Caracterización de Rutas Metabólicas de las Bacterias Ácido Lácticas Presentes en la Fermentación del Cacao Theobroma cacao

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Caracterización de Rutas Metabólicas de las Bacterias Ácido Lácticas Presentes en la

Fermentación del Cacao Theobroma cacao

Miguel Bravo Gaviria

Proyecto de grado, Ingeniería Química, Biología, Universidad de los Andes Asesores: Andrés González Barrios

Alejandro Reyes Muñoz

Resumen: La fermentación del cacao se considera una etapa de procesamiento de gran importancia. Esto se debe a que todos los precursores que ayudan a generar los perfiles de sabor en el producto final son producidos a partir de los cambios que suceden durante la fermentación. Se conocen distintos grupos de microrganismos que se encuentran presentes durante este proceso, entre los cuales los de mayor importancia se consideran las levaduras, las bacterias ácido lácticas y las bacterias ácido acéticas. Cada cual tiene sus distintas funciones durante el proceso y generan condiciones que afectarán los cotiledones del cacao. En el presente trabajo se modelaron dos especies de bacterias ácido lácticas, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus fermentum con el objetivo de buscar distintos compuestos que aportan al sabor del chocolate, así como entender sus interacciones durante el proceso. A partir de la reconstrucción del genoma, se realizó un proceso de anotación por medio de la herramienta RAST, para obtener una primera aproximación de la red metabólica. Se realizó adicionalmente un primer acercamiento a la curación de la red para poder realizar modelamientos por medio de algoritmos como FBA y SteadyCom. Este último permite optimizar el crecimiento de dos o más organismos que comparten el mismo espacio. A partir de la anotación genética, se observó que estas especies no parecen producir compuestos precursores del sabor. Además, por medio de las simulaciones se logró obtener perfiles de producción de lactato para las dos especies, en donde los perfiles de producción de biomasa alcanzaron un valor de 25ℎ−1. La producción de lactato para los dos modelos alcanzo un flujo máximo de 1000 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ cuando el límite de glucosa se estableció en 500 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ. Aunque las simulaciones de SteadyCom no arrojaron resultados importantes debido a la falta de curación del modelo, se observó una producción de biomasa que alcanzó 125 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ cuando la glucosa se estableció en 400 𝑚𝑚𝑜𝑙/ℎ. Por medio de estos resultados, se concluyó que la glucosa es un compuesto limitante en el crecimiento de los organismos, además de que SteadyCom es una metodología adecuada para la simulación de modelos conjuntos de organismos. Por otro lado, la modelación de organismos a partir de la anotación de sus genomas requiere una gran cantidad de tiempo y no resulta eficiente cuando se desea observar el comportamiento de pocas rutas de la red metabólica.

Palabras Clave: Theobroma cacao, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum, Fermentación, SteadyCom

1. Introducción

El proceso de fermentación para la fruta del cacao Theobroma cacao se da de forma variable en distintos lugares del mundo dependiendo de la cantidad que se tenga para procesar. Esto se puede hacer apilando en montones el cacao y cubriéndolo con hojas, técnica utilizada mayormente en plantaciones pequeñas, o también por medio de la técnica de fermentación en

caja, en la cual se utilizan mayormente cajas de madera capaces de albergar entre 1 y 2 toneladas de producto (Lima & Nout, 2013).

La fruta del cacao consiste en una agregación de semillas además de una pulpa mucilaginosa que contiene aproximadamente un 83% agua, 12% azucares como glucosa, fructosa y sacarosa, 2% pentosas, 1% ácido cítrico y 1% pectina además de

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2 otros polisacáridos (Pettipher, 1986). Cada uno de

estos compuestos funciona como substrato para el crecimiento de los distintos organismos que se presentan durante el proceso de fermentación (Galvez et al., 2007). El pH cambiará dependiendo de la concentración de ácido cítrico en la pulpa y puede tomar valores entre 3.0 y 4.0 (Schwan et al., 2014). Para que la fermentación se dé de forma correcta es necesario que los embriones mueran, proceso que sucede debido a la difusión de compuestos como etanol, ácido acético y ácido láctico, que con el calor producido por los distintos procesos microbianos lo finalizan (Hansen et al., 1998). Esto desencadena una serie de procesos de descomposición de las paredes celulares acompañado por una baja en el pH de las semillas de 7.0 a 5.0 que permite la activación de enzimas que degradan las proteínas de los cotiledones en distintos aminoácidos y péptidos (Schwan et al., 2014). En cuanto a los proceso que ocurren fuera de la semilla es importante determinar cuáles son los organismos presentes, pues sus procesos metabólicos pueden cambiar de forma importante dependiendo de la estructura poblacional que se tenga.

Entre estos organismos, existen tres grupos a los cuales se les atribuye la mayor parte de los efectos que se producen durante la fermentación. Estas son las levaduras, las bacterias ácido lácticas y las bacterias ácido acéticas (Coppeti et al., 2011). Los microorganismos son introducidos al proceso de manera natural y pueden provenir de las manos de los trabajadores, utensilios usados para el transporte, apertura de la mazorca o de los mismos recipientes donde se haga el proceso de fermentación (Ostovar & Keeney 1973). También se ha sugerido la importancia de ciertos vectores como moscas de la fruta, abejas y otros insectos en la introducción de los microorganismos (Ostovar & Keeney 1973).

En cuanto a los grupos responsables de la fermentación, las levaduras son las más estudiadas, debido a que se han aislado de manera frecuente y se consideran esenciales para que el proceso se dé de manera apropiada (Schwan et al., 2014). Entre las especies que más se encuentran durante la

fermentación del cacao en Brasil, están Saccharomyces cerevisiae, Hanseniaspora uvarum y algunas especies de los géneros Candida y Pichia (Pereira et al., 2012).

Las levaduras inician el proceso de fermentación alcohólica, consumiendo azucares y produciendo etanol y dióxido de carbono, además de distintos compuestos como parte del metabolismo secundario (Romano et al., 2003). El etanol producido durante el crecimiento de las levaduras sirve como sustrato para el posterior crecimiento de las bacterias ácido acéticas, pero también puede permear las semillas y causar su muerte (Quesnel 1965). Por otro lado, el aumento de dióxido de carbono en el medio mejora las condiciones para el crecimiento de las bacterias ácido lácticas. Otro aspecto importante en este grupo es la degradación de la pulpa, generando así el exudado que se produce durante la primera etapa del proceso (Schwan et al., 1995). Esto último favorece la entrada de oxígeno en el sistema, que ayuda posteriormente al crecimiento de la comunidad de bacterias ácido acéticas. Finalmente, la muerte de estos organismos puede proveer micronutrientes como vitaminas y aminoácidos a los demás grupos (Fleet 2003).

Las bacterias ácido lácticas actúan en las primeras etapas del proceso y lo dominan justo después que la comunidad de levaduras empieza a decaer. Estos microorganismos producen lactato como producto de la fermentación y pueden consumir glucosa u otras azucares además de citrato. Las especies que más se asocian a este proceso en Brasil y Ecuador son Lactobacillus fermentum y Lactobacillus plantarum, debido a que se pueden encontrar en grandes cantidades y suelen dominar en tamaño poblacional frente a otras especies (Papalexandratou et al., 2011; Garcia-Armisen et al., 2010; Illeghems et al., 2011). Funcionalmente, las bacterias ácido lácticas al producir lactato y consumir citrato del medio, son capaces de regular el pH del medio, lo que permite la activación de enzimas dentro de las semillas del cacao (De Vuyst et al. 2010). Sin embargo, la producción de lactato se considera en algunos casos indeseable

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3 debido a la capacidad de este compuesto de entrar en

las semillas y generar niveles de acidez en el sabor del producto final (De Vuyst et al. 2010). Es también conocido, que este grupo es capaz de producir sustancias con funciones antimicrobianas que pueden afectar las comunidades de otros grupos (Fleet 2003). En cuanto a las bacterias ácido acéticas, existen muchas especies que se han encontrado durante la fermentación. Entre ellas están Acetobacter pasteurians, Acetobacter tropicalis, Acetobacter lovaniensis y Glucanobacter oxydans (Garcia-Armisen et al., 2010). Se conoce que los organismos que hacen parte de este grupo se encuentran desde el comienzo del proceso de fermentación, pero la falta de oxígeno en el medio limita su crecimiento. En el momento que la concentración de oxígeno aumenta, el crecimiento de este grupo se da de manera acelerada, utilizando el etanol presente en el medio y produciendo ácido acético (Lima et al., 2011). Este proceso se da de manera exotérmica, lo que lleva a una subida de la temperatura del fermentado hasta 50°C (De Vuyst et al. 2010). Estos cambios generan finalmente la muerte de las semillas y su desorganización interna, ayudando a la producción de compuestos precursores que generan los distintos sabores del chocolate (Lima et al., 2011).

Una reconstrucción metabólica de un organismo que ha sido curada, contiene las distintas reacciones que se presentan dentro de este, ya sea parte del metabolismo central o de intercambio. (Price et al., 2004). Estos modelos pueden utilizarse para simular su comportamiento frente a condiciones en las cuales las concentraciones de ciertos compuestos cambian, permitiendo entender su funcionamiento (Reed & Palsson, 2003). La construcción y solución de estos modelos se basa en la formulación de restricciones, así como una función objetivo, que definen el problema de manera lineal. Para la modelación de redes metabólicas se usa el estado estacionario del sistema, por lo que la restricción principal del sistema es que la suma de todos los flujos en los que participa cada metabolito sea igual a cero, basado en la estequiometria de las reacciones. La forma de

modelar organismos individuales más utilizada es el análisis de balance de flujo (FBA) (Orth et al., 2010). Para el modelamiento de consorcios existen dos aproximaciones que son principalmente usados, Joint FBA y OptCom. El primero crea un espacio para el intercambio de metabolitos entre especies en donde la función objetivo es la suma de las reacciones de biomasa, por lo que es necesario agregar nuevas restricciones para modelar un comportamiento lo más real posible (Stolyar et al., 2007). OptCom utiliza las mismas restricciones que los modelos basados en Joint FBA, pero su función objetivo se diferencia en usar una formulación de dos niveles, donde la función de biomasa es la función objetivo interna, y la biomasa de la comunidad es la externa (Zomorrodi & Maranas, 2012). También es posible la utilización de otra función que tenga en cuenta parámetros del consorcio.

SteadyCom es un modelo de optimización para consorcios basado en joint FBA, y se considera una forma generalizada del mismo (Chan et al., 2017). La principal ventaja de este modelo está en la predicción de comunidades sin necesidad de imponer una cantidad adicional de restricciones. Este modelo es además compatible con análisis de variabilidad de flujo (FVA), lo que hace que esta sea una herramienta importante que puede ser usada para modelar las comunidades microbianas de manera más aproximada.

Para poder realizar estas simulaciones, es necesario generar los modelos adecuados, los cuales son de análisis y reconstrucción basados en restricciones o COBRA por sus siglas en inglés. Las restricciones que se generan son dadas debido a la falta de información que existe para los modelos biológicos. Entre estas se encuentran la compartimentación, conservación de la masa y direccionalidad termodinámica (Heirendt et al., 2017). Este modelo permite entonces encontrar un set de soluciones por medio de la optimización basado en el organismo estudiado.

El objetivo principal de este estudio fue realizar una reconstrucción metabólica y curación preliminar de

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4 los modelos de bacterias ácido lácticas, Lactobacillus

fermentum y Lactobacillus plantarum, y observar su comportamiento a distintas concentraciones de glucosa. Para lograrlo, se realizaron procesos de anotación genómica y curación, además, utilizaron los modelos de optimización FBA para su modelamiento individual y StedyCom para el consorcio. Esto, con el objetivo final de poder entender cómo interactúan las distintas especies de bacterias ácido lácticas durante el proceso de fermentación, y cuál es su principal función. De igual manera, se hace un análisis topológico de las redes metabólicas para observar las estructuras metabólicas presentes en los distintos organismos.

2. Materiales y Métodos

Teniendo en cuanta la gran cantidad de organismos que pueden participar durante la fermentación, la escogencia de L. plantarum y L. fermentum para este estudio se fundamentó en estudios realizados en Brasil y Ecuador, en donde se realizó una determinación de las comunidades microbianas presentes en la fermentación del cacao. Con estos datos se soporta la idea de la utilización de estas dos especies de Lactobacillus, debido a que se presentaban en todos los estudios y tenían unas concentraciones altas, por lo que se consideraban los organismos dominantes de la bacterias ácido lácticas. A partir de esta información se buscaron los genomas en la base de datos de NCBI. Se utilizaron los archivos FASTA para los genomas de referencia que corresponden a Lactobacillus plantarum WCF S1 y Lactobacillus fermentum IFO 3959, con números de acceso GCA_000203855.3 y GCA_000010145.1 respectivamente (Wheeler et al., 2007).

2.1. Anotación del genoma

El proceso de anotación de los genomas se realizó por medio de la herramienta en línea RAST (Aziz et al., 2008), en donde se subieron los archivos FASTA para los dos organismos estudiados a la plataforma en línea de RAST.

El funcionamiento de anotación de RAST está dividido en varios pasos para poder identificar los genes, así

como su función. Una de las características de esta metodología, es la utilización de FIGfams, familias de proteínas que se agrupan de acuerdo a su función y su similitud. Estas dos características definen si las familias creadas hacen parte de un subsistema, en caso de ser agrupadas principalmente por función, o aquellas que no hacen parte de algún subsistema (Aziz et al., 2008).

En primer lugar, se identifican las regiones codificantes para el ARN de transferencia y ARN ribosomal (tRNA y rRNA por sus siglas en inglés). Este proceso se realiza con el fin de evitar estas regiones en los siguientes pasos, debido a la posible existencia de genes codificantes para proteínas que se sobreponen con las regiones encontradas. El siguiente paso consiste en estimar los posibles genes que se encuentren en el genoma, los cuales se consideran genes putativos. Este último proceso se realiza por medio de la herramienta GLIMMER2, el cual utiliza un método interpolado de Markov (Delcher et al., 1999). Teniendo un estimado inicial de genes codificantes para proteínas, se usan un conjunto de FIGfams que se consideran universales para los procariotas (grupo de enfoque para RAST). Con esto se busca además de encontrar estos genes en el genoma, hallar un estimado de los organismos filogenéticamente cercanos al genoma que se está anotando. En caso que alguno de los genes sea identificado en este paso, se pasa del conjunto de genes putativos al conjunto de genes determinados.

La identificación de los genomas cercanos, sirve para usar un conjunto FIGfams que se encuentren presentes en estos. Este conjunto se usa entonces en el nuevo genoma debido a que se espera una alta relación entre los FIGfams de los distintos genomas. Aquellos genes que se identifiquen son entonces trasladados al conjunto de determinados. Los genes que aún se encuentren en el conjunto de putativos son comparados con todos los FIGfams. Aunque esta búsqueda se hace únicamente con un conjunto representativo para determinar familias potenciales que se deban identificar en el genoma. El último paso del proceso consiste en realizar un blast de los genes

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5 putativos restantes con una base de datos no

redundante de proteínas. Esto con el fin de hallar ciertas similitudes y poder asignar funciones a estos genes.

2.2. Curación del modelo

Habiendo anotado los distintos genomas, se bajaron los datos por medio de ModelSEED (Henry et al., 2010), plataforma en la cual ya se había realizado el proceso de gapfind y gapfill, por lo que se tomaron las distintas reacciones, así como los distintos metabolitos presentes para cada organismo. A partir de estos daos, se realizó una búsqueda de las rutas del metabolismo central, así como de compuestos esenciales para el desarrollo de los organismos escogidos. Este proceso también incluyo una revisión de la reversibilidad de las reacciones más importantes, entra las cuales se encontraban las que involucraban la producción de lactato a partir de citrato y glucosa.

A partir de los modelos obtenidos anteriormente, se buscaron en los mapas para distintos subsistemas del metabolismo central para encontrar reacciones que no hubieran sido anotadas durante el proceso realizado con RAST. Las reacciones que no estuvieran en el modelo fueron agregadas siempre y cuando se tuviera evidencia suficiente de que estas hicieran parte del metabolismo del organismo. La información fue corroborada con literatura para poder obtener un modelo más robusto.

Las energías libres de Gibbs de las reacciones para estos subsistemas fueron también revisadas para poder determinar si la reversibilidad de la reacción fuera la correcta. Esta revisión de datos se realizó por medio de la información dada por la base de datos de ModelSeed (Henry et al., 2010), en donde es posible encontrar los valores para (delta de G) para cada una de las reacciones que se revisaron

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2.3. Mapeo de la red metabólica

Teniendo las distintas reacciones para los dos organismos estudiados, se creó una red metabólica con las interacciones entre los distintos compuestos por medio de Cytoscape (Doncheva et al., 2012). Este proceso se realizó para establecer los distintos metabolitos que participan en la mayoría de las reacciones presentes. Esto revela la cantidad de interacciones presentes para cada uno de los metabolitos existentes en cada uno de los microorganismos. Este proceso se realizó por medio de un conteo de cada una de las interacciones para los distintos metabolitos entre si, determinando sus relaciones en la red metabólica.

2.4. Optimización del modelo

El modelo corregido fue entonces modificado para poder generar un modelo COBRA con el cual fuera posible trabajar con los algoritmos de FBA y de SteadyCom (ver Anexo 1). Por medio de FBA, se realizó un análisis de sensibilidad para L. plantarum y L. fermentum con la glucosa como variable para evaluar el comportamiento de cada población de manera individual. Esto con el fin de determinar si cada modelo permitía el crecimiento y se definía la glucosa como recurso limitante, además de servir como comparación para el crecimiento del consorcio La glucosa se varió entre los valores de 0 y 600 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ. El sistema de optimización de SteadyCom fue usado para modelar el comportamiento de la comunidad a las mismas condiciones que con el FBA.

SteadyCom consiste en la maximización de los distintos organismos que comparten un espacio comunal conocido como lumen. Este se basa en encontrar la tasa de crecimiento comunal máxima, µ. Una diferencia que tiene esta formulación en comparación al modelo de FBA es el uso de una nueva variable llamada el flujo agregado, 𝑉𝑗𝑘, que se define para cada reacción j en cada organismo k y se define como el flujo agregado.

𝑉𝑗𝑘 = 𝑋𝑘 ∗ 𝑣 𝑗𝑘

Donde 𝑋𝑘 es la abundancia relativa del organismo k, por lo que 𝑉𝑗𝑘 tiene unidades de 𝑚𝑚𝑜𝑙/ℎ. Esta diferencia, hace que los flujos no estén normalizados por la biomasa del organismo. A continuación, se observan las distintas ecuaciones para resolver SteadyCom, basado en lo anterior.

La restricción (1) se basa en la ecuación que relaciona todas las reacciones con sus metabolitos, que al igualar a 0 se está calculando un estado estacionario del sistema, donde 𝑆𝑖𝑗𝑘 es la estequiometria del metabolito i en la reacción j. La restricción (2) limita los valores que pueden tomar los flujos agregados de cada reacción, donde 𝐿𝐵𝑗𝑘 y 𝑈𝐵𝑗𝑘 son los limites inferiores y superiores para cada una de las reacciones j en cada organismo k. La restricción (3) indica que la producción de biomasa es igual a la abundancia relativa de la especie k por la tasa de crecimiento comunal. Esta última restricción es un cambio considerable al modelo de joint FBA, debido a que no se espera que el crecimiento de las distintas especies sea igual. La restricción (4) es un balance para los flujos de intercambio entre el espacio comunal y los distintos organismos, donde 𝑢𝑖𝑐 y 𝑒𝑖𝑐 son los flujos de entrada y de salida para los metabolitos que pueden existir en el espacio compartido, y 𝑉𝑒𝑥𝑘 son los flujos de intercambio entre el espacio comunal y el individuo k. Este último tiene en cuenta la abundancia relativa del organismo por lo que cuantifica la contribución de cada especie al balance de los metabolitos i.

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7 En cuanto a la restricción (6), esta no permite que se

solucione el problema con valores de 𝑉𝑗𝑘 = 𝑋𝑘 = 0, dado que todas las restricciones se cumplen para este caso para cualquier µ. Al tener 𝑋𝑘 = 1, esta restricción hace inviable la solución con flujos iguales a 0. Por último, las restricciones (4) y (7) corresponden a la naturaleza de las variables.

3. Resultados y Discusión

Los modelos con los que se realizaron los distintos análisis fueron revisados para poder generar la mayor exactitud en comparación con la realidad del comportamiento de los organismos. La adición de reacciones, así como de metabolitos corresponde a esta expectativa del modelo. Uno de los primeros problemas que se observó al manipular los datos obtenidos de la anotación, fue la falta de ciertos compuestos esenciales en el crecimiento de los microorganismos seleccionados. Según los modelos iniciales, la salida de lactato no se presentaba en ninguno de los organismos, por lo que se debió agregar una reacción de transporte para este compuesto. También se observó la falta de citrato en L. fermentum, por lo que se debía agregar tanto la reacción de transporte, así como la descomposición de este de acuerdo con lo descrito por Hugenholtz en 1993.

También se revisaron los distintos compuestos pertenecientes a la función objetivo de biomasa para poder crear rutas para su producción. En primer lugar, se analizaron los distintos aminoácidos, aunque algunos no tenían rutas de síntesis, por lo que la agregación de reacciones de intercambio para que pudiera existir un flujo fue necesario. Esto permite su adición en la función objetivo de biomasa. Entre estos metabolitos se encuentran Isoleucina, Metionina y Triptófano. Esto no se logró hacer para todos los compuestos, debido a la complejidad del modelo y el número de reacciones y metabolitos presentes como se observa en la Tabla 1

Tabla 1. Numero de metabolitos y reacciones presentes para los modelos de L. plantarum y L.fermentum

Si bien el proceso de anotación permite obtener una gran cantidad de rutas presentes partir del genoma, si se realiza una comparación con otros modelos, se puede observar una gran diferencia en el número de reacciones y metabolitos con los que se trabaja. Un ejemplo de esto es el modelo usado por Teusink et al. en el 2006, el cual tiene 643 reacciones y 531 metabolitos. Esto permite identificar la magnitud de los modelos con los que se está trabajando.

3.1. Análisis de compuestos volátiles

Haciendo una comparación entre los metabolitos presentes en los modelos y los distintos compuestos volátiles conocidos que tienen un efecto en el sabor del chocolate de acuerdo con lo descrito por Rodriguez et al., 2011, se encontró únicamente un compuesto en L. fermentum. Se trata de Acetoina, una cetona que proporciona una calidad de olor calificada como cremosa (Rodriguez et al., 2011). Por otro lado, La mayor producción de compuestos que generan las bacterias ácido lácticas son lactato y manitol (Camu et al., 2007), compuestos necesarios para el crecimiento de las bacterias ácido acéticas, las cuales dominan el proceso de fermentación después de 48 h de empezar la fermentación (Passos et al., 1984). El proceso de producción de manitol no genera lactato, por lo que la acidez del proceso se verá limitada en caso que las especies presentes en la fermentación prioricen esta producción (Lefeber et al., 2011).

Esto parece confirmar en primer lugar que la función de las bacterias ácido lácticas en la fermentación es la producción de lactato, el cual baja el pH del medio y hace inviables las semillas con la ayuda de las altas temperaturas que alcanza el proceso (Schwan & Wheals 2004). Esto permite la destrucción de las divisiones biológicas presentes en los cotiledones. Es entonces cuando comienza la degradación de compuestos dentro del cacao, donde se producen los distintos precursores que darán origen a los distintos sabores durante el proceso de tostado. Es además

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8 importante notar que un cacao con un bajo contenido

de precursores no logrará obtener un sabor deseado sin importar como se lleve a cabo el proceso de fermentación (Rohan & Stewart, 1967).

3.2. Análisis topológico de la red

De acuerdo con el Anexo 2, La mayor parte de las interacciones entre metabolitos están dadas por aquellas asociadas al intercambio energético como lo son H+, ATP, ADP, Fosfato, etc. Otro compuesto de importancia en el modelo es el piruvato, el cual está asociado a las distintas rutas de producción de lactato como un intermedio, ya sea por el metabolismo de citrato o por el de carbohidratos (Hugenholtz, 1993; Kandler, 1993). Para los dos casos, L. fermentum y L. plantarum, este último compuesto tiene una gran participación en el metabolismo, además de presentar funcionalidades parecidas. Esto último se confirma por medio de los distintos procesos realizados en este estudio, especialmente en el metabolismo central. La gran similitud es concorde a los distintos procesos que estos organismos pueden presentar, dado que se trata de bacterias ácido lácticas heterofermentativas. En el caso particular de L. plantarum, aunque pueda usar el metabolismo homofermentativo, no se pudo reflejar en las simulaciones debido a la falta de curación.

teniendo la red metabólica, no solo se observan las relaciones entre metabolitos, también se pueden encontrar algunas reacciones que no se encuentran conectadas a la red principal. Esto se puede comparar con un grafo no conexo, indicando que el gapfill realizado por ModelSeed no fue completo. Esto se evidencia al observar el Anexo 3. En este se tiene que algunas de estas reacciones son de transporte, más específicamente por difusión. Otra reacción que se puede encontrar sin conectividad es la de Violaxanthin a Neoxanthin, compuestos asociados en la producción de ácido abscísico en plantas (Bouvier et al., 2000). Esto muestra la posibilidad de que este tipo de compuestos fue identificado de forma errónea al realizar la anotación, y por lo tanto no es posible generar una conectividad adecuada con la red metabólica.

Además, se tienen varios metabolitos que solo están conectados a 1, por lo que no se podrá obtener flujo en la reacción a la que este asociado. Esto sucede debido a la forma de solución del modelo de optimización, es igualar a 0 la suma de los flujos para cada metabolito. Debido a esto, si solo existe un metabolito en una reacción, su flujo debe ser igual a 0 y se mantendrá bloqueada hasta que se analice su función y la ruta a la cual pertenece.

3.3. Modelamiento de las redes metabólicas

En la figura 2 se puede observar el crecimiento para los dos modelos, mostrando que la concentración de glucosa en el medio es un factor limitante para el crecimiento de las dos poblaciones. El valor máximo que alcanzó fue de 25 ℎ−1, Pero el comportamiento que se obtiene no es igual para los dos modelos. Para L. plantarum existe un crecimiento inicial mayor que el de L. fermentum, pero desacelera cuando la concentración de glucosa es de 250 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ. Al observar la figura 3, se puede apreciar un cambio significativo en la producción de lactato entre L. plantarum y L. fermentum. Mientras que para el primero se empieza a producir este compuesto cuando la concentración de glucosa llega a 250 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ, momento que coincide con la desaceleración de la producción de biomasa. Aunque la producción de este compuesto se mantiene estática al pasar el umbral de los 500 (unidades) de consumo de glucosa, la producción de lactosa para L. fermentum termina siendo un poco menor que la de L. plantarum, pero su crecimiento termina siendo ligeramente mayor.

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Figura 2. Producción de lactato en función de la

glucosa disponible en el medio

Figura 3. Tasa de crecimiento para L. fermentum y L.

plantarum en función de la disponibilidad de glucosa en el medio

Por otro lado, al realizar el modelamiento en conjunto para los dos organismos solo se obtuvo crecimiento para L. plantarum. El comportamiento se da de manera directamente proporcional con la disponibilidad de glucosa hasta que se llega a un umbral de crecimiento de 125 ℎ−1 cuando la concentración de glucosa es de 400 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ, como se muestra en la figura 4. Pero la producción de lactato no aumenta y se mantiene en valores muy cercanos a 0, indicando que no existe producción de este compuesto bajo el modelo de SteadyCom.

Además, el crecimiento de L. fermentum es nulo bajo cualquiera de las condiciones dadas.

Figura 4. Tasa de crecimiento de L. plantarum por

medio de SteadyCom

A partir de la simulación del modelo conjunto se esperaba una posible diferencia en el crecimiento de los distintos organismos debido a que L. fermentum y L. plantarum no se encuentran en iguales proporciones en la mayoría del proceso de fermentación (Ardhana and Fleet 2003; Camu et al. 2007). Esto puede deberse a que L. fermentum es un heterofermentativo por lo que el 50% del producto de su fermentación es lactato, mientras que L. plantarum es heterofermentativa facultativa y puede producir una cantidad de lactato mayor. Un proceso distinto en las rutas metabólicas puede llevar un cambio en el crecimiento, especialmente cuando los cultivos en la fermentación del cacao son de gran tamaño. Además de las distintas rutas que poseen estos organismos, su crecimiento está condicionado por factores ambientales imposibles de modelar en este estudio como el pH y la temperatura, los cuales condicionan el crecimiento de formas distintas, hasta para cepas de la misma especie (Fu et al.,1999, Santoyo et al., 2003, Garro et al., 2004). Estos modelos no son entonces adecuados para medir sus interacciones, y no es posible determinar a que condiciones se podría disminuir la producción de lactato.

Teniendo en cuenta que las bacterias ácido lácticas dominan el proceso después de las levaduras, la

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10 disponibilidad de glucosa dependerá de estas últimas

y por consiguiente, el crecimiento de las ácido lácticas. De la figura 3 se puede observar que a una tasa de entrada menor a 500 𝑚𝑚𝑜𝑙/ ℎ de glucosa, L. plantarum tendrá una tasa de crecimiento mayor, y por ende dominará por encima de L. fermentum. Por medio de la figura 2 es posible determinar que la producción de lactato de L. plantarum es nula hasta que la glucosa se encuentra a un nivel de 250 𝑚𝑚𝑜𝑙/ ℎ, por lo que la acides causado por la presencia de lactato no será tan grande. Cuando la glucosa empieza a aumentar, se esperaría que L. fermentum domine esta etapa de la fermentación, aunque en estas condiciones los dos organismos tienen tasas de producción de lactato muy cercanas, por lo que la acides aumentara en el proceso. Debido a que grandes cantidades de lactato son indeseadas para el proceso por su capacidad de penetrar la testa y acidificar el sabor final del chocolate, es necesario entonces controlar el crecimiento de las bacterias ácido lácticas por medio de las concentraciones de glucosa que se produzcan anteriormente en el proceso

Uno de los posibles problemas que existen con los modelos es la falta de curación, por lo que los sistemas del metabolismo central no se encuentran completos y son en gran parte iguales entre los dos organismos, esto lleva a que las rutas tomadas por el algoritmo SteadyCom sean las mismas. Debido a que la función objetivo de biomasa no se encuentra completa, el algoritmo no dirigirá flujos hacia la producción de compuestos necesarios para el crecimiento del organismo. Esto se debe a que las reacciones para producir estos compuestos se encuentran bloqueadas y no es posible generar flujo al correrlo. Si bien este proceso puede hacerse, es necesario revisar cada compuesto perteneciente a la función objetivo y sus distintas rutas de producción para poder completar el modelo. Cada reacción que se adicione o se elimine del modelo debe tener un soporte con literatura que respalde las decisiones tomadas. Si bien se logró hacer la curación de producción de lactato por las rutas descritas por Gänzle en 2015, estas solo corresponden aproximadamente al 1% del modelo total. Uno de los

factores determinantes a la hora de realizar la curación fue la gran cantidad de metabolitos obtenidos de la anotación genética.

Por otro lado, las rutas de producción de ciertos aminoácidos no se lograron completar haciendo su producción inviable, esto se presentaba en aquellos que tenían la mayor cantidad de reacciones asociadas, debido a que esto implica una mayor cantidad de metabolitos con los que también se debe cumplir un flujo hacia su producción. En el Anexo 2 se puede observar que el grado de conectividad para el glutamato es alta para los dos organismos, complicando así su proceso de curación.

El número de rutas que se logró desbloquear al usar FBA para L. plantarum y L. fermentum fue de 139 y 123

respectivamente, correspondiendo

aproximadamente a un 10% de las reacciones totales. En la mayoría de los casos, el valor para las reacciones fue de 1000 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ o -1000 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ. Para el caso de SteadyCom, únicamente se obtuvo flujo en 82 de las reacciones combinadas y todas fueron en L. plantarum, por lo que no hubo crecimiento para L. fermentum. En cuanto a la función objetivo de biomasa, se usó la estequiometria dada por ModelSEED para los distintos compuestos, pero solo se logró añadir además de los requerimientos energéticos, ATP, ADP y H+ algunos aminoácidos como triptófano y metionina, que solo estaban involucrados en reacciones de intercambio con muy pocas dentro del organismo. Esto no garantiza que los resultados mostrados en las figuras 3 y 4 sean consistentes, haciendo necesaria la continuación del proceso de curación ya siendo buscando más reacciones que se le deban agregar al sistema para resolver ciertas rutas, o encontrar métodos más efectivos para realizar este proceso.

4. Conclusiones

En este trabajo se realizó un primer acercamiento a los modelos metabólicos para L. plantarum y L. fermentum, por medio de la anotación de sus genomas y una curación básica. Gracias a estos, se realizaron simulaciones para determinar el

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11 comportamiento de las interacciones entre estos dos

microorganismos. Por medio de los resultados obtenidos se pudo determinar que no parecen existir compuestos conocidos producidos por estas bacterias ácido lácticas que influyan en el sabor final del chocolate a excepción del lactato, mostrando que aparentemente la función de este grupo no es la producción de este tipo de compuestos. Aunque es necesario continuar con el proceso de curación para obtener un modelo que compruebo lo dicho anteriormente.

Por medio de las simulaciones se mostró que la glucosa es un compuesto limitante en el crecimiento de los organismos, aunque su papel no sea tan evidente cuando se trabajó con SteadyCom, indicando la falta de curación que se debe realizar para poder obtener un modelo completamente funcional. Es entonces importante mencionar que el modelo de SteadyCom puede ser utilizado para modelar comunidades microbianas, pero es necesario tener en primer lugar modelos funcionales en donde no existan rutas metabólicas bloqueadas. Finalmente se observó que existe una cantidad considerable de metabolitos que se mantienen bloqueados debido a la falta de conexiones que tienen, además de existir reacciones no conectadas al sistema, indicando un error en el gapfill hecho por ModelSeed. Es entonces necesario seguir con el proceso de curación para poder obtener modelos completos para L. plantarum y L. fermentum. Por medio de este trabajo se logró utilizar

SteadyCom, el cual parece ser un método adecuado para la simulación de modelos conjuntos, además de entender en primera instancia el comportamiento de las bacterias ácido lácticas en el proceso de

fermentación. Aunque no fue del alcance de este trabajo, sería interesante lograr modelos completos para todos los grupos de microorganismos presentes durante la fermentación para poder modelar sus interacciones, ya que como se observó, existe una dependencia entre los grupos para que puedan crecer. Esto podría mejorar el proceso, así como el sabor del producto final al poder aplicar los

conocimientos obtenidos de estos estudios.5.

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14

ANEXOS

A.1. Creación del modelo COBRA y código para StedyCom

Para poder correr SteadyCom por medio del toolbox de COBRA en Matlab, es necesario en primer lugar organizar los datos de manera correcta en un archivo de Excel. En las figuras A1.1 y A1.2 se muestra un ejemplo del modelo usado para L. plantarum.

Figura A1.1 Estructura de los datos para la lista de reacciones

Figura A1.2 Estructura de los datos para la lista de metabolitos

El archivo .xlsx debe tener dos hojas distintas en donde se muestre la información relacionada con las reacciones y los metabolitos en hojas distintas. En la primera debe estar la información correspondiente a las reacciones y en la segunda la de los metabolitos, sus nombres deben ser ‘Reaction List’ y ‘Metabolite List’ respectivamente. Para las reacciones, las filas ‘Abbreviation’ y ‘Reaction’ son obligatarios, mientras que ‘Descripton’ y ‘Notes’ dan información adicional que puede ser consultada posteriormente al generar el modelo. Es importante arregkar la direccionalidad de las reacciones, dado que solo se puede tener => o , por lo que si se tiene una reacción con direccionalidad <= debe cambiarse el orden para que cumpla con la estructura necesaria para crear el modelo COBRA.

En cuanto a los metabolitos, únicamente la columna ‘Abbreviation’ es necesaria. Los nombres dados a los metabolitos, deben ser los mismos usados en las reacciones para que la función xls2model sea capaz de generar la matriz S. Nótese que después del nombre de cada metabolito existe una letra encerrada en los paréntesis cuadrados [ ]. Esta hace referencia al espacio en el que se encuentra, [c] para citosol y [e] para extracelular. Teniendo esta estructura de datos, se usa la función,

model1 =xls2model('L_plantarum_Model.xlsx')

Donde model1 es el modelo COBRA creado y L_plantarum_Model.xls es el archivo en el que se guardaron los datos anteriormente descritos. A continuación, se generan las estructuras con las se creará el modelo conjunto

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15 utilizado por SteadyCom. Deben existir dos, en la primera se juntan los modelos COBRA y en la segunda los nombres que se les desee dar cada uno de los modelos.

models{1,1}=model1 models{2,1}=model2

nameTag{1,1}='L_plantarum'; nameTag{2,1}='L_fermentum';

Estos deben tener un orden interno, por lo que el modelo en la posición {1,1}, será al que se le asignará el nombre en la posición {1,1} de la estructura donde se encuentren los nombres. El siguiente paso es generar el modelo conjunto, donde se creará un espacio nuevo [u] donde se compartirán los distintos metabolitos que tengan reacciones de intercambio. Esto se genera con la función que se muestra a continuación

[JointModel]=createMultipleSpeciesModel(models,nameTag);

El modelo JointModel corresponde al modelo conjunto, en donde se creó la matriz S para los dos organismos. Para poder correr el algoritmo de SteadyCom, es necesario crear dos nuevas estructuras internas, infoCom e indCom. Esto se realiza con la función getMultiSpeciesModelId, como se muestra a continuación

[names, ids] = getMultiSpeciesModelId(JointModel, nameTag)

JointModel.infoCom=names JointModel.indCom=ids

Habiendo creado infoCom e indCom solo hace falta agregar la información correspondiente a las funciones objetivo de biomasa, las cuales se encuentran dentro de estas estructuras y deben llamarse spBM. En infoCom.spBM deben agregarse los nombres asignados a las funciones objetivo de biomasa, las cuales pueden encontrarse en JointModel.rxn, mientras que en indCom.spBM deben agregarse las posiciones de estas funciones. A continuación, se muestra el código utilizado para esta sección.

JointModel.infoCom.spBm{1,1}='L_plantarumbiomasa1' JointModel.infoCom.spBm{2,1}='L_fermentumbiomasa2' JointModel.indCom.spBm=[406;734]

El modelo generado puede entonces ser utilizado para usar el algoritmo SteadyCom, el cual se encuentra en el toolbox de COBRA y se corre usando la siguiente función,

[sol, result, LP, LPminNorm, indLP] = SteadyCom(JointModel,[]) Donde los resultados pueden ser encontrados en la estructura ‘result’

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A.2. Conectividad de los metabolitos Tabla A.2

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A.3. Redes Metabólicas

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Referencias

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