Predictive analysis of superficial fluorescence patterns in non-melanoma skin cancer during photodynamic therapy

Type: Research Paper Section: Biophotonics

Predictive analysis of superficial fluorescence patterns in

non-melanoma skin cancer during photodynamic therapy

Análisis predictivo de los patrones de fluorescencia superficiales en

cáncer de piel no melanoma durante la terapia fotodinámica

I. Salas-García*, F. Fanjul-Vélez, J. L. Arce-Diego

S

Grupo de Técnicas Ópticas Aplicadas. Departamento TEISA, Universidad de Cantabria, Av. de los Castros S/N, 39005 Santander, Cantabria, España.

(*) _{E-mail: [email protected] S: SEDOPTICA member}

Received: 09/09/2015 Accepted: 16/02/2016 DOI: 10.7149/OPA.49.1.7

ABSTRACT:

Non-invasive treatment monitoring is one of the key elements to assess the photosensitizer activation during the photochemical process underlying Photodynamic Therapy (TFD) by its fluorescence. Furthermore the photosensitizer fluorescence can be employed to discriminate the pathological tissue from the healthy one. In this work the superficial fluorescence patterns in three different types of nonmelanoma skin cancer tumors and their photodynamic treatment response are analysed by a fluorescence based dosimetric model for PDT with topical MAL-PpIX. Results show differences of even more than 50% in the fluorescence patterns as the treatment progresses depending on the malignant tissue type. They demonstrate the great relevance of the biological media as an additional dosimetric factor within the photodynamic context. These results contribute to the development of a future customized therapy with the assistance of dosimetric tools to interpret the fluorescence images obtained during the treatment monitoring as well as in differential photodiagnosis.

Key words: Photodynamic Therapy, fluorescence, photodiagnosis, nonmelanoma skin cancer, dosimetry, photosensitizer.

RESUMEN:

La monitorización no invasiva es uno de los elementos claves para analizar la activación del fotosensibilizador durante el proceso fotoquímico subyacente a la Terapia Fotodinámica (TFD) mediante su fluorescencia. Esta última se puede emplear también para discriminar el tejido patológico del sano. En este trabajo se analizan los patrones de fluorescencia superficial en tres tipos diferentes de cáncer de piel no melanoma, así como su respuesta al tratamiento fotodinámico, mediante un modelo dosimétrico para TFD con MAL-PpIX. Los resultados obtenidos muestran diferencias incluso mayores del 50% en los patrones de fluorescencia a medida que progresa el tratamiento dependiendo del tipo de tejido maligno. Lo que demuestra la gran relevancia del medio biológico como factor dosimétrico adicional en el contexto fotodinámico. Estos resultados contribuyen al futuro de desarrollo de una terapia personalizada asistida mediante herramientas dosimétricas para interpretar las imágenes de fluorescencia obtenidas durante la monitorización del tratamiento y el fotodiagnóstico diferencial.

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1. Introducción

fotosensibilizador en varios tumores comunes de cáncer de piel no melanoma (carcinoma basocelular nodular (CBCN), carcinoma basocelular infiltrativo (CBCI) y carcinoma de células escamosas (CCE)). Se han escogido estas tres patologías, aunque para alguna de ellas la TFD no esté aún aprobada, debido a su tipología como cáncer de piel no melanoma, y no lesiones precursoras, de tal manera que su potencial de riesgo hace interesante plantearse el uso de la TFD. El análisis llevado a cabo permite evaluar la relevancia del tipo de tumor empleando un modelo tridimensional para TFD que proporciona la evolución de los principales fenómenos involucrados en el proceso fotodinámico junto con los patrones de fluorescencia superficiales y en profundidad a medida que progresa el tiempo de tratamiento. Los resultados específicos para cada tipo de tumor podrían ser útiles como herramienta de asistencia clínica tanto para planificar la respuesta al tratamiento como para monitorizar su progresión. En la sección 2 se describe brevemente el modelo dosimétrico para TFD-MAL empleado. Su aplicación en los tres tipos de cáncer de piel se presenta en la sección 3 junto a los resultados obtenidos. Finalmente en la sección 4 se presentan las conclusiones más relevantes de este trabajo.

2. Descripción del modelo dosimétrico para la monitorización de fluorescencia

superficial durante la TFD-MAL

A continuación se describe brevemente la fundamentación del modelo empleado para obtener la evolución de los fenómenos involucrados en la TFD. Tal y como se indicó anteriormente, el fotosensibilizador de uso tópico MAL, es un precursor del elemento fotoactivo PpIX. Tras la administración tópica del MAL en la superficie cutánea, se produce un proceso de difusión a través de las diferentes capas de la piel y a continuación una transformación metabólica en la PpIX. Diferentes estudios han demostrado la gran influencia que tiene la capa córnea de la epidermis en el proceso de difusión del precursor hacia las capas más profundas de la piel y su distribución inhomogénea en el tejido. Para obtener dicha distribución durante el periodo de incubación de 3 horas impuesto por el protocolo para Metvix, se empleó la ley de difusión de Fick teniendo en cuenta la permeabilidad de la capa córnea K y el coeficiente de difusión D en el tejido tal y como se indica en (1) [9]. Donde τ es el tiempo de relajación del precursor como consecuencia de la generación del fotosensibilizador y otros procesos como el flujo linfático y la perfusión sanguínea y

M

₀ es la concentración inicial de precursor aplicada en la superficie del tumor. Esta última se obtuvo a partir de las indicaciones relacionadas con la administración de la crema Metvix® _{que se recogen en el protocolo clínico, considerando en todos los casos una lesión con una} extensión superficial circular, la densidad de precursor en la crema y su masa molecular.

M(t)=M_o K Dπt′e

−z2 4Dt′−K

2

D e

K Dz_e

K2

Dt′_erfc K

D t′+ z

2 Dt′ ⎛ ⎝⎜ ⎞ ⎠⎟ ⎛ ⎝ ⎜ ⎞ ⎠ ⎟e− ′

t

τ_dt′

0

t

∫

(1)

La concentración de PpIX producida endógenamente, S₀, es proporcional a la concentración instantánea de MAL, M , cuando el tiempo de relajación de la PpIX es mucho más pequeño que el tiempo de difusión del MAL y se puede obtener con la expresión (2).

0( ) ( ) p p

a p

S t ε τ M t

τ →

= (2)

La interacción fotoquímica que tiene lugar entre la luz, el fotosensibilizador y el oxígeno presente en el tejido se modeló mediante un sistema de ecuaciones diferenciales (3)-(8) que permite obtener la evolución temporal de los componentes moleculares en los diferentes puntos de la muestra de tejido [10, 11]. Las soluciones del sistema de ecuaciones se obtuvieron mediante una herramienta de resolución de ecuaciones diferenciales disponible en la plataforma Matlab®_{. En estas ecuaciones, S}

0

⎡⎣ ⎤⎦ es la

concentración de fotosensibilizador en estado base, _{⎡⎣ ⎤⎦}S₁ es la concentración de fotosensibilizador en estado singlete excitado, _{⎡⎣ ⎤⎦}T es la concentración de fotosensibilizador en estado triplete excitado, 3_O

2

⎡⎣ ⎤⎦ es la concentración de oxígeno en estado base, 1_O

2

⎡⎣ ⎤⎦ es la concentración de oxígeno singlete, _{⎡⎣ ⎤⎦}R es la

concentración de receptores intracelulares del oxígeno singlete, _{⎡⎣ ⎤⎦i}C es la concentración se scavengers, τ₁ es el tiempo de relajación del estado S₁ a S₀, τ₃ es el tiempo de relajación del estado T a S₀, τ₀ es el tiempo de relajación del estado 1

2

O a 3 2

13

η es el rendimiento cuántico de transición de S₁ a T ,

_η

₃₀ es el rendimiento cuántico de transición de T a S₀, η₀ es el rendimiento cuántico de transición de 1

2

O a 3 2

O , α_s es el factor de eficiencia para la transferencia de energía de T a 3

2

O ,

kpb

es la tasa de fotoquemado biomolecular, kcx es la tasa de citotoxicidad biomolecular, ksc es la tasa de reacción del 1

2

O con varios scavengers, ν es la velocidad de la luz en el tejido, ρ es la densidad de fotones,

σ

_psa es la sección transversal de absorción de las moléculas de S₀, P es la tasa de difusión y perfusión de oxígeno y U es la tasa de reparación de daño celular.

1 3

0 10 30

0 2 0 1 2

[ ]

[ ] [ ][ ] [ ] [ ] [ ][ ]

1 3 3

psa

d S _{S kpb O S S T} s _{T O}

dt

η

η

α

νρσ

τ

τ

τ

=− − + + + ; (3)

1

1 0

[ ] 1

[ ] [ ]

1 psa

d S

S S

dt −

τ

+

νρσ

; (4)

3

30 13

2 1

[ ]

[ ] [ ][ ] [ ]

3 3 1

d T s

T T O S

dt

η

α

η

τ

τ

τ

=− − + ; (5)

3

3 0 1

2

2 2

[ ]

[ ][ ] [ ]

3 0

d O s

T O O P

dt

η α

τ τ

=− + + ; (6)

1

1 1 1 0 1 3

2

0 2 2 2 2 2

0

[ ]

[ ][ ] [ ][ ] [ ] [ ] [ ] [ ][ ]

3

i

d O s

kpb S O kcx R O ksc C O O T O

dt

η

α

τ

τ

=− − − − + ; (7)

1 2

[ ]

[ ][ ]

d R

kcx O R U

dt =− + (8)

La distribución de la radiación óptica de excitación en medios turbios, fuertes dispersores de la luz, y con grandes variaciones en sus propiedades ópticas, como son los tejidos biológicos, se puede obtener en una muestra de tejido en tres dimensiones mediante la Teoría de Transporte de la Radiación (RTT) asumiendo scattering múltiple y despreciando los efectos de interferencia y polarización. En el estado estacionario cuando la fuente de luz ha iluminado la muestra de tejido durante el tiempo suficiente de forma que los niveles de luz han alcanzado el equilibrio, y en una región libre de fuentes, la ecuación RT puede expresarse como en la ecuación (9), donde el parámetro básico es la intensidad específica

I r s

( , )

ˆ

o potencia por unidad de área por unidad de ángulo sólido. Para resolver la ecuación RT en el estado estacionario se empleó el método de Monte Carlo de Wang y Jacques [12]. Esta implementación es multicapa, con sus bordes perpendiculares al haz de la fuente óptica y por lo tanto adecuada para el cálculo de la distribución óptica en medios estratificados como la piel. En este trabajo se consideraron las propiedades ópticas de cada capa de tejido a la longitud de onda de la TFD (635 nm).

4

ˆ· ( , )ˆ ( ) ( , )ˆ (ˆ ˆ· ) ( , )ˆ

4 s

a s

s I r s I r s p s s I r s d

π

µ

µ µ

π

′ ′ ′

∇ =− + +

_∫

Ω (9)

La emisión de fluorescencia del fotosensibilizador en cada punto de la muestra del tejido (705 nm) se obtuvo a partir de la densidad de fotones de excitación absorbidos por las moléculas de fotosensibilizador y el rendimiento cuántico de fluorescencia η₁₀ [13]. La distribución espacial no uniforme de fluoróforo y su variación temporal provoca que la densidad de potencia generada en las fuentes emisoras de fluorescencia en cada posición del tejido varíen a lo largo del tratamiento como se expresa en (10). En esta ecuación ν es la velocidad de la luz en el tejido, ρ es la densidad local de fotones y

σ

_psa es la sección transversal de absorción delas moléculas de fotosensibilizador. Efoton_λem =h c· /

λ

em es la energía de fotón a la longitud de onda de emisión de fluorescencia

_λ

_em, h es la constant de Planck y c es la velocidad de la luz en el vacío.

0 10

( , , ) · · ·[ ]· · _em

f psa photon

P r z t =v

ρ σ

S

η

E _λ (10)

sufren una variación espacial y temporal dinámica [8]. Así, en un instante determinado del tratamiento, la fluorescencia total que escapa de la superficie del tumor J_f en una determinada posición radial r se puede obtener acumulando el flujo que escapa en superficie producido por cada fluente de potencia de fluorescencia tal y como se expresa en (11). En esta ecuación r_s y z_s son las coordenadas de la fuente de fluorescencia, ΔV r z

(

s, s

)

es el volumen incremental asociado con la posición de la fuente y T r z r

(

s, ,s

)

es

la función de transferencia de fluorescencia desde la fuente hasta la superficie del tejido [8].

( , ) ( , , ) ( , ) ( , , )

s s

f f s s s s s s

r z

J r t =

∑ ∑

P r z t V r z T r z rΔ (11)

3. Aplicación del modelo: resultados y discusión

El modelo dosimétrico para TFD-MAL descrito anteriormente se aplicó a tres tipos diferentes de cáncer de piel no melanoma: CBCI, CBCN y CCE. Se consideró en todos los casos una lesión de radio superficial 1 cm y 3 mm de profundidad. Las propiedades ópticas empleadas para los diferentes tipos de tejido a la longitud de onda de tratamiento y de emisión de fluorescencia se recogen en la Tabla 1 [15]. En todos los casos se consideró un haz óptico cilíndrico de 0.3 cm de radio perpendicular a la muestra de tejido, una irradiancia de 100 mW/cm2 _{y un tiempo de radiación de 10 minutos.}

TABLA 1.Propiedades ópticas de los tejidos a las longitudes de onda de excitación y de emisión (µa: coeficiente de absorción;

s

µ : coeficiente de scattering).

Longitud de onda de excitación (635 nm) Tipo de tejido µa(cm

-1₎

s

µ (cm-1)

CBCI 1.5 142.85

CBCN 1.5 104.76

CCE 2 95.238

Longitud de onda de emisión (705 nm) Tipo de tejido µa(cm

-1₎

s

µ (cm-1₎

CBCI 1.5 100

CBCN 0.8 90

CCE 1 85

La concentración inicial de MAL aplicada en la superficie de la lesión se calculó en base a las especificaciones del protocolo clínico para Metvix®_{, donde se recomienda la aplicación de 1 mm de grosor} de crema cubriendo 5 mm extra de piel sana alrededor de la patología y un periodo de incubación de 3 horas antes de aplicar la radiación óptica. Así, teniendo en cuenta una densidad de 160 mg de MAL por gramo de crema Metvix® _{y su masa molecular, se obtuvo una concentración inicial de precursor de PpIX} de 4.5·1020 _cm-3 _{sobre la superficie del tumor. Se adoptaron valores empleados comúnmente tanto para el} coeficiente de difusión a través de la epidermis y la dermis, 0.69·10-10 _m2_{/s, así como para la} permeabilidad de la capa cornea, 10-6 _{m/s. Una descripción más detallada de los parámetros empleados} para el modelado de la interacción fotoquímica se puede consultar en trabajos previos [16].

casos, la monitorización espacio-temporal de la señal de fluorescencia emitida por el fotosensibilizador podría ser un indicador adecuado para estimar de forma no invasiva la generación del agente citotóxico a partir de la señal de fluorescencia detectada en la superficie tumoral durante el tratamiento fotodinámico. En la Fig. 2 se representa la dependencia temporal de la fluorescencia media que escapa de la superficie del CBCI en función de la coordenada radial. Se llevaron a cabo un total de 10 iteraciones del modelo, de naturaleza pseudoaleatoria, para cada tipo de cáncer de piel, empleando valores promedio de propiedades ópticas y fotoquímicas, y su distribución particular de fuentes de fluorescencia en diferentes instantes temporales. Las barras de error representan la desviación estándar de los valores de irradiancia óptica de fluorescencia en cada punto de la dirección radial para el total de 10 iteraciones. Tal y como se puede observar el aumento de la degradación del fotosensibilizador como consecuencia del fotoquemado y la absorción de la señal de fluorescencia particular en cada patología produce una disminución de la fluorescencia que escapa en la superficie del tumor a medida que progresa el tiempo de tratamiento. Igualmente se puede observar el efecto del radio del haz óptico sobre el área superficial de máxima emisión. Lo que pone de manifiesto la necesidad de disponer de modelos tridimensionales para evaluar la influencia del perfil del haz óptico empleado sobre la predicción obtenida.

Fig.1. Absorción de fluorescencia (W / cm2_{) en el CBBI tras a) 6 s y b) 600 s de irradiación, y distribución de} 1_{O2 (cm}-3_{)en los mismos}

instantes temporales c) y d) respectivamente, (nótese la diferente escala en los gráficos).

Fig.2. Fluorescencia que escapa en la superficie del CBCI (W/cm2_{) vs. componente radial en diferentes instantes temporales a lo largo}

Los patrones de fluorescencia superficial obtenidos a medida que transcurre el tratamiento fotodinámico para los diferentes tipos de tejido maligno se representan en la Fig. 3 donde se pueden observar claras diferencias dependiendo del tejido tratado. Como se puede observar, a pesar de que su tendencia espaciotemporal es similar en los tres tipos de tumor (CBCI, CBCN, CCE) bajo las mismas condiciones de tratamiento, la fluorescencia detectada en la superficie varía para cada lesión en los diferentes instantes temporales a lo largo del tratamiento (instante temporal al comienzo del tratamiento Fig. 3 a), en el primer minuto Fig. 3 b), a mitad del tratamiento Fig. 3 c) y al final Fig. 3 d)).

La cuantificación estadística de las diferencias encontradas en el área de incidencia directa del haz óptico revela un incremento medio por encima del 50 % entre el CBCN y el CBCI a lo largo de todo el tratamiento (50.39 % en el primer minuto, 58.22 % a mitad del tratamiento y 56.51 % al final). Esta diferencia se reduce ligeramente si se compara el CCE y el CBCI a 35.30 %, 40.62 % y 39.46 % respectivamente. La discriminación entre patologías se reduce considerablemente entre el CBCN y el CCE. En cuyo caso la diferencia se reduce a 11.18 %, 12.53 % y 12.25 %. Este tipo de resultados son de gran ayuda para la monitorización personalizada de la evolución del tratamiento fotodinámico y además reflejan la importancia del tipo de tumor para planificar adecuadamente el tratamiento ya que los patrones de fluorescencia tienen una relación directa con la degradación del fotosensibilizador durante la reacción fotoquímica y en consecuencia con la generación de agente citotóxico. Igualmente las diferencias observadas en los instantes iniciales del tratamiento, a tan solo 1·10-8 _{s cuando aún no se ha producido} agente citotóxico, le confieren al modelo presentado utilidad desde el punto de vista del fotodiagnóstico diferencial. Las diferencias estadísticamente significativas en la emisión de fluorescencia superficial, así como la falta de solapamiento entre las desviaciones estándar, apoyan la viabilidad de herramientas predictivas tanto para la monitorización del tratamiento como para el fotodiagnóstico.

Fig.3. Fluorescencia que escapa en la superficie (W/cm2_{) del CBCN, CBCI y del CCE vs. la componente radial en diferentes instantes}

temporales del tratamiento: a) al comienzo (1·10-8 _{s), b) en el primer minuto, c) a la mitad y d) al final. Las barras de error}

representan la desviación estándar de los valores de irradiancia óptica de fluorescencia en cada punto de la dirección radial para el total de 10 iteraciones.

3. Conclusiones

Este modelo predictivo contempla, por un lado, la distribución de la propagación óptica en el tejido biológico. Por otro, tiene en cuenta la distribución del fotosensibilizador tópico Metvix®_{. Mediante un}

completo modelo fotoquímico se estima la distribución espacial de las fuentes de fluorescencia, y se genera la propagación de la radiación proveniente de dichas fuentes hasta la superficie del tejido.

Los resultados obtenidos revelan diferencias incluso superiores al 50 % dependiendo del tipo de tumor y una relación inherente con la generación del agente citotóxico encargado de la destrucción de las células tumorales. De manera cuantitativa, estas diferencias se explicitan, entre el CBCN y el CBCI a lo largo de todo el tratamiento, en un 50.39 % en el primer minuto, un 58.22 % a mitad del tratamiento y un 56.51 % al final. La diferencia se reduce ligeramente si se compara el CCE y el CBCI a 35.30 %, 40.62 % y 39.46 % respectivamente. La discriminación entre patologías se reduce considerablemente entre el CBCN y el CCE. En cuyo caso la diferencia se reduce a 11.18 %, 12.53 % y 12.25 %. Como consecuencia, tanto la morfología como el tipo de tumor deben ser considerados como un factor dosimétrico clave para el desarrollo de herramientas predictivas que permitan una adecuada interpretación de la fluorescencia superficial emitida en tumores de cáncer de piel no melanoma fotosensibilizados mediante MAL-PpIX. Se plana extender este estudio a un mayor número de muestras y de patologías. Las aproximaciones dosimétricas basadas en fluorescencia necesitan de este tipo de análisis para asegurar la precisión de la monitorización. Lo que pone de manifiesto la aplicabilidad de este tipo de herramientas tanto en la planificación personalizada y monitorización del tratamiento fotodinámico, como en el fotodiagnóstico diferencial.

Agradecimientos