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DETECCIÓN DE ELEMENTOS GENÉTICOS QUE LE CONFIEREN RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS A CEPAS DE Aeromonas spp. Registro asignado por la SIP:

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DETECCIÓN DE ELEMENTOS GENÉTICOS QUE LE CONFIEREN RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS A CEPAS DE Aeromonas spp.

Registro asignado por la SIP: 20060709 Directora: Elizabeth Fernández Rendón

RESUMEN

Durante los últimos años ha aumentado la resistencia en diferentes especies bacterianas a los antimicrobianos, y el género Aeromonas no es caso excepcional, observándose un auge en su resistencia en diferentes partes del mundo y se ha reportado que en Aeromonas spp. algunos genes de resistencia están codificados en elementos genéticos como plásmidos, transposones e integrones.

Con la finalidad de detectar y caracterizar los elementos genéticos encontrados en cepas de Aeromonas spp. provenientes de aislamientos clínicos, relacionados o no epidemiológicamente, se estudiaron 41 cepas de Aeromonas spp. aisladas de heces diarreicas en el Estado de Hidalgo las cuales fueron identificadas genéticamente por los patrones RFLPs del gen 16S/rDNA. Entre las 41 cepas aisladas se identificaron las especies A. caviae, A. hydrophila, A. veronii y A. media, siendo la más frecuente A. caviae.

Se determinó la resistencia antimicrobiana (28 antibióticos) por el método Bauer – Kirby y se observó que todas cepas fueron resistentes a ampicilina, amikacina, vancomicina, bacitracina, oxacilina, sulfadiacina y penicilina, mientras que a cefotaxime, norfloxacina, aztreonam, gentamicina y neomicina todas las cepas fueron sensibles.

Se obtuvo el DNA plasmídico utilizando la técnica Birmboin & Doly. De 41 cepas sólo en 13 de ellas se encontraron plásmidos, lo que representa el 32%. Se observaron perfiles plasmídicos diferentes.

Se llevo a cabo la amplificación de uno de los genes que codifican para resistencia a tetraciclina (tet A), de las 16 cepas resistentes a tetraciclina solo 5 cepas presentan en gen tet A.

Se ha demostrado que todas las cepas de Aeromonas ensayadas fueron resistentes a ampicilina, esta característica es específica del género, a excepción de A. trota. Los porcentajes de cepas resistentes a cloranfenicol, tetraciclina, trimetoprim sulfametoxazol, ácido nalidixico, estreptomicina, entre otros variaron entre el 5 y el 50%. Este porcentaje se ha relacionado con el uso indiscriminado de estos agentes antimicrobianos en los países en vías de desarrollo, ya que se ha presentando un incremento en el número de cepas resistentes, siendo éstos los antibióticos de selección para el tratamiento de infecciones causadas por Aeromonas. Dichas resistencias se relacionan con la presencia de elementos genéticos como plásmidos. En Aeromonas spp. de origen ambientales han descrito genes tet A, D, E y tet 31, en este trabajo solo se ha detectado el gen tet A.

Se detectaron elementos genéticos tales como plásmidos pero se realiza la búsqueda de transposones e integrones, con la finalidad de conocer su relación con las resistencias antimicrobianas encontradas.

La importancia de determinar la presencia de plásmidos, transposones e integrones radica en saber si estos elementos genéticos influyen sobre la resistencia de las cepas que los poseen. En otros trabajos se ha reportado la presencia de plásmidos e integrones en A. salmonicida, pero pocos trabajos reportan la incidencia de estos

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INTRODUCCIÓN

El género Aeromonas consiste de bacilos Gram negativos que miden de 0.3 por 1.0 a 3.5 µm, agrupados en pares o en cadenas cortas. Son móviles por un flagelo polar a excepción de A. salmonicida y A. media las cuales son inmóviles. Metabólicamente son anaerobios facultativos, oxidasa y catalasa positivos, reducen nitratos a nitritos y fermentan la D-glucosa. Son mesofílicos aerobios y sólo A. salmonicida es psicrofílica. Son resistentes al agente vibriostático O/129 (2,4 diamino – 6,7 diisopropilpteridina) a concentraciones de 10 y 150 µg, no crecen en medios de cultivo con más del 6 – 6.5% de NaCl. Son ß-galactosidasa, desoxioribonucleasa, gelatinasa y amilasa positivas. Se desarrollan en intervalos de temperatura y pH entre 4 y 41ºC y 5.5 a 9.1 respectivamente (Popoff 1984).

En la segunda edición del Manual de Bacteriología médica Bergey, volumen 1, que propone que el género Aeromonas quede clasificado de la siguiente manera (Garry y col., 2002):

Phylum: Proteobacteria Clase: Gammaproteobacteria Orden XI: Aeromonadales Familia: Aeromonadaceae Género 1: Aeromonas Género 2: Tolumonas

El género incluye en la actualidad 17 especies mismas que se describen brevemente en el cuadro 1.

Estos microorganismos, considerados autóctonos del medio acuático, están ampliamente diseminados en hábitats naturales como el suelo, el agua potable, agua contaminada, aguas negras, piscinas, ríos, lagos y mar. Un hecho de trascendencia es que se han aislado en aguas potables cloradas o no cloradas e incluso de aguas embotelladas (Borrel y col., 1998; Sisti y col., 1998; Massa y col., 2001; Croci y col., 2001; Biscardi y col., 2002; Villari y col., 2003).

Estos microorganismos se han aislado en una gran variedad de alimentos: productos cárnicos (pollo, res y puerco), pescado, mariscos, alimentos preparados, productos de pastelería, verduras, leche y derivados lácteos (Correa y col., 1993; Krovacek y col., 1995; Palumbo y col., 1989). También suelen ser aisladas de anfibios, los peces y los reptiles.

Aeromonas se asocia con infecciones gastrointestinales y extraintestinales, que se dividen en tres síndromes clínicos principalmente: I) gastroenteritis (la cual se manifiesta con diferentes tipos de diarreas), II) infecciones en heridas y III) enfermedades sistémicas. Las infecciones gastrointestinales son las de mayor frecuencia y afectan principalmente a los niños menores de 5 años (Janda y Abbott 1998; Altweeg 1989; Gómez-Campedra y col., 1995).

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Cuadro 1. Características de las cepas de referencia de las 17 especies que actualmente constituyen el género Aeromonas.

Especie Cepa tipo Equivalentes en otras colecciones Origen de aislamiento Aislamiento de cuadros clínicos.

A. hydrophilaA ATCC 7966 T CECT839T; NCIMB 9240T Leche +++

A. bestiarum ATCC 51108 T CECT4227T;NCIBM1134T Pez enfermo +

A. salmonicidaB NCIMB 1102 T CECT894T;ATCC33658T Salmón +

A. caviaeC ATTCC 15468 T CECT838T Cobayo +++

A. media ATCC 33907 T CECT4232T;NCIMB2237T Agua de

piscifactoría

A. eucrenophila NCIMB 74 T CECT4224T;ATCC23309T Pez de agua

dulce

A. sobria NCIMB 12065 T ATCC43979T;CECT4245T Pez

A. veroniiD ATCC 35624 T CECT4257T ;NCIBM13015T Esputo +++

A. jandaei ATCC49568 T CECT4228T;LMG12221T Heces humanas +

A. schubertii ATCC 43700 T CECT4241T;NCIBM13161T Absceso cutáneo ++

A. trotaE ATCC 49657 T CECT4255T ;LMG12223T Heces humanas ++

A.

allosaccharophila CECT 4199

T ATCC51208T;LMG14059T Anguila

A. encheleia CECT 4342 T ATCC51929T;LMG16330T Anguila

A. popoffii LMG 17541T CECT4995

T; ATCC

BAA-243T; NCIBM13618T Agua potable ++

A. culicicola MCT 3249T CECT5761T;NCIBM5147T Mosquito

A. molluscorum CECT5874T LMG 22214 Molusco bivalvo

A simiae. IBS S6874T CIP 107798T, CCUG 47378T Heces de mono

A especie tipo del género Aeromonas para la que se han descrito 3 subespecies: A. hydrophila subsp. hydrophila; A. hydrophila subsp.

dhakensis y A. hydrophila subsp. ranae; B incluye cinco subespecies: A. salmonicida subsp. salmonicida, A. salmonicida subsp. achromogenes, A. salmonicida subsp. smithia y A. salmonicida subsp. mausocida, A. salmonicida subsp. pectinolytica; C comparte la misma cepa tipo que A. punctata , nombre propuesto para la especie con anterioridad, está todavía por resolver cual de ambos es el nombre correcto; D incluye dos biotipos: A. veronii bt. sobria y A. veronii bt. veronii; A. ichtiosmia es un sinónimo de esta especie; E A. enteropelogenes es un sinónimo de ésta especie. +++, Mayor frecuencia de aislamiento a partir de cuadros clínicos, + menor frecuencia

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Las especies de Aeromonas que se han reportado con mayor frecuencia de aislamientos en cuadros clínicos son: A. hydrophila, A. caviae, y A. veronii bt. sobria. Aunque en total 9 especies son las que se han reportado en algún cuadro clínico (Cuadro 2) (Kelly y col., 1992; Janda y Abbott 1998; Janda 2001).

Cuadro 2. Especies de Aeromonas reportadas en algún cuadro clínico.

Patógenos principales Patógenos eventuales

A. hydrophila A. jandaei A. caviae A. schubertii A. veronii A. trota A. salmonicida A. bestiarum A. popoffii

En los últimos años se han realizado estudios para tratar de conocer el mecanismo de patogenicidad del género Aeromonas. Los factores asociados a la virulencia descritos hasta la fecha se han caracterizado en estudios “in vivo” e “in vitro” y comprenden productos extracelulares y estructuras:

Productos extracelulares:

ü Hemolisinas (Janda 1991) ü Proteasas (Loewy y col., 1993) ü Lipasas (Anguita y col., 1993)

ü Desoxirribonucleasas (Chang y col., 1992) ü Sideróforos (Barghouthi y col., 1989) ü Quitinasas (O’ Brien y col., 1987) ü Amilasas (Gobius y col., 1988)

ü Enterotoxinas citotónicas (Chopra y col., 1992) Estructuras:

ü Capa S (Dooley y col., 1988)

ü Pili (Ho y col., 1992, Kirov y col., 1996, Pepe y col., 1996) ü Cápsula (Martínez y col., 1995)

ü Lipolisacárido (Dooley y col., 1985)

ü Proteínas de membrana externa (Jeanteur y col., 1992)

Los antibióticos y otros agentes antimicrobianos son usados extensivamente en diversas actividades, entre los cuales encontramos su uso terapéutico y profiláctico en medicina humana y veterinaria.

El uso de antibióticos es generalmente indiscriminado lo cual representa una serie de repercusiones tales como, el aumento de infecciones por bacterias resistentes a los antibióticos en las poblaciones humanas y animales,

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alteraciones importantes de las relaciones ecológicas y la contaminación del medio ambiente con antibióticos (Cabello Cárdenas 2003).

Las bacterias pueden presentar resistencia intrínseca, aquellas que son parte constitutiva de la bacteria y las resistencias adquiridas por presencia de mutaciones en el DNA o por la adquisición de genes debido a la transferencia de información genética (plásmidos, transposones, integrones) (Martinez-Freijo 1998).

La resistencia a antibióticos en bacterias ha estado fijada en una serie de elementos, que al final han encajado unos dentro de otros. En los años 70 el objeto de estudio eran los plásmidos. A finales de esa década y durante toda la siguiente el nuevo sujeto de estudio, han sido los transposones y en estos momentos se centra en una nueva clase de elementos genéticos, los integrones (García Lobo 1999).

Actualmente se conoce como plásmidos a un grupo de elementos extracromosomales, presentes en la mayoría de las bacterias y en otros organismos. Son moléculas de ácido nucleico, generalmente de DNA bicatenario y circulares, que se replican independientemente del organismo que los hospeda, que pueden o no integrarse al cromosoma de su hospedero, portan genes que a veces le confieren a estos últimos ventajas selectivas bajo ciertas condiciones ambientales y son heredados establemente, sin selección específica, en estado extracromosomal (Carlos Hidalgo 2005).

Los transposones son cadenas cortas de DNA que saltan de un cromosoma a un plásmido, en uno u otro sentido, entre plásmidos o entre plásmidos y bacteriófagos. La característica más importantes de este tipo de material es la de integrarse con facilidad a cadenas de DNA. Los transposones pueden ser simples o compuestos. Los transposones simples solo constan de secuencias de inserción y la maquinaria para la recombinasa sitio específica. Los transposones compuestos constan de una región central flanqueada por secuencias de inserción, y el gen que codifica para una recombinasa, generalmente en la región central se encuentran genes de resistencia a antibióticos. No son autoreplicables, por lo tanto deben mantenerse dentro de una estructura autoreplicante para poder replicarse (Gary Roberts 2003, Benjamín Lewis 2000). Los integrones se pueden definir como elementos genéticos dinámicos, en el que por un mecanismo de recombinación sitio especifica se acumula una combinación de genes estructurales organizados como un operon. Los genes presentes en los integrones son mayoritaria, pero no exclusivamente, genes de resistencia a antibióticos. Estructuralmente se suele hablar de tres regiones en un integrón: una región constante 5´ que contiene el gen de la integrasa. A continuación encontramos una región variable en la que se localizan los genes estructurales del integrón. A continuación de la región central encontramos otra región constante 3´ en la que se encuentra un gen de resistencia a sulfamidas y un gen de resistencia a compuestos cuaternarios de amonio y dos marcos de

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lectura abierta (Martínez-Freijo 1998, García Lobo 1999, Bennett 1999, Rosser and Young 1999, Schmidt y col. 2001).

Durante los últimos años ha aumentado la resistencia a los antimicrobianos en diferentes especies bacterianas, y el género Aeromonas no es caso excepcional, observándose un auge en su resistencia en diferentes partes del mundo y se ha reportado que en Aeromonas spp. algunos genes de resistencia están codificados en elementos genéticos (Cuadro 3).

Dentro de los antibióticos relacionados con elementos genéticos en Aeromonas spp. se encuentra el cloranfenicol, trimetropin/sulfametoxasol, tetraciclina, estreptomicina, ácido nalidíxico y sulfamidas. Sin embargo la resistencia a los diferentes antibióticos está claramente influenciada por factores geográficos y socioeconómicos (Schmidt y col., 2001a, Goñi-Urriza y col., 2000, Casas t col., 2005, Sørum y col., 2003, L´Abbed y col. 2000).

En el tratamiento para infecciones causadas por Aeromonas tanto en el hombre como en animales se han empleado una gran variedad de agentes antimicrobianos, el resultado de ésto es el incremento en la frecuencia de bacterias resistentes a diversos antimicrobianos, lo que ha originado cepas de origen ambiental resistentes a antibióticos utilizados en el hombre y viceversa. En Aeromonas algunos genes de resistencia pueden estar localizados en elementos genéticos tales como plásmidos, transposones o integrones por ello la evolución y diseminación tanto de las bacterias como de los elementos genéticos relacionados con la transferencia de resistencia es un aspecto importante a estudiar, especialmente porque no se tiene este tipo de información en cepas asociadas a cuadros diarreicos en humanos.

Es conveniente detectar y caracterizar los elementos genéticos encontrados en cepas de Aeromonas spp. provenientes de pacientes con diarrea, relacionados o no epidemiologicamente. Lo que se explicaría nuestra hipótesis si encontramos que las especies del género Aeromonas spp. aisladas de origen clínico poseen elementos genéticos que codifican para resistencias a diversos antibióticos, se entendería la constante aparición de cepas resistentes a una amplia variedad de antibióticos. Además la transferencia de dichos elementos entre una misma especie y entre especies diferente facilitaría la diseminación de estos elementos y por consiguiente las resistencias asociadas, por lo que al encontrar dichos elementos en nuestras cepas podríamos analizar su distribución epidemiológica.

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Cuadro 3. Antecedentes bibliográficos sobre la presencia de elementos genéticos que confieren resistencia a antimicrobianos en el género Aeromonas spp.

Publicación de: Cepas reportadas Origen de Aislamiento Conclusión del estudio:

Casas y col., 2005 A. salmonicida Peces Plásmidos; se detectaron secuencias IS600, el gen sul1, el gen dfr A16, el Tn1721 completo, genes tet A y tet B

Barlow y col., 2004 A, caviae,

A. veronii bt. sobria Heces de bovinos Integrón tipo 1 relacionados con la resistencia a estreptomicina y trimetropin.

Sørum y col., 2003 A. salmonicida Salmón con furunculosis Plásmido pRAS1 confiere resistencia a tetraciclina, trimetropin y sulfonamidas, contiene un Integrón clase 1 y el Tn1721.

Schmidt S. y col. 2001a A. hydrophila A. veronii bt. sobria

A. bestiarum

Agua, peces, sedimento Integrones asociados a resistencia a antibióticos Cepas resistentes a tetraciclina.

Schmidt S. y col. 2001 A. salmonicida Peces Integrones tipo 1 asociados con plásmidos R. L´abbe-Lund and

Henning Sørum, 2000

A. salmonicida Peces Tn5393c el cual contiene a los genes straA-strB que

codifican para la resistencia a estreptomicina; identificado en una parte del plásmido pRAS2.

Rhodes y col., 2000 A. hydrophila A. veronii bt. sobria

A. caviae A. salmonicida

Agua de efluente

hospitalario y peces Plásmidos que confieren resistencia a oxitetraciclina. Contienen el transposon Tn1721 Adams y col. 1998 A. salmonicida Salmón con furunculosis Plásmidos que confieren resistencia a tetraciclina

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MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL BIOLÓGICO

Se analizaron 46 cepas de Aeromonas spp. de origen clínico aisladas de pacientes que presentaban cuadros diarreicos en el estado de Hidalgo.

IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA

Antes de llevar acabo la identificación genética se confirmó su pertenencia al género Aeromonas con base en las siguientes pruebas (Cuadro 3):

Cuadro 3. Pruebas bioquímicas para la identificación hasta género.

Géneros Pruebas bioquímicas

Vibrio Aeromonas Pleisiomonas Pseudomonas Enterobacterias

Gram - - - - - Oxidasa + + + + - Crecimiento en NaCl 3% 6% - + + - + + NA NA - -

Ácido del inositol - - + NA V

O/F de la glucosa + + + - +

+= La mayoría de las cepas son positivas; -= La mayoría de las cepas son negativas, NA = no aplicable, V = variable. Altwegg 1999.

IDENTIFICACIÓN GENÉTICA

La identificación genética se realizó con base al análisis de los patrones RFLPs del gen rDNA 16S propuesto por Borrel y col., 1997 y Figueras y col., 2000 (Fig1).

EXTRACCIÓN DE DNA TOTAL.

1. Se obtuvo un cultivo líquido de 18 a 24 horas de la bacteria deseada. 2. En un tubo para microcentrífuga, se colocó 1.5 ml de cultivo, se

centrifugó 1 minuto, se descartó el sobrenadante.

3. Se adicionaron 500 µl de TE (50/20), se resuspendieron las bacterias, se centrifugó 1 minuto, se descartó el sobrenadante.

4. Se adicionaron 175 µl de TE (50/20), se resuspendieron las bacterias. 5. Se agregaron 5 µl de proteinasa K (20mg/ml) y 20 µl de SDS al 10%, se

agitaron cuidadosamente para mezclar e incubar a 56º C por 1 ó 2 horas. 6. Se adicionaron 500 µl de TE (10/1) y 20 µl de NaCl 5M, se agitó

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7. Se realizaron dos extracciones con fenol, agregando 500 µl de fenol al tubo, agitando con cuidado (15 min, de preferencia en un dispositivo rotatorio) para mezclar lo mejor posible y centrifugar por 10 minutos. 8. Se realizó una extracción con 500 µl de cloroformo : alcohol isoamílico

(24:1), agitando cuidadosamente y centrifugando 2 min.

9. Se realizaron cuatro extracciones con éter saturado con agua para eliminar todo rastro de fenol, incubar a 65º C de 5 – 10 min para evaporar el éter.

10. Se agregó un volumen de 500 µl de isopropanol, agitar con mucho cuidado por inversión y centrifugar por 30 seg. Descartar el sobrenadante.

11. El DNA se enjuagó con 1ml de etanol al 70%, centrifugar 30 seg. Descartar el sobrenadante para secarlo a 65º y disolverlo en 200 o 400 µl de agua destilada, desionizada estéril.

• AMPLIFICACIÓN MEDIANTE PCR DEL GEN 16S rDNA.

Para la amplificación mediante PCR del gen 16S rDNA, se sometieron a la amplificación aproximadamente 200-300 ng del DNA genómico, en un volumen final de 50 µl. La mezcla de reacción contiene : Tris-HCl 20 mM (pH8.4), KCl 50 mM, MgCl2 1.5 mM,, desoxirribonucleósidos trifosfato dNTP´s (dATP, dCTP,

dGTP y dTTP ) 0.3 mM de cada uno, iniciadores Anti 1 y S 0.3µM de cada uno y 2.5 U de Taq polimerasa. Las condiciones para cada ciclo de reacción fueron: 96°C durante 5 min. (desnaturalización), 94°C durante 1 min. (desnaturalización), 56°C durante 1 min. (hibridación), 72°C durante 1.30 min. (extensión), estas condiciones se repitierán por 35 ciclos y al finalizar se efectuó una última extensión a 72°C durante 5 min.

Las secuencias de los iniciadores empleados para este propósito se muestran en el cuadro 4.

Cuadro 4. Iniciadores empleados para la amplificación del gen 16S rDNA. • RESTRICCIÓN DEL AMPLICÓN DEL GEN 16S rDNA.

Previamente a la digestión se procedió a la purificación del amplificado empleando el sistema NUCLEO TRAP (CLONTECH).

El producto resultante de la limpieza se sometió a la digestión enzimática doble (AluI y MboI), se preparó una mezcla la cual contiene 12 µl del fragmento amplificado, 1 µl del regulador de digestión (10x), 5U Alu I y 5U de la enzima Mbo I (Gibco BRL), adicionando agua para un volumen final de 20 µl, la mezcla

Región

Amplificada Secuencia 5´-3´ Tamaño del amplicón

rDNA 16S FW: 5´AGA GTT TGA TCA TGG CTC A 3

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se incubo a 37°C durante toda la noche. Los fragmentos polimórficos, se separaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 20% a 150 V durante 8 h. Al término del tiempo se tiñeron los geles durante 30 min con bromuro de etidio (0.5 µg/ml) y se visualizaron en un documentador de geles con luz ultravioleta.

Las fotografías de los PCR-RFLP obtenidas de las digestiones dobles con las enzimas Alu I y Mbo I fueron comparadas con los patrones para las cepas tipo de cada una de las especies, para asignar a cada cepa la especie correspondiente (Fig 4).

Fig. 4 Protocolo para la identificación de las especies de Aeromonas por RFLPs del gen 16S rDNA (Figueras

y col., 2000).

Patrón especie -específico para: Patrón común para:

Patrón común para: Patrón común para:

Patrón especie-específico para: Patrón común para:

Patrón especie-específico para: Patrón especie-específico para: Patrón especie-específico para: Patrón especie-específico para:

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DETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS

Se determinó el grado de resistencia de las cepas de Aeromonas spp. a diversos agentes antimicrobianos, por el método de difusión en agar siguiendo las indicaciones del CLSI ( antes NCCLS).

1. Al menos 3 a 5 colonias bien aisladas se seleccionaron de un agar cultivo. El crecimiento se transfirió a un tubo con 4 a 5 ml de CALDO Mueller-Hinton. El caldo de cultivo se incubo a 35ºC hasta que alcanzó la turbidez del estándar de 0.5 McFarland (usualmente 2 a 6 horas). Esto resulta en una suspensión que contiene aproximadamente 1 a 2 x 108 UCF/mL.

2. Se sembraron placas de agar mueller-Hinton usando un hisopo a partir de la suspensión ajustada en varias direcciones.

3. Se dejaron reposar las placas cinco minutos a temperatura ambiente para que se seque el inóculo.

4. Los sensidiscos se dispensaron sobre la superficie del agar. Cada disco debe ser presionado para asegurar contacto pleno con la superficie del agar. Ya sea que el disco se ponga individualmente o con un dispensador, deben ser distribuidos en forma constante y no debe quedar a menos de 24 mm de distancia entre centros. No más de 12 discos se deben poner por placa de 150 mm o no más de 5 en placas de 100 mm. Debido a que algunas drogas difunden casi instantáneamente, un disco no debe ser relocalizado una vez que haya tomado contacto con la superficie del agar.

5. Las placas se incubaron a 37ºC durante 24 horas.

6. Se midieron los halos de inhibición en milímetros por el fondo de la placa y se interpretaron los diámetros de las zonas de inhibición de las cepas y determinar las categorías de susceptibles, intermedio y resistente.

EXTRACCIÓN DE DNA PLASMÍDICO.

TÉCNICA DE BIRNBOIM Y DOLY (MODIFICADA)

La técnica consiste en una lisis alcalina y se basa en el intervalo de pH estrecho que existe de 12.0 a 12.5, dentro del cual hay desnaturalización del DNA cromosomal que no se encuentra superenrollado generándose, una masa de DNA lineal la cual se puede separar por centrifugación. El procedimiento se desarrolló como sigue:

1. De un cultivo puro de 24 horas de crecimiento se seleccionaron de 4 ó 5 colonias, se siembraron en 3 ml de caldo tripticaseína extracto de levadura a doble concentración (2 XTY) y se incubaron a 37°C en agitación durante 18 horas.

2. Se pasaron 1.5 ml del cultivo a tubos de 2 ml y se centrifugó a 12 000 rpm durante 5 minutos, posteriormente se eliminó el sobrenadante.

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3. Se resuspendió el paquete celular con 100 µl de solución TEG (trizma - HCl 25 mM pH 8, EDTA 10 mM, glucosa 50 mM).

4. Se mezcló y se dejó 5 minutos a temperatura ambiente.

5. Se adicionó un volumen de 200 µl de la solución de lisis (NaOH 0.2N - SDS 1%) y se colocaron inmediatamente en hielo durante 5 minutos. 6. Se precipitó el DNA cromosomal y las proteínas con 150 µl de acetato de

potasio 3 M, pH 4.8 y se colocaron en hielo durante 5 minutos. 7. El tubo se centrifugó a 12 000 rpm durante 5 minutos.

8. Se tomaron 400 µl del sobrenadante y se transfirieron cuidadosamente a un tubo limpio.

9. Se adicionaron 200 µl de cloroformo-fenol saturado con Tris pH 7.8. 10. Se centrifugó a 12 000 rpm durante 5 minutos.

11. Se precipitó el DNA de la fase acuosa con un volumen igual de isopropanol y se mezcló en un vortex.

12. Se centrifugó a 12 000 rpm por 5 minutos.

13. Se decantó e invitió el tubo sobre un papel secante y se dej secar a temperatura ambiente.

14. El botón se resuspendió en 50 µl de solución reguladora TE (Trisma-HCL 50 mM - EDTA 10 mM, pH 8) (Sambrook 1989).

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 0.8%.

1. Se colocaron en un matraz, 25 ml de la solución reguladora de TAE y 0.2 g de agarosa y se calienta hasta su disolución.

2. Se vació el gel en una placa cuando estuvo aproximadamente a 45°C, se colocó el peine para hacer los pozos, hasta que se gelificó.

3. Se preparó una mezcla 15 µl de la muestra con 5 µl de regulador de carga. Se colocó en cada pozo 15 µl de cada una de las muestras.

4. Se sometió a una corriente de 60 V por 2 horas.

5. Se tiñó durante 20 minutos con bromuro de etidio en una concentración de 0.5 µg/ml y se observó en un documentador de imágenes (Sambrook 1989).

DETECCIÓN DE DETERMINANTES tet (para las cepas que presenten resistencia a tetraciclina).

Los genes que codifican la resistencia a tetraciclina (tet A-E) serán detectados por medio de PCR utilizando condiciones e iniciadores establecidos por Schmidt y col., 2001, Guardabasi y col. 2000 (cuadro 7, 8).

Para la reacción de PCR se someterán a la amplificación 5µl (200-300 ng) del DNA, 25µl de Master Mix, 5µl (10 pmol/µl) de cada iniciador, 4µl en un volumen final de 50µl.

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Cuadro 7. Iniciadores para PCR utilizados para la detección de determinantes tet clases A, B, C, D, E, G.

Clase Iniciadores

(5´? 3´) No de Acceso (GenBank) Amplicón (pb)

A FW: GTA ATT CTG AGC ACT GCT GC

RV: CTG CCT GGA CAA CAT TGC TT X0006 937 B FW: CTC AGT ATT CCA AGC CTT TG

RV: CTA AGC ACT TGT CTC CTG TT J01830 416 C FW: TCT ACC AAT GCG CTC ATC GT

RV: GGT TGA AGG CTC TCA AGG GC J01749 588 D FW: ATT ACA CTG CTG GAC GCG AT

RV: CTG ATC AGC AGA CAG ATT GC X65876 1123 E FW: GTG ATG ATG GCA CTG CTG AT

RV: CTC TGC TGT ACA TCG CTC TT L06940 1199

Cuadro 8. Condiciones PCR (tet)

tet A y E

Etapa Temperatura

(oC)

Tiempo Ciclos Desnaturalización inicial 95 5 min

Desnaturalización 95 30 seg

Alineamiento 62 30 seg

Extensión 72 45 seg

Extensión final 72 7 min

22

tet B y D

Etapa Temperatura (oC) Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial 95 5 min

Desnaturalización 95 30 seg

Alineamiento 57 30 seg

Extensión 72 20 seg

Extensión final 72 7 min

25

tet C

Etapa Temperatura (oC) Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial 95 5 min

Desnaturalización 95 30 seg

Alineamiento 62 30 seg

Extensión 72 20 seg

Extensión final 72 7 min

30

Para la reacción de PCR se someterán a la amplificación 5µl (200-300 ng) del DNA, 25µl de Master Mix, 5µl (10 pMol/µl) de cada iniciador, 4µl en un volumen final de 50µl.

Los productos de PCR obtenidos serán analizados por electroforesis en geles de agarosa teñidos posteriormente con bromuro de etidio.

(14)

RESULTADOS

I. Identificación de las cepas de Aeromonas spp. Identificación fenotípica

En este trabajo se emplearon 6 pruebas bioquímicas para la confirmación de género (Fig. 6).

De un total de 45 cepas presuntivamente del género Aermonas solo en 41 cepas se confirmo el género después de realizar las pruebas presuntivas basadas en el criterio de Abbott.

Las 41 cepas identificadas como Aeromonas spp. se conservaron a corto y largo plazo, para los pruebas posteriores.

Identificación genotípica

• Obtención de DNA genómico:

Se obtuvo el DNA total de las 41 cepas problema y de las cepas de referencia empleando la técnica antes descrita. El DNA mostró integridad y la concentración necesaria para emplearlo en la técnica de PCR (Fig. 7).

A B

Fig. 6 A) Pruebas bioquímicas: O/F, inositol, crecimiento en NaCl al 3 y 6 %. B) Prueba de oxidasa.

Fig. 7 Electroferograma del DNA genómico de cepas de Aeromonas spp. DNA genómico

(15)

1114 900 692 501 404 320 242 110

• Amplificación del gen 16S/rDNA:

Se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen 16S/rDNA en cada una de las cepas problema y la cepa de referencia, donde el producto del amplificado corresponde a un tamaño de 1502 pb (Fig. 8)

Restricción del gen 16S/rDNA (RFLP):

Para la identificación de especie de cada una de las cepas problema el gen 16S/rDNA ya amplificado se sometió a una digestión enzimática doble (AluI y MboI) y los fragmentos polimórficos, se separaron en geles de poliacrilamida, obteniendo los patrones correspondientes para cada cepa. Todas las cepas presentaron patrones característicos con la primera restricción (fig. 9-10) por lo que ya no fue necesario aplicar mas restricciones como lo indica el protocoló propuesto por propuesto por Borrel y col., 1997 y Figueras y col., 2000.

Los resultados muestran de cada patrón de RFLP de las especies aisladas entre las 41 cepas estudiadas fueron A. caviae, A. veronii, A. hydrophila y A. media (cuadro 8).

Cuadro 8. Resultados de la identificación genética de las 41 cepas problema.

A. caviae A. hydrophila A. veronii A. media

# de cepas n= 27 n= 10 n= 3 n= 1

1502 pb

Fig. 8 Electroferograma del gen 16S/rDNA (1502 pb) de cepas de Aeromonas sp. de origen clínico. Carril 1 marcador de peso molecular (MP) VII Roche, Carril 12 MP II Roche, Carril 3 A. hydrophila 839 testigo positivo. Carriles 3-11 cepas de

Aeromonas spp. 4361 2322 2027 564 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12

(16)

Fig.9 Electroferograma en gel de poliacrilamida del producto de RFLP del gen 16S/rDNA amplificado por PCR. Carril 1 marcador de peso molecular 100 pb Invitrogen; carriles 2 a 5 y 7-8 perfil correspondiente a

Aeromonas caviae; carril 6 perfil correspondiente a A. hydrophila.

A. caviae

Fig. 10 Electroferograma en gel de poliacrilamida del producto de RFLP del gen 16S/rDNA amplificado por PCR. Carril 1 marcador de peso molecular 100 pb Invitrogen; carriles 2 a 4 A. hydrophila; Carril 5 A.

caviae; A. veronii. 600 1 2 3 4 5 6 100 1500 2072 500

1 2 3 4 5 6 7 8 9

100 200 600

(17)

II. Determinación de la resistencia a antimicrobianos

Se determinó el grado de resistencia de las cepas de Aeromonas spp. a 28 agentes antimicrobianos, por el método de difusión en agar siguiendo las indicaciones del CLSI (antes NCCLS) empleando cepas de referencia: Aeromonas hydrophila 839 ATCC (Fig. 11)

Se observó que todas las cepas fueron resistentes a ampicilina, vancomicina, bacitracina, oxacilina, sulfadiacina, penicilina, carbenicilina y clindamicina. Mientras que a cefotaxime, norfloxacina, aztreonam, gentamicina, amikacina y neomicina todas las cepas fueron sensibles. El resto de los resultados de las cepas resistencias donde se observa variación entre el número de cepas resistente se muestran en la cuadro 9.

Antibiótico % de resistencia (n= 41) Imipenem 2% Kanamicina 2% Ciprofloxacina 3% Azitromocina 5% Cloranfenicol 5% Polimixina B 7% Eritromicina 12% Piperacilina 12% Estreptomicina 17% Tetraciclina 39% Ac. Nalidixico 41% Trimetoprim 53% Rifampicina 88%

Cuadro 9. Porcentaje de resistencias de las cepas de Aeromonas sp. aisladas de cuadros diarreicos.

(18)

II.1. Determinación de la resistencia HgCl

2

7 cepas de Aeromonas sp. presentaron un crecimiento abundante en el medio adicionado de HgCl (50 µg/ml), mientras que 15 cepas presentan un crecimiento menor. Las cepas restantes no presentaron crecimiento.

III. Obtención de los perfiles plasmídicos.

La presencia de plásmidos en las cepas de Aeromonas se demostró empleando el método de Birnboim y Doly que se basa en una lisis alcalina.

Para la extracción de DNA plasmídico se emplearon como testigos positivos las siguientes cepas A. salmonicida 718, Escherichia coli V517 y E. coli C600.

De las 41 cepas sometidas al proceso de extracción de DNA plasmídico, solo se detectaron plásmidos en 13 cepas lo que representa el 32%. Se observaron perfiles plasmídicos diferentes. Las bandas obtenidas en los perfiles plasmídicos son de pesos moleculares en un intervalo de 3 a 53 Kb (Fig. 12)

A. caviae es la especie donde la frecuencia de plásmidos fue mayor que en las otras especies reportadas.

Fig. 12 Electroferograma de DNA plasmídico de las cepas problema. Carril1 marcador de peso molecular Tracker supercoiled DNA. Carril 2 E. coli V517; Carril 3 A. salmonicida 718; carril 4 E. coli C600 ; Carriles 5 – 15 cepas problema de Aeromonas sp.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 165 120 95 55 38 28 8

(19)

V. Detección de elementos genéticos: TRANSPOSON Tn1721

El criterio de selección para la detección de este transposón fueron aquellas cepas resistentes a tetraciclina (n=16).

Se llevo acabo la amplificación de uno de los genes que codifican para resistencia a tetraciclina tet A de las 16 cepas resistentes a tetraciclina solo 5 cepas presentan en gen tet A (Fig. 17).

Posteriormente se llevara acabo la detección de otros genes tet.

En la cuadro 10 se muestran el número de genes y elementos genéticos relacionados con resistencias Aeromonas spp.

Cuadro. Resultados de los elementos identificados en las cepas de Aeromonas spp.

A. caviae A. hydrophila A. veronii A. media

# de cepas n= 27 n= 10 n= 3 n= 1

Plásmidos 9 3 - 1

Gen de estreptomicina - - - -

Gen de tetraciclina 3 2 - -

Fig 17. Electroferograma del producto de amplificación del gen tet A. Carri1 1 Marcador de peso molecular Roche IX. Carril 2 A. hydrophila 839 testigo negativo Carril 3. A. salmonicida 718 testigo positivo. Carriles 4-8 cepas problema de Aeromonas spp

1 2 3 4 5 6 7 8 1323 1078 872 603 310 937 pb

(20)

IMPACTO

Las cepas de origen clínico muestran resistencia a diversos antibióticos, relacionados con elementos genéticos. Hasta el momento como elementos genéticos en el 32% (13/41) de las cepas estudiadas se han encontrado plásmidos entre 3 a 53 Kb. Aunque falta detectar otros elementos que pudieran participar de igual manera en la adquisición de resistencia como los integrones y transposones.

La importancia de determinar la presencia de plásmidos, transposones e integrones en cepas de Aeromonas spp. aisladas de cuadros diarreicos radica en saber si estos elementos genéticos influyen sobre la resistencia de las cepas que los poseen. En otros trabajos se ha reportado la presencia de plásmidos e integrones en A.

salmonicida, pero pocos trabajos reportan la incidencia de estos elementos en cepas aisladas de cuadros clínicos lo que aportaría el conocimiento sobre la transmisión de esta resistencia importante en los procesos infecciosos que se presentan en la población y que tiene impacto directo en la Salud Pública

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