Módulo I: Moléculas pequeñas. Módulo II: Macromoléculas.

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Texto completo

(1)

FCEyN-INTI

Docente a cargo:

SANTAGAPITA, Patricio

CEBI_E1_8: Espectrometría de masa

Materia de Especialización CEBI_E1

Técnicas de análisis en biotecnología

Módulo I: Moléculas pequeñas.

Módulo II: Macromoléculas.

(2)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Es una técnica instrumental sofisticada que separa y

detecta iones en fase gaseosa. Se basa en ionizar

moléculas

gaseosas

convirtiéndolas

en

iones

(generalmente

cationes),

que

se

separan

al

ser

acelerados por un analizador de masa:

la separación se

basa en la distinta relación m/z de los iones.

(3)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Componentes del instrumento

Introducción de

la muestra

Fuente de

ionización

Separador de

masas

Detector

iónico

Procesador

de señal

Registrador

En este punto sucede el

(4)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Ionización por impacto electrónico

Ionización química

Fuente de bombardeo con átomos rápidos

Desorción con láser

Ionización a presión atmosférica:

- Electronebulización asistida con un gas: electrospray

- Ionización química a presión atmosférica

- Fotoionización a presión atmosférica

HPLC

Fuentes de ionización

(5)

Ionización por impacto electrónico

placa de repulsión

placas focalizadoras

haz de electrones (70 eV) moléculas neutras moléculas neutras placas aceleradoras (4000 V) filamento de W iones

M + e M.

+

+ 2e

ion molecular

(6)

Fragmentación del ión molecular

Molécula hipotética ABCD (A, B, C y D = átomos)

Fragmentación del

ion molecular

ABCD.

+

+ ABCD (ABCD)

2.+

BCD. + ABCDA

+

Colisión seguida de

fragmentación

ABCD.

+

ADBC.

+

BC. + AD

+

AD. + BC

+

Reordenamiento seguido de

fragmentación

ABCD + e ABCD.

+

+ 2 e

ABCD.

+

A

+

+ BCD.

A. + BCD

+

BC

+

+ D

CD. + AB

+

AB. + CD

+

B + A

+

A + B

+

D + C

+

C + D

+

(7)

Ionización química

CH

4+

+ CH

4

CH

5+

+ CH

3

CH

3+

+ CH

4

C

2

H

5+

+ H

2

CH

5+

+ MH MH

2+

+ CH

4

C

2

H

5+

+ MH M

+

+ C

2

H

6

CH

4

+ e (alta energía) CH

4+

y CH

3+

Gas reactivo

metano, isobutano, amoníaco (cámara de

ionización de “alta” presión a 10 torr)

(8)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Espectrómetro de masas de sector magnético

Espectrómetro de masas de cuadrupolo

Espectrómetro de masas de tiempo de vuelo

Espectrómetro de masas de trampa iónica

(9)
(10)

¿cómo se separan los iones de distinta masa?

m

: masa

v

: velocidad de la partícula

m

: masa

z

: carga

V

: diferencia de potencial

F

M

= Bzv

F

C

= mv

2

/r

mv

2

/r = Bzv

v = Bzr/m

F

M

: fuerza centrípeta

F

C

: fuerza centrífuga

B

: campo magnético

r

: radio de curvatura

Bzr/m = (2zV/m)

½

m/z = B

2

r

2

/2V

E

cinética

= ½ mv

2

= zV

v = (2zV/m)

½

(11)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Espectrómetro de masas de cuadrupolo

(12)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

(13)

Patricio Santagapita_CEBI_E1 Po ten cia l corri en te di recta tiempo masa Po ten cia l de rad io frecu en cia

Relación de voltajes durante un barrido de masa con un

analizador cuadrupolo

(14)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

EM de tiempo de vuelo (TOF: time of flight)

(15)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Espectros de masas

Energía de ionización de la molécula

Grupos funcionales de la molécula

Método de ionización

Presión y temperatura de trabajo

Diseño instrumental

(16)

Espectros de masas obtenidos por impacto electrónico

En este ejemplo el pico base se forma por pérdida de CH3

Etilbenceno

pico base

ion molecular (ion “parent”)

M+ → fragmento de

mayor masa

molécula con número par de N → M+ con masa par

molécula con número impar de N→ M+ con masa impar 4 H → M-4 F → M-19 CH3→ M-15 HF → M-20 NH3 → M-17 C2H2 → M-26 H2O → M-18 Átomos y grupos frecuentemente desplazados

(17)

Espectros de masas

de

cloruro de metileno

13C1H 235Cl2 (m= 85) 12C1H 235Cl37Cl (m= 86) 13C1H 235Cl37Cl (m= 87) 12C1H 237Cl2 (m= 88) Picos isotópicos 12C1H 235Cl2 (m= 84)

pico base → pérdida de Cl

(18)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

El ion molecular (m/z = 226) prácticamente no se distingue

Impacto electrónico

Espectros de masas de

pentobarbital (sedante)

(19)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Ionización química

(20)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Separador de chorro (columnas rellenas)

(21)

Sistema de

acople

MS-HPLC

Sistema de ionización

Formación de iones gaseosos a partir de analitos en solución

Electronebulización asistida con un gas: electrospray (ESI)

Ionización química a presión atmosférica (APCI) ***

Fotoionización a presión atmosférica (APPI)

Ionización a presión atmosférica

(22)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Electronebulización asistida con un gas o Electrospray (ESI)

1. La fase móvil y el analito se nebulizan (dispersados en pequeñas gotas)

2. El solvente de la fase móvil se evapora de las gotas (desolvatación)

3. La densidad de carga en las gotas aumenta hasta alcanzar el límite Raleigh (108 V/cm3) y luego la gota sufre

explosiones de Coulomb y se rompe en gotas más pequeñas.

4. Bajo la influencia de potenciales electrostáticos en la cámara de spray (nube), el ion analito se desorbe de la gota.

(23)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

(24)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

¿Cuándo es apropiado trabajar en ESI?

-

Solutos ionizables de alto y bajo peso molecular. El analito de

interés debe ser capaz de portar carga en solución

Ejemplos:

a) Muestras que contienen heteroátomos: carbamatos, benzodiacepinas

b) Ácidos o bases

c) Especies iónicas: fosfatos, conjugados con grupos sulfato, aminas, etc

d) Muestras que se multi-cargan en solución (ej: péptidos, proteínas,

oligonucleótidos)

e) Compuestos que pueden aceptar carga inducida

A evitar

: muestras con grupos no polares en los que la inducción de

carga no sea un proceso eficiente

(25)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Fotoionización a presión atmosférica -

APPI

APPI (modo positivo)

El solvente y la muestra se

nebulizan y son completamente

vaporizados por calefacción.

• La ionización del solvente y la

muestra ocurre por bombardeo

con fotones a partir de una

(26)
(27)

La molécula de analito M se ioniza a ion molecular (si el potencial de ionización del analito es menor a la energía del fotón).

El ion M.+ puede extraer un hidrógeno del solvente para formar

[M+H]+

Un dopante fotoionizable en exceso: rinde muchos iones moleculares.

El analito se ioniza por transferencia protónica a partir del dopante o solvente

El ión molecular del dopante ioniza al analito por transferencia electrónica

(28)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

¿Cuándo usar APPI?

Puede ionizar compuestos que no se ionizan bien con ESI

o APCI (ej: PAHs).

Tiene mejor sensibilidad global para algunos compuestos

(THC-tetrahidrocanabinol, ácido benzoico, vitaminas no

hidrosolubles).

Tiene mejor sensibilidad a bajas velocidades de flujo que

APCI.

(29)

Selección del sistema CL/EM

1.000

No polar

Muy polar

10.000

100.000

Peso

mol

ec

ul

ar

Polaridad del analito

ESI

(30)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Registros gráficos CG-EM y CL-EM

Cromatograma de corriente iónica total

Cromatograma de ión seleccionado

Arreglo tridimensional: señal en función del tiempo (información

cromatográfica) y en función de la relación m/z (información

espectroscópica)

(31)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Combustión de tela tratada con producto ignífugo

Cromatograma de

corriente iónica

total (TIC)

EM de pico 12

(benceno)

(32)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Confirmación presencia de cocaína en orina por CG-masa

Cromatograma de corriente iónica total

EM del pico a 11.5 min

EM de testigo de cocaína (m = 303) a igual tiempo de elución

(33)

Cromatograma convencional con detección UV

Mezcla de 6 herbicidas

resuelta por HPLC-masas

Cromatograma de masas de corriente iónica total

Detección de un ion seleccionado m/z = 312 (corresponde a MH+ formado a partir de imazaquina de masa = 311)

(34)

Representación de la estructura tridimensional de datos CG-EM en

modo barrido completo (full-scan)

Se obtiene: el cromatograma iónico total, el cromatograma iónico de un ión seleccionado (a determinada masa) y los espectros de masas (a determinados tiempos de retención)

(35)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Varias técnicas pueden acoplarse a espectrometría de masa para

la identificación de proteínas y ácidos nucleicos.

¿Y para macromoléculas?

Componentes básicos

:

Generador de iones Analizador de masas Detector

Generación de iones:

MALDI :

Matrix Assisted Laser Desorption

sin límite

(36)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Las proteínas se mezclan con una matriz, usualmente orgánica, y

se permite que se evapore, y se forman cristales. Sobre la

muestra se aplica un pulso de láser, que produce la desorción y

carga de la proteína.

Matrices

(37)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

(38)
(39)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

En una primera etapa los

iones son separados por

m/z y transmitidos a un

segundo cuadrupolo, a partir

de este se transmite un ión

en particular y pasa a la

cámara de colisión.

En la cámara de colisión el

ión es fragmentado por

irradiación con un gas inerte

Los fragmentos del ión

péptidico son luego

resueltos en base a su

relación m/z en el tercer

cuadrupolo.

(40)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Ejemplo de aplicación

MS/MS

(41)

Patricio Santagapita_CEBI_E1 http://www.matrixscience.com/search_form

(42)
(43)
(44)

Patricio Santagapita_CEBI_E1 http://www.matrixscience.com/search_form

(45)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

(46)
(47)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Permite el fraccionamiento de una muestra utilizando los principios de

cromatografía, la detección de las proteínas se realiza mediante SELDI

(semejante a MALDI)

Los Chips para proteínas o

Protein chips arrays

están preparados con

diferentes propiedades cromatográficas: - intercambio aniónico

o

catiónico; - afinidad por metal; - fase reversa, etc

(48)

Proteins are captured, retained and purified directly on the chip (affinity capture ) Sample Laser Molecular Weight 100 mm2 to 1 mm2

Chemical, Biochemical or Biological Affinity Capture Surface

The SELDI Process and

The SELDI Process and

ProteinChip

ProteinChip

TMTM

Arrays

Arrays

Sample goes directly onto the ProteinChip™ Array

Retentate Map™ is “read” by Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization (SELDI)

Retained proteins can be processed directly on the chip

(49)
(50)

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Para la identificación de las bandas que salen de la CE, muchas

veces se acopla la misma a un espectrómetro de masa.

Para ello es necesario primero someter la muestra a una

ionización por

electrospray

, lo que requiere que el

buffer

de

corrida sea volátil. Esto altera la resolución del sistema.

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Referencias

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