MASTER EN MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA: I+D TRABAJO FIN DE MÁSTER

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MASTER EN

MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA: I+D

TRABAJO FIN DE MÁSTER

ALUMNO: Paula Fernández Gómez

TÍTULO DEL TRABAJO: Producción heteróloga y caracterización bioquímica

de una acetilxilano esterasa de Lactobacillus plantarum WCFS1.

CURSO ACADÉMICO: 2016-2017 CONVOCATORIA: Junio

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Índice

Resumen / Abstract ... 2 Introducción ... 3 Justificación y Objetivos ... 5 Materiales y Métodos ... 5

1. Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de cultivo ... 5

2. Técnicas de ADN ... 6

2.1. Extracción de ADN cromosómico de L. plantarum WCFS1 ... 6

2.2. Amplificación de la secuencia del gen xynC mediante PCR ... 6

2.3. Electroforesis de ADN en geles de agarosa ... 7

2.4. Purificación de ADN a partir de geles de agarosa ... 7

2.5. Método de clonación independiente de ligación ... 8

2.6. Transformación genética de E. coli ... 8

2.7. Extracción y selección plásmidos recombinantes ... 8

2.8. Secuenciación de ADN y análisis de la secuencia ... 9

3. Técnicas de proteínas ... 9

3.1. Hiperproducción de la proteína recombinante ... 9

3.2. Purificación de la proteína recombinante ... 10

3.3. Electroforesis en geles de poliacrilamida ... 10

3.4. Ensayo de especificidad de sustrato ... 11

3.5. Caracterización bioquímica de la proteína Lp_2660 ... 11

3.5.1. Estudio cinético de la actividad acetilesterasa ... 11

3.5.2. Efecto de la temperatura y pH sobre la actividad acetilesterasa ... 12

3.5.3. Efecto de aditivos sobre la actividad acetilesterasa ... 12

3.5.4. Ensayo de estabilidad térmica ... 12

Resultados ... 13

1. Clonación, hiperproducción y purificación de la proteína Lp_2660 de L. plantarum WCFS1 ... 13

2. Actividad enzimática de la proteína Lp_2660 de L. plantarum WCFS1. ... 14

3. Caracterización bioquímica de la proteína Lp_2660 de L. plantarum WCFS1. ... 15

3.1. Parámetros cinéticos de la actividad acetilesterasa de Lp_2660 ... 15

3.2. Efecto de la temperatura en la actividad acetilesterasa de Lp_2660 ... 15

3.3. Efecto del pH en la actividad acetilesterasa de Lp_2660 ... 16

3.4. Efecto de aditivos en la actividad acetilesterasa de Lp_2660 ... 17

3.5. Estabilidad térmica de la proteína Lp_2660 ... 17

Discusión ... 18

Conclusiones ... 22

Bibliografía ... 22 Lista de abreviaturas

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Resumen

Las acetilxilano esterasas (EC 3.1.1.72), enzimas que actúan sobre el acetilxilano hidrolizando enlaces éster para liberar el grupo acetilo, han sido objeto de estudio en numerosos microorganismos por sus interesantes aplicaciones en la síntesis de antibióticos y el aprovechamiento de la biomasa vegetal. Análisis metagenómicos han identificado el gen codificante de una acetilxilano esterasa (Lp_2660) en Lactobacillus plantarum WCFS1. Para confirmar que esta anotación es correcta se procedió a la producción heteróloga en Escherichia coli, la purificación y la caracterización bioquímica de la proteína Lp_2660. El gen se clonó mediante un método de clonación independiente de ligación (LIC) en un vector de expresión que añade una etiqueta de polihistidina para su posterior purificación por cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC). Se obtuvo una proteína de 31 kDa con actividad principal frente al p-nitrofenil acetato (C2), aunque también presenta una alta actividad frente al p-nitrofenil butirato (C4). La proteína Lp_2660 mostró una actividad específica acetilesterasa de 1,51 U/mg y una eficiencia catalítica de 98,63±33,51 mM -1 min-1. Las condiciones óptimas de reacción se encuentran en el intervalo de temperatura de 22-37 oC (manteniendo más de un 80 % de su actividad a 4 oC) y a pHs ácidos. La actividad acetilestersa de la proteína Lp_2660 se vio fuertemente inhibida por la presencia de mercurio (Hg2+), cobre (Cu2+), SDS y PMSF, y favorecida por la presencia de potasio (K+) y Tween 80. Mostró una actividad del 50 % respecto al máximo tras 4 horas de incubación a 37 oC.

Abstract

Acetylxylan esterases (EC 3.1.1.72), enzymes that hydrolyze ester bonds from acetylxylan to release the acetyl group, have been studied in numerous microorganisms due to their interesting applications in the synthesis of antibiotics and complete degradation of xylan, one of the most abundant renewable polysaccharide in nature. Metagenomic analyzes have identified a gene coding for an acetylxylan esterase (Lp_2660) in Lactobacillus plantarum WCFS1. To confirm that this annotation is correct, the Lp_2660 protein was heterologous produced in Escherichia coli, purificated and biochemicaly characterizated. The gene was cloned by a ligation-independent cloning (LIC) method into an expression vector which added a polyhistidine tag for further purification by immobilized metal affinity chromatography (IMAC). We obtained a 31 kDa protein with main activity on p-nitrophenyl acetate (C2) and also high activity on p-nitrophenyl butyrate (C4). The Lp_2660 protein showed a specific acetylesterase activity of 1.51 U/mg and a catalytic efficiency of 98.63±33.51 mM-1 min-1. Optimal reaction conditions are within the temperature range of 22-37 oC (maintaining more than 80% of its activity at 4 oC) and acid pHs. The acetylsterase activity of the Lp_2660 protein was strongly inhibited by the presence of mercury (Hg2+), cooper (Cu2+), SDS and PMSF, and increased by the presence of potassium (K+) and Tween 80. It showed an activity of 50% of the maximum after 4 hours of incubation at 37 oC.

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Introducción

Las acetilxilano esterasas (EC 3.1.1.72) son enzimas que hidrolizan enlaces éster liberando el grupo acetilo del acetilxilano (Martíez-Martínez et al., 2007). El interés en las acetilxilano esterasas (EXE) reside en su aplicación en la industria farmacéutica y biotecnológica. Entre otros usos, se pueden emplear en la desacetilación enzimática de cefalosporinas para la síntesis de antibióticos o en la degradación de la hemicelulosa (Martíez-Martínez et al., 2007).

El aprovechamiento eficiente y económico de la biomasa vegetal se encuentra obstaculizado por la dificultad para degradar la pared celular vegetal, compuesta principalmente por celulosa seguida de hemicelulosa y, en menor medida, pectina y lignina (Koseki et al., 2005; Biely et al., 2014). El xilano, componente mayoritario de la hemicelulosa, está formado principalmente por polímeros de 1,4-β-D-xilosa sustituida en varios grados por residuos acetilo, arabinosilo y glucuronilo (Biely, 1985). Es por ello que para la completa degradación de la hemicelulosa, además de la acción de endo-β-1,4-xilanasas (EC 3.2.1.8) y β-xilosidasas (EC 3.2.1.37), es necesaria la actividad sinérgica de enzimas que eliminan los distintitos sustituyentes del xilano. Este tipo de enzimas incluyen las 1-arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55), α-glucuronidasas (EC 3.2.1.139), feruloil esterasas (EC 3.1.1.73) y las acetilxilano esterasas (Koseki et al., 2005).

Sin embargo, las acetilxilano esteras no solo muestran actividad frente al acetilxilano sino que aceptan otros sustratos acetilados, como la xilosa tetraacetato, la glucosa pentaacetato, el p-nitrofenil acetato, el α-naftil acetato, el ácido 7-aminocefalosporanico (7-ACA) y la cefalosporina-C (Figura 1) (Degrassi et al., 2000).

Figura 1. Reacciones catalizadas por acetilxilano esterasas. (A) Desacetilación de xilano acetilado. (B) Desacetilación del ácido 7-aminocefalosporanico o la acetilcefalosporina C catalizada por una

acetilxilano esterasa para generar ácido 7-amino-3-deacetilcefalosporanico (7-DACA) o deacetilcefalosporina C (DCPC) (Martíez-Martínez et al., 2007).

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Precisamente debido a estas dos últimas actividades, las acetilxilano esteras se han empleado en la producción de antibióticos β-lactámicos semisintéticos ya que permiten obtener las desacetilcefalosporinas a partir de las cuales se inicia el proceso de síntesis de antibióticos. Suponen una ventaja respecto al uso de métodos químicos al poder llevarse a cabo la reacción en condiciones suaves de temperatura y pH, y presentar un alto rendimiento.

Las acetilxilano esterasas, descritas por primera vez por Biely (Biely, 1985), se han encontrado en numerosos ambientes donde habitan microorganismos degradadores de lignocelulosa. La bioprospección de suelos forestales, del intestino de las termitas, del rumen de varios animales o del compost, ha permitido identificar tanto hongos como bacterias productores de acetilxilano esterasas (Adesioye et al., 2016).

Aunque la clonación, expresión y caracterización de acetilxilano esterasas se ha descrito en multitud de microorganismos (Adesioye et al., 2016), existen pocos estudios centrados en las bacterias ácido-lácticas como fuente de esterasas, quizás debido al bajo nivel de producción de este tipo de enzimas (Brod et al., 2010).

Lactobacillus plantarum es un organismo heterofermentativo facultativo capaz de utilizar una amplia variedad de fuentes de carbono. Desde la secuenciación completa en 2003 de las 3,3 Mb de su genoma (Kleerebezem et al., 2003), L. plantarum WCFS1 se ha convertido en uno de los Lactobacilos más estudiados (Nieuwboer y Hemert, 2016). Se trata de una de las bacterias lácticas con mayor genoma, lo que se relaciona con la gran variedad de azucares que puede metabolizar. La mayoría de genes implicados en estas funciones se concentran en una región cercana al origen de replicación denominada “lifestyle adaptation island” (Molenaar et al., 2005). Se trata por tanto de una especie muy versátil que es posible encontrar en diversos nichos ecológicos, como vegetales, carnes, pescados y lácteos fermentados así como en el tracto gastrointestinal humano (Siezen et al., 2011). Es la especie predominante en las fermentaciones de sustratos de origen vegetal (Rodríguez et al., 2009), donde la hemicelulosa es abundante, por lo que es probable que posea enzimas capaces de romper la biomasa vegetal, incluyendo acetilxilano esterasas. De hecho, en las bases de datos aparece en su genoma el gen xynC, que codifica la única proteína anotada como posible acetil xilosidasa.

Dada la importancia de estas enzimas tanto en la industria biotecnológica como farmacéutica resulta muy interesante la búsqueda y caracterización de nuevas acetilxilano esterasas con adecuadas propiedades bioquímicas que puedan ser empleadas en los diferentes procesos industriales.

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Justificación y Objetivos

Mediante análisis bioinformáticos del genoma de L. plantarum WCFS1 se ha identificado el gen xynC codificante de la proteína Lp_2660, anotada como una posible acetilxilano esterasa (número de acceso NC_004567.2).

Sin embargo, la asignación de la actividad enzimática basada en el grado de similitud con otras proteínas en muchas ocasiones resulta errónea, lo que reduce la relevancia de la información. Por ello, la asignación de una determinada especificidad basada en datos metagenómicos se debe verificar experimentalmente con la enzima pura.

Debido a las interesantes aplicaciones industriales en la síntesis de antibióticos y el aprovechamiento de la hemicelulosa, se decidió realizar una caracterización bioquímica que permitiera confirmar que la proteína Lp_2660 de L. plantarum WCFS1 es una acetilxilano esterasa, tal y como aparece anotada en las bases de datos.

Por ello, los objetivos específicos de este trabajo son: (i) la clonación del gen codificante de la proteína Lp_2660 de L. plantarum WCFS1, (ii) la producción heteróloga y purificación de dicha proteína, y (iii) la caracterización bioquímica de la misma.

Materiales y Métodos

1. Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de cultivo

El gen xynC, codificante de la proteína Lp_2660, se amplificó a partir del ADN extraído de la cepa Lactobacillus plantarum WCFS1, cedida por el Dr. Michiel Kleerebezem (NIZO Food Research, Paises Bajos), que procede de una colonia aislada de L. plantarum NCIMB 8826 obtenida de una muestra de saliva humana.

L. plantarum WCFS1 se cultivó en medio Man, Rogosa y Sharpe (MRS) a 30 oC sin

agitación.

El gen de interés se clonó en el vector de expresión pURI3-Cter (Curiel et al., 2011) mediante el método de clonación independiente de ligación (LIC) desarrollado por De las Rivas y colaboradores (Rivas et al., 2007) (Figura 2).

El plásmido pURI3-Cter-Lp_2660, con el gen codificante de la proteína Lp_2660 clonado, se propagó en Escherichia coli DH10B y la expresión se llevó a cabo en

E. coli BL21 (DE3). Ambas cepas se cultivaron en agitación (150 rpm) a 37 oC en

medio líquido Luria-Bertani (LB), al que se añadió ampicilina con una concentración final de 100 µg/mL.

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6 2. Técnicas de ADN

2.1. Extracción de ADN cromosómico de L. plantarum WCFS1

El ADN cromosómico de L. plantarum WCFS1 se aisló a partir de un cultivo de 10 mL de medio MRS incubado a 30 oC durante 24 horas. Las células se precipitaron por centrifugación a 12000 x g durante 1 minuto, se lavaron con 500 µL de tampón TES (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0) y se centrifugaron a 12000 x g durante 4 minutos. La ruptura celular se realizó con 600 µL de tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0), 10 mg/mL de lisozma (Sigma-Aldrich®) e incubando a 37oC durante 30 minutos. Se añadieron 80 µL de SDS al 10% y se mezcló por inversión para terminar de romper las células. Para purificar el ADN se realizó una extracción con un volumen equivalente de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1). Se centrifugó durante 15 minutos a 12000 x g, se tomó la fase superior y se realizó una segunda extracción con cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) para eliminar las trazas de fenol. Se centrifugó de nuevo 15 minutos a 12000 x g y se tomó la fase superior acuosa a la que se añadió NaCl 5 M en proporción 1:25. Se precipitó el ADN con etanol 100 %, se centrifugó 15 minutos a 12000 x g, se descartó el sobrenadante y se realizó un lavado con etanol al 70 % (Vaquero et al., 2004). El ADN se dejó secar, se resuspendió en 40-50 µL de tampón TE y se conservó a -20 oC hasta el momento de su uso.

2.2. Amplificación de la secuencia del gen xynC mediante PCR

Se amplificó el gen xynC por PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos 1814 (5’ TAACTTTAAGAGGAGATATACATatggcactgattcgtattaattttatg 3’) y 1815 (5’ GCTATTAATGATGATGATGATGATGattagctttaatatgcccagaattaac 3’), con los extremos 5’ complementarios con el vector de expresión pURI3-Cter (indicados en mayúsculas) y los extremos 3’ complementarios con el gen de interés (indicados en minúsculas).

Figura 2. Representación esquemática del plásmido de expresión pURI3-Cter. La secuencia del

plásmido presenta una etiqueta de polihistidina en el extremo carboxilo terminal seguida de cuatro codones de parada en tándem. La secuencia líder de expresión se encuentra bajo el control del promotor de la polimerasa Ø del fago T7. ApR es el gen de resistencia a ampicilina. Se indican también los sitios de restricción Nd (NdeI), N (NotI), H (HindIII) y C (ClaI).

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La reacción se llevó a cabo en un volumen de 50 µL incluyendo la polimerasa PrimeSTARTM HS (Takara) en una concentración final de 1,25 U/µL, el tampón de reacción 5X PrimeSTAR Buffer (Takara) con MgCl2 5 mM en la mezcla final, los

desoxiribonucleótidos (dNTPs) (Takara) 0,4 mM, los oligonucleótidos utilizados como cebadores en una concentración final 0,3 µM y el ADN molde (1 µL), que en este caso fue el ADN cromosómico extraído de L. plantarum WCFS1.

La reacción de PCR consistió en 30 ciclos con las siguientes fases: fase de desnaturalización del ADN a 98 oC durante 10 segundos; fase de hibridación de los cebadores a 55 oC durante 5 segundos; fase de elongación o síntesis de ADN a 72 oC durante un tiempo acorde a la longitud del gen amplificado (1kb/minuto). En este caso la secuencia del gen xynC tiene una longitud de 849 pb por lo que se seleccionó un tiempo de elongación de 1 minuto.

2.3. Electroforesis de ADN en geles de agarosa

Los productos amplificados por PCR se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 0,7 % en tampón TAE (tampón Tris-HCl 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0) (Sambrook et al., 1989). Las muestras cargadas contenían, en una proporción 2:1:2, los productos de la PCR, el tampón de carga (azul de bromofenol al 0,25 %, xilencianol FF al 0,25 % y glicerol al 30 %) y el tampón TE. La electroforesis se realizó a 90 V en tampón TAE. Como marcador de tamaño se utilizó el ADN del fago Lambda cortado con EcoT141 (Takara). Finalizada la PCR, los geles se tiñeron con GelRed ™ Nucleic acid Gel Stain (Biotium) 3X con NaCl 0,1 M. El resultado se visualizó mediante transiluminación ultravioleta (λ=302 nm) en el equipo

Molecular Imager ®ChemiDoc™ XRS+ Imaging System(BioRad).

En el caso de las PCRs en las que se amplificó el gen para su posterior purificación, se cargó todo el producto de PCR en el gel de agarosa al 0,7 % junto con tampón de carga en proporción 5:1. Se recortó la banda correspondiente al gen amplificado para la posterior purificación (apartado 2.4 de Materiales y Métodos) antes de continuar con la clonación.

2.4. Purificación de ADN a partir de geles de agarosa

Para la extracción y purificación del ADN resultado de la PCR de los geles de agarosa se utilizó el Kit QIAquick Gel extraction (QIAGEN). Compuesto por columnas de sílice y tampones de salinidad variable, este kit permite la adsorción del ADN a la columna para su lavado y posterior elución. De esta forma se obtiene el ADN del gen de interés que se emplea en la siguiente etapa de clonación en el vector de expresión pURI3-Cter (apartado 2.5 de Materiales y Métodos).

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2.5. Método de clonación independiente de ligación

El gen de xynC se clonó en el vector de expresión pURI3-Cter (Curiel et al., 2011) mediante el método de clonación independiente de ligación (LIC) (Rivas et al. 2007). Para ello se realizó en primer lugar la amplificación del fragmento correspondiente al gen xynC utilizando los oligonucleótidos 1814 y 1815. Estos oligonucleótidos amplifican el gen de tal forma que queda flanqueado por secuencias que hibridan con el vector pURI3-Cter. Posteriormente se llevó a cabo una segunda amplificación utilizando como molde el vector pURI3-Cter y como cebador el gen xynC previamente amplificado y flanqueado por secuencias que hibridan con el vector pURI3-Cter, de forma que se consigue la integración del gen de interés en el vector de expresión. La reacción se llevó a cabo en un volumen de 50 µL incluyendo la polimerasa PrimeSTARTM HS (Takara) en una concentración final de 1,25 U/µL, el tampón de reacción 5X PrimeSTAR Buffer (Takara) con MgCl2 5 mM en la mezcla final, los

desoxiribonucleótidos (dNTPs) (Takara) 0,4 mM, 20 µL del gen xynC amplificado con los cebadores 1814 y 1815 (que hibridan con el plásmido pURI3-Cter) y 2 µL del vector pURI3-Cter. Se realizaron 30 ciclos con las siguientes condiciones: 98 oC durante 10 segundos; 55 oC durante 5 segundos y 72 oC durante 4 min.

El producto de esta amplificación se incubó a 37 oC durante 10h con la enzima DpnI, que digiere únicamente el ADN metilado, por lo que solo actúa sobre el plásmido utilizado como molde (pURI3-Cter).

2.6. Transformación genética de E. coli

La transformaron genética de E. coli DH10B y E. coli BL21(DE3) se realizó mediante choque térmico partiendo de células competentes obtenidas mediante un protocolo modificado del método de cloruro de rubidio (Hanahan, 1983). Se aplicaron 10 µL de la digestión anterior (apartado 2.5 de Materiales y Métodos) sobre alícuotas de 200 µL de células competentes conservadas a -80 oC. Se incubó en hielo durante 15 minutos, a 37 oC durante 3 minutos y en hielo durante 5 minutos. A continuación se añadió 1 mL de medio LB y se incubó a 37 oC durante 1 hora. El producto de la transformación se sembró en placas de medio LB suplementado con ampicilina a una concentración final de 100 µg/mL. Se incubó a 37 oC durante 20h y se observó crecimiento de colonias transformadas.

2.7. Extracción y selección plásmidos recombinantes

Para seleccionar colonias en las que tuvo lugar la transformación con el vector que contiene el gen de interés se realizó una extracción rápida del ADN plasmídico seguida de una electroforesis convencional siguiendo un protocolo basado en el desarrollado por Sekar (Sekar, 1987). Las colonias se cogieron con puntas estériles y se resuspendieron en 20 µL de solución extractora (lisozima 0,5 mg/mL, EDTA 25mM; Tris-HCl 25 mM pH 7,5; ARNasa 0,1 mg/mL, azul de bromofenol 0,02 % y glicerol 11,5%). Se incubó a

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temperatura ambiente durante 15 minutos, se añadieron 5 µL de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1) y se agitó en vortex. A continuación se centrifugó a 13000 x g durante 2 minutos para conseguir la separación de dos fases. La fase superior acuosa se cargó en un gel de agarosa al 0,7 % y se llevó a cabo una electroforesis en las mismas condiciones que las indicadas en el apartado 2.3 de Materiales y Métodos. Como control se utilizó un cultivo de E. coli DH10B transformada con el plásmido pURI3-Cter sin ningún gen, de forma que en la electroforesis es posible distinguir por tamaño los plásmidos originales de los recombinantes, que incluyen el gen clonado.

Para continuar el proceso con la transformación de E. coli BL21(DE3) se obtuvo el plásmido pURI3-Cter-Lp_2660 con mayor pureza empleando el sistema comercial

FavorPrep™ Plasmid DNA extraction Mini Kit (Favorgen® Biotech Corp.). Se purificó

a partir de un cultivo en medio LB (100 µg/mL de ampicilina) de colonias positivas en la comprobación anterior, a 37 oC en agitación durante 20 horas.

2.8. Secuenciación de ADN y análisis de la secuencia

Antes de continuar con la producción de la proteína, se verificó por secuenciación que las colonias seleccionadas contenían el plásmido con la secuencia del gen xynC sin ninguna mutación. Se envió el ADN plasmídico al servicio de secuenciación Secugen que llevó a cabo la secuenciación utilizando el cebador T7 reverso, que hibrida con la secuencia que flanquea al gen en el plásmido pURI3-Cter-Lp_2660. La secuencia obtenida se comparó con la depositada en el NCBI (número de acceso NC_004567.2) utilizando el programa MUSCLE.

3. Técnicas de proteínas

3.1. Hiperproducción de la proteína recombinante

Se transformaron células competentes de E. coli BL21 (DE3) con el plásmido extraído de la colonia de E. coli DH10B en la que se confirmó que el vector pURI3-Cter-Lp_2660 incluía el gen xynC.

Para la producción de la proteína se realizó un preinóculo en medio LB (100 µg/mL de ampicilina) y se incubó en agitación (150 rpm) a 37 oC durante 20h. A continuación se inoculó 1 L del mismo medio y se cultivó en las mismas condiciones hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm de entre 0,4 y 0,6. Se indujo la producción de la proteína añadiendo isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) con una concentración final 0,4 mM.

Se ensayaron distintas condiciones de inducción modificando la temperatura de incubación (22, 30 y 37 oC) y el tiempo de expresión (4 y 20 horas). Se cultivó en agitación (150 rpm) y se recogieron las células por centrifugación a 7000 x g durante 15 minutos a 4 oC.

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10 3.2. Purificación de la proteína recombinante

Las células se resuspendieron en tampón de lavado (tampón fosfato 0,5 M, NaCl 300 mM, pH 7.0) y se lisaron mediante prensa French. El lisado celular se centrifugó a 15000 rpm (rotor SS34 en una centrífuga Sorvall) durante 40 minutos a 4 oC y se filtró empleando un tamaño de poro de 0,45 µm para eliminar restos celulares.

La purificación de la proteína se realizó mediante cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC) utilizando la columna TALON® (Clontech) gracias a la etiqueta de polihistidina de la proteína recombinante. El extracto celular se puso en contacto con la columna, previamente equilibrada con tampón de lavado, durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los materiales no adheridos específicamente a la columna se eluyeron con tampón de lavado con imidazol 10 mM. A continuación se eluyó la proteína de interés con tampón de lavado con imidazol 150 mM, se recogieron fracciones y se estimó la concentración de proteína en cada una midiendo la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro UVmini-1240 (Shimadzu).

Se combinaron las fracciones con mayor absorbancia por una parte y las fracciones con menor absorbancia por otra. Se realizó una diálisis de la las fracciones proteicas frente a tampón de lavado a 4 oC realizando varios cambios para eliminar el imidazol. La proteína purificada se conservó a -20 oC en glicerol al 10%.

La concentración de la proteína Lp_2660 en las muestras con un 10% de glicerol se calculó a partir de la absorbancia a 280 nm con la ecuación de Lambert-Beer, conociendo el peso molecular y el coeficiente de extinción molar teórico ( http://web.expasy.org/protparam/).

Se calculó el rendimiento de la purificación de la proteína Lp_2660 como los mg de proteína Lp_2660 obtenidos tras el proceso de purificación a partir de 1 L de cultivo de E. coli BL21 (DE3) transformada con el plásmido pURI3-Cter. La cantidad de proteína obtenida tras la purificación se calculó, aplicando la ecuación de Lambert-Beer, a partir de la absorbancia a 280 nm de las fracciones recogidas en la cromatografía IMAC y conociendo el coeficiente de extinción molar de la proteína Lp_2660 (50420 M-1cm-1), el paso óptico (1 cm), el peso molecular de la proteína Lp_2660 (31062,45 g/mol) y el volumen total recogido ( L).

3.3. Electroforesis en geles de poliacrilamida

Se realizó una electroforesis SDS-PAGE en gel de poliacrilamida al 10% del extracto, el eluido y las fracciones de la purificación de la proteína Lp_2660. Las muestras de proteína se mezclaron con tampón de ruptura (Tris-HCl 6,5 mM, SDS 2%, β-mercaptoetanol 5%, glicerol 10% y azul de bromofenol 0,005%, pH 6,8) y se incubaron 10 minutos a 80 oC. La electroforesis se llevó a cabo en un tampón Tris-HCl 25 mM, glicina 192 mM y SDS 0,1% a temperatura ambiente utilizando el marcador de tamaño Mini-PROTEAN® II. El gel se tiñó con Azul de Coomassie 15-30 minutos a 55 oC y se destiñó con una solución de metanol 25% y ácido acético 10%, para su

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visualización por epiiluminación con luz blanca en el equipo Molecular

Imager ®ChemiDoc™ XRS+ Imaging System(BioRad).

3.4. Ensayo de especificidad de sustrato

La especificidad de sustrato de la proteína Lp_2660 se determinó mediante un método colorimétrico empleando los siguientes derivados de p-nitrofenilo (pNP) de esteres de cadena corta: pNP acetato (C2), pNP butirato (C4) y pNP caprilato (C8). La actividad enzimática da lugar a la liberación de p-nitrofenol, lo que permite la cuantificación mediante la medida de la absorbancia a 348 nm (Liu et al., 2001). Los experimentos se llevaron a cabo en placas multipocillo (96 pocillos, Sarstedt) y la medida de la absorbancia con un lector de placas Synergy HT Bio Tek microplate. Todos los ensayos se realizaron por triplicado e incluyendo un control en el que no se añadió la proteína Lp_2660.

La mezcla de reacción estándar incluyó el derivado de pNP en una concentración final 1 mM, 7 µg de la proteína Lp_2660 y se realizó en tampón fosfato 50 mM, pH 7,0 (volumen final 150 µL). Se incubó a 30 oC durante 10 minutos, se paró la reacción en hielo y se midió la absorbancia a 348 nm.

La actividad específica, que son los moles de p-nitrofenol producidos por minuto por mg de proteína, se determinó a partir de la absorbancia media de la reacción estándar. La concentración de p-nitrofenol se halló empleando la ecuación de Lambert-Beer, conociendo el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol (6890 M-1cm-1) y el paso óptico (0,43 cm), y se calcularon los moles de p-nitrofenol teniendo en cuenta que el volumen de reacción es de 150 µL. El tiempo de reacción fue de 10 minutos y se emplearon mg de proteína en el ensayo.

3.5. Caracterización bioquímica de la proteína Lp_2660

La caracterización bioquímica se realizó utilizando como sustrato el pNP acetato (1 mM concentración final). En la reacción estándar se utilizaron 7 µg de proteína Lp_2660 y tampón fosfato 50 mM, pH 7,0 (volumen final 150 µL). Todos los ensayos se realizaron por triplicado e incluyendo un control sin la proteína Lp_2660. La reacción se llevó a cabo a 30 oC durante 10 minutos, se paró en hielo y se midió la absorbancia a 348 nm

3.5.1. Estudio cinético de la actividad acetilesterasa de la proteína Lp_2660

Se determinaron los parámetros cinéticos de la proteína Lp_2660 como acetilesterasa. Para ello se realizaron ensayos con distintas concentraciones de sustrato (pNP acetato) entre 0 y 1 mM (0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1 mM). Las reacciones se realizaron en tampón fosfato 50 mM, pH 7,0 (volumen final 150 µL) y utilizando 1 µg de proteína Lp_2660. Las placas se precalentaron a 30 oC durante 5 minutos antes de añadir la proteína y proceder a la medida de la absorbancia a 348 nm cada 30 segundos

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empleando un lector de placas Synergy HT Bio Tek microplate. La reacción se llevó a cabo a 30 oC durante 10 minutos y con agitación entre las lecturas de la absorbancia. Los datos obtenidos se representaron gráficamente para calcular la velocidad inicial, para cada concentración ensayada de pNP acetato, a partir del intervalo lineal. El análisis de la cinética enzimática se realizó con el programa SigmaPlot 12.5, que calcula los valores de la constante de Michaelis (KM) y la velocidad máxima (Vmax) frente al

pNP acetato. Se calculó la constante catalítica (kcat) como el cociente de la Vmax entre la

concentración de proteína empleada, y la eficacia catalítica (Ecat) como el cociente de la

KM entre la kcat.

3.5.2. Efecto de la temperatura y pH sobre la actividad acetilesterasa de la proteína Lp_2660

Para determinar la temperatura óptima para la actividad acetilesterasa de la proteína Lp_2660 se realizaron ensayos estándar modificando la temperatura de reacción: la mezcla de reacción se incubó a 4, 22, 30, 37, 45 y 65 oC durante 10 minutos.

El efecto del pH sobre la actividad acetilesterasa de la proteína Lp_2660 se determinó empleando soluciones tamponadas con distinto pH (3; 4; 5; 6; 6,5; 7 y 8). Para el ensayo a pH 3 se usó tampón citrato 50 mM, para los ensayos a pH 4 y 5 se usó tampón acetato 50 mM, para el ensayo a pH 6 se usó tampón citrato, para los ensayos a pHs 6,5 y 7 se usó tampón fosfato 50 mM y para el ensayo a pH 8 se usó tampón Tris 50 mM.

3.5.3. Efecto de aditivos sobre la actividad de actividad acetilesterasa de la proteína Lp_2660

Se determinó el efecto de la presencia de metales y otros agentes que podrían modificar la actividad enzimática realizando el ensayo estándar en tampón fosfato 50 mM, pH 7,0 con distintos aditivos a una concentración 2 mM: KCl, CaCl2, HgCl2, MgCl2, ZnCl2,

CuCl2, NiCl2, FeCl2, MnCl2, Tween 80, SDS, cisteína, ditiotreitol (DTT),

β-mercaptoetanol, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), dietilpirocarbonato (DEPC) y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

3.5.4. Ensayo de estabilidad térmica de la proteína Lp_2660

La termoestabilidad se estudió incubando la proteína Lp_2660 a distintas temperaturas (4, 22, 30, 45 y 65 oC) durante intervalos de tiempo determinados (0,5; 1; 2; 4; 6 y 24 horas) y realizando el ensayo colorimétrico estándar inmediatamente después para determinar la actividad residual.

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Resultados

1. Clonación, hiperproducción y purificación de la proteína Lp_2660 de

L. plantarum WCFS1

El gen de la proteína Lp_2660 de L. plantarum WCFS1 se clonó en el plásmido de expresión pURI3-Cter mediante un sistema independiente de ligación (apartado 1 de Materiales y Métodos) y el plásmido pURI3-Cter-Lp_2660 se propagó en E. coli DH10B. Se realizó un chequeo de las colonias obtenidas tras la transformación para buscar candidatas en las que se hubiera producido la clonación del gen xynC (Figura 3).

Figura 3. (A) Amplificación mediante PCR del fragmento del gen xynC, codificante de la proteína

Lp_2660, utilizando los oligonucleótidos 1814 y1815: (1) marcador de peso molecular λT14 (Takara), (2) banda correspondiente al gen xynC. (B) Chequeo de las construcciones pURI3-Cter-Lp_2660 mediante el método de extracción rápida de plásmidos: (1) marcador de peso molecular λT14 (Takara), (2) control pURI3-Cter, (3-20) ADN plasmídico de las colonias seleccionadas.

Se extrajo el ADN plasmídico de la colonia candidata y se secuenció empleando el cebador T7 reverso frente a la secuencia que flanquea al gen xynC. Se realizó un alineamiento del resultado de la secuenciación del plásmido pURI3-Cter-Lp_2660 frente al gen xynC, codificante de la proteína Lp_2660, depositado en la base de datos del NCBI. La secuenciación permitió descartar que se hubieran producido mutaciones indeseadas en la secuencia del gen codificante de la proteína Lp_2660 durante la amplificación y el clonaje.

La hiperproducción de la proteína Lp_2660 en E. coli BL21 (DE3) transformada con el plásmido pURI3-Cter-Lp_2660 se llevó a cabo utilizando una concentración 0,4 M de IPTG como inductor de la expresión del gen xynC. La combinación de condiciones de inducción elegida fue la incubación a 22oC durante 20 horas, ya que permitió obtener una mayor producción de la proteína Lp_2660.

Se comprobó que la proteína purificada en la cromatografía de afinidad a cobalto era la Lp_2660 mediante una electroforesis SDS-PAGE en gel de poliacrilamida al 10% en la que se visualizaron las distintas etapas de la purificación (Figura 4).

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Figura 4. Electroforesis SDS-PAGE en gel de poliacrilamida al 10% de la purificación de Lp_2660:

(1) marcador, (2) control, (3) extracto, (4) eluido, (5-9) fracciones 1 a 5 recogidas durante la elución de la proteína de interés.

El tamaño teórico aproximado de esta proteína es de 31 kDa y, efectivamente, se observó una banda correspondiente a este tamaño y de concentración decreciente en las fracciones 1 a 5 recogidas en la purificación. Esta banda también se puede observar, aunque de forma más tenue, en el extracto pero no en el eluido. Como control se empleó una cepa de E. coli BL21 (DE3) transformada con el plásmido pURI3-Cter sin ningún gen clonado.

Se obtuvo un rendimiento de la purificación de 4,15 mg de proteína Lp_2660 por litro de cultivo.

2. Actividad enzimática de la proteína Lp_2660 de L. plantarum WCFS1.

La actividad enzimática de la proteína Lp_2660 se estudió frente a derivados de pNP de esteres de cadena corta. Los resultados obtenidos se recogen en la Figura 5.

Figura 5. Actividad relativa de la proteína Lp_2660 (7 µg) sobre los siguientes derivados de

p-nitrofenilo (1 mM): pNP acetato (C2), pNP butirato (C4) y pNP caprilato (C8).

La actividad más elevada se detectó frente al sustrato pNP acetato, con una longitud de cadena de 2 carbonos (C2). La proteína Lp_2660 también presentó una actividad

0 20 40 60 80 100 A ct iv idad rel at iv a (% )

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relativa elevada (94 %) frente al sustrato pNP butirato (C4) pero solo un 20 % frente al pNP caprilato (C8). Por tanto, se realizó la caracterización de la proteína Lp_2660 empleando el sustrato para el que se obtuvo mayor actividad: el pNP acetato.

La proteína Lp_2660 recombinante purificada presentó una actividad específica acetilesterasa de 1,51 U/mg (µmol/min/mg).

3. Caracterización bioquímica de la proteína Lp_2660 de L. plantarum WCFS1. 3.1. Parámetros cinéticos de la actividad acetilesterasa de Lp_2660

Se realizaron ensayos cinéticos utilizando 1 µg de proteína Lp_2660 y distintas concentraciones de pNP acetato comprendidas entre 0 y 1 mM. Se comprobó que la representación de la velocidad inicial frente a la concentración de sustrato se ajusta a una hipérbola, por lo que la cinética de reacción se corresponde con la de Michaelis-Menten (Figura 6).

Figura 6. Cinética de reacción de la proteína Lp_2660 (1µg) como acetilesterasa. Se representa la

velocidad inicial de reacción (Abs 348 nm / min) frente a la concentración del sustrato pNP acetato (mM). Los valores representados son el promedio de los triplicados y se ajustaron a una hipérbola utilizando el programa SigmaPlot 12.5.

Se obtuvieron los siguientes valores para los parámetros cinéticos: Vmax 3,99±0,56 µmol min-1mg-1; KM 1,26±0,25 mM; kcat 123,93±17,30 min-1;

Ecat 98,63±33,51 mM -1 min-1.

3.2. Efecto de la temperatura en la actividad acetilesterasa de Lp_2660

Se ensayó el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la proteína Lp_2660 empleando como sustrato el pNP acetato. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 7. [pNP acetato] V 0 ( A bs 348 nm /m in)

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Figura 7. Actividad relativa de la proteína Lp_2660 sobre pNP acetato (1 mM) a distintas temperaturas

de reacción. Los ensayos se realizaron utilizando 7 µg de proteína Lp_2660 y por triplicado. Se muestran los valores medios (descartando la absorbancia procedente del control) relativizados respecto al mayor de ellos y los errores relativos.

La actividad acetilesterasa de la proteína Lp_2660 se mantiene con valores superiores al 80 % en el intervalo de temperatura que va de 4 a 37 oC. Por encima de 37 oC su actividad decae bruscamente hasta valores de actividad relativa inferiores al 20 %, como puede observarse en los ensayos realizados a 45 y 65 oC.

3.3. Efecto del pH en la actividad acetilesterasa de Lp_2660

Se estudió el efecto del pH sobre la actividad enzimática de la proteína Lp_2660 utilizando como sustrato el pNP acetato y llevando a cabo la reacción a distintos pHs entre 3 y 8. En la Figura 8 se representan los resultados obtenidos.

Figura 8. Actividad relativa de la proteína Lp_2660 sobre pNP acetato (1 mM) llevando a cabo la

reacción a distintos pHs. Los ensayos se realizaron utilizando 7 µg de proteína Lp_2660 y por triplicado. Se muestran los valores medios (descartando la absorbancia procedente del control) relativizados respecto al mayor de ellos y los errores relativos.

La proteína Lp_2660 presenta una mayor actividad acetilesterasa a pHs comprendidos entre 4 y 6, con una actividad relativa superior al 80 %. A pH más ácido la actividad de la proteína Lp_2660 es ligeramente menor, como puede observarse en el ensayo realizado a pH 3, en el que se obtuvo una actividad relativa del 70%. En cambio el aumento del pH por encima de 6 provoca una disminución considerable de la actividad

0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 Ac ti vidad r elativa (% ) Temperatura (°C) 0 20 40 60 80 100 2 3 4 5 6 7 8 Ac ti vi dad r elativ a (% ) pH

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acetilesterasa hasta valores de actividad relativa del 20 y 30 % en los ensayos realizados a pH 6,5 y 7 respectivamente. La actividad relativa de la proteína Lp_2660 se reduce hasta un valor del 2 % cuando la reacción se lleva a cabo a pH 8.

3.4. Efecto de aditivos en la actividad acetilesterasa de Lp_2660

Se estudió la capacidad de distintos aditivos en concentración 2 mM para modificar la actividad acetilesterasa de la proteína Lp_2660. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 9 relativizados respecto al control, la reacción estándar sin ningún aditivo.

Figura 9. Efecto de distintos aditivos (en concentración 2 mM) sobre la actividad acetilesterasa de la

proteína Lp_2660 (7 µg): ( ) control sin aditivos, ( ) iones metálicos, ( ) detergentes, ( ) agentes reductores, ( ) dos inhibidores de proteasas y ARNasas por interacción covalente, el PMSF y el DEPC; y un agente quelante de cationes divalentes, el EDTA. Se consideró a la actividad del control, al que no se añadió ningún aditivo, como el 100 %.

Como se puede observar, los aditivos que provocan un mayor descenso en la actividad de la proteína Lp_2660 son el mercurio (Hg2+), seguido del inhibidor de proteasas PMSF, el detergente SDS y el cobre (Cu2+); todos ellos con una actividad relativa menor del 30 %. Los aditivos que más aumentan la actividad relativa son el potasio (K+) y el detergente Tween 80, que mostraron valores de actividad relativa superiores al 134 % respecto al control. También provocaron un aumento de la actividad aditivos como el calcio (Ca2+) y el hierro (Fe2+), con valores del 126 y 129 % respectivamente.

3.5. Estabilidad térmica de la proteína Lp_2660

La estabilidad térmica de la proteína Lp_2660 se ensayó en un intervalo de temperaturas comprendido entre los 22 y los 65 oC durante un periodo de 24 horas. En la Figura 10 se representan los resultados obtenidos en los ensayos estándar relativizados respecto a los ensayos realizados a tiempo cero.

0 20 40 60 80 100 120 140 Ac ti vidad r elativa (% )

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Figura 10. Estabilidad térmica de la proteína Lp_2660. Efecto de la incubación a temperaturas

comprendidas entre los 22 y 65 oC durante periodos de tiempo crecientes hasta 24 horas (0; 0,5; 1; 2; 4; 6 y 24 horas). Los valores representados son las actividades relativas respecto al tiempo 0. Se realizaron ensayos estándar por triplicado con 7 µg de la proteína Lp_2660 y pNP acetato 1 mM.

La incubación de la proteína Lp_2660 a 65 oC causa un descenso de la actividad acetilesterasa hasta valores cercanos a cero en tan solo 30 minutos. De forma similar, la actividad de la proteína Lp_2660 desaparece después de una hora de incubación a 45 oC.

En cambio, la incubación a 22, 30 y 37 oC reduce la actividad en torno al 50 % pero se mantiene hasta las 4 horas. Pasado este tiempo, la actividad de la proteína disminuye hasta hacerse prácticamente cero a las 6 horas cuando la incubación se realiza a 30 y 37 oC. En el caso de la incubación a 22 oC se conserva este nivel reducido de actividad pasadas las 6 horas, y finalmente en la medida a las 24 horas la actividad acetilesterasa desaparece por completo.

Discusión

Debido a las interesantes aplicaciones industriales de las acetilxilano esterasas se decidió realizar una caracterización bioquímica de la proteína Lp_2660, que estaba anotada como una posible acetilxilano esterasa en las bases de datos. Para ello se clonó, mediante un sistema independiente de ligación (LIC), el gen xynC en el vector de expresión pURI3-Cter para la producción heteróloga de la proteína Lp_2660 en Escherichia coli, y su posterior purificación y caracterización bioquímica.

Las acetilxilano esterasas se pueden clasificar en 8 familias dentro de las carboxilesterasas (CE), basándose en relaciones filogenéticas de sus secuencias y, en algunos casos, en su especificidad de sustrato. En la base de datos de proteínas CAZy (http://www.cazy.org/) la proteína Lp_2660 aparece anotada como una

0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 A ctivi da d r ela tiva (% )

Tiempo de incubación (horas)

22 °C 30 °C 37 °C 45 °C 65 °C

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carboxilesterasa 1 (CE1). Esta familia de CE incluye principalmente acetilxilano esterasas aisladas de hongos, aunque muestran una homología con acetilxilano esterasas procedentes de bacterias suficiente para clasificarlas en la misma categoría (Adesioye et al., 2016).

La actividad enzimática esterasa de la proteína Lp_2660 se ensayó frente a derivados de pNP de esteres de cadena corta. Teniendo en cuenta que se trataba de una proteína anotada como una acetilxilano esterasa se esperaba que el máximo de actividad fuera frente al pNP acetato. Sin embargo, se encontró que la actividad relativa es prácticamente la misma para dos sustratos de cadena corta: el pNP acetato (C2) y el pNP butirato (C4). En cambio, la actividad relativa sobre el pNP caprilato (C8), de mayor longitud de cadena, es menor del 20%. En la caracterización de otras esterasas de L. plantarum con actividad principal frente a pNP acetato se han encontrado diversos comportamientos. Algunas son capaces de actuar sobre derivados pNP de esteres de longitud de cadena comprendida entre los 2 y 16 carbonos (Esteban-Torres et al., 2014a; Esteban-Torres et al., 2014b) mientras que otras no son capaces de hidrolizar esteres de longitud de cadena superior a 4 carbonos (Esteban-Torres et al., 2014c, Kim et al., 2017). Este último comportamiento se aproxima al de la proteína Lp_2660 y coincide con lo esperado en una acetilesterasa.

Para caracterizar la proteína Lp_2660 como una acetilxilano esterasa se empleó el pNP acetato como sustrato, evaluando de esta forma su actividad acetilesterasa. Se trata de un método ampliamente utilizado para la caracterización de acetilxilano esterasas debido a la falta de disponibilidad de los sustratos naturales adecuados y a que permite el seguimiento espectrofotométrico de los ensayos (Christov y Prior, 1993).

La actividad específica de la proteína Lp_2660 frente al pNP acetato fue de 1,51 U/mg, un valor que se encuentra dentro de lo habitual para acetilxilano esterasas de hongos (Christov y Prior, 1993). Por ejemplo, las acetilxilano esterasas de Neocallimastix MC-2 (CE2, 3 y 6), Orpinomyces PC-3 (CE6), Trichoderma reesei QM9414 (CD5, 16) (Christov y Prior, 1993) y Aspergillus ficuum (CE1) (Chung et al., 2002), tienen actividades específicas de 5,11; 3,14; 0,24 y 0,9 U/mg respectivamente. En general las actividades específicas de las acetilxilano esterasas de bacterias son notablemente superiores a las de hongos. Como ejemplo se pueden mencionar las acetilxilano esterasas de Streptomyces C-254, Streptomyces olivochromogenes NRCC 2258 (Christov y Prior, 1993), Caldicellulosiruptor bescii (Soni et al., 2017) y Bacillus pumilus (Degrassi et al., 1998), con valores de actividad específica de 110,4; 17,2 ; 94 y 40 U/mg respectivamente. Teniendo en cuenta la actividad específica frente al pNP acetato que muestran otras esterasas de L. plantarum, como la proteína Lp_0973 (128,9 U/mg) (Brod et al., 2010) o la proteína Lp_1002 (170 U/mg) (Esteban-Torres et al., 2014d), la actividad específica de la acetilxilano esterasa Lp_2660 es considerablemente inferior.

El estudio de la cinética de reacción de la hidrólisis del pNP acetato por la proteína Lp_2660 permitió obtener un valor de eficiencia catalítica de 98,63 mM-1 min-1.

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Estudios previos de caracterización de acetilxilano esterasas han calculado sus parámetros cinéticos y obtenido eficiencias catalíticas muy superiores, como es el caso de la acetilxilano esterasa CE1 de Aspergillus awamori (3420 mM-1 min-1) (Koseki

et al., 2005) o la acetilxilano esterasa termófila de C. bescii (17220 mM-1 min-1) (Soni

et al., 2017). De forma similar, la eficiencia catalítica de la esterasa Lp_0973 de

L. plantarum es de 17184 mM-1 s-1, considerablemente mayor a la de la proteína

Lp_2660 (Brod et al., 2010). Este parámetro es la relación entre la constante catalítica (kcat), que describe la velocidad de la reacción enzimática en condiciones de saturación

por sustrato, y la constante de Michaelis (KM), que es un indicador de la afinidad de la

proteína por el sustrato. En el caso de la proteína Lp_2660 el valor de KM obtenido en el

análisis cinético (1,26 mM) es muy similar a los valores hallados para las proteínas de los ejemplos anteriores. Las mayores diferencias se encuentran en la kcat, para la que se

obtuvo un valor de 123,93 min-1 mientras que los valores encontrados en otras acetilxilano esterasas son superiores (4914, 6894, 10512 min-1) (Koseki et al., 2005; Brod et al., 2010; Soni et al., 2017). Esto parece indicar que la afinidad de la proteína Lp_2660 por el pNP acetato se encuentra en el mismo nivel que otras proteínas de actividad similar y que las mayores diferencias aparecen en la capacidad para llevar a cabo la reacción, lo que disminuye la eficiencia catalítica de la proteína Lp_2660. En el estudio del efecto de aditivos cabe destacar que la presencia de iones metálicos de cobre (Cu2+) y mercurio (Hg2+) reduce de manera importante la actividad acetilesterasa de la proteína Lp_2660, especialmente este último, que provoca que la actividad relativa sea de solo un 17 % respecto al control. La presencia de iones de zinc (Zn2+) y níquel (Ni2+) también disminuye la actividad relativa aunque en menor medida. En cambio, los iones de potasio (K+), calcio (Ca2+) y hierro (Fe2+) contribuyen al aumento de la actividad hasta valores superiores al 125 %. La disminución de la actividad relativa como consecuencia de la adición de iones de metales pesados se ha observado previamente en otras acetilxilano esterasas, como las de Bacillus pumilus y

Schizophyillum commune, inhibidas principalmente por Cu2+ y Zn2+ (Degrassi et al.,

1998).

El efecto de los detergentes sobre la actividad de la proteína Lp_2660 también es variado. Mientras que el SDS reduce la actividad hasta un 22%, el Tween 80 es uno de los aditivos que más aumenta esta actividad, llegando a un valor del 134 % respecto al control. Los detergentes iónicos, como es el caso del SDS, son capaces de desnaturalizar las proteínas por lo que se reduce la actividad observada. En cambio los detergentes no iónicos, como el Tween 80, no desnaturalizan las proteínas sino que previenen la agregación, por lo que se usan como estabilizantes. De esta forma se explicaría el aumento de actividad observado en el ensayo con Tween 80 (Johnson, 2013).

Después del SDS, el aditivo que más disminuye la actividad relativa de la proteína Lp_2660 es el PMSF. Se trata de un inhibidor de proteasas que actúa modificando los residuos de serina. Este comportamiento de la proteína Lp_2660 sugiere que existe algún residuo de serina implicado en la reacción de hidrólisis. En esta línea, el hecho de que la actividad no se vea afectada por la presencia de DEPC, un agente que modifica

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21

covalentemente los residuos de histidina, indica que posiblemente este aminoácido no está presente en el centro activo. Este último resultado se aleja de lo esperado ya que las esterasas se caracterizan por presentar una triada catalítica formada por los residuos de serina, histidina y aspartato (Ser-His-Asp) (Adesioye et al., 2016).

Los tres agentes reductores ensayados disminuyeron la actividad relativa, lo que hace suponer que la reducción de los residuos de cisteína limita la capacidad de la proteína Lp_2660 para hidrolizar los enlaces acetilester. El hecho de que el quelante de iones EDTA no influya apenas en la actividad relativa parece indicar que no se trata de una metaloproteína.

Se ha encontrado que la actividad acetilesterasa de Lp_2660 es mayor a pHs ácidos, disminuyendo su actividad a pHs neutros e inactivándose a pH superior a 8. En general el pH óptimo de otras esterasas de L. plantarum se encuentra a pHs neutros o alcalinos, como es el caso de la esterasa activa a baja temperatura de L. plantarum, la Lp_2631, cuyo máximo de actividad se encuentra a pH 6-7 (Esteban-Torres et al., 2014c), la esterasa de tipo SGNH de L. plantarum LpSGNH1, que tiene su máximo de actividad a pH 7-8 (Kim et al., 2017) o la esterasa Lp_0973, con mayor actividad a pH 5,5-7 (Brod et al., 2010). Esta actividad a pH ácido tampoco es frecuente en acetilxilano esterasas CE1 de otros microorganismos, que también suelen tener su máximo de actividad en el intervalo de pH comprendido entre 6 y 8 (Egaña et al., 1996; Chung et al., 2002; Koseki et al., 2005; Ding et al., 2007; Pouvreau et al., 2011).

La temperatura óptima de la proteína Lp_2660 se encuentra entre los 22 y 37 oC, su actividad se mantiene por encima de un 80 % a 4 oC y se reduce notablemente a temperaturas superiores a los 37 oC. Esto la convierte en una acetilesterasa con actividad a menor temperatura de lo que es habitual en esterasas de L. plantarum, que tienen temperaturas óptimas en torno a los 40 oC (Brod et al., 2010; Kim et al., 2017). De la misma forma las acetilxilano esterasas aisladas de hongos también tienen temperaturas óptimas de actividad a 40 oC (Chung et al., 2002; Pouvreau et al., 2011), a 50 oC (Egaña

et al., 1996) o incluso a 60 oC (Egaña et al., 1996; Ding et al., 2007). Si se compara con

esterasas activas a baja temperatura de L. plantarum previamente caracterizadas es posible observar que la actividad cae por debajo del 30 % entre los 22 y 30 oC (Esteban-Torres et al., 2014a; Esteban-(Esteban-Torres et al., 2014c) mientras que en el caso de la proteína Lp_2660 la actividad máxima se mantiene hasta los 37 oC.

Respecto a su estabilidad térmica, la proteína Lp_2660 se mostró sensible a la incubación a temperaturas entre 22 oC y 37 oC, que reducen su actividad hasta valores entorno al 50-60 % en 1 hora, aunque es capaz de mantener este nivel de actividad hasta 4 horas. En cambio, temperaturas superiores a los 45 oC provocan la inactivación completa de la proteína en el mismo tiempo de 1 hora de incubación. La proteína Lp_2660 es más termolábil que las acetilxilano esterasas caracterizadas en otros microorganismos, como las de B. pumilus y A. awamori, estables a temperaturas de hasta 50 oC e inactivadas rápidamente a 60 oC (Degrassi et al., 2000; Koseki et al., 2005).

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Teniendo en consideración las características de la proteína Lp_2660 cabe destacar que, aunque su actividad específica y eficiencia catalítica es más baja, presenta unas condiciones óptimas de reacción distintas a las de la mayoría de acetilxilano esterasas previamente caracterizadas y comercializadas. Estas características podrían permitir su aplicación en procesos realizados a menor temperatura y pH.

Conclusiones

Los resultados obtenidos en este trabajo permiten concluir que: (i) se ha conseguido clonar el gen xynC de L. plantarum WCFS1 en el vector de expresión pURI3-Cter e hiperproducir de forma heteróloga y purificar la proteína Lp_2660; (ii) se ha comprobado que la proteína Lp_2660 es una acetilesterasa, con una actividad específica de 1,51 U/mg y una eficiencia catalítica de 98,63±33,51 mM -1 min-1; (iii) la máxima actividad relativa se encontró en el intervalo de temperatura de 22 a 37 oC y de pH 4 a 6, unas características que la diferencian de otras acetilxilano esterasas caracterizadas previamente; (iv) la proteína Lp_2660 es termolábil a temperaturas superiores a 45 oC mientras que la incubación a temperaturas de hasta 37 oC mantiene un 50 % de su actividad durante 4-6 horas.

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Lista de abreviaturas

Abs Absorbancia

ADN Ácido desoxirribonucleico CE Carboxilesterasa CPC Acetilcefalosporina C DCPC Deacetilcefalosporina C DEPC Dietilpirocarbonato dNTPs Desoxiribonucleótidos DTT Ditiotreitol

Ecat Eficiencia catalítica

EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EXE Acetilxilano esterasa

IMAC Cromatografía de afinidad a metales inmovilizados IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido

kcat Constante catalítica

kDa Kilodalton

KM Constante de Michaelis

kpb Kilobases

LB Medio de cultivo de Luria y Bertani LIC Clonación independiente de ligación MRS Medio de cultivo Man, Rogosa y Sharpe NCBI National Center for Biotechnology Information PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida

PCR Reacción en cadena de la polimerasa PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo

pNP p-Nitrofenilo

rpm Revoluciones Por Minuto SDS Dodecilsulfato sódico Vmax Velocidad máxima

V0 Velocidad inicial

ε Coeficiente de extinción molar 7-ACA Ácido 7-aminocefalosporanico

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