BBL Haemophilus Test Medium Agar
L007380 • Rev. 06 • Febrero 2007
PROCEDIMIENTOS DE CONTROL DE CALIDAD
I INTRODUCCIÓN
Haemophilus Test Medium Agar (agar de medio de prueba para Haemophilus) está diseñado para su uso en el procedimiento de prueba de sensibilidad por medio del método de difusión en disco para Haemophilus.
II REALIZACIÓN DEL PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
1. Inocular muestras representativas con los cultivos enumerados a continuación. a. Preparación del inóculo.
Preparar una suspensión del organismo en caldo Mueller Hinton o Mueller Hinton II. Ajustar la suspensión a 0,1 unidad de absorbencia a 625 nm. Esta suspensión contendrá aproximadamente entre 1 y 4 x 108
UFC/mL. b. En un plazo de 15 min después de ajustar la turbidez del inóculo, sumergir una torunda estéril en la suspensión
de caldo. Girar la torunda varias veces en la pared interna del tubo por encima del nivel de líquido para quitar el exceso de inóculo de la torunda.
c. Inocular la superficie de la placa extendiendo la muestra de torunda sobre la superficie de la placa. Repetir este procedimiento dos veces más, girando la placa 60 grados cada vez.
d. Volver a colocar la tapa de la placa y dejar que el inóculo se absorba durante al menos 3 pero no más de 15 min, antes de aplicar los Sensi-Disc antimicrobial susceptibility test discs.
e. Utilizando un Sensi-Disc Dispenser de 6 o de 8 posiciones para placas de 100 mm y el Sensi-Disc Designer Dispenser System de 12 posiciones para placas de 150 mm, colocar los discos adecuados en los cultivos correspondientes. No deben colocarse más de cuatro discos antimicrobianos en una sola placa de 100 mm, y no más de nueve en una sola placa de 150 mm, incluidos no más de seis de los siguientes discos:
cefalosporinas de tercera generación, aztreonam, imipenem y ciprofloxacina.
f. Dentro de los 15 min después de aplicar los discos, invertir las placas e incubar a 35 ± 2 °C en una atmósfera aerobia enriquecida con dióxido de carbono al 5%.
2. Examinar las placas después de 16–18 h y medir los diámetros de zona de las zonas de inhibición completas hasta el milímetro más cercano. El criterio de valoración debe tomarse como la superficie que no muestra crecimiento visible evidente; desestimar el crecimiento leve de colonias diminutas que pueden detectarse con dificultad en el borde de la zona de inhibición. En el caso de la trimetoprima y las sulfonamidas, desestimar el crecimiento ligero (20% o menos de la extensión de crecimiento) y medir el margen más evidente para determinar el diámetro de zona.
3. Resultados previstos a. Organismos de prueba:
* Haemophilus influenzae ATCC 49247
* Haemophilus influenzae ATCC 49766
Haemophilus influenzae ATCC 10211
(Para verificación de propiedades de fomento de crecimiento.)
b. Los tamaños de zona deben encontrarse dentro de los intervalos de los límites aceptables de control de calidad de diámetro de zona para H. influenzae, especificados por el Clinical and Laboratory Standards Institute (antes NCCLS). Dichos límites se encuentran publicados en el Documento M100-S17 (M2) del CLSI, que se incluye con el Documento M2-A9 del CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests, 9th ed.; Approved Standard1. Se publican periódicamente las tablas complementarias con tablas revisadas de discos
antimicrobianos y normas de interpretación. Consultar en las tablas más recientes las recomendaciones vigentes. Véase en el recuadro en “RESULTADOS” de la sección INFORMACIÓN DEL PRODUCTO para obtener más información.
c. El crecimiento de H. influenzae ATCC 10211 debe ser de moderado a denso.
III CONTROL DE CALIDAD ADICIONAL
1. Examinar las placas como se describe en la sección “Deterioro del Producto”.
2. Examinar visualmente las placas representativas para asegurarse de que los defectos físicos existentes no interfieran con el uso.
3. Determinar el pH potenciométricamente a temperatura ambiente para verificar el cumplimiento de la especificación 7,3 ± 0,1.
4. Observar la firmeza de las placas durante el procedimiento de inoculación.
5. Incubar las placas representativas no inoculadas a 35 ± 2 °C durante 72 h y examinar en busca de contaminación microbiana.
INFORMACIÓN DEL PRODUCTO
IV USO
PREVISTO
Haemophilus Test Medium Agar (HTM Agar) está diseñado para su uso en el procedimiento de prueba de sensibilidad por medio del método de difusión en disco para Haemophilus spp., como se describe en Approved Standard M2-A9, publicada por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)1.
V RESUMEN Y EXPLICACIÓN
En 1966, Bauer, Kirby y otros desarrollaron un procedimiento estandarizado para el análisis de sensibilidad antimicrobiana de bacterias comunes de crecimiento rápido en el que se seleccionó como medio de prueba el agar Mueller Hinton2-4. Dicho medio no es satisfactorio para los organismos exigentes tales como los estreptococos,
gonococos y la especie Haemophilus.
El agar Mueller Hinton suplementado con hemoglobina al 1% y enriquecimiento IsoVitaleX al 1% (agar chocolate Mueller Hinton) era el medio anteriormente recomendado para Haemophilus influenzae5. Extensos estudios realizados
por Jorgensen y otros llevaron al desarrollo del medio de prueba de Haemophilus (HTM)6,7
. Este medio es agar o caldo Mueller Hinton suplementado con factor X (hemina o hematina), factor V (nicotinamida adenina dinucleótido, o NAD) y extracto de levadura.
Una ventaja importante del agar HTM en comparación con el agar chocolate Mueller Hinton es la claridad óptica, lo que permite las mediciones de diámetro de zona desde el fondo de la placa, como es el procedimiento de prueba estándar para los organismos no exigentes en agar Mueller Hinton. Además, el agar HTM contiene niveles bajos de timidina y es, por consiguiente, adecuado para analizar trimetoprima/sulfametoxazol.
Los criterios de interpretación para la prueba de sensibilidad antimicrobiana de Haemophilus se suministran en Standard M100-S17 (M2)8 del CLSI, que se incluye con el documento M2-A9 del CLSI1. Se debe consultar dicho
documento para obtener más detalles.
VI PRINCIPIOS
DEL
PROCEDIMIENTO
El procedimiento de Bauer-Kirby se basa en la difusión a través de gel de agar de sustancias antimicrobianas que se impregnan en discos de papel. En comparación con los métodos anteriores que utilizaban discos con altas y bajas concentraciones antimicrobianas, además de la presencia o ausencia de zonas de inhibición para su interpretación, este método emplea discos con una sola concentración de agente antimicrobiano, y los diámetros de zona se correlacionan con las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI)1-3,9
.
En el procedimiento de análisis, una suspensión estandarizada del organismo se extiende por toda la superficie del medio. Los discos de papel impregnados con cantidades específicas de antibióticos y otros agentes antimicrobianos luego se colocan en la superficie del medio, se incuba la placa y se miden las zonas de inhibición en torno a cada disco. La determinación de que si el organismo es sensible, resistente o intermedio en su respuesta al agente se realiza comparando los diámetros de zona obtenidos con los presentados en el documento M100-S17 (M2) del CLSI8
. Se han identificado diversos factores que afectan las pruebas de sensibilidad por medio del método de difusión en disco. Se incluyen en esta categoría: el medio, la profundidad del agar, la potencia del disco, la concentración del inóculo, el pH y la producción de β-lactamasa por parte de los organismos de prueba1,5,9,10
VII REACTIVOS
Haemophilus Test Medium Agar
Fórmula aproximada* por litro de agua purificada
Extracto de carne bovina ...2,0 g Hidrolizado ácido de caseína...17,5 g Almidón ...1,5 g Agar...17,0 g Extracto de levadura ...5,0 g Hematina...15,0 mg Dinucleótido de nicotinamida adenina...15,0 mg
*Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.
Advertencias y precauciones Para uso diagnóstico in vitro.
Si se observa exceso de humedad, invertir la parte inferior sobre una tapa desplazada y dejar secar al aire para evitar la formación de un sello entre las partes superior e inferior de la placa durante la incubación.
Emplear una técnica aséptica y seguir las precauciones habituales contra riesgos microbiológicos durante todo el proceso. Después de ser usados, los recipientes de muestras y otros materiales contaminados deben esterilizarse en autoclave antes de ser desechados.
Instrucciones para el almacenamiento
Al recibir las placas, almacenarlas en un lugar oscuro a 2–8 ºC. No congelar ni sobrecalentar. No abrir hasta que vayan a utilizarse. Reducir al mínimo la exposición a la luz. Las placas preparadas, si se encuentran almacenadas en su envase original a una temperatura de 2–8 ºC hasta el momento de utilizarse, pueden inocularse hasta la fecha de caducidad e incubarse según los tiempos de incubación recomendados. Permitir que el medio llegue a temperatura ambiente antes de la inoculación.
Deterioro del producto
No utilizar las placas si muestran evidencia de contaminación microbiana, decoloración, deshidratación o cualquier otro signo de deterioro.
VIII RECOGIDA Y MANIPULACIÓN DE LAS MUESTRAS
Este medio no está diseñado para uso directo con muestras clínicas ni cultivos mixtos. La prueba de sensibilidad por medio del método de difusión en disco está diseñada para uso con cultivos puros. Se requieren tinción de Gram e identificación presunta de Haemophilus.
Para más detalles sobre los procedimientos de recogida y manipulación de muestras, consultar los textos correspondientes11,12.
IX PROCEDIMIENTO
Material suministrado Haemophilus Test Medium AgarMateriales necesarios pero no suministrados:
1. Caldo de inóculo, en tubos de 5 mL, tal como el caldo Mueller Hinton, caldo Mueller Hinton II o solución salina al 0,9%, para la preparación de un inóculo estándar.
2. Preparar un patrón de sulfato de bario McFarland de 0,5 para ajustar el inóculo (añadiendo 0.5 mL de 0,048 M BaCl2 [1,175% (peso/vol) BaCl2• 2H2O] a 99,5 mL de 0,18 M [0,36 N] H2SO4 [1% (vol/vol)]).
3. Un dispositivo fotométrico para ajustar la turbidez de la suspensión de inóculo para que sea equivalente al patrón de McFarland de 0,5.
4. Como alternativa a los materiales anteriormente mencionados (1-3), se puede utilizar BBL Prompt Inoculation System (dispositivo volumétrico de preparación de inóculo)13,14
.
5. Cultivos de control: Haemophilus influenzae ATCC 49247, ATCC 49766 y ATCC 10211.
Sensi-8. Dispositivo para medir o interpretar diámetros de zona al milímetro más cercano, tal como un calibrador deslizante o una regla1. También hay disponible para el mismo fin el Sensi-Disc Zone Interpretation Set (Cat. No.
260639), formado por las plantillas de patrones y etiquetas de medición de zona.
9. Un reactivo o dispositivo para la realización de una prueba rápida de β-lactamasa, tal como BBL Cefinase Discs.
10. Un incubador que produce una atmósfera con CO2 al 5% u otro dispositivo que produce una atmósfera aerobia
enriquecida con CO2.
11. Medios de cultivo auxiliar, reactivos y el equipo de laboratorio que se requiera. Procedimiento de análisis
1. Preparar una tinción de Gram antes de comenzar con la prueba de sensibilidad para confirmar la pureza del cultivo y la posible identificación de Haemophilus.
2. Utilizar varias colonias bien aisladas extraídas directamente de una placa de agar chocolate del día anterior (preferentemente de 20–24 h) como origen del inóculo.
3. Se debe utilizar una prueba rápida de β-lactamasa para la detección rápida de cepas resistentes a la penicilina, ampicilina o amoxilina.
4. Preparar una suspensión del organismo de prueba en caldo Mueller Hinton, caldo Mueller Hinton II o solución salina al 0,9%. Dicha suspensión debe ajustarse a la turbidez del patrón 0,5 de McFarland mediante un dispositivo fotométrico. Esta suspensión contendrá aproximadamente 1–4 x 108 UFC/mL. Se debe tener cuidado
al preparar esta suspensión, dado que altas concentraciones de inóculo pueden producir resultados resistentes falsos con determinados antibióticos betalactámicos, en especial cuando se analizan cepas de H. influenzae productoras de β-lactamasa1. Realizar periódicamente diluciones y recuentos en placa de las suspensiones de
inóculos para confirmar que el método de ajuste utilizado produce un inóculo con aproximadamente 1–4 x 108 UFC/mL.
5. Para análisis de rutina, se han encontrado aceptables métodos alternativos de preparación de inóculos con dispositivos que permiten la estandarización directa de los inóculos sin ajuste de turbidez, tal como el BBL Prompt Inoculation System13. Dicho sistema también parece ser satisfactorio para el análisis de H. influenzae14.
6. A los 15 min de ajustar la turbidez del inóculo, sumergir una torunda de algodón estéril en el inóculo diluido correctamente y girarla varias veces contra la porción superior de la pared interna del tubo para exprimir el exceso de líquido.
7. Inocular toda la superficie de agar de la placa tres veces, girando la placa 60 grados cada vez para obtener una inoculación pareja. Como paso final, extender la muestra de torunda en el borde del lecho de agar.
8. La tapa puede dejarse entreabierta entre 3 y 5 min y la placa puede mantenerse a temperatura ambiente, pero no más de 15 min, para permitir que se absorba la humedad de la superficie antes de aplicar los discos impregnados con fármaco.
9. Aplicar los discos mediante un dispensador de discos antimicrobianos, empleando medidas de precaución asépticas. La mayoría de los agentes antimicrobianos produce zonas de inhibición más grandes cuando se les efectúan pruebas de Haemophilus en comparación con otros organismos. Por consiguiente, no pueden colocarse más de cuatro discos antimicrobianos en una sola placa de 100 mm, y no más de nueve en una sola placa de 150 mm, incluidos no más de seis de los siguientes discos: cefalosporinas de tercera generación (por ejemplo, cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona, ceftizoxima), aztreonam, imipenem o ciprofloxacina. Si los discos se han colocado en el agar, presiónelos con una aguja o una pinza estériles para que haga contacto completo con la superficie del medio. Este paso no es necesario si los discos se han colocado con el Sensi-Disc Self Tamping 12-Place Dispenser (no se accionarán los apisonadores de los orificios que no tengan cartuchos).
10. A los 15 min después de aplicar los discos, invertir las placas e incubar durante 16–18 h a 35 °C en una atmósfera aerobia enriquecida con dióxido de carbono al 5%.
11. En una placa de agar HTM, extender H. influenzae ATCC 10211 e incubar junto con las placas de prueba de sensibilidad para determinar si el medio favorece un crecimiento adecuado.
Control de calidad del usuario
Véase “Procedimientos de control de calidad”.
Se deben incluir cultivos de control siempre que se realicen las pruebas de sensibilidad o bien semanalmente, si se puede documentar un rendimiento satisfactorio conforme al criterio del CLSI1. Los diámetros de zona correctos se
X RESULTADOS
1. Examinar las placas después de 16–18 h de incubación. Se debe obtener una extensión confluente de crecimiento. Si sólo crecen colonias aisladas, el inóculo es muy ligero y se debe repetir la prueba. 2. Medir el diámetro de las zonas de inhibición completa (como se puede observar a simple vista), incluido el
diámetro del disco, hasta el milímetro más cercano, con calibradores, una regla o una plantilla preparada para dicho propósito. Se sostiene un dispositivo de medición en la parte posterior de la placa, la que se sostiene sobre un fondo negro no reflejante e iluminado por arriba.
El criterio de valoración debe considerarse como la superficie que no muestra crecimiento visible evidente detectable a simple vista. Desestimar crecimiento tenue de colonias diminutas que pueden detectarse con dificultad cerca del borde de la zona de inhibición evidente.
Con trimetoprima y las sulfonamidas, los antagonistas en el medio pueden permitir cierto crecimiento leve; por consiguiente, desestimar el crecimiento ligero (20% o menos de la extensión del crecimiento) y medir el margen más evidente para determinar el diámetro de zona.
3. Consultar el documento M100-S17 (M2) del CLSI para más información acerca de cómo interpretar los resultados obtenidos con aislados clínicos de Haemophilus8. Se pueden informar resultados resistentes, intermedios o
sensibles, según los diámetros de zona obtenidos.
NOTA: Se publican periódicamente las tablas complementarias del Documento M2-A9 del CLSI, con tablas de discos antimicrobianos y normas de interpretación revisadas. Consultar en las tablas más recientes las recomendaciones vigentes. Para obtener información acerca de las publicaciones vigentes, póngase en contacto con el representante local de BD. La norma completa y los suplementos informativos se pueden solicitar al Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898, EE.UU. Tel: (610) 688-1100.
Los organismos con resultado positivo de producción de β-lactamasa deben considerarse resistentes a ampicilina a pesar de los diámetros de zona obtenidos. Debe tenerse en cuenta que las cepas de H. influenzae resistentes a la ampicilina se han descrito como carentes de actividad de β-lactamasa15. Por lo tanto, si el diámetro de zona
indica resistencia a la ampicilina, el aislado debe informarse como resistente a dicho fármaco, aun si la prueba de
β-lactamasa tiene resultado negativo.
XI LIMITACIONES
DEL
PROCEDIMIENTO
Con ciertas combinaciones de organismo y agente antimicrobiano, la zona de inhibición tal vez no esté definida claramente, lo que podría llevar a una interpretación incorrecta.
La concentración incorrecta de inóculo puede producir resultados inexactos. Las zonas de inhibición pueden ser demasiado pequeñas si el inóculo es demasiado denso y pueden ser muy grandes y difíciles de medir si el inóculo es demasiado ligero.
No deben colocarse más de cuatro discos antimicrobianos en una sola placa de 100 mm, y no más de nueve en una sola placa de 150 mm, incluidos no más de seis de los siguientes discos: cefalosporinas de tercera generación (por ejemplo, cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona, ceftizoxima), aztreonam, imipenem o ciprofloxacina.
El almacenamiento inadecuado de los discos antimicrobianos puede causar pérdida de potencia y resultados resistentes falsos.
La sensibilidad in vitro de un organismo a un agente antimicrobiano específico no necesariamente significa que el agente tendrá eficacia in vivo. Consultar los textos correspondientes para obtener instrucciones para la interpretación de resultados5,10.
XII CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO
A. Estudio de reproducibilidad16Se evaluaron tres lotes de producción de agar HTM con el procedimiento de prueba de sensibilidad con disco antimicrobiano (M2-A4), recomendado por el NCCLS en aquel momento17. En el estudio se utilizaron en total 12
había cuatro con tetraciclina, uno con cefaclor y uno con cefuroxima. En el caso de la tetraciclina, el resultado habría producido una categoría de interpretación de sensible o intermedio (error menor). Con cefaclor y
cefuroxima, la diferencia de 1 mm que se produjo daría un resultado de categoría intermedia o resistente, también un error menor.
En este estudio se utilizaron cinco cepas de H. influenzae productoras de β-lactamasa. Con cada una de estas cepas, cada lote de agar HTM produjo diámetros de zona con ampicilina que podrían interpretarse como
resultados resistentes. Dos de las cinco cepas también produjeron cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Las zonas de cloranfenicol obtenidas con estas dos cepas serían acordes a la resistencia de cloranfenicol18,19.
B. Comparación con agar chocolate Mueller Hinton16
El procedimiento de disco del NCCLS se realizó con 213 aislados clínicos de H. influenzae en agar HTM y agar chocolate Mueller Hinton17,20. Los agentes antimicrobianos analizados fueron ampicilina, ampicilina-sulbactam,
amoxicilina-clavulanato y cloranfenicol. Fueron los únicos agentes antimicrobianos para los que los criterios de interpretación de diámetro de zona se habían definido para el agar chocolate Mueller Hinton21,22. Se obtuvieron los
siguientes resultados.
Haemophilus Test Medium Agar S I R
Agar chocolate S 808 1 2 Mueller Hinton I 0 0 0 R 0 0 41
Concordancia: 99,6% S = Sensible I = Intermedio R= Resistente
Se produjeron dos errores mayores y un error menor con ampicilina. En ambos errores mayores, el agar HTM produjo un resultado resistente, mientras que el agar chocolate Mueller Hinton produjo un resultado sensible. Ambos aislados dieron resultado positivo para β-lactamasa. Por consiguiente, el resultado resistente fue correcto. El error menor se produjo con un aislado que dio resultado intermedio en agar HTM y un resultado sensible en agar chocolate Mueller Hinton.
XIII DISPONIBILIDAD
N.º ref. Descripción221954 BBL Haemophilus Test Medium Agar, pqt. de 8 placas (150 x 15 mm) 221992 BBL HaemophilusTest Medium Agar, pqt. de 10 placas (100 x 15 mm)
XIV REFERENCIAS
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