias técnicas pueden acoplarse a espectrometría de masa para
la identificación de proteínas y ácidos nucleicos.
¿Y para macromoléculas?
Componentes básicos
:
Generador de iones Analizador de masas DetectorGeneración de iones:
MALDI :
Matrix Assisted Laser Desorption
–
sin límite
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Las proteínas se mezclan con una matriz, usualmente orgánica, y
se permite que se evapore, y se forman cristales. Sobre la
muestra se aplica un pulso de láser, que produce la desorción y
carga de la proteína.
Matrices
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Patricio Santagapita_CEBI_E1
En una primera etapa los
iones son separados por
m/z y transmitidos a un
segundo cuadrupolo, a partir
de este se transmite un ión
en particular y pasa a la
cámara de colisión.
En la cámara de colisión el
ión es fragmentado por
irradiación con un gas inerte
Los fragmentos del ión
péptidico son luego
resueltos en base a su
relación m/z en el tercer
cuadrupolo.
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Ejemplo de aplicación
MS/MS
Patricio Santagapita_CEBI_E1 http://www.matrixscience.com/search_form
Patricio Santagapita_CEBI_E1 http://www.matrixscience.com/search_form
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Permite el fraccionamiento de una muestra utilizando los principios de
cromatografía, la detección de las proteínas se realiza mediante SELDI
(semejante a MALDI)
Los Chips para proteínas o
Protein chips arrays
están preparados con
diferentes propiedades cromatográficas: - intercambio aniónico
o
catiónico; - afinidad por metal; - fase reversa, etc
•
Proteins are captured, retained and purified directly on the chip (affinity capture ) Sample Laser Molecular Weight 100 mm2 to 1 mm2Chemical, Biochemical or Biological Affinity Capture Surface
The SELDI Process and
The SELDI Process and
ProteinChip
ProteinChip
TMTMArrays
Arrays
•
Sample goes directly onto the ProteinChip™ Array•
Retentate Map™ is “read” by Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization (SELDI)•
Retained proteins can be processed directly on the chipPatricio Santagapita_CEBI_E1
