REVISTA PERUANA DE MEDICINA EXPERIMENTAL Y SALUD PÚBLICA
Instituto Nacional de Salud Calle Cápac Yupanqui 1400, Lima 11, Perú
Apartado Postal 471 Telf.: (0511) 471-9920 - Fax: (0511) 471-0179 Correo electrónico: [email protected]
REVISTA PERUANA DE
MEDICINA EXPERIMENTAL Y SALUD PÚBLICA
REVISTA PERUANA DE
MEDICINA EXPERIMENTAL Y SALUD PÚBLICA
REVISTA PERUANA DE
MEDICINA EXPERIMENTAL Y SALUD PÚBLICA
REVISTA PERUANA DE
MEDICINA EXPERIMENTAL Y SALUD PÚBLICA
R E V IS T A P E R U A N A D E M E D IC IN A E X P E R IM E N T A L Y S A LU D P Ú B LI C A
VOLUMEN 22 NÚMERO 1 ENERO - MARZO 2005VOLUMEN 22 NÚMERO 1 ENERO - MARZO 2005
VOLUMEN 22 NÚMERO 1 ENERO - MARZO 2005
Editorial
! Enfermedades emergentes y reemergentes. César Cabezas S ...
Trabajos Originales
! Perfiles genéticos (IS6110) y patrones de resistencia en aislamientos de M. tuberculosis de pacientes con tuberculosis pulmonar. Lima Sur, Perú. Luis Capcha A, Martha Urbina B, Lucy Vásquez C, Luis Asencios S, Neyda Quispe T, Elena Leo H, Christian Baldeviano V, Amparo Zavaleta P. ...
! Distribución de los subtipos del VIH-1 en nueve países de América del Sur. V.Alberto Laguna-Torres, James Olson, José L. Sánchez, Silvia Montano, Gloria Chauca, Gladis Carrión, Ada Romero, Jane Ríos, María E Gamero, Merly Sovero, Juan Pérez-Bao, Jean Carr, y el Grupo de Trabajo de Genotipificación del VIH en Sudamérica ...
! Consumo de alimentos según condición de pobreza en mujeres peruanas en edad fértil y niños menores de 12 a 35 meses de edad. María Calderón A, Carmen Moreno P, Carlos Rojas D, Juan Barboza del C. ...
! Conocimientos actitudes y prácticas acerca del dengue en los distritos de Cercado de Lima, La Victoria y San Luis. Lima, Perú. Junio 2004. Ronal Jamanca S, Antonio Touzett V, Leonel Campos A, Héctor Jave C, Miguel Carrión M, Sixto Sánchez C. ...
! Impacto de los eventos de El Niño Southern Oscillation (ENSO) sobre la leishmaniosis cutánea en sucre, Venezuela, a través del uso de información satelital, 1994-2003. Gilberto Cabaniel S, Liliana Rada T, Juan Blanco G, Alfonso J. Rodríguez-Morales, Juan Escalera A. ...
! Clonamiento, expresión y seroreactividad del antígeno recombinante flagelina de Bartonella bacilliformes. Karen Gallegos V, Christian Baldeviano V, Adolfo Marcelo Ñ, Carlos Padilla R. ...
! Oportunidad del diagnóstico y tratamiento de la malaria en la amazonía del Perú.Salomón Durand V, César Ramal A, Maria Huilca A, César Cabezas S. ...
Articulo de Revisión
! Ecoepidemiología y epidemiología satelital. Nuevas herramientas en el manejo de problemas de salud pública. Alfonso J. Rodríguez-Morales ...
! Tabaquismo. Problema de salud pública en el Perú. Luis Pinillos A, Mercedes Quesquén P, Félix Bautista G, Ebert Poquioma R. ...
Comunicaciones Cortas
! Características de las atenciones registradas por la policía en el servicio de emergencia de un hospital de Lima, 2001. Félix García A, Javier Cieza Z, Berly Alvarado B. ...
! Evaluación de los métodos Graham y pin tape en el diagnóstico de Enterobius vermicularis. María Beltrán F, Hara T, Raúl Tello C. ...
Sección Especial
! Arístides Herrer Alva. Zuño Burstein A. ...
! Reflexiones acerca de la enfermedad de Hansen (Lepra). José Neyra R. ...
Galería Fotográfica
! La lepra (enfermedad de Hansen). Parte I: Manifestaciones clínicas. Zuño Burstein A. ...
Contenido
Tuberculosis - 4 VIH - 12
Consumo de alimentos - 19 Dengue - 26
Leishmaniosis - 32
Bartonella bacilliformis - 39 Malaria - 47
Ecoepidemiología - 54
Tabaquismo - 64 Emergencias - 71
Enterobius vermicularis - 76 Lepra - 81, 83
3
4
12 19
26
32 39 47
54 64
71 76
79 81
83
CONTENIDO
3
4
12
19
26
32
39
47
54
64
71
76
79 81
83
VOLUMEN 22 NÚMERO 1 ENERO – MARZO 2005
Editorial
• Enfermedades emergentes y reemergentes. César Cabezas S...
Trabajos Originales
• Perfiles genéticos (IS6110) y patrones de resistencia en aislamientos de M. tuberculosis de pacientes con tuberculosis pulmonar. Lima Sur, Perú. Luis Capcha A, Martha Urbina B, Lucy Vásquez C, Luis Asencios S, Neyda Quispe T, Elena Leo H, Christian Baldeviano V, Amparo Zavaleta P. ...
• Distribución de los subtipos del VIH-1 en nueve países de América del Sur. V.Alberto Laguna- Torres, James Olson, José L. Sánchez, Silvia Montano, Gloria Chauca, Gladis Carrión, Ada Romero, Jane Ríos, Maria E Gamero, Merly Sovero, Juan Pérez-Bao, Jean Carr, y el Grupo de Trabajo de Genotipificación del VIH en Sudamérica ...
• Consumo de alimentos según condición de pobreza en mujeres peruanas en edad fértil y niños menores de 12 a 35 meses de edad. María Calderón A, Carmen Moreno P, Carlos Rojas D, Juan Barboza del C. ...
• Conocimientos actitudes y prácticas acerca del dengue en los distritos de Cercado de Lima, La Victoria y San Luis. Lima, Perú. Junio 2004. Ronal Jamanca S, Antonio Touzett V, Leonel Campos A, Héctor Jave C, Miguel Carrión M, Sixto Sánchez C. ...
• Impacto de los eventos de El Niño Southern Oscillation (ENSO) sobre la leishmaniosis cutánea en Sucre, Venezuela, a través del uso de información satelital, 1994-2003. Gilberto Cabaniel S, Liliana Rada T, Juan Blanco G, Alfonso J. Rodríguez-Morales, Juan Escalera A. ...
• Clonamiento, expresión y seroreactividad del antígeno recombinante flagelina de Bartonella bacilliformes. Karen Gallegos V, Christian Baldeviano V, Adolfo Marcelo Ñ, Carlos Padilla R. ...
• Oportunidad del diagnóstico y tratamiento de la malaria en la amazonía del Perú.Salomón Durand V, César Ramal A, María Huilca A, César Cabezas S. ...
Articulo de Revisión
• Ecoepidemiología y epidemiología satelital. Nuevas herramientas en el manejo de problemas de salud pública. Alfonso J. Rodríguez-Morales ...
• Tabaquismo. Problema de salud pública en el Perú. Luis Pinillos A, Mercedes Quesquén P, Félix Bautista G, Ebert Poquioma R. ...
Comunicaciones Cortas
• Características de las atenciones registradas por la policía en el servicio de emergencia de un hospital de Lima, 2001. Félix García A, Javier Cieza Z, Berly Alvarado B. ...
• Evaluación de los métodos Graham y pin tape en el diagnóstico de Enterobius vermicularis.
María Beltrán F, Hara T, Raúl Tello C. ...
Sección Especial
• Arístides Herrer Alva. Zuño Burstein A. ...
• Reflexiones acerca de la enfermedad de Hansen (Lepra). José Neyra R. ...
Galería Fotográfica
• La lepra (enfermedad de Hansen). Parte I: Manifestaciones clínicas. Zuño Burstein A. ...
Rev Peru Med Exp Salud Publica 22(1), 2005 Laguna-Torres et al.
CONTENTS
VOLUME 22 NUMBER 1 JANUARY – MARCH 2005
Editorial
• Emerging and reemerging disease. César Cabezas S ...
Original Papers
• Genetic profiling (RFLP-IS6110) and resistance pattern in M. tuberculosis isolates from patients with pulmonary tuberculosis, Southern Lima, Peru. Luis Capcha A, Martha Urbina B, Lucy Vásquez C, Luis Asencios S, Neyda Quispe T, Elena Leo H, Christian Baldeviano V, Amparo Zavaleta P. ...
• Distribution on HIV - 1 subtypes in nine countries of South America. V. Alberto Laguna-Torres, James Olson, José L. Sánchez, Silvia Montano, Gloria Chauca, Gladis Carrión, Ada Romero, Jane Ríos, María E Gamero, Merly Sovero, Juan Pérez-Bao, Jean Carr, y el Grupo de Trabajo de Genotipificación del VIH en Sudamérica ...
• Food consumption according to poverty conditions in fertile women and children between 12 and 35 months old. María Calderón A, Carmen Moreno P, Carlos Rojas D, Juan Barboza del C. ...
• Dengue fever knowledge, attitude and practices in Downtown Lima, La Victoria and San Luis districts. Lima, Peru. June 2004. Ronal Jamanca S, Antonio Touzett V, Leonel Campos A, Héctor Jave C, Miguel Carrión M, Sixto Sánchez C. ...
• Impact of El Niño Southern Oscillation (ENSO) events on cutaneous leishmaniasis in Sucre, Venezuela, trough the use of satellital data. 1994-2003. Gilberto Cabaniel S, Liliana Rada T, Juan Blanco G, Alfonso J. Rodríguez-Morales, Juan P. Escalera A. ...
• Cloning, expression and seroreactivity of recombinant antigen flagellin of Bartonella bacilliformis. Karen Gallegos V, Christian Baldeviano V, Adolfo Marcelo Ñ, Carlos Padilla R. ...
• Assessment of the opportunity in malaria diagnosis and treatment in periurban communities from the Peruvian Amazon basin. Salomón Durand V, César Ramal A, María Huilca C, César Cabezas S....
Review
• Ecoepidemiology and satellital epidemiology: new tools in the management of public health problems. Alfonso J. Rodríguez-Morales ...
• Tobacco use: a public health problem in Peru. Luis Pinillos A, Mercedes Quesquén P, Félix Bautista G, Ebert Poquioma R. ...
Short Communications
• Characteristics of the attentions registered by the police in the emergency service in a Lima hospital, 2001. Félix García A, Javier Cieza Z, Berly Alvarado B....
• Assessment of Graham and pin tape methods for diagnosing Enterobius vermicularis infection.
María Beltrán F, Hara T, Raúl Tello C....
Special Section
• Arístides Herrer Alva. Zuño Burstein A. ...
• Reflections on the Hansen’s disease (Leprosy). José Neyra R....
Picture Galery
• The leprosy (Hansen’s disease). Part I: Clinical manifestations. Zuño Burstein A....
3
4
12
19
26
32
39
47
54
64
71
76
79 81
83
EDITORIAL
La emergencia y reemergencia de enfermedades obedece a varios factores entre los que destacan, la adaptación y cambios microbianos, la susceptibilidad de los humanos a la infección, los cambios climáticos, los cambios en los ecosistemas, los cambios demográficos, el desarrollo económico, el comercio y turismo internacional, el desarrollo de la tecnología e industria, la pobreza e inequidad, las guerras y hambruna, así como la carencia de políticas de salud adecuadas en los países.
Varios de estos factores están condicionando la aparición de enfermedades y su dispersión en dife- rentes áreas del mundo lo cual se evidencia en los artículos que se presentan en este número, como el de la distribución de los subtipos del VIH-I en América del Sur que muestra el predominio del subtipo B y en menor proporción el F, A y B, hallazgos que probablemente servirán para el estudio de vacunas.
Dentro de la aplicación del desarrollo tecnológico para mejorar el diagnóstico y enfrentar enferme- dades infecciosas también está la aplicación de marcadores moleculares, como los que se descri- ben en la determinación de los perfiles genéticos de la resistencia del M. tuberculosis que acortaría los tiempos para decidir un tratamiento adecuado, así como la determinación de un antígeno recombinante que puede servir para el desarrollo de una técnica alternativa de diagnóstico serológico para la enfermedad de Carrión, dada la baja sensibilidad del diagnóstico del frotis y el limitado acceso a los servicios con diagnóstico microscópico en áreas rurales.
De otro lado, también teniendo como condicionantes a los factores arriba descritos tenemos que las enfermedades transmitidas por vectores, como la malaria, el dengue, la fiebre amarilla, enfermedad de Carrión, leishmaniosis, enfermedad de Chagas sean prevalentes en diferentes áreas geográfi- cas del país. Dentro de los factores condicionantes de estas enfermedades debemos destacar los cambios climáticos como el calentamiento global, los cambios en los ecosistemas, como los pro- piciados por las plantaciones de arroz en la costa norte y los cambios demográficos debidos a la intensa migración, que contribuye a la dispersión de enfermedades, como ocurre con la fiebre amarilla en la selva alta, la malaria y el dengue en la costa norte y la amazonia. Los artículos en este número referidos al Fenómeno del Niño y el de ecoepidemiología y epidemiología satelital, nos introducen a estas nuevas herramientas disponibles para un diagnóstico situacional que permita orientar mejor las medidas de control y prevención no solo de los daños descritos, si no también de los riesgos, siendo su implementación uno de los aportes a la medicina moderna que debemos considerar dentro del nuevo enfoque integral de la salud pública.
En medio de la transición epidemiológica, aunque más lenta en nuestros países, y las enfermeda- des no transmisibles, debemos considerar los aspectos nutricionales y la pobreza, que tienen un mayor efecto particularmente en mujeres y niños, condicionando y limitando el desarrollo integral de nuestra población, lo cual es evidenciada en el articulo referido al consumo de alimentos según condición de pobreza en mujeres en edad fértil en niños pequeños.
Finalmente en el grupo de enfermedades no transmisibles enfatizar el tabaquismo, que pese al conocimiento de su asociación con el cáncer particularmente de pulmón, como un problema de salud pública no resuelto por la flexibilidad legislativa y la activa difusión de su consumo por parte de las tabacaleras.
En síntesis, los artículos de este número versan sobre enfermedades transmisibles y no transmisi- bles como problemas, pero también sobre instrumentos para enfrentarlas de acuerdo con el desa- rrollo científico tecnológico y de acuerdo con nuestra realidad concreta. Es así como iniciamos este primer número del año 2005, a 63 años de la aparición de nuestro primer ejemplar el cual vio la luz en 1942.
Comité editor
Rev Peru Med Exp Salud Publica 22(1), 2005 Capcha A. et al.
PERFILES GENÉTICOS (IS6110) Y PATRONES DE RESISTENCIA EN AISLAMIENTOS DE M. tuberculosis DE PACIENTES CON
TUBERCULOSIS PULMONAR. LIMA SUR, PERÚ*
Luis Capcha A1, Martha Urbina B1, Lucy Vásquez C2, Luis Asencios S2, Neyda Quispe T2, Elena Leo H2, Christian Baldeviano V3, Amparo Zavaleta P4.
TRABAJOS ORIGINALES
RESUMEN
Objetivos: Conocer los perfiles genéticos de M. tuberculosis y determinar el patrón de resistencia a drogas en una población de sujetos infectados provenientes del sur de Lima mediante el marcador genético IS6110 (RFLP-IS6110).
Materiales y Métodos: Entre octubre de 2002 y abril de 2003 se incluyeron pacientes mayores de 15 años con tuberculosis (TB) pulmonar frotis positivo procedentes de servicios de salud del distrito Villa María del Triunfo y del Hospital María Auxiliadora. Se realizó la prueba de sensibilidad a las cuatro drogas de primera línea rifampicina (RIF), isoniacida (INH), estreptomicina (SM) y etambutol (EMB) por el método de proporciones, y la genotipificación mediante el método estándar de RFLP-IS6110. Se recolectó información de los casos de los registros del establecimiento e historias clínicas. Resultados: De 118 aislamientos de M. tuberculosis se identificaron 97 perfiles genéticos varian- do entre 2 a 15 bandas por perfil. El 29,7% de los aislamientos dio origen a 14 grupos o clusters genéticos mientras que el resto mostró patrones variables de bandas. De otro lado, los perfiles de resistencia revelaron que cerca de 33% de los sujetos participantes nunca tratados presentaron resistencia a drogas y 58% de los tratados con anterioridad. La multidrogoresistencia fue de 8,42% y 36% en los nunca y anteriormente tratados respectivamente.
Conclusiones: Nuestro análisis revela la existencia de grupos genéticos con relación epidemiológica o clonal sin evidencia de transmisión de cepas resistentes a múltiples drogas.
Palabras clave: Tuberculosis; M. tuberculosis / genotipificación; Resistencia a drogas; Códigos genéticos;
Polimorfismo de longitud del fragmento de restricción; Epidemiología Molecular; Perú (fuente: DeCS BIREME).
ABSTRACT
Objectives: To know the genetic profile of M. tuberculosis, and to determine its drug resistance pattern in a population consisting in infected subjects from southern Lima using the IS610 genetic marker (RFLP-IS6110). Materials and Methods: Between october 2002 and april 2003 patients older than 15 years of age diagnosed with pulmonary tuberculosis (TB) by a positive sputum smear were included. Patients were recruited from health facilities in Villa Maria del Triunfo district and Maria Auxiliadora Hospital. Susceptibility testing for all first-line drugs was performed:
rifampin (RIF), isoniazid (INH), streptomycin (SM), and ethambutol (EMB) using the proportion method, and genotyping was performed using the standard RFLP-IS6110 method. Information was collected from case registries in health facilities, as well as from clinical records. Results: Out of 118 M. tuberculosis isolates, 97 genetic profiles were identified, with between 2 to 15 bands per profile. 29.7% of isolates originated 14 genetic groups or clusters, while the others showed variable patterns in their bands. On te other hand, resistance profiles revealed that nearly 33% of participating subjects who never received any previous therapy had drug resistance, as well as 58% of those previously treated. Multidrug resistance was present in 8.42% and in 36% of those never before treated and those previously treated, respectively. Conclusions: This analysis revealed the existence of epidemiologically- or clonally- related genetic groups with no evidence for multidrug resistant strains transmission.
Key words: Tuberculosis; M. tuberculosis/genotipification; Drug resístanse; Genetic code; Polymorphism, restriction fragment length; Molecular Epidemiology; Peru (source: DeCS BIREME).
1 Laboratorio del Hospital María Auxiliadora. Lima, Perú.
2 Laboratorio de Referencia Nacional de Mycobacterias, Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú.
3 Laboratorio de Biología Molecular, Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú.
4 Departamento de Biología Molecular, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.
* Esta investigación contó con el apoyo técnico - financiero del Proyecto «Enfrentando las amenazas de las enfermedades infecciosas emergentes y reemergentes» Vigía (MINSA / USAID), en el marco del III CONCURSO PARA PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS EMERGENTES Y REEMERGENTES – AÑO 2002.
INTRODUCCIÓN
A pesar de los esfuerzos mundiales para combatir la tuberculosis (TB), la enfermedad permanece como el mayor problema de salud pública en países industrializados y en países en vías de desarrollo como el Perú1,2. La enfermedad activa producida por Mycobacterium tuberculosis, se desarrolla después de una infección adquirida recientemente (primaria) o de la reactivación de una infección adquirida en el pa- sado (latente)3. El síndrome de inmunodeficiencia ad- quirida (SIDA) es el mayor factor de riesgo tanto para la reactivación de la infección de M. tuberculosis laten- te, como de enfermedad primaria en los países euro- peos y en Estados Unidos de América4,5. En los países en vías de desarrollo parece ser que el principal factor de riesgo son las condiciones económicas y socia- les6,7. También se ha determinado que el diagnóstico tardío de la tuberculosis esta asociado con la mayor morbilidad y mortalidad debido al incremento de la carga bacilar en el individuo, los factores asociados con el diagnóstico tardío son: automedicación, per- cepción de un tiempo de espera prolongado, percep- ción de un costo elevado y desconocimiento de la exis- tencia de programas de control de tuberculosis8. Otra de las grandes dificultades para el control de la TB es la emergencia de cepas multidrogoresistentes (MDR)9. Entre los factores claves para el control de la TB están la rápida detección y una adecuada terapia para dete- ner una futura transmisión10.
En el Perú, esta enfermedad presenta altas tasas de incidencia, en el año 2000 se notificó el diagnóstico de 39 918 casos de TB en todas sus formas, 58% de los cuáles fueron informados en Lima y Callao (inciden- cia anual de 133,60 x 100 000 habitantes). En el caso de la zona sur de Lima (donde se realiza el presente estudio), los datos epidemiológicos notificados por la Dirección de Salud de Lima Sur señalan que la inci- dencia de tuberculosis pulmonar frotis positivo (TBP- FP) es 125,8 x 100 000 habitantes; y los niveles de resistencia primaria y adquirida en el Perú son de 17,8 y 23,5%, respectivamente (1999). Además, existen al- gunas zonas de alta incidencia de tuberculosis en los distritos de San Juan de Miraflores y Villa María del Triunfo llamados «bolsones tuberculosos»11.
Con el fin de entender mejor la dinámica de la trans- misión y la patogénesis de la TB se han desarrollado en los últimos años diversas técnicas moleculares que han permitido caracterizar genéticamente aisla- mientos de M. tuberculosis. Uno de estos métodos es el análisis del polimorfismo de longitud de los frag- mentos de restricción usando como sonda la secuen-
cia de inserción IS6110 (RFLP-IS6110, por sus inicia- les en inglés), convirtiéndose en una poderosa herra- mienta de la epidemiología molecular en diferentes países12-16.
En nuestro país, los estudios que han usado esta he- rramienta molecular son escasos, uno de ellos, reali- zado en la provincia del Callao, encontró genotipos asociados a resistencia, lo cual indicaría transmisión activa de cepas resistentes17. Estos datos sugieren la importancia de continuar con la caracterización genética de aislamientos peruanos de M. tuberculo- sis, especialmente en zonas de alta incidencia como el sur de Lima.
En ese sentido, el objetivo del presente estudio fue conocer los perfiles genéticos (frecuencia y agrupamientos) de M. tuberculosis en una zona del sur de Lima (distrito de Villa María del Triunfo) median- te el marcador genético IS6110 (RFLP-IS6110) así como determinar el patrón de resistencia a drogas en esta población
MATERIALES Y MÉTODOS
DESCRIPCIÓN DEL ÁREA DEL ESTUDIO
Villa María del Triunfo es un distrito ubicado en el cono sur de la ciudad de Lima, capital del Perú. Con una extensión de 70,57 km2, su área urbana ocupa sólo 21 km2, siendo el resto de su territorio zonas áridas. Este distrito se divide en 6 zonas (José Carlos Mariátegui, Cercado –capital del distrito–, Inca Pachacútec, Nueva Esperanza, Tablada de Lurín y Villa Poeta José Gálvez Barrenechea). Tiene una población de 330 348 habi- tantes, de los cuales 51% son mujeres y más de 60 % son jóvenes. Presenta un crecimiento caracterizado por una constante migración de población procedente principalmente de las provincias andinas del interior del país, y además tiene al 30% de su población en situación de extrema pobreza.
POBLACIÓN Y MUESTRAS CLÍNICAS INCLUIDAS
Entre el 1 de octubre de 2002 y el 30 de abril de 2003, se incluyeron a pacientes mayores de 15 años con diagnóstico de TB pulmonar mediante baciloscopía positiva, procedentes de diferentes servicios de salud del distrito Villa María del Triunfo y del Hospital María Auxiliadora (hospital nacional de referencia de la zona sur de Lima). Los casos incluidos fueron los «nunca tratados» y los «anteriormente tratados», las mues- tras clínicas de esputo fueron transportadas al labora-
Rev Peru Med Exp Salud Publica 22(1), 2005 Capcha A. et al.
torio del Hospital María Auxiliadora, acompañada de la ficha clínico-epidemiológica estándar correctamente llenada (que incluye datos de filiación: edad, sexo, pro- cedencia, antecedentes de tratamiento). Cuando fue necesario completar los datos de los pacientes, se revisó el libro de registros de baciloscopías y cultivos o las fichas de tratamiento del centro de salud, y en el caso de los pacientes del hospital se acudió a su his- toria clínica. Además, en el caso de los pacientes «agru- pados», cuyas cepas de M. tuberculosis forman parte de un mismo cluster, se indagó por su relación epidemiológica (antecedentes de contacto con un pa- ciente con TB, antecedentes de TB clínica, antecedentes de hospitalización previa en el hospital o en algún otro hospital, y antecedentes de tratamiento ambulatorio).
CULTIVO Y PRUEBA DE SENSIBILIDAD A DROGAS ANTITUBERCULOSAS
Las muestras fueron recibidas para la realización de cultivo de M. tuberculosis, de acuerdo con los procedi- mientos estándares18. De estos, sólo las muestras aisladas fueron transportadas al Laboratorio Nacio- nal de Referencia de Mycobacterias (LNRM), Centro Nacional de Salud Pública, Instituto Nacional de Salud (INS) donde inicialmente se realizó el reaislamiento bacteriano y la prueba de susceptibilidad a drogas de primera línea. Estas muestras fueron las que final- mente se incluyeron para el estudio molecular.
La prueba de sensibilidad a drogas de primera línea (rifampicina, RIF; isoniacida, INH; estreptomicina, SM y etambutol, EMB) fue realizada de acuerdo con el método convencional de las proporciones de Canetti, Rist y Grosset, en su variante económica19.
Adicionalmente, se consideraron algunos criterios básicos para sospechar de la presencia de mycobacterias no tuberculosas, como: observación de características de morfología y tamaño de colonias, presencia de ramificación, velocidad de crecimiento, coloración y temperatura de incubación18.
CARACTERIZACIÓN GENÉTICA MEDIANTE EL MÉTODO RFLP-IS6110
La caracterización genética de los aislamientos fue realizado en la División de Biología Molecular del INS.
La cepa de referencia M. tuberculosis 14323, propor- cionada por el LNRM, fue incluida en cada corrida de electroforesis como un control para el análisis de ca- racterización genética por el método de RFLP-IS6110.
El método empleado consistió en la restricción enzimática o RFLP (de las siglas en inglés: Restriction Fragment Lenght Polimorphism) e hibridación de ADN con una sonda correspondiente a un fragmento de la secuencia de inserción IS6110. Esta secuencia de in- serción está presente en número (0 a 20 copias) y posición variable en distintas cepas de M. tuberculo- sis, y esta forma genera un polimorfismo de bandas (perfil genético RFLP-IS6110). El procedimiento se rea- lizó siguiendo el protocolo estándar propuesto por van Embden20, y van Soolingen21.
Extracción de ADN genómico. Para ello, una asada de cultivos jóvenes (25 a 35 días) fue resuspendida en 400 µL buffer TE (0.01 M Tris-HCl, 0,001 M EDTA [pH 8]) e inactivadas a 85 °C durante 20 minutos. Luego, se adicionó 50 µL de lisozima, 10 mg/mL (SIGMA) y se incubó a 37 °C durante 2 horas, para posteriormente adi- cionar 70 µL SDS 10% (SIGMA) y 5 µL de proteinasa K, 10 mg/mL(SIGMA) y se incubó a 65 °C por 15 minutos.
Finalmente, 100 µL de NaCl 5M y CTAB-NaCl fueron adicionados para incubarlo a 65 °C por 15 minutos. El ADN fue extraído mediante cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), precipitado mediante isopropanol absoluto y resuspendido en buffer TE.
Restricción enzimática y transferencia de ácidos nucleicos. Una concentración de 4,5 µg de ADN genómico fue cortado con la enzima de restricción PvuII (PROMEGA), la mezcla de restricción fue Y µL H2O mQ, 2 µL de buffer de digestión 10X, 1 µL de la enzima de restricción Pvu II 10 U/µL y X µL DNA (4,5µg) dando un volumen final de 20 µL; la mezcla fue incubada a 37 ºC durante 3 horas. Los fragmentos fueron separados mediante electroforesis en agarosa 0,8% (SIGMA) du- rante toda la noche a 25 V. Luego, el ADN se transfirió a una membrana de nylon (Hybond+, Amersham Pharmacia, Biotech) por el método de capilaridad. La duración de la transferencia fue de cinco horas en un buffer SSPE 10X.
Hibridación con la sonda 245pb-IS6110 y obtención de los perfiles genéticos RFLP-IS6110. La hibrida- ción de ácidos nucleicos fue llevada a cabo emplean- do el kit ECL (Amersham Pharmacia, Biotech) de acuer- do con las instrucciones del fabricante. Para ello, se preparó un volumen de buffer de hibridación y se agregó la sonda marcada. La sonda empleada fue un producto de amplificación de 245 pb de la secuencia de inserción IS6110 previamente amplificado por PCR usando los primers INS1 (5'-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3') e INS2 (5'-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3') y purificados median- te electroforesis en gel de bajo punto de fusión (SIGMA).
La sonda fue marcada con la enzima peroxidasa si- guiendo el procedimiento del kit ECL. Luego de una hibridación de 12 horas, la membrana fue lavada con un buffer conteniendo urea (Urea 7M, SDS %, SSC 0,5), y expuesto a un film (Hipefilm ECL, Amersham Pharmacia, Biotech). Los patrones de restricción fue- ron visualizados exponiendo la película de fotografía con soluciones de revelado y de fijación.
ANÁLISIS DE LOS PERFILES GENÉTICOS RFLP- IS6110
Para comparar patrones genéticos que proceden de diferentes geles, la cepa de referencia M. tuberculosis 14323 fue usada como control, e incluida en el primer y último carril. Los perfiles genéticos generados en base al número y posición de la secuencia de inser- ción IS6110 en el genoma de los diferentes aisla- mientos de M. tuberculosis fueron analizado emplean- do el programa GelCompar II versión 4.0 (Window 98, Applied Maths, Kortrijk, Bélgica). Los perfiles genéticos generados a partir de diferentes geles fueron introdu- cidos en una base de datos, aquellos geles cuyos patrones genéticos de la cepa de referencia 14323 no coincidieron en un 100% fueron repetidos.
Luego de eliminar aislamientos repetidos de un mis- mo paciente, se definieron cepas que provienen de una misma población clonal como aislamientos «agru- pados» si ellos compartieron patrones idénticos o con sólo una banda de diferencia (como se sabe las se- cuencias de inserción son elementos genéticos móvi- les, por lo que entre cepas de una misma cadena de transmisión [cluster] puede ocurrir un cambio de 1,5%, además estos mínimos cambios no afectan la inter- pretación de los resultados23).Y «no agrupados» si sus patrones genéticos fueron totalmente diferentes entre sí. Para estudiar la relación genética de las cepas se elaboró también un árbol de similaridad basado en el algoritmo UPGMA y el coeficiente de Dice. Todos los patrones fueron inspeccionados visualmente para detectar posibles errores, eliminando y volviendo a repetir los ensayos cuyos patrones IS6110 de la ce- pas 14323 no coincidieron en 100%.
RESULTADOS
PERFIL DE SUSCEPTIBILIDAD
De 144 pacientes reclutados, 128 fueron selecciona- dos por cumplir los criterios de inclusión para la prue- ba de susceptibilidad. Los pacientes tuvieron una edad media de 24,52 ± 11,80 años, y 76 (59,37%) fueron de
sexo masculino. Los pacientes «nunca tratados» fue- ron 95 (74,21%) y los «antes tratados» fueron 33 (25,78%).
El análisis de perfil de sensibilidad a drogas de las cepas estudiadas, mostró de forma global que 50 (39,0%) presentaron resistencia de una a más dro- gas, con un nivel de resistencia primaria y adquirida de 32,63 y 57,57%, respectivamente. En el grupo de los pacientes «nunca tratados», 64 (67,37%) presen- taron sensibilidad a todas las drogas de primera lí- nea, 31 (32,63%) mostraron resistencia de una a más drogas. En el grupo de los «antes tratados», 14 (42,43%) fueron sensibles a todas las drogas, mien- tras que 19 (57,57%) fueron resistentes de una a más drogas. Se encontraron 20 cepas (54,78%) con el pa- trón de multidrogorresistencia (MDR), de los cuales 8,42% pertenecían a los «nunca tratados» y 36,36% a los «antes tratados» (Tabla 1).
PERFILES GENÉTICOS MEDIANTE RFLP
De los 144 pacientes reclutados se excluyeron 19 pa- cientes, debido a que pese a repetidos ensayos de extracción de ADN de sus respectivas cepas de M. tu- berculosis que se practicó, no fue posible recuperar sus ADN genómicos en óptimas condiciones para el análisis de RFLP; finalmente se realizó el RFLP-IS6110 a 125 cepas de M. tuberculosis; sin embargo, siete perfiles genéticos con menos de cuatro bandas IS6110
Tabla 1. Perfil de resistencia de aislamientos de M.
tuberculosis. Lima sur, 2002-2003.
Nunca tratados Antes tratados Patrón de resistencia Total
n (%) n (%)
Un medicamento
Isoniazida (INH) (1,0)
Rifampicina (R) (1,0)
Estreptomicina (SM) (15,7)
Etambutol (E) (1,0)
Dos medicamentos
INH+SM (5,2) INH+R (3,2) Tres medicamentos
INH+SM+R (1,0)
INH+E+R (1,0) Cuatro medicamentos
INH+R+EM+SM (3,2)
Sensibles (67,4)
Resistentes (24,2)
MDR (8,4)
Total
1 2 18 1
8 6
4 2
8
78 30 20 128
1 1 15 1
5 3
1 1
3
64 23 8
95 (100) 0
1 3 0
3 3
3 1
5
14 7 12 33
(0,0) (3,0) (9,0) (0,0)
(9,0) (9,0)
(9,0) (3,0)
(15,2)
(42,4) (21,2) (36,4) (100)
Rev Peru Med Exp Salud Publica 22(1), 2005 Capcha A. et al.
Figura 1. Dendograma de similitud y cluster de patrones RFLP-IS6110.
Pacientes de la zona sur de Lima (octubre 2002 y abril 2003).
Dice (Opt:1.00%) (Tol 1.2%-1.2%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
RFLP RFLP
Tabla 2. Distribución de copias IS6110 entre aislamien- tos de M. tuberculosis (n=125)
Figura 2. Copias IS610 frente a los aislamientos agrupados y no agrupados
En total, 97 perfiles genéticos RFLP-IS6110 diferentes fueron obtenidos de 118 aislamientos; 35(29,7%) per- files genéticos se agruparon en 14 clusters y 83 perfi- les RFLP-IS6110 tuvieron ocurrencia única.
De los 14 cluster encontrados la mayoría agrupó pa- cientes que presentaron perfiles genéticos desde 5 a 11 bandas con 100% de similitud, los cuales no pre- sentaron link epidemiológico que determine una trans- misión activa de la tuberculosis, a excepción del clus- ter VIII que agrupó a dos pacientes con un perfil genético de 10 bandas, cuyo antecedente epidemiológico fue que eran hermanos y compartían la misma vivienda, demostrándose en este cluster la transmisión activa de la TB. Además, el cluster XII pre- sentó 10 bandas y sus pacientes agrupados (02) vi- vían en la misma localidad (Daniel Alcides Carrión) y presentaron similar patrón de resistencia a isoniazida y rifampicina; asimismo, el cluster XIII presentó perfi- les genéticos con nueve bandas de similitud y el mis- mo patrón de resistencia a una droga (estreptomicina).
DISCUSIÓN
La epidemiología molecular usando el RFLP-IS6110 es una herramienta valiosa para estudiar la transmi- sión de la TB24,25. En el presente estudio se encontró una gran diversidad de patrones genéticos diferentes (97 patrones), de las cuales 35 se agruparon en 14 cluster, aunque un cluster de tres cepas y que presentó menos de cuatro bandas no fue considerado en el aná- lisis de transmisión. Probablemente a estas cepas se les debería hacer una subtipificación con otro método molecular, tales como el spoligotyping, VNTRs o DRE- PCR para confirmar su pertenencia a un cluster.
De nuestros hallazgos, en el cluster VIII se encontra- ron genotipos relacionados (dos pacientes hermanos y que vivían en la misma vivienda), lo que indicaría una transmisión activa de la enfermedad y una relación clonal con el agente etiológico que causó la enferme- dad en ambos casos. En el resto de clusters, dado que no se pudo establecer alguna relación epidemiológica de transmisión activa, se tratarían de casos de reactivación endógena, que probablemente hayan tenido diversas fuentes de contagio en el pasa- do. Sin embargo, cabe resaltar que no en todos los pacientes se pudo realizar una indagación epidemiológica que nos pudiera indicar un mayor in- dicio del encontrado.
Este método mediante RFLP-IS6110 se presenta como una excelente herramienta para definir transmisión Aislados agrupados
Nº de copias
IS6110 Nº de aislados
Nº de clusters
Aislados No agrupados
2 0 0 2 3 3 1 0 4 0 0 2 5 4 2 3 6 10 3 9 7 7 2 10 8 2 1 9 9 4 2 16 10 6 3 11 11 2 1 12 12 0 0 3 13 0 0 5 14 0 0 3 15 0 0 2
Total 38 (30,4%) 14 87 (69,6%)
si bien están incluidas en el dendograma fueron pos- teriormente excluidas del análisis de agrupamiento porque el análisis del RFLP no tiene un buen poder discriminativo en cepas menores de 5 bandas, que- dando como población final 118 cepas (Figura 1).
El número de copias IS6110 varió desde 2 hasta 15 bandas y la mayoría estuvo entre 5 a 11 bandas (Tabla 2). Además el número de copias de IS6110 se presen- tó con menor frecuencia en las poblaciones clonales que en las no clonales (Tabla 1, Figura 2).
Rev Peru Med Exp Salud Publica 22(1), 2005 Capcha A. et al.
reciente y reactivación de TB12,13,16,17. Las investigacio- nes de numerosos brotes han demostrado que mues- tras de M. tuberculosis con algún link epidemiológico presentan similares patrones genéticos, mientras que muestras no relacionadas tienen patrones diferentes22. En países de alta prevalencia de TB como el nuestro, emplear este método será de gran valor, dado que permitirá identificar grupos de alto riesgo de transmi- sión, la identificación temprana de casos, y una mejor elección de los tratamientos antituberculosos.
Como se aprecia, la zona escogida para el estudio (Villa El Salvador) presenta altos niveles de resisten- cia y multidrogoresistencia, y metodologías como la empleada, ligada a un fuerte componente epidemiológico y de antecedentes de tratamiento de los casos, nos ayudaría a seleccionar alternativas de tratamiento, con la consiguiente reducción de la trans- misión de la enfermedad. Si bien se encontró un alto porcentaje de TB-MDR, nuestro estudio no reveló una transmisión activa de MDR en la zona.
Se sugiere continuar con este tipo de investigaciones de epidemiología molecular, que nos permita caracte- rizar la diversidad clonal de las cepas provenientes de diferentes zonas del país, así como definir grupos de perfiles genéticos asociados a transmisión.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a los médicos, enfermeras, tecnólogos médicos, técnicos y auxiliares de los diferentes cen- tros de salud del distrito de Villa María del Triunfo que colaboraron desinteresadamente en el estudio. A los biólogos del Laboratorio de Biología Molecular por sus consejos y experiencia en el transcurso del trabajo. Al Dr. Leonid Lecca por su gran aporte en la finalización del trabajo.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Perú, Ministerio de Salud. Tuberculosis en el Perú.
Informe 1999. Lima: MINSA / DGSP; 2000.
2. Raviglione MC, Snider DE Jr, Kochi A. Global epidemiology of tuberculosis: morbidity and mortality of a worldwide epidemic. JAMA 1995; 273(3): 220-26.
3. Chaves F, Dronda F, Alonso-Sanz M, Noriega AR.
Evidence of exogenous reinfection and mixed infection with more than one strain of Mycobacterium tuberculo- sis among spanish HIV-infected inmates. AIDS 1999;
13(5): 615-20.
4. Barnes P, Bloch AB, Davidson PT, Snider DE Jr. Tu- berculosis in patients with human immunodeficiency vi- rus infection. N Engl J Med 1991; 324(23): 1644-50.
5. Coronado VG, Beck-Sague CM, Hutton MD, Davis BJ, Nicholas P, Villarreal C, et al. Transmission of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis among persons with the human immunodeficiency virus infection in an urban hospital: epidemiologic and restriction fragment length polymorphism analysis. J Infect Dis 1993; 168(4):
1052-55.
6. Garcia-Garcia ML, Jimenez-Corona ME, Ponce-de- Leon A, Jimenez-Corona A, Palacios-Martinez M, Balandrano-Campos S, et al. Mycobacterium tuber- culosis drug resistance in a suburban community in southern Mexico. Int J Tuberc Lung Dis 2000; 4(12 Suppl 2): S168-70.
7. Harrow EM, Rangel JM, Arriega JM, Cohen I, Regil Ruiz MI, DeRiemer K, et al. Epidemiology and clinical consequences of drug-resistant tuberculosis in a Guatemalan hospital. Chest 1998; 113(6): 1452-58.
8. Muñoz D, Rios G, Villalva C, Muñoz S. Factores aso- ciados al diagnóstico tardío de pacientes con tuberculo- sis pulmonar en Lima Este. Peru. Rev Peru Med Exp Salud Publica 2004; 21(1): 18-22.
9. Taylor JP, Bergmire-Sweat D, Suarez L. Epidemiology of drug-resistant tuberculosis in Texas. Am J Epidemiol 1999; 149(4): 359-65.
10. Farmer P, Kim JY. Community based approaches to the control of multidrug resistant tuberculosis: introducing
«DOTS-plus». BMJ 1998; 317(7159): 671-74.
11. Perú, Ministerio de Salud. Tuberculosis en el Perú.
Informe 2000. Lima: MINSA / DGSP; 2001.
12. Alland D, Kalkut GE, Moss AR, McAdam RA, Hahn JA, Bosworth W, et al. Transmission of tuberculosis in New York City. An analysis by DNA fingerprinting and conventional epidemiologic methods. N Engl J Med 1994;
330(24): 1710-16.
13. Diel R, Schneider S, Meywald-Walter K, Ruf CM, Rusch-Gerdes S, Niemann S. Epidemiology of tuber- culosis in Hamburg, Germany: long-term population-based analysis applying classical and molecular epidemiological techniques. J Clin Microbiol 2002; 40(2): 532-39.
14. Ellis BA, Crawford JT, Braden CR, McNabb SJ, Moore M, Kammerer S. Molecular epidemiology of tuberculo- sis in a sentinel surveillance population. Emerg Infect Dis 2002; 8(11): 1197-209.
15. Gutierrez MC, Vincent V, Aubert D, Bizet J, Gaillot O, Lebrun L, et al. Molecular fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis and risk factors for tuber- culosis transmission in Paris, France, and surrounding area. J Clin Microbiol; 36(2): 486-92.
16. Small PM, Hopewell PC, Singh SP, Paz A, Parsonnet J, Ruston DC, et al. The epidemiology of tuberculosis in San Francisco. A population-based study using conventional and molecular methods. N Engl J Med 1994;
330(24): 1703-9.
17. Baldeviano C, Quispe N, Bonilla C, Gastiaburu D, Pro J, Llanos-Zavalaga L. Perfiles genéticos (RFLP- IS6110) y resistencia a drogas en aislamientos de M.
tuberculosis de pacientes internados en un hospital referencial del Callao, Perú. Rev Peru Med Exp Salud Publica 2003; 20(2): 72-7.
18. Instituto Nacional de Salud. El laboratorio de salud pública frente a la emergencia de la tuberculosis resis- tente. Lima: INS; 2001. Documento Técnico Nº3.
19. Canetti G, Rist N, Grosset J. [Measurement of sensitivity of the tuberculous bacillus to antibacillary drugs by the method of proportions. Methodology, resistance criteria, results and interpretation.]. Rev Tuberc Pneumol (Paris) 1963; 27: 217-72.
20. van Embden JD, Cave MD, Crawford JT, Dale JW, Eisenach KD, Gicquel B, et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting:
recommendations for a standardized methodology. J Clin Microbiol 1993; 31(2): 406-9.
21. van Soolingen D, de Haas P, Kremer K. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) typing of mycobacteria. Bilthoven, The Netherlands: National Intitute of Public Health and The Environment; 2002. p. 52.
22. Daley CL, Small PM, Schecter GF. An outbreak of tu- berculosis with accelerated progresión among persons
infected with the human immunodeficiency virus: an analysis using restriction-fragment-length polymorphisms.
N Eng J Med 1992; 326(4): 231-35.
23. Niemann S, Rusch-Gerdes S, Richter E. Stability of IS6110 restriction fragment polymorphism patterns of Mycobacterium tuberculosis strains in actual chains of transmission. J Clin Microbiol 2000; 38(1): 152-57.
24. Fletcher HA. Molecular epidemiology of tuberculosis:
recent developments and applications. Curr Opin Pulm Med 2001; 7(3): 154-59.
25. Narayanan S. Molecular epidemiology of tuberculosis.
Indian J Med Res 2004; 120(4): 233-47.
Correspondencia: Luis Capcha A.
Dirección: Av. Miguel Iglesias s/n San Juan de Miraflores, Lima.
Teléfono: (511) 4665545.
Correo electrónico: [email protected]
Rev Peru Med Exp Salud Publica 22(1), 2005 Laguna-Torres et al.
RESUMEN
Objetivo Determinar la distribución de los subtipos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) y las presencia de cepas recombinantes en Argentina, Bolivia, Colombia, Chile, Ecuador, Paraguay, Perú, Uruguay y Venezuela a través de estudios epidemiológicos y de genotipificación. Materiales y Métodos: Se incluyeron a los participantes de los protocolos realizados en los nueve paises, incluyendo poblaciones de trabajadoras sexuales (TS), hombres que tienen sexo con hombres (HSH), individuos VIH positivos, gestantes y paciente con tuberculosis (TB). Se utilizó la prueba de movilidad heteroduplex de envoltura (env HMA), ProRT, secuenciamiento completo o ambas para determinar los subtipos de VIH 1. Resultados: Se identificaron 3081 individuos positivos al VIH (de un total de 42 290 voluntarios), las prevalencias oscilaban entre menos de 1% a 29% según población estudiada, siendo mayor en los HSH. Un total de 1654 muestras (54%) fueron genotipificadas. Se encontró el subtipo B en 1380 (83%) muestras, el subtipo F en 218 (13%), así como los subtipos A y C en 0,1% y 0,4% respectivamente. Se hallaron subtipos recombinantes BF en 39 muestras (2%) y formas recombinantes CRF01_AE(0,1%), CRF17_BF(0,4%) y CRF02_AG(0,1%). En Venezuela, Colombia, Ecuador, Perú, Bolivia y Chile (paises andinos) predominó el subtipo B, mientras en Argentina, Uruguay y Paraguay hubo un alto porcentaje del subtipo F. Conclusiones: En la mayoría de países andinos la epidemia de VIH-1 se concentró en los HSH con un predominio del subtipo B. El subtipo F es más frecuente en las TS en Argentina y Uruguay. Esta información es útil para implementar planes de prevención y futuros ensayos de vacunas en esta región.
Palabras clave: VIH-1; Genotipificación; Subtipos del VIH; América del Sur (fuente: DeCS BIREME).
ABSTRACT
Objectives: To determine human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) subtype distribution, and the presence of recombinant strains in Argentina, Bolivia, Colombia, Chile, Ecuador, Paraguay, Peru, Uruguay, and Venezuela using epidemiological and genotyping studies. Materials and Methods: Participants in the studies performed in nine countries were included, amongst them female sex workers, men who have sex with men (MSM), HIV-positive individuals, pregnant women, and patients with tuberculosis (TB) were included. Envelope-base heteroduplex mobility assay (env HMA) testing was used, as well as ProRT, complete sequencing, or both for determining HIV-1 subtypes. Results: 3081 HIV positive individuals were identified (out of 42 290 volunteers), prevalences from less than 1% to 29% in the different populations studied, and it was higher among MSM. 1654 samples (54%) underwent genotyping. B subtype was found in 1380 (83%) samples, F subtype was found in 218 (13%) samples, and A and C subtypes were found in 0,1% and 0,4%, respectively. BF recombinant serotypes were found in 39 samples (2%), and CRF01_AE (0,1%), CRF17_BF (0,4%), and CRF02_AG (0,1%) were also found. In Venezuela, Colombia, Ecua- dor, Peru, Bolivia, and Chile (Andean countries) subtype B predominated, while in Argentina, Uruguay, and Paraguay there was a high frequency of F subtype. Conclusions: In most Andean countries, HIV-1 epidemic concentrated among MSM, who are predominantly infected with B subtype. F subtype is more frequent among female sex workers in Argentina and Uruguay. This is useful information in order to implement prevention plans and future vaccine tests in this region.
Key words: HIV-1; genotyping; HIV subtypes; South America (source: DeCS BIREME).
DISTRIBUCIÓN DE LOS SUBTIPOS DEL VIH-1 EN NUEVE PAÍSES DE AMÉRICA DEL SUR, 1995-2002*
V. Alberto Laguna-Torres1, James Olson1, José L. Sánchez2, Silvia Montano1, Gloria Chauca1, Gladys Carrión1, Ada Romero1, Jane Ríos1, Maria E. Gamero1, Merly Sovero1, Juan Pérez-Bao1, Jean Carr2 y el
Grupo de Trabajo de Genotipificación de VIH en Sudamérica**.
1 Centro de Investigación de Enfermedades Tropicales de la Marina de los EEUU -NMRCD. Lima, Perú.
2 Instituto de Investigación del Ejército Walter Reed, Maryland, Estados Unidos.
* Este trabajo ha sido financiado por la unidad de trabajo (Work Unit No. 62787A S17 H B0002). Las opiniones y afirmaciones contenidas aquí son propias de los autores y no deben interpretarse como posición oficial o que reflejan la opinión del Departamento de la Marina o del servicio naval de los Estados Unidos. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del NMRC (Protocolo # NMRCD.1998.0001 DoD 30578; Protocolo # NMRCD.1999.0001 DoD 30587; Protocolo # NMRCD.1999.0002 DoD 30590, Protocolo # NMRCD.2000.0004 DoD 31513; Protocolo # NMRCD.2000.0002 DoD 31523; Proto- colo # NMRCD.2000.0003 DoD 31533, Protocolo # NMRCD.2002.0006 DoD 31590), en cumplimiento con todos los reglamentos federales que rigen la protección de sujetos humanos.
INTRODUCCIÓN
A fines del año 19851, el Centro de Investigación de Enfermedades Tropicales de la Marina de los de Esta- dos Unidos (NMRCD-Lima) con sede en el Hospital Naval de Lima, Perú, participó en un estudio colaborativo con el Ministerio de Salud (MINSA) y la Universidad Peruana Cayetano Heredia (UPCH) a fin de realizar un gran estudio de prevalencia del virus de la inmunodeficiencia adquirida (VIH-1) en muestras de sangre obtenidas de población general y en pobla- ción con riesgo de adquirir esta infección.
Este primer trabajo colaborativo dio inicio a los estu- dios epidemiológicos relacionados con el VIH en el Perú. Estudios posteriores se condujeron en colabo- ración con autoridades del MINSA y se analizaron en- tre 1986 y 1990, más de 14 0000 muestras proceden- tes de Lima y de varios departamentos del país1.
A finales del año 1988 el NMRCD - Lima había transfe- rido al MINSA la responsabilidad de tamizaje de las pruebas de sangre para el VIH y durante 1989 y 1990 limitó su función a confirmar las pruebas por Western Blot (WB). Desde entonces, participó en varios estu- dios de investigación de VIH-1 en alianza estratégica con el MINSA y diferentes organizaciones no guberna- mentales (ONG) en el Perú2.
A partir de 1995, con el reconocimiento de la importancia que tiene el conocer la distribución de los subtipos del VIH en América del Sur, el NMRCD - Lima inició estudios prospectivos y de seroprevalencia en poblaciones en riesgo3, los cuales tuvieron el fin de establecer estrate- gias adecuadas para implementar medidas de preven- ción futuras, tales como vacunas. Estos estudios se hi- cieron en colaboración con la Organización Panameri- cana de la Salud (OPS), ministerios de salud, universi- dades y ONG de nueve países de América del Sur4.
Entre 1995 y 2002, como producto de estas alianzas estratégicas, que incluyeron el uso mutuo de fondos y la participación conjunta en estudios epidemiológicos con genotipificación, se ha conseguido trabajar en 9 años, en varios países sudamericanos a excepción de Brasil, Surinam y las Guyanas. Se describió la di- versidad genética del VIH-1 en América del Sur inclu- yendo a Argentina, Bolivia, Colombia, Chile, Ecuador, Paraguay, Perú, Uruguay y Venezuela4-6.
La identificación de cepas recombinantes del VIH-1 es de gran importancia debido a que estas cepas pue- den diseminarse rápidamente en redes sociales aso- ciadas a poblaciones de alto riesgo, en especial entre
usuarios de drogas intravenosas (UDI) En redes de transmisión sexual, donde cocirculan diferentes subtipos del VIH-1 se originan formas recombinantes de los subtipos circulantes. Las cepas recombinantes también se pueden diseminar y originar patrones com- plejos de transmisión del VIH-1 en la región7.
Reconocer la diversidad genética del VIH es importan- te para el desarrollo de vacunas contra este virus, lo que permitiría en un futuro establecer que tipo de va- cunas pueden ser eficaces contra los genotipos pre- dominantes en las diferentes áreas de Sudamérica, por ello planteamos este estudio con el objetivo princi- pal de deteminar la distribución de los subtipos de VIH en nueve países de América del Sur.
MATERIALES Y MÉTODOS
METODOLOGÍA
Estudio observacional, descriptivo, transversal, en el que se incluyeron a los participantes de los diferentes estudios realizados en Argentina, Bolivia, Colombia, Chile, Ecuador, Paraguay, Perú, Uruguay y Venezuela entre 1995 y el 2002. El proceso de genotificación del periodo que incluye este manuscrito ha sido realizado aún en el año 2003. La captación de voluntarios en estos estudios fue realizada por el organismo oficial gubernamental de cada país o por las ONG involucradas en los estudios.
Se incluyeron trabajadoras sexuales (TS), hombres que tienen sexo con hombres (HSH), gestantes y con tuberculosis (TB). Además, mediante un muestreo por conveniencia, se incluyeron a individuos VIH positivos para garantizar un número suficiente de muestras para genotipificar, permitiendo una mejor evaluación de la variabilidad genética de las cepas de VIH en cada país.
Con respecto a los estudios epidemiológicos, dife- rentes estrategias fueron empleadas para el cálculo muestral en cada protocolo o en cada país participan- te. Los colaboradores locales mostraban su interés en trabajar con una o más de las poblaciones ante- riormente mencionadas y además se escogía las ciu- dades a ser muestreadas basándose en poblaciones según el caso. Los datos de las prevalencias se cal- culaban para cada población, datos que son de inte- rés y manejo por cada país o institución participante.
Los estudios fueron de tipo transversal, buscando seroprevalencias y son motivo también de otras publi- caciones8.
Rev Peru Med Exp Salud Publica 22(1), 2005 Laguna-Torres et al.
ASPECTOS ÉTICOS
En cada uno de los protocolos, personal entrenado explicó la metodología, aplicó el consentimiento infor- mado escrito (CI) y realizó la consejería pre y postprueba. Los analfabetos, tuvieron la opción de fir- mar con una «X» o colocar la huella digital del índice derecho. Cada CI incluía la firma de un testigo, quien verificaba que el participante era realmente voluntario.
Los datos socio-demográficos e información sobre los comportamientos de alto riesgo, conocimientos, acti- tudes y prácticas fueron incluídos en los cuestiona- rios. Todos los protocolos de estudio, fueron aproba- dos por los comités de ética de cada país y luego por el Comité de Revisión Cientifica y Comité de Ética de la Marina de EEUU (US Naval Medical Research Center IRB) y por los Institutos Nacionales de Salud del De- partamento de Defensa.
El personal de los ministerios de salud encargado de los programas de prevención y control de la infección por VIH coordinó el seguimiento y consejería de los voluntarios, utilizando un código identificador único que no debía ser vinculado con la muestra analizada en el NMRCD-Lima. Se enfatizó en la importancia de la en- trega de resultados de beneficio para el voluntario y en que los resultados serían entregados en una o dos semanas (diagnóstico de VIH y niveles de CD4/CD8 en los positivos). Los positivos al VIH fueron derivados a los ministerios de salud y ONGs para su cuidado y seguimiento segun las regulaciones gubernamenta- les locales. Tuvieron exámenes médicos periódicos, profilaxis para infecciones oportunistas y la terapia antirretroviral disponible en cada país.
Una copia del CI, el cuestionario y una alícuota de la muestra llegaba al NMRCD-Lima, Perú siempre codi- ficada, para proteger la confidencialidad del individuo.
PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
De una muestra de sangre de 5-10 mL en un tubo con anticoagulante (EDTA) se separó plasma para detec- ción de anticuerpos, realizando la prueba de inmunoensayo enzimático (Enzym Linked Immune Assay -ELISA). Si ésta resultaba reactiva procedía a ser corrida por duplicado para luego ser confirmada por medio de la prueba de Western Blot (Figura 1), las alícuotas fueron compartidas con las autoridades de los ministerios de salud y ONG dependiendo del pro- tocolo.
Las pruebas de ELISA y Western Blot para VIH fueron realizadas en los laboratorios locales de cada pais
participante. Las marcas utilizadas variaron según los años de trabajo y el país participante. Frecuentemente para la prueba de ELISA fue utilizado el kit de VIRONOSTIKA® y para Western Blot el kit de BIO RAD®.
La genotipificación fue hecha a partir de sangre total fresca (obtenida antes de 48 horas de su procesamien- to) usando linfocitos-células mononucleares periféricas (PBMC) para la identificación del genotipo viral. El uso de manchas de sangre en papel de filtro (FTA Cards Whartman Bioscience®) fue eficiente y práctico cuando el transporte de las muestras al laboratorio requería más de 48 horas. Fue útil obtener las manchas de san- gre al primer contacto con el voluntario, las cuales fue- ron codificadas y procesadas después de la confirma- ción por Wester Blot, al conocer el resultado positivo del primer ELISA, así no se requería una segunda muestra de sangre. Se usó una tarjeta de mancha de sangre seca donde se colocaba 50 µL de muestra en cada círculo (cartilla con cuatro círculos) y una pipeta de trans- ferencia por paciente (Figura1).
Figura 1. Procedimiento utilizado en los protocolos durante 1995-2002.
(*) Cuando no fue posible realizar el ELISA dentro de los 3 días subsiguientes a la toma de muestra, se sugirió guar- dar una alícuota de sangre total (0,5mL) a –20 °C para ser enviada al NMRCD - Lima.
AL 1ª ELISA POSITIVO
BLOOD SPOT (*) FTA CARDS (50 µL muestra x círculo)
Importante:
- Secar sin cerrar el FTA CARD a T°A x 3 h
- Almacenar y proteger con bolsa plástica y desecante a T°A - Enviar a NMRCD a T° A
herméticamente cerrado.
- “No congelar”
Congelar (-85°C) (1 ó 2 crioviales)
2) REPETIR ELISA (+) POR
DUPLICADO
CONFIRMAR WB (+)
ENVIAR PLASMA (1 ó 2 crioviales) en
HIELO SECO al NMRCD SANGRE TOTAL
PLASMA (separar 2 ó 3 crioviales)
ALÍCUOTA (0,5ml) (centrifugar x 10’
a 1500 RPM T° A)
El secuenciamiento se realizó en los laboratorios de NMRCD-Lima, se asignaron los genotipos mediante la Prueba de Movilidad Heteroduplex (env HMA) a tra- vés de un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) donde los fragmentos selecciona- dos del gen de la envoltura (env) fueron amplificados.
El secuenciamiento automatizado del genoma de longi- tud completa permite identificar y describir la filogenia de las posibles cepas recombinantes. El Programa de Investigacion de VIH del Instituto Walter Reed del Ejérci- to de EEUU realizó el secuenciamiento parcial del gen pol y el secuenciamiento completo del genotipo viral.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
A partir de una base de datos construída en Visual Fox Pro V. 6,0 se hicieron los análisis descriptivos y cuan- do fue necesario se aplicó el test de significancia Chi cuadrado (p<0,05).
RESULTADOS
Desde 1995, un total de 42 290 voluntarios incluyendo trabajadores sexuales masculinos y femeninas, hom- bres que tienen sexo con hombres, gestantes y pa- cientes con tuberculosis (TB) han participado en los protocolos de investigación desarrollados en 9 paí- ses sudamericanos. Todos los individuos estudiados eran mayores de 18 años. La edad promedio de los HSH fue de 29 años y de las TS femeninas fue de 34 años (p<0,01).
La prevalencia de VIH, ha oscilado entre menos de 1 y 29%, con un total de 3081 individuos positivos a la infección por VIH-1. Se encuentra que la infección es más prevalente en las poblaciones de HSH que en las
TS(p <0,001), tanto en los estudios realizados en el Perú (Figura 2), como en los realizados en países del cono sur de Sudamérica (Figura 3).
Las muestras de 1654 (54%) de los 3081 voluntarios positivos fueron genotipificadas mediante la técnica de HMA (env) o secuenciamiento completo, de ellos 1380 (83%) fueron del subtipo B mientras que 218 (13%) fueron del subtipo F. Los subtipos A, C se en- contraron en una minoría de individuos infectados con VIH (0,1% y 0,4%, respectivamente) (Tabla 1). Se ha- llaron subtipos recombinantes BF en 39 muestras (2%) y formas recombinantes CRF01_AE(0,1%), CRF17_BF(0,4%) y CRF02_AG (0,1%).
Figura 2. Prevalencia de infección por VIH en hombres que tienen sexo con hombres (HSH) y trabajadoras sexuales.
Perú 1998 -2000.
0 2 4 6 8 10 12 14 16
PrevalenciadeVIH
Lima 1998-99 Provincias 1998-99
Lima 2000 Provincias 2000 Lugar y año de estudio
TS HSH
Figura 3. Prevalencia de infección por VIH en hombres que tienen sexo con hombres (HSH) y trabajadoras sexuales.
Argentina, Paraguay y Uruguay 1999 -2002.
La distribución de los subtipos de VIH fue diferente en los países donde se han realizado los trabajos de in- vestigación. Los países de la región andina (Venezue- la, Colombia, Ecuador, Perú, Bolivia y Chile) tienen una mayor prevalencia del subtipo B (entre 92 y 100%) y en los países de la cuenca del Río de La Plata (Argentina, Paraguay y Uruguay) hay una prevalencia importante del subtipo F, que varía entre 21 y 49 % (Figura 4).
DISCUSIÓN
La recombinación es un fenómeno evolutivo impor- tante que ha experimentado el virus del VIH. Esto difi- culta que el sistema inmune reconozca y elimine el virus utilizando el sistema inmune celular. La recombinación ocurre cuando una célula es coinfectada por dos cepas de VIH-1 diferentes pero
Rev Peru Med Exp Salud Publica 22(1), 2005 Laguna-Torres et al.
relacionadas entre sí. Esto puede llevar a la formación de cadenas de ADN mixto, las cuales pueden conferir resistencia a varias drogas antirretrovirales en los pa- cientes que portan dichas cepas lo que tiene gran im- plicancia clínica9,10.
Pais A B BF C CRF17_BF CRF01_AE F CRF02_AG TOTAL Argentina 0 154 24 4 2 0 146 0 330 Bolivia 0 131 4 0 1 0 6 0 142 Chile 0 8 0 0 0 0 0 0 8 Colombia 0 238 0 0 0 0 1 0 239 Ecuador 0 250 0 0 0 1 2 2 255 Paraguay 0 85 08 2 2 0 25 0 122 Perú 1 478 2 0 1 0 6 0 488 Uruguay 0 34 1 1 0 0 32 0 68 Venezuela 0 2 0 0 0 0 0 0 2 TOTAL 1 1380 39 7 6 1 218 2 1654 Tabla 1. Distribución de los subtipos del VIH en nueve paises sudamericanos, 1995-2002.
Desde el punto de vista clínico y epidemiológico, la apa- rición de cepas recombinantes plantea dificultades para el desarrollo de una vacuna eficaz contra el VIH. El enten- dimiento progresivo de la secuencia replicativa del VIH que origina la formación del sincitio y la transactivación, es de importancia puesto que esta estrategia replicativa sugiere la capacidad de poseer la carga genética de ambos provirus infectantes, lo cual lleva a la formación de un virión «heterocigoto». A partir de esta secuencia replicativa se pueden generar mutaciones11.
El monitoreo de la prevalencia de cepas de VIH me- diante el establecimiento de una vigilancia sistemáti- ca en diversos grupos de riesgo a través de la región es de gran importancia. La distribución de los subtipos de VIH-1 muestra la diseminación diferencial de estas cepas en diversos grupos de riesgo y puede llamar la atención hacia la aparición de epidemias inminentes.
Los resultados obtenidos provienen de estudios de poblaciones en riesgo de las principales ciudades la- tinoamericanas realizados en diferentes años. En al- gunos países como Chile y Venezuela, pudo haber un sesgo durante la obtención de la muestra poblacional por lo que no son muestras representativas. En Ecua- dor, Colombia, Uruguay, Perú y Argentina los trabajos han sido sostenidos y muestran resultados que se correlacionan con los datos oficiales que manejan estos países. En Paraguay los datos provienen de todo el país, los resultados han sido obtenidos durante el último trimestre del año 2002 y reflejan la situación de la capital y siete ciudades principales12. En Bolivia la gran mayoría (93%) de las muestras obtenidas provie- ne de la ciudad de Santa Cruz y pueden no representar la distribución real13.
Figura 4. Distribución de los subtipos de VIH en 9 paises de Sudamérica, 1995 -2002.
B: 98 % F: 0,8 %
B: 67 % F: 21 %
B: 50 % F: 49 %
B: 47 % F: 44 % B: 100 %
B: 92 % F: 4,2 % B: 98 % F: 1,2 %
B: 99,6 % F: 0,4 % B: 100 %
