Desarrollo de nuevas líneas
celulares permisivas a PRRSV, y
sus implicaciones próximas
Introducción
• Primera descripción de la enfermedad a finales de los 80
(USA) y principios de los 90 (Europa) – “Enfermedad misteriosa del cerdo”. Posteriormente se descubrió su etiología vírica y se denominó Síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS)
• Probablemente una de las enfermedades más devastadoras
del sector porcino. En un estudio reciente realizado en los EE.UU los costes asociados a PRRS en ese país, se han estimado en 530,6 millones de dólares*, o lo que es lo
mismo, entre 5,6 y 7,6 dólares por cada cerdo que se envía al rastro
* Johnson, C et al. 2012. The impact of PRRS on the cost of Pig production. National Pork Board.
Introducción
• Virus por primera vez aislado en 1991 (Europa – Lelystad
Virus) y 1992 (USA – VR-2332)
• El aislamiento se realizó, inicialmente, en Macrófagos
Alveolares Porcinos (MAPs), ya que no era posible crecerlo en líneas celulares establecidas
– Necesidad de sacrificar lechones (los macrófagos no se
multiplican)
– No uniformidad en el número de células obtenidas;
diferencias en títulos víricos
– Contaminaciones frecuentes (flora del cerdo)
Macrófagos Alveolares Porcinos
En 1992, aparece la primera línea celular
que permitía crecer el virus
MARC-145
Características
• Obtenida a partir de un clon susceptible de la línea MA-104,
una línea celular de riñón de mono verde africano.
Posteriormente se produjeron nuevos clones a partir de misma línea celular dando origen a la línea MARC-145
• En la actualidad, el crecimiento del virus PRRS en células de
simio, está protegido por patente en algunos países.
– Permitido para uso en investigación
¿Por qué Pfizer investiga en PRRS?
• Pfizer es una compañía líder en CRP
• PRRS es una enfermedad muy interesante para nuestro
departamento de investigación y desarrollo
• Distribución mundial de la enfermedad (aunque dos
tipos muy diferenciados)
• Múltiples retos; enorme variabilidad genética y
antigénica
• Con incremento en virulencia en varias regiones
¿Por qué Pfizer investiga en PRRS?
•
Grupo de investigación en PRRS con más de 20 años
de experiencia propia y/o con colaboraciones
•
Avances generados en el conocimiento genético del
virus y de sus proteínas estructurales
•
Primer clon infeccioso de ADN complementario de
un virus PRRSV tipo 2
•
Primer uso del virus PRRSV como vector
¿Qué es el receptor CD163?
• El CD163 es una glicoproteína de membrana específica
que se expresa en la superficie de los macrófagos
• CD163 está involucrado en el reconocimiento de varios
ligandos y patógenos como el virus de la Fiebre Porcina Africana.
• En el año 2007 nuestros científicos descubrieron que un
receptor, denominado CD163, estaba involucrado en la penetración del PRRSV en las células
– Anticuerpos monoclonales frente al CD163 bloqueaban la
El CD163 hace que las células sean permisivas
• Se realizaron librerías de cADN a partir de Macrófagos
Alveolares que se seleccionaron por su habilidad de hacer que células no de simio fueran susceptibles al PRRSV. • Se identificó el CD163 como el receptor primario frente
al virus. La transfección transitoria del cDNA fue
necesaria y suficiente para hacer que diferentes líneas celulares fueran permisivas a PRRSV.
• Posteriormente hemos creado líneas celulares que de
modo continuo expresan el receptor CD163 en su superficie, permitiendo la replicación del virus.
• Dichas líneas proceden de diferentes especies, BHK21
(riñón de hamster), PK0809 (riñón porcino), y NLFK (riñón felino).
Implicaciones Futuras
Evidentemente, la más cercana es la generación de nuevas vacunas
Vacunación frente a PRRSV hoy
• Existen tanto vacunas vivas como muertas
• Ampliamente usadas, junto con otras estrategias
– Vacunación en primerizas
– Vacunación en cerdas
– Vacunación en lechones
• Han sido útiles, pero todavía no han controlado totalmente el
problema*
*Yoo, D. 2008. Development of stable cell lines permissive for PRRSV replication and production. National Pork Board. Research Report. NPB 06-145. http://www.pork.org/ResearchDetail/603/Developmentofstablec.aspx
Desafíos presentes en PRRSV
• Alta tasa de mutación y variación genética
La inmunidad natural es limitada frente a cepas heterólogas
• Mecanismos de evasión del sistema inmune
- El virus induce la producción temprana de Interleukina 10 – una citoquina antiinflamatoria muy potente
- La producción de Interferón-α está suprimida en algunas cepas del
virus
Diferente línea celular: diferentes propiedades
• La atenuación es un proceso evolutivo• El virus acumula mutaciones que le permiten crecer de forma eficiente
en la línea celular
• Al mismo tiempo pierde propiedades que son útiles para su
multiplicación en el cerdo
• Las presiones selectivas son diferentes dependiendo de la
línea celular utilizada y, por ello, los virus vivos atenuados en diferentes líneas celulares tienen propiedades diferentes
• Estas líneas celulares permitirán el desarrollo de nuevas vacunas,
tanto muertas como vivas modificadas frente a PRRS y potencialmente con nuevas propiedades
• De hecho, ya hemos obtenido el virus tipo 2 Master para el desarrollo
de una vacuna (ya disponible en US) mediante el pase en células no
de simio como de riñón porcino, CD163+ PK y células de riñón de
hamster, CD163+ BHK que expresan el receptor CD163
MAPs Células
PK-CD163 Células PK-CD163 Células BHK-CD163
Clonaje molecular
(clon de ADN complementario infectivo)
Desarrollo actual
Desarrollo actual
A pesar de su paso en células BHK el virus de la vacuna de Pfizer replica bien in vitro en MAPs y sus predecesores
perdieron genes que inhiben la liberación de ciertos interferones por las células del hospedador
Nuevas oportunidades en el futuro
El tener un clon infectivo de ADN complementario y una línea susceptible permitirá en un futuro el alterar el genoma del PRRSV y por lo tanto:
– Identificar factores de virulencia y construir virus genéticamente
atenuados
– El desarrollo de Vacunas DIVA
– Utilizar el virus del PRRS como vector adicionando genes que