MEMORIA FINAL. 1. Resumen

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NUEVAS ESTRATEGIAS DE TERAPIA GÉNICA PARA EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA

INTESTINAL: LA SILENCIACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL TNF- ALFA Y LA SOBREEXPRESIÓN DE INTERLEUQUINA-10

Investigadores principales:

Dr. Miquel Àngel Gassull Duro

Hospital Universitari Germans Trias i Pujol Dra. Ester Fernández Gimeno

Facultat de Veterinària UAB Dr. Miguel Chillón Rodríguez

Centre de Biotecnologia Animal i Teràpia Gènica UAB Dr. José Carlos Perales Losa

Facultat de Medicina CSUB Duración: 3 años

MEMORIA FINAL

1. Resumen

El TNF-α desempeña un papel central en el desarrollo y la

exacerbación de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). Al mismo

tiempo, el papel inmunomodulador de la interleuquina-10 (IL-10)

puede representar una herramienta terapéutica en el tratamiento de

esta enfermedad. El presente proyecto pretende establecer el valor

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terapéutico de nuevas estrategias de intervención génica y valorar, por una parte, la efectividad de la silenciación específica del gen de TNF-α mediante fragmentos cortos de RNA (siRNA) y, por otra parte, la efectividad de la sobreexpresión de IL-10 en el intestino inflamado.

Para conseguir especificidad en el órgano diana y unos buenos niveles de inhibición y sobreexpresión, respectivamente, se utilizarán

vectores adenovirales que presentan un marcado tropismo en humanos.

Por tanto, los objetivos del presente proyecto son:

-Diseñar y sintetizar secuencias de siRNA y valorar in vitro su eficacia relativa en cuanto a la silenciación de la expresión de TNF-α.

-Analizar in vivo la biodistribución y la bioseguridad de los vectores adenovirales a utilizar.

-Generar y caracterizar los vectores adenovirales que contengan los genes de interés.

-Valorar en modelos animales de inflamación intestinal crónica la eficacia de las estrategias propuestas.

Estos estudios deben permitir sentar les bases para el diseño de nuevas estrategias de cara a su posible aplicación en la clínica humana.

2. Resultados

-Amplificación de los vectores quiméricos y producción de un stock de titulación elevada.

Durante el primer año del proyecto pudo establecerse un protocolo

para amplificar y purificar los diferentes vectores quiméricos Ad5/40

en cantidades suficientes para la realización de los experimentos in

vitro e in vivo determinados en el proyecto. Para ello fue necesario

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aumentar diez veces el número de virus por célula (MOI) y realizar dos procesos de amplificación de 5 días con un ciclo final de

producción, sin límite de tiempo, hasta observar el efecto citopático (CPE). Tal y como era de esperar, tanto las partículas virales

producidas como la infectividad varían mucho de un vector quimérico a otro.

-Generación del genoma viral de Ad5/40.

Los adenovirus quiméricos amplificados contienen únicamente genes marcadores como β-gal y GFP. Debido a no disponer del genoma de los adenovirus quiméricos 5/40 clonado dentro de un plásmido, y siendo nuestro objetivo introducir genes terapéuticos como IL-10 o siRNA antiTNF-α, fue preciso generar de nuevo el genoma quimérico a través de la introducción de la proteína fiber de Ad40 en el genoma de Ad5, para poder clonar posteriormente los genes terapéuticos.

El primer paso fue modificar el plásmido pKP1.3 (donde se halla el genoma del Ad5) manteniendo la zona de la fiber, la ampicilina y el origen de replicación y delecionando todo el resto. Con este propósito fue digerido el plásmido pKP1.3 por las dianas Spe-I, originando dos fragmentos de 27 Kb y 9 Kb. El fragmento de 9 Kb se religó,

obteniendo el plásmido pKP1.3 intermedio, que denominamos

pKP1.3-shuttle. Posteriormente, se diseñaron oligonucleótidos para

introducir una diana Xba-I en el extremo 5’ de la fiber y una diana

Mlu-I en el extremo 3’. De este modo pudo escindirse la proteína

fiber del Ad5 e introducir una proteína fiber de otro serotipo. Este

trabajo ha sido muy laborioso, complejo y largo, pero en la actualidad

ya estamos en el último punto antes de generar el constructo que nos

permitirá clonar nuestros genes de interés terapéutico.

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-Clonación de genes terapéuticos.

El gen de la IL-10 de ratón, así como el siRNA contra la posición 229 del gen del TNF-α han sido clonados dentro de los plásmidos con el genoma del Ad5 y los vectores adenovirales Ad5 que servirán como control que ya han sido amplificados y purificados. Estas dos

secuencias serán inseridas dentro de los plásmidos por el genoma del Ad5/40 tan pronto como estén disponibles.

-Estudios de protección a exposición a ácidos.

Durante el transcurso del proyecto, hemos podido analizar la resistencia de los diferentes vectores quiméricos a la exposición a medio ácido, simulando las condiciones de acidez del estómago adulto e infantil. Se llevaron a cabo tres experimentos de exposición a ácidos con una n=3 por experimento. La infectividad del Ad5 β-gal, y los vectores quiméricos Ad40SL y Ad5.40 es inhibida por la

exposición a pH ácido. En cambio, la capacidad de infección del vector Ad40S-lacZ no sólo no se ve afectada, sino que aumenta con la

exposición al pH ácido. Este experimento permite, pues, pensar en el Ad40S como un posible vector de terapia génica dirigida al intestino.

-Estudios de biodistribución y bioseguridad de Ad5/40 en ratones mediante diferentes vías de administración.

Puesto que con respecto a la vía natural de infección del Ad40, se da como hipótesis que sea oral o rectal, se decidió estudiar en ratones hembras CD1 sanos la biodistribución y bioseguridad de estos vectores administrados a través de 3 vías distintas: oral, rectal e intravenosa. De los vectores Ad40SL y Ad5β-gal, se administró una dosis de 10

⁹

IU/animal en grupos de 5 ratones. Del resto de

adenovirus se asignaron 4 ratones para cada vía con una dosis de

0,3x10

⁹

IU/animal. El PBS se empleó como control negativo y el

Ad5β-gal como control positivo. Al cabo de 3 días los animales fueron

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sacrificados y se les extrajeron 15 órganos, de los cuales se cuantificó la expresión de β-gal por luminometría.

Las muestras de los órganos se separaron en 3 grupos:

-Grupo A: órganos para los que el Ad5 tiene mayor afinidad (hígado, pulmón, bazo, músculo).

-Grupo B: órganos que forman parte del tracto gastrointestinal (esófago, estómago, intestino proximal, intestino distal y colon).

-Grupo C: órganos que no pertenecen a ninguno de los grupos anteriores (tráquea, útero, ovario, páncreas, corazón y riñón).

En el grupo A de órganos, la mayor expresión la encontramos en la vía intravenosa. En esta vía se observa una elevada expresión de β- gal en el hígado de los ratones infectados por el Ad5. En menor

grado, también se halla expresión en Ad40SL, Ad40.5 y en Ad40S. En bazo y músculo sólo se observa expresión en los órganos infectados con Ad5. En la vía oral, no se observa expresión en órgano alguno, a excepción de pulmón con el Ad5, que se explica por un reflujo del inóculo, lo que ha permitido al virus entrar por la vía respiratoria. No existe expresión en la vía rectal.

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Fetge Pulmo Melsa Múscul VIA INTRAVENOSA

RLU

Ad5 Bgal Ad40SL Ad40S LacZ Ad40.5 Ad5.40

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Fetge Pulmo Melsa Múscul VIA ORAL

RLU

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

RLU

(6)

0 100 200 300 400 500 600

Esòfag Estómac Intestí proximalIntestí distal Colon VIA INTRAVENOSA

RLU

0 100 200 300 400 500 600

Esòfag Estómac Intestí proximal Intestí distal Colon VIA ORAL

RLU

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Esòfag Estómac Intestí proximal

Intestí distal

Colon VIA RECTAL

RLU

Ad5 Ad40SL Ad40S Ad40.5 Ad5.40

En el grupo B de órganos, es preciso destacar por su interés

terapéutico como órgano diana, que la mayor expresión se encuentra en el colon, cuando los Ad40.5, 5.40, Ad40S son administrados por vía oral o rectal, en especial cuando el vector es el Ad40S. En el resto de órganos no se observa ninguna expresión, ni tampoco en la vía intravenosa.

En el grupo C no se detecta expresión en ningún órgano en ninguna vía de administración.

Además, en ninguno de los animales transfectados se observaron, a nivel macroscópico, síntomas de citotoxicidad, excepto en los

animales a los que se administró Ad5 por vía intravenosa, en los que

se observó esplenomegalia. Con posterioridad y en un modelo murino

de inflamación inducida por DSS se confirmó que el Ad5/40S también

mantiene su capacidad de infectar el intestino y el colon.

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Por último, los resultados obtenidos hasta el momento muestran que no se producen alteraciones significativas en los animales colíticos tratados con Ad5/40 por vía oral y/o por vía rectal. No existen

diferencias respecto a los controles sanos en cuanto a bioseguridad.

El único parámetro que se observa elevado, aunque de forma muy ligera, son los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST, con incrementos del 10% aproximadamente).

-Estudios de infección en líneas celulares humanas de intestino.

Para ver cuál era la capacidad de infectar células humanas de epitelio intestinal del Ad5/40S respecto al Ad5, ambos vectores fueron

titulados en la línea permisiva HEK 293, y, una vez igualados por unidades infecciosas, fueron puestos en contacto con diferentes líneas celulares humanas de epitelio intestinal. Los resultados demostraron una mayor capacidad de infección del Ad40S en todas las líneas testadas y, en especial, en las líneas Caco-2 y Ht-29.

-Estudio terapéutico con siRNA antiTNF-α.

Una vez validada la capacidad silenciadora de las secuencias siRNA antiTNF-α in vitro, se valoró su posible efecto terapéutico en ratones C57Bl6 colíticos. En un primer ensayo se administró el siRNA por vía intrarrectal el mismo día de inicio del tratamiento de DSS al 3% en el agua de beber y los ratones se monitorizaron diariamente. Este

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

HT29 HCT116 Caco2 SW480

% infección

Ad5 Ad40S

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estudio, sin embargo, no evidenció una mejora evidente de los signos clínicos ni de los parámetros histopatológicos ni bioquímicos. En la actualidad hemos modificado ligeramente el modelo incrementando la dosis y esperamos poder valorar la capacidad silenciadora muy

pronto.

-Estudio terapéutico con Ad5-IL-10 y con plásmido IL-10.

Tanto la administración de Ad5-IL-10 como la administración del plásmido IL-10 conlleva mejoras significativas en los parámetros clínicos, morfológicos y bioquímicos estudiados. Estas mejoras son evidentes a tiempos cortos, pero la tendencia se modifica a tiempos más largos. Es decir, en un primer período disminuye la gravedad de la inflamación. No obstante, la administración por vía endovenosa provoca la expresión de IL-10 principalmente en hígado y, por tanto, existe una sobreexpresión generalizada de IL-10, que a la larga tiene efectos deletéreos por sus efectos inmunosupresores (se observó mortalidad a partir de las 2 semanas, momento en que la colitis ya ha remitido). Por tanto, con estos resultados cobran mayor fuerza los siguientes conceptos:

1) La IL-10 es capaz de inhibir el desarrollo de la colitis experimental.

2) La sobreexpresión generalizada y sostenida de IL-10 no supone una mejora a largo plazo sino que determina un riesgo de

inmunosupresión.

3) Se evidencia que la estrategia más adecuada es administrar un

vector viral capaz de producir sólo una sobreexpresión circunscrita al

órgano afectado (en este caso el colon), circunstancia que podríamos

lograr mediante el vector quimérico Ad5/40S-IL10.

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3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos

El actual tratamiento de la EII consiste principalmente en potentes medicamentos inmunomoduladores e inmunosupresores que se administran de forma sistémica u oral. Los efectos sistémicos de estos medicamentos (reacciones alérgicas, daño hepático,

inmunosupresión sistémica, etc.) pueden conducir a serias complicaciones para los enfermos. Una alternativa a tales

tratamientos es dirigir citoquinas antiinflamatorias o inhibir genes proinflamatorios al propio lugar de la inflamación. En este aspecto, se han propuesto estrategias empleando Ad5 como vector, pues se ha demostrado que éste es capaz de transducir células epiteliales de intestino humano y que el intestino de pacientes con EII permite una mejor entrada de los adenovirus, posiblemente debido a las