Caracterització de l'activitat i el fenotip de la proteasa del VIH-1 mitjançant un sistema de cribratge genètic basat en el bacteriòfag lambda

Texto completo

(1)CARACTERITZACIÓ DE L’ACTIVITAT I EL FENOTIP DE LA PROTEASA DEL VIH-1 MITJANÇANT UN SISTEMA DE CRIBRATGE GENÈTIC BASAT EN EL BACTERIÒFAG LAMBDA Marta Cabana Badalona, 2002.

(2) NOMBRE ESTIMAT D’ADULTS I NENS VIVINT AMB EL VIH/SIDA A FINALS DEL 2001. América del Norte. 940 000 Caribe. 420 000 América Latina. 1,4 millones. Europa occidental. Europa oriental y Asia central. 560 000 1 millón Asia oriental y Pacífico Africa del Norte 1 millón Asia y Oriente Medio 440 000 Africa subsahariana. del Sur y Sudoriental. 6,1 millones. 28,1 millones. Australia y Nueva Zelandia. 15 000. Total: 40 milions 00002-Sp- 4 – 1 de decembre de 2001. Organización Mundial de la Salud.

(3) CURS NATURAL DE LA INFECCIÓ PEL VIH-1. Fase aguda. Fase. crònica. Fase de SIDA Cèl·lules T CD8+. Cèl·lules T CD4+ Cèl·lules T CD8+ específiques pel VIH. Còpies d’RNA víric en plasma. 5. 15. setmanes. 2. 4. 6. ANYS. 8. 10. 12.

(4) ESTRUCTURA DEL VIH-1. SU (gp120) TM (gp41) MA (proteïnes. de la matriu, p17). Embolcall Càpsida. (CA o p24). RNA i NC (p7).

(5) GENOMA DEL VIH-1. DNA PROVIRAL DEL HIV-1. PARTÍCULA DEL HIV-1. env gag. pol proteïnes auxiliars.

(6) CICLE DE REPLICACIÓ DEL VIH-1 Unió. Receptor de quimiocines CD4. Fusió. Integració. Vpr IN. Transcripció inversa Expressió RNA madur. RT. Rev. RNA sencer. Nef. FASE INICIAL FASE TARDANA. Traducció ribosomal. Vpu. Degradació del CD4. Gag Gag-Pol SU. TM. Encapsidació. PR Gemmació. Maduració.

(7) DIANES DE LA TERÀPIA ANTIRETROVIRAL CD4 DNA proviral. INHIBIDORS DE LA TRANSCRIPTASA INVERSA ANÀLEGS DE NUCLEÒSIDS CD4(ITIAN). SU i TM. RT. DNA proviral. • Zidovudina (AZT) • Didanosina (ddI). SU i TM. • Lamivudina (3TC). P. •INHIBIDORS Estavudina (d4T) DE LA PROTEASA(IP) • Zalcitabina (ddC) • Saquinavir (SQV) • Abacavir (ABC) • Ritonavir (RTV) • Indinavir (IDV) INHIBIDORS DE LA TRANSCRIPTASA INVERSA • Nelfinavir (NFV) NO ANÀLEGS DE NUCLEÒSIDS (ITINN) • Amprenavir (APV) Lopinavir • Nevirapina• (NVP) • Delavirdina (DLV) • Efavirenz (EFV).

(8) DINÀMICA DE DESENVOLUPAMENT DE RESISTÈNCIES DEL VIH • La RT del VIH no posseeix activitat de correcció de còpia, sent la taxa de mutació a cada cicle de replicació de 3x10-5 mutacions/nt (Mansky and Temin. J. Virol.,1995). • La taxa de generació del VIH és de 108-1010 nous virions per dia ( Wei et al. Nature,1995; Ho et al. Nature, 1995). • El genoma del VIH conté 104 nt.. • Així, diàriament poden generar-se variants mutacions individuals o dobles mutacions.. amb.

(9) A. Distribució de les seqüències. Seqüència consens. B. C.

(10) MUTACIONS EN EL GEN DE LA PROTEASA DEL VIH-1 ASSOCIADES A LA RESISTÈNCIA ALS INHIBIDORS. Indinavir Indinavir IDV 1 IDV 1 Ritonavir Ritonavir RTV RTV Saquinavir Saquinavir SQV SQV Nelfinavir Nelfinavir NFV NFV Amprenavir Amprenavir APV APV. 10. L L. I,R,V I,R,V. 20. 10 10. F ,I F ,I. 10 10. V V. 24. M M. 32 36. M,R I M,R I. 20 20 10 10. K L K L. I I IL I L. M M. I I. I I. V V. 46. 54. 32 33 36 32 33 F 36. 46 I, 46 L. 54 V,L54. F. I, LG G. V,L. 48. V48 V. D D. 30 30. 36 36. N N. 32 32. 54 54. 46 46. I,L I,LI I I I. 46 47 50 54 46I V47V50 54 I V V. Adapted from: Hirsch, et al. JAMA. 2000. Adapted from: Hirsch, et al. JAMA. 2000.. AG AG. V V. V V. I I. L L. 71 73 77 82 84 90 V,T S,A I A,F,T,S V V,T S,A I A,F,T,S V. 71 71. M M. 77 82 84 90 77 82 84 90. 71 73 77 82 84 90 71 S73 77 A82 84 90 S. A. N N. 71 77 82 84 88 90 71 77 82 AFTS84 88 D 90 AFTS. D. 84 84. 99 99.

(11) MUTACIONS ASSOCIADES A LA RESISTÈNCIA ALS ITIANs Zidovudina AZT 1. M. D K. 41. 67. L 65. L. R. M. 65 69 74. 184. V T. V,I 184. D. E. V. 44. 118 D. 184 I. V 75 T. 41. Y. 70 74 65 67. Multi-nRTI-A3. F. V 41. 62 67 Insert ^R. Adapted from: Hirsch, et al. JAMA. 2000.. V Q. F 75 77. 62 IL. 70 69. 210 215 219. 184. 115 F. A. Multi-nRTI-B3. W Y,F Q. 74. Estavudina d4T Abacavir ABC. 215 219. N R. Didanosina ddI. Lamivudina 3TC. 210. 70. K. Zalcitabina ddC. LT K. 116 Y. 151 M 210 215. 219. 560.

(12) MUTACIONS AL GEN DE LA TRANSCRIPTASA INVERSA ASSOCIADES A LA RESISTÈNCIA ALS ITINNs. Nevirapina NVP 1 Delavirdina DLV Efavirenz EFV. LKVV 106 100 108 103 I NAI. Y YG 188 181 190 C,I C,A L,H P. 103. 100 103. Adaptat de: Hirsch, et al. JAMA. 2000.. 181 C. 236 L P. 108. 188 190 225 L S,A H. 560.

(13) OBJECTIUS I: • Determinar, en pacients que responien durant llargs períodes de temps a diverses teràpies de combinació, els canvis genètics observats en les poblacions víriques i detectar l’aparició de mutacions associades a la resistència als diferents fàrmacs.. • Avaluar l’aparició de resistències genotípiques en els gens de la transcriptasa inversa i la proteasa a partir de mostres de pacients infectats amb el VIH-1 que clínicament no responien a múltiples teràpies antivirals de combinació..

(14) 3TC AZT+ddI. IND+3TC+D4T. AZT+ddC. 1400. Còpies d’RNA víric per ml. Recompte de cèl.lules T CD4 per ml. EVOLUCIÓ DELS PARÀMETRES CLÍNICS EN TRES PACIENTS DURANT UNA TERÀPIA DE COMBINACIÓ. 1000000. A. 1200. B. C. 100000. 1000. 10000. 800 1000 600. 200 100. 400. 20 10. 200 0. 1 0. 7. 14. 21. 28 0. 7. 14. 21. Mesos de tractament. 0. 7. 14.

(15) ANÀLISI FILOGENÈTIC DE LES SEQÜÈNCIES DEL GEN env OBTINGUDES DE PBMCs DELS TRES PACIENTS. 100. A l’inici de la teràpia Després d’un o dos anys de teràpia. 80 98. Pacient C. 100 100. 100 100. 92 98. Pacient A. Pacient B 93 100 100 100 100 100 1%. HXB2 NL43.

(16) ANÀLISI FILOGENÈTIC DE SEQÜÈNCIES DEL GEN pol DEL DNA PROVIRAL (K70R) (M184V;K219E). Al’inici de la teràpia. (K70R). Després d’un o dos anys de teràpia. Pacient A. (K70R) (K70R) 99. 85. 83. Pacient B 99. Pacient C 100. NL43 1%. HXB2.

(17) 1400. 10000000. 1200. B. 1000. AZT ddC. 800. Recompte de cèl·lules T CD4 per ml. 600. 3TC d4T IND AZT d4T SQV. AZT ddC AZT 3TC ddC 3TC IND. ddI NEV RIT. C. d4T 3TC RIT SQV. D. d4T ddI NEV. AZT ddC 3TC. 3TC NEV IND SQV. 1000000 100000. AZT ddC. 3TC d4T IND. 10000. AZT ddC 3TC. d4T 3TC IND. AZT 3TC RIT. 400. 1000 100. 200. 10. 0. 1 0. 14. 7. 14. 7. 0. 1400. E. 1200. 21. 35. 28. AZT IND. F. 49. 42. AZT ddC. AZT ddC 3TC. 600 400. AZT AZT 3TC ddI d4T RIT 3TC RIT SQV. AZT 3TC IDN. AZT 3TC IND. 0. d4T 3TC SQV NEV. G. d4T 3TC RIT SQV. 14. 7. 28. 21. 35. AZT 3TC RIT SQV NEV. AZT ddI. 42. 10000000 3TC d4T RIT IND 1000000 NEV. H. d4T 3TC SQV. 1000 800. 21. 14. 7. 0. 100000. AZT 3TC RIT. AZT ddI 3TC. AZT ddI. d4T ddI IND SQV NEV. ddI 3TC IND. 10000 3TC IND SQV. 1000 100. 200. 10. 0. 1 0. 7. 14. 21. 28. 35 0. 7. 14. 21. 28. 0. 7. 14. 21. 28. 35. 42. 49. 0. 14. 7. 21. 28. 35. 42. 49. 56. 1400. 10000000. I. 1200. J. 1000 AZT ddI 3TC. 800 AZT ddI. 600. 3TC d4T RIT SQV. IND. d4T 3TC RIT SQV. L. K. 3TC NFV NEV. AZT ddC IND. ddI 3TC d4T NFV SQV NEV. 400. 1000000 100000. 3TC d4T RIT SQV. ddC RIT SQV. 3TC d4T RIT. 3TC d4T RIT SQV. 10000 1000. AZT 3TC ddI. 100. 200. 10. 0. 1 0. 7. 14. 21. 28. 35. 0. 7. 0. 7. Mesos. 14. 21. 28. 0. 7. 14. 21. 28. 35. 42. RNA del VIH en plasma (còpies/ml). A.

(18) Proteasa ConB: H- 0: H-38: H-41: H-44: H-51: H-58: H-60:. 10 20 30 40 50 60 70 80 90          PQITLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMNLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNF: .........I..............................K...................................................L......: .........I.........................I....K......................V...................................: .........I.........................I....K....L.......V.........V......V..........A..........L......: .........I.........................I....K....L.......V.........V......V..........A..........L......: .........I.............I...........I....K....L......LV.........V......V..........A..........L......: .........I.............I..........DI....K....L.A....LV.........V......V..........A..........L......: .........I.............I..........DID...K....L.T.....V.........V......VV.........A..........L......:. Transcriptasa inversa ConB: H- 0: H-44: H-51: H-58: H-60:. 41 50 60 70 80 90 100 110 120 130           TEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDKDFRKYTAFTIPSINNE ..L................................V............................................................T... ..L................................V.......................S....................................T... ..LK...............................V........K..............S....N...............................T... ..L................................V........K..............P....N...P...........................T... ..L................................V........K..............S....N...............................T.... 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230           ConB: TPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGFTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDK: H- 0: H-44: H-51: H-58: H-60:. .......................C...............................................WK...Y.......................: .......................C.................V..SV.N.......................WK...Y............Q..........: ...V...................C..................C..V.........................WK...Y............Q..........: ...V...................C..................C..V.........................WK...Y............Q..........: ...V...................C.................TC..V.........................WK...Y............Q..........:.

(19) PROTEASA 100. 82. D- 0. D-29. D-35 D-42 D-39. 100 100. L-39. 99. 98. L- 0. E-35 E-37 E- 0 99 C- 0 C-17 C-28 F-19 F-22 100 F-28 F-34 F- 0 F-16 I-33 I-37 100 I-35 I-40 I- 0 91. 85. TRANSCRIPTASA INVERSA. 98. 95 100. 94. 91. H-51 H-60 H-58 H-44. 88 100 100. H- 0 100. K- 0 J- 4 J- 8 J- 0 J-12 93 A-11 100 A-18 A- 0 B-41 B-47 B-58 B-44 B- 0 83 G-53 89. B- 0 B-58. K-21 K-24 K-35 K-18. F-19 F-22 99. F-28 F-34. F- 0 87. 100. J- 0 J-12 90 K-24 K-35 K- 0 98 100. G-56 100 80 100. H- 0 Consensus B. Consensus B 1%. D-39 D-42 D-29 D- 0 C-17 C-28 C- 0. L-39 L-47. L- 0. G-51. G- 0 G-47 H-58 81 H-60 100 H-51 91 H-41 H-38 H-44. 1%. A-18 A- 0. 100. 100. 98. I- 0 A-11. E- 0 E-37. 91. 97. G- 0 I-35 I-40. 100. 81. L-47. G-53 G-56.

(20) RESULTATS DE L’ANÀLISI ESTADÍSTIC : TAXA D’EVOLUCIÓ ( mitja): Proteasa........................... 1.7x10-3± 0.5x10-3 sub/nt/mes. Transcriptasa inversa..... 0.8x10-3±0.4x10-3 sub/nt/mes. DISTRIBUCIÓ DE LES DISTÀNCIES GENÈTIQUES: Regió codificant. ± SD)a Distància de l’ADN (mitja Al l'inici de l'estudi. Al final de l'estudi. ValorP c. Sin. b(mitja± SD) Al l'inici de l'estudi. Al final de l'estudi. No sin.b(mitja± SD) valorP c. Al l'inici de l'estudi. Al final de valorP c l'estudi. 0,057±0.017. 0,089±0,021 <0,001. 0,118±0,044 0,122±0,044. Transcriptasa 0,059±0,014 inversa. 0.077±0.017 <0.001. 0.140±0.037 0.169±0.032 <0.001 0.034±0.003 0.046±0.014 <0.001. Proteasa. 0,934 0.035±0.013 0.071±0.015 <0.001.

(21) 1400. 10000000. 1200. B. 1000. AZT ddC. 800 600. 3TC d4T IND AZT d4T SQV. AZT ddC AZT 3TC ddC 3TC IND. ddI NEV RIT. C. d4T 3TC RIT SQV. D. d4T ddI NEV. AZT ddC 3TC. 3TC NEV IND SQV. 100000 AZT ddC. 3TC d4T IND. 10000. AZT ddC 3TC. d4T AZT 3TC 3TC IND RIT. 7. CD4 T cell counts per µl. 0. 14. 1400. E. 1200 1000 800. AZT ddC. 400 200 0 0. 7. 14. 21. 28. 1400. I. 1200. 14. 14. AZT ddI 3TC. 800 AZT ddI. 600. 3TC d4T RIT SQV. IND. 21. 28. 0. J. d4T 3TC RIT SQV. 21. 0. d4T 3TC SQV NEV. G AZT 3TC AZT IND ddI. AZT 3TC RIT SQV NEV. d4T143TC RIT SQV. 7. 0. 42. d4T 3TC RIT SQV. IND. d4T 3TC SQV. AZT 3TC AZT RIT 3TC RIT SQV NEV. 7. 14. 21. 35. 42. 49. 3TC NFV NEV. 21 AZT ddC IND. ddI 3TC d4T NFV SQV NEV. 400. 11 14. 7. 28. 21. 35. 0. 7. 42. 10000000 3TC d4T RIT IND 1000000 NEV 100000 AZT ddI 3TC. ddI 3TC IND. 10000 3TC IND SQV. 10 1 14. 21. 28. 35. 42. 49. 56. 10000000 1000000. 28. 100000. 3TC d4T RIT SQV. ddC RIT SQV. 1000 100. L. 14. 7. 100 10 10. AZT ddI. d4T ddI IND SQV NEV. 28. 1000. H. K 0. 1000. AZT 49 IND. 35. 28. AZTAZT ddI3TC. 7. 35 0. F21 AZT IND. F. AZT AZT 3TC ddI d4T RIT 3TC RIT SQV. AZT 3TC IDN. AZT ddC 3TC. 600. 7. 0. RNA del VIH en plasma (còpies/ml). 0. Recompte de cèl·lules T CD4 per ml. 400 200. 1000000. 3TC d4T RIT. 3TC d4T RIT SQV. 10000 1000. AZT 3TC ddI. 100. 200. 10. 0. 1 0. 7. 14. 21. 28. 35. 0. 7. 0. Months. 7. 14. 21. 28. 0. 7. 14. 21. 28. 35. 42. Plasma HIV-1 RNA (copies/ml). A.

(22) REGULACIÓ DEL CANVI LÍTIC-LISOGEN EN EL CICLE DE REPLICACIÓ DEL BACTERIÒFAG LAMBDA. Represor. RecA Cro. cI. OR. CICLE LISOGEN. X. X. OR. cro. CICLE LíTIC UV. CICLE LISOGEN. CICLE LÍTIC.

(23) SISTEMA DE CRIBRATGE GENÈTIC DE LA PROTEASA DEL VIH-1 BASAT EN EL BACTERIÒFAG LAMBDA λ. cI.VIH-1. Proteïna de fusió λ βGal-Proteasa del VIH-1. cI.salvatge. cI.VIH-1 QARSQNYPIVQARM. QAGM. QARSQNYPIVQARM. PIVQARM cI. cro X OR1 OR2 OR3. Cicle lisogen. cI. cro X OR1 OR2 OR3. Cicle lisogen. QARSQNY. cI cro X OR1 OR2 OR3. Cicle lític. Adaptat de: Harry J. Sices and Thomas M. Kristie, PNAS 1998.

(24) OBJECTIUS II: • Avaluar el sistema de cribratge genètic de proteases específiques pel lloc de tall basat en el bacteriòfag lambda, com a sistema alternatiu i senzill per caracteritzar l’activitat de la proteasa del VIH-1 i el seu fenotip. • Caracteritzar proteases del VIH-1 obtingudes de mostres de pacients que clínicament no responien a la teràpia amb inhibidors de la proteasa. • Determinar i caracteritzar l’activitat i el fenotip de set proteases del VIH-1 cadascuna de les quals presenta una única mutació primària de resistència als inhibidors de la proteasa..

(25) CREIXEMENT SELECTIU DE FAGS RECOMBINANTS (λ-proteasa del VIH-1) EN CÈL·LULES QUE EXPRESSEN LA CONSTRUCCIÓ cI.HIV-1-cro λ-VIH-1 λ-invVIH-1 λ. 1. 10. pfu/µl 100. 1000. Inhibició dels λ-proteasa-VIH-1 per quatre inhibidors de la proteasa 10000. λ-invVIH-1. pfu/ul. 1000. λ-VIH-1 Indinavir Ritonavir. 100. Saquinavir. 10. Nelfinavir. 1 0. 0.5. 2.5 12.5 62.5 313. 0. 0.5 2.5 12.5 62.5 313. µM drug.

(26) 1400. 10000000. 1200. B. 1000. AZT AZT IND ddC. F. 800 600. 3TC d4T IND AZT d4T SQV. AZT ddC AZT 3TC ddC 3TC IND. ddI NEV RIT. C. d4T 3TC RIT SQV. d4T ddI NEV. AZT ddC 3TC. G. d4T 3TC RIT SQV. D. 3TC d4T IND. 3TC NEV IND SQV. 100000. d4T 3TC AZTNEV SQV ddC AZT ddC 3TC. d4T 3TC SQV. 10000 d4T AZT 3TC 3TC IND RIT. 400. 0 7. 14. 7. 0. 14. 1400. E. 1200. 21. AZT IND. F. 800. AZT ddC. AZT ddC 3TC. 600 400. AZT AZT 3TC ddI 14 7 d4T RIT 3TC RIT SQV. AZT 03TC IDN. 49. 42. AZT 3TC 14 RIT. 7. 0. 200 0 0. 7. 14. 21. 7. 35 0. 28. 1400. I. 1200. J. 1000 AZT ddI 3TC. 800 AZT ddI. 600. 3TC d4T RIT SQV. IND. d4T 3TC RIT SQV. 400 200. 14. 21. AZT ddC. 1000. 0. 7. 14. 21. 28. 35. 0. 7. AZT ddC 28 3TC 0. AZT14 3TC RIT. 7. AZT ddC IND. ddI 3TC d4T NFV SQV NEV. 0. 3TC d4T RIT SQV. ddC RIT SQV. AZT ddI 42. 35. 40 0. 42. 10000000 3TC d4T RIT IND 1000000 NEV. AZT ddI 3TC. 49. ddI 3TC IND. 10000 3TC IND SQV. 42. 100000 49 0 10000. 7. 10 1 14. 21. 28. 35. 42. 49. 56. 10000000. L. 1000 100 10. 1000000 100000 3TC d4T RIT. 3TC d4T RIT SQV. 10000 1000. AZT 3TC ddI. 100 10. 60 7. MESOS Months. 14. 1000 100. 1000000. 1. 20 7. 11 28. 21. H. 35 d4T ddI IND SQV NEV. 28. AZT 3TC Nev Nelf. SQV. 600. 200. d4T 14 ddI IND SQV NEV. 7. 100000. 21. 3TC 3TC d4T d4T RTV 14 21 IDV 28 35. K. 0. 0. AZT 0ddI. 800. 3TC NFV 400 NEV. 0. d4T 3TC SQV NEV. 1400 1200. 100. d4T 3TC SQV. AZT 3TC 28 RIT SQV NEV. M. 21. G. d4T 3TC RIT SQV. AZT 3TC IND21. 1000. 10 10 AZT ddI. 1000. Recompte de cèl·lules T CD4 per µl. CD4 T cell counts per µl. 0. AZT 3TC RIT SQV 35 28 NEV. Còpies d’RNA de VIH-1 per ml. AZT 3TC IND. AZT ddI. 200. 1000000. 1 21. 28. 0. 7. 14. 21. 28. 35. 42. Plasma HIV-1 RNA (copies/ml). A.

(27) CARACTERÍSTIQUES CLÍNIQUES I HISTÒRIA DEL TRACTAMENT DELS TRES PACIENTS INCLOSOS A L’ESTUDI. Cèl·lules CD4+ / ml. Còpies d’RNA del VIH-1 / ml. Història del tractament amb inhibidors de la proteasa. 95. 54. 140000. naïf. 98. 6. 363344. 11m IND, 19m RIT, 19m SQV. 93. 128. 76823. naïf. 98. 71. 11798. 24m RIT, 10m SQV, 4m IND. 95. 630. 81771. naïf. 97. 327. 1996. 3m RIT, 10m IND. Pacient Mostra. F G M. IND, indinavir; RIT, ritonavir; SQV, saquinavir; NFV, nelfinavir..

(28) ACTIVITAT CATALÍTICA DE LES PROTEASES OBTINGUDES DE MOSTRES DE PACIENTS * 20 * 40 * 60 * 80 * 99 ConsensusB : PQITLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMNLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNF λ HIVpHXB2. : ....................................S............................................................... λ HIVpF95 λ HIVpF98. : ..................................D...........................P.............I...................... : .........I........................D.D..........V.....V........P.......V..........A.......M..L....... λ HIVpG93 λ HIVpG98. : ..............................................................P.................................... : .........I..V...................F..IC................V........P...F...VMS...I....A.V.....M.......... λ HIVpM95 λ HIVpM97. : ............V......R..........................................PV............I...................... : ............V......R...........I..............................PV......V..........A.................. 10000. 100 10. H λX B2 H IV pH X B2 λH IV pF 95 λH IV pF 98 λH IV pG 93 λH IV pG 98 λH IV pM 95 λH IV pM 97. H. IV. pi. nv. λ. 1. λ-. pfu / µ l. 1000.

(29) INHIBICIÓ DEL CREIXEMENT DE FAGS RECOMBINANTS (λ-proteasa del VIH-1) PER DIVERSOS INHIBIDORS DE LA PROTEASA 10000 λ-HIVpHXB2. λ-HIVpF95. λ-HIVpG93. λ-HIVpM95. pfu / µl. 1000. IND RIT SQV NFV. 100 10. 1 10000. λ-HIVpinvHXB2. λ-HIVpF98. λ-HIVpG98. λ-HIVpM97. pfu / µl. 1000. IND RIT SQV NFV. 100 10 1 0. 0.5 2.5 12.5 62.5 313 0. 0.5 2.5 12.5 62.5 313 0. 0.5 2.5 12.5 62.5 313 0. µM de fàrmac. 0.5 2.5 12.5 62.5 313.

(30) FENOTIPS I GENOTIPS DELS FAGS QUE CODIFIQUEN LES PROTEASES PROVINENTS DE MOSTRES DELS TRES PACIENTS. Mostra. Patró mutacional de les proteases. λ-HIVpHXB2 37S λ-HIVpF95. 35D, 63P, 77I. λ-HIVpF98. 10I, 35D, 37D, 48V, 54V, 63P 71V, 82A, 90M, 93L. λ-HIVpG93. 63P. λ-HIVpG98. 10I, 14V, 33F, 36M, 37C, 54V, 63P, 67F, 71V, 72M, 73S, 77I, 82A, 84V, 90M. λ-HIVpM95. 14V, 20R, 63P, 64V, 77I. λ-HIVpM97. 14V, 20R, 32I, 63P, 64V, 71V, 82A. IC 50 (µΜ) (increment respecte el naïf) IND. RIT. SQV. NFV. 17.5. 1.28. 1.69. 0.30. 6.31. 1.78. 1.88. 0.17. >313 (>50). >313 (>176). >313 (>166). >313 (>1043). 1.43. 1.97. 1.38. 0.35. >313 (>219). >313 (>159). >313 (>227). 10.13 (29). 2.76. 3.73. 1.16. 0.28. 23.37 (8). >313 (>84). 0.93 (0). 1.3 (5).

(31) MUTACIONS EN EL GEN DE LA PROTEASA DEL VIH-1 ASSOCIADES A LA RESISTÈNCIA ALS INHIBIDORS. Indinavir IDV 1. L. 10 I,R,V. K L. 20. V. 24. M. M. 32 36. M,R I. I. I. AG. 46. I. I. 54. V. V. I. L. 71 73 77 82 84 90 V,T S,A I A,F,T,S V. V. M. L. Ritonavir RTV. 20. 32 33 36. 46. F. Saquinavir SQV. 10. Nelfinavir NFV. 10. Amprenavir APV. 10. I, L G. 48 30. 36. 54. 46. N. I,L I I. 32. 46 47 50 54. Adapted from: Hirsch, et al. JAMA. 2000.. I V V. 71. 77 82 84 90. V,L. V. D. F ,I. 54. 71 73 77 82 84 90 S. A. N. 71 77 82 84 88 90 AFTS. D. 84. 99.

(32) Catalytic efficiency of phages encoding laboratory generated single mutants of the HIV-1 protease 150. 100. Phage growth relative to WT λHIVpHXB2. 50. 0. λ. WT D30N M46L G48V I50V V82A I84V L90M (HXB2). Cabana et al. Submitted, 2001.

(33) ACTIVITAT CATALÍTICA DE LES PROTEASES AMB UNA ÚNICA MUTACIÓ PRIMÀRIA DE RESISTÈCIA WT-HXB2 C3063 C4622 C4832 C5082 C8291 C8412 C9071. : : : : : : : :. -40 * -20 * 0 * 20 * KAREFSSEQTRANSPTRRELQVWGRDNNSPSEAGADRQGTVSFNFPQITLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVL ..........................................................................N... .............................................................................. .............................................................................. .............................................................................. .............................................................................. .............................................................................. ............................................................................... : : : : : : : :. 78 78 78 78 78 78 78 78. WT-HXB2 C3063 C4622 C4832 C5082 C8291 C8412 C9071. : : : : : : : :. 40 * 60 * 80 * 100 * EEMSLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNFPISPIETVPVKL .............................................................................. ............L................................................................. ..............V............................................................... ................V............................................................. ................................................A............................. ..................................................V........................... ........................................................M...................... : : : : : : : :. 156 156 156 156 156 156 156 156. 150. Creixement dels fags relatiu al salvatge (λ-HIVpHXB2). 100. 50. 0. λ. WT D30N M46L G48V I50V V82A I84V L90M (HXB2).

(34) Phenotype of recombinant phages containing HIV-1 proteases with one primary resistance mutation Clone name. b. IC 50 (µM) (fold increase). a. Site-directed PR mutation. SQV. RTV. 1.29± 0.24. IDV. 3.97± 2.13. 3.31± 2.39. NFV 1.87± 0.71. C10.021. WT. C3063. D30N. 0.75± 0.34 (0.6)0.25 ± 0.02 (0.06) 0.84 ± 0.36 (0.25) 5.77± 1.67 (3.1). C4622. M46L. 2.01± 0.76 (1.6) 19.36 ± 8.40 (5). C4834. G48V. 13.17± 5.17 (10.2) 7.68 ±5.09 (1.9). C5082. I50V. 4.44± 3.11 3 ( .5). C8291. V82A. 0.79± 0.39 (0.6) 10.87±6.87 (2.7) 24.49±11.48 (7.4). C8412. I84V. 17.89± 7.64 1(4). C9071. L90M. 3.35± 1.40 (2.6) 25.46±3.00 (6.4). 6.53 ±7.17 (1.6). 29.81±1.47 (7.5). 10.97±7.95 (3.3) 3.48 ±0.48 (1.9) 13.20±8.35 (4). 1.52 ±0.32 (0.8). 4.26±2.47 (1.3). 1.39 ±0.32 (0.7). 22.90±7.1 (7) 2.72±0.72 (0.8). -Resistant -Hipersensible. 3.00 ±2.18 (1.6) 1.93 ±1.13 (1) 5.20 ±1.49 (2.8).

(35) FENOTIP DELS FAGS QUE CODIFIQUEN PROTEASES AMB UNA ÚNICA MUTACIÓ PRIMÀRIA DE RESISTÈNCIA. IC50 (µM) (increment )a RTVb IDVb. Bacteriòfags recombinants. Mutacions. λ-HIVpHXB2. WT. 1.9±1.5. 3.8±2.3. 2.4±2.3. 1.8±0.9. λ-HIVpD30N. D30N. 0.7±0.3 (0.4). 0.2±0.02 (0.07). 0.9±0.4 (0.4). 5.3±3.2 (2.9). λ-HIVpM46L. M46L. 1.8±0.8 (1.0). 19.4±8.4 (5.0). 7.4±1.2 (3.2). 3.4±0.2 (1.9). λ-HIVpG48V. G48V. 12.8±5.3 (6.8). 7.4±5.4 (2.0). 10.0±5.3 (4.3). 1.6±0.4 (0.9). λ-HIVpI50V. I50V. 4.9±2.2 (2.6). 1.1±0.6 (0.3). 4.3±2.5 (1.8). 1.4±0.4 (0.8). λ-HIVpV82A. V82A. 1.0±0.4 (0.5). 10.9±6.9 (2.7). 17.5±17.1 (7.4). 2.7±1.6 (1.5). λ-HIVpI84V. I84V. 17.3±6.5 (9.2). 30.2±1.5 (8.0). 22.9±7.2 (9.7). 2.1±1.3 (1.2). λ-HIVpL90M. L90M. 2.9±1.5 (1.5). 17.3±14.3 (4.6). 2.7±0.7 (1.2). 3.9±1.5 (2.2). SQVb. NFVb.

(36) ASSAIG DE COMPETICIÓ ENTRE BACTERIÒFAGS RECOMBINANTS AMB DIVERSES PORTEASES DEL VIH-1. % de la població. Sense fàrmac. 62.5 µM SQV. 100. 100. 75. 75. 50. 50. 25. 25. 0. 0 0. 1. 2. 3. 0. Passatge. 1. 2. Passatge λ-HIVpG93 λ-HIVpG98. 3.

(37) COMPETICIÓ DELS FAGS QUE CODIFIQUEN PROTEASES AMB UNA ÚNICA MUTACIÓ CONTRA EL λ-HIVpHXB2 λ-HIVpHXB2 + λ-HIVpM46L. λ-HIVpHXB2 + λ-HIVpD30N. λ-HIVpHXB2 + λ-HIVpG48V. λ-HIVpHXB2 + λ-HIVpI50V. 100% 80% 60% 40% 20% 0%. 0. 1. 2. 3. λ-HIVpHXB2 + λ-HIVpV82A. 0. 1. 2. 3. 0. λ-HIVpHXB2 + λ-HIVpI84V. 1. 2. 3. 0. 1. 2. 3. λ-HIVpHXB2 + λ-HIVpL90M. 100% 80%. Proteasa salvatge Proteasa mutada. 60% 40% 20% 0%. 0. 1. 2. 3. 0. 1. 2. 3. 0. 1. 2. 3.

(38) SELECCIÓ DELS MUTANTS FUNCIONALS I NO FUNCIONALS D’UNA LLIBRERIA DE FAGS λ-PROTEASA DEL VIH-1 GENERADA IN VITRO Proteasa del VIH-1. Llibreria de mutants λ-βGal-Proteasa del VIH-1. Hipermutagènesi aleatòria in vitro. Cèl·lules E. coli que expressen el repressor λ cI cI.VIH-1. Cèl·lules E. coli que no expressen el repressor λ cI. QARSQNYPIVQARM. PIVQARM. Replicació lítica. QARSQNY X OR1 OR2 OR3. Els mutants no funcionals entren en cicle lisogen. cI X. Els mutants funcionals entren en cicle lític.

(39) DISTRIBUCIÓ DE MUTANTS OBTINGUTS DESPRÉS D’UNA RONDA D’HIPERMUTAGÈNESI IN VITRO. HM10c3 HM10c6 HM10c52 HM10c55 HM10c35 HM10c51 HM30c04 HM30c6 HM10c43 HM10c28 HM10c36 HM10c40 HM10c54 HM10c47 HM30c01 HM10c1 HM10c10 HM30c2 HM30c10 HM10c2 HM10c5 HM10c7 HM10c8 HM10c4 HM10c26 HM10c9 HM30c1 HM30c7 HM30c9 HM30c3 HM30c4 HM30c8. : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :. * 20 * 40 * 60 * 80 * PQITLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMSLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNF ................................................................................................... ................................................................................................... ...................R............................................................................... .............................................................V..................................... ........................................K.......................................................... ........................................G.......................................................... ..........................................................................................A........ .......................................................I........................................... .....................................................................R............................. ...........A.........................................................E............................. ......................................S...........................................................L ......R......................................................M..................................... ..............................................................P...R................................ .................................G...............................V................................. ................................S.........................................................A........ ..............M...........................................................................A........ .....................................................T.......V..................................... ............................................RT..................................................... ......................................................E...........................D................ ..............................................M..V........................A........................ ....................................G...............L............................................S. .........................................................*...........E...............E............. ....................................G......................G.........E............................. .........H..V....................G..........................R...................................... ............................G......V....G.............E............................................ ..V......H.....*.........................................R......................................... ............T......................T........I..................K................................... .............R..R...........G..............................................................R....... ..........A.......P......................................R..........................V.S............ ......R........R.........................................R.............T...................R....... .................R........................E..........T.................M..........................S ............M.M....................V......E..................V......Y............................... 51 residus mutate en 33 clons seqüenciats. : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :. 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 98 99 99 99 98 99 99 99 99 99 99. 0 0 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 6.

(40) Selective growth of λ-HIV-1 protease mutant library in cells expressing the cI.HIV-1-cro construct 150. 100. Phage growth relative to WT λHIVpHXB2. λ λ-HXB2 (wt). 50. 0. λ-HXB2mut (16% of survivals.

(41) CREIXEMENT SELECTIU DE CLONS INDIVIDUALS DE λ-proteasa-VIH-1 OBTINGUTS D’UNA LLIBRERIA DE MUTANTS GENERADA in vitro. λ. 100000. pfu/µl. 10000 1000 100 10 1 0.1. HXB2 (WT) HM10c52 HM10c55 HM10c35 HM10c51 HM30c04 HM10c43. (K20R) (I62V) (R41K) (R41G) (T91A) (K70R). HM10c28 HM10c36 HM10c40 HM10c54 HM10c47. (T12A, K70E) (P39S, F99L) (Q7R, I62M) (L63P, C67R) (E34G, I66V). HM30c01 (F0S, L33S, T91A) HM10c26 (D29G, M36V, R41G,K55E).

(42) CONCLUSIONS I: • En pacients en que es mantenien els nivells d’RNA víric reduïts durant llargs períodes de temps, vam confirmar l’evolució de la quasiespècie vírica amb una reducció de la diversitat genètica en el gen env, i vam detectar l’aparició de mutacions de resistència a pol tan sols en un pacient. • Una manca de resposta a successius tractaments antiretrovirals, permet l’acumulació de mutacions de resistència enfront als diversos inhibidors tant en el gen de la proteasa com en el de la transcriptasa inversa, sense existir cap base genètica que limit,i o predisposi, a l’evolució vírica o al desenvolupament de les mutacions de resistència.. ! El nivell de supressió de la replicació vírica condiciona la facilitat d’aparició de mutacions associades a resistència malgrat l’existència d’evolució genètica..

(43) CONCLUSIONS II: • El sistema de cribratge genètic basat en el bacteriòfag lambda permet la caracterització de proteases del VIH-1 mostrant diferències en l’activitat catalítica o la susceptibilitat als inhibidors associades a determinats genotips. • L’anàlisi de proteases aïllades de mostres de pacients durant el tractament permet pronosticar la resposta a posteriors canvis de teràpia.. • Una manca d’un nivell elevat de resistència i un compromís de l’activitat proteolítica associats a la presència d’una única mutació primària de resistència a la proteasa del VIH-1, davant l’àmplia i elevada resistència dels mutants múltiples argumenten la rara aparició de les mutacions primàries d’una forma aïllada..

(44) CONCLUSIONS II:. • L’elevada especificitat del sistema, fa que sigui efectiu en determinar petites variacions en l’activitat o el fenotip de les proteases, a l’hora, que permet la competició dels bacteriòfags recombinants per identificar aquella més avantatjosa en determinades condicions.. ! El sistema de cribratge basat en el bacteriòfag lambda constituiex una bona eina per a la caracterització de proteases del VIH-1 rellevants clínicament, així com per la profundització en l’estudi i caracterització d’aquesta proteïna i les seves variants..

(45) Selective growth of λ-HIV-1 proteases in cells expressing the cI.HIV-1-cro construct. 10000. λ λ-HIVpinvHXB2. pfu/µl. 1000. λ-HIVpHXB2 λ-HIVpF95. 100. λ-HIVpF98 λ-HIVpG93. 10. λ-HIVpG98 λ-HIVpJ95 λ-HIVpJ97. 1.

(46) nhibition of patient F, G, and J λ-HIV-1 protease n the presence of four different protease inhibito 10000. λ-HIVpHXB2. λ-HIVpF95. λ-HIVpG93. λ-HIVpJ95. log pfu/µl. 1000. IND RIT SQV NFV. 100. 10 1 10000. λ-HIVpinvHXB2. λ-HIVpF98. λ-HIVpG98. λ-HIVpJ97. log pfu/µl. 1000. IND RIT SQV NFV. 100. 10. 1 0. 0.5. 2.5. 12.5 62.5. 313. 0. 0.5. 2.5. 12.5 62.5. 313. 0. µM drug. 0.5. 2.5. 12.5 62.5. 313. 0. 0.5. 2.5. 12.5 62.5. 313.

(47)