46 UNA NOTA SOBRE LA CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA DE SEMEN DE VERRACOS CC21 A PARTIR DE DOS TÉCNICAS DE MEDICIÓN
Yusimy Camino, M de J. Acosta y F. González
Instituto de Investigaciones Porcinas. Gaveta Postal No. 1, Punta Brava. La Habana, Cuba email: ycaminos@iip.geg.cu
RESUMEN
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio del Centro de Procesamiento de Semen Porcino del Instituto de Investigaciones Porcinas. Se utilizaron 10 sementales CC21 durante un período de un año. Para la prueba se utilizaron 255 eyaculados y se determinó la concentración espermática mediante dos técnicas: cámara de Bürker y espectrofotómetro. Se utilizó un modelo de clasificación simple que tuvo en cuenta la técnica para determinar la concentración como única fuente de variación.
Se encontraron diferencias significativas entre tratamientos (P<0.01), lo que indica que el método empleado influye en el valor de la concentración espermática. Los valores de concentración espermática medida por la técnica de espectrofotómetro, fueron superiores respecto a la técnica en cámara de Bürker. La determinación de la concentración por cámara de Bürker fue más exacta que al usar el espectrofotómetro, aunque los valores obtenidos por ambos métodos estuvieron dentro de los parámetros establecidos.
Palabras clave: cámara de bürker, concentración espermática, espectrofotómetro, técnicas de medición
A NOTE ON THE SPERMATIC CONCENTRATION OF CC21 BOAR SPERM BY MEANS OF TWO MEASUREMENT TECHNIQUES
ABSTRACT
This work was carried at the laboratory of the Swine Semen Processing Center of the Swine Research Institute.
Ten CC21 boars were used for a one year period. For the test, 255 ejaculates were used and sperm concentration was determined by two techniques: Bürker chamber and spectrophotometer. The only source of variation used was a model of simple classification that kept in count the technique to determine the concentration.
Significant differences between treatments (P<0.01) were found, which indicates that the method used influences the value of sperm concentration. The values of sperm concentration measured by the spectrophotometer technique were higher compared to the Bürker chamber technique. The determination of the concentration by Bürker chamber was more accurate than when using the spectrophotometer, although the values obtained by both methods were within the established parameters.
Key words: bürker chamber, sperm concentration, spectrophotometer, measurement techniques
47 INTRODUCCIÓN
De los sementales porcinos depende el 50% de la fertilidad de la granja (García 1995), por ello es de suma importancia garantizarle al semental todas las condiciones necesarias (alimentación, manejo, instalaciones, ambiente etc.) para que este logre un óptimo comportamiento reproductivo. Este incluye una adecuada calidad espermática, que influye directamente en la fertilidad.
El espermiograma clásico es el método de evaluación de la calidad espermática más empleado en países desarrollados. En este se deben tener en cuenta una serie de parámetros macroscópicos y microscópicos (Delhomme 2014, citado por Acosta 2018): volumen, motilidad, concentración, porciento de patologías (de cola y acrosoma), resistencia a las 24, 48 y 72 horas, y número de dosis, entre otros. Según Paulino (2017), estas características reproductivas varían significativamente entre verracos.
La medición de la concentración de espermatozoides (número de espermatozoides/ml) es uno de los parámetros más importantes en la evaluación de la fertilidad. Esta medición es considerada por muchos autores, entre ellos Rodríguez et al (2008), el procedimiento más trabajoso y menos eficiente de la evaluación seminal. Según Hafs et al (1958), a pesar de ser un elemento variable, es el que determina la calidad real del eyaculado. El cálculo de la concentración espermática del eyaculado es un valor muy importante, ya que, de esta, junto al volumen del eyaculado, dependerá el número de dosis a realizar. Sin duda, este es el punto más crítico y controvertido de todo el proceso, ya que la variabilidad entre los distintos aparatos de medida es considerable (Llamas y García 2017).
Para el cálculo de la concentración se utilizan diferentes métodos que pueden ser manuales o automáticos. Dentro de los manuales están los hematocitómetros (cámara de Neubauer o Thoma, cámara de Bürker, entre otras), este ha sido el método tradicionalmente usado para determinar la concentración y se considera el patrón de oro para este tipo de pruebas. Se ha observado que la variabilidad de los resultados se encuentra entre 7.1 y 12%;
sin embargo, es una técnica que requiere de experiencia para realizarla adecuadamente y toma alrededor de 15 minutos por muestra (Mahmoud et al 1997 y WHO 1999). Según Llamas y García (2017) estos métodos han sido reemplazados por aparatos electrónicos (método automático), principalmente espectrofotómetros, debido a su mayor rapidez de cálculo. Por otra parte, el método de espectrofotometría permite medir la muestra bajo parámetros de longitud de onda determinada según el tamaño celular y volumen, transmitancia y absorbancia como resultado del nivel de densidad de la misma. El mismo es de rápida aplicación sin importar el grado de concentración del eyaculado o la especie del macho que es evaluado (Knox et al 2004). Rodríguez et al (2008) plantean que dicho método también ofrece una menor variabilidad que el conteo en cámara de Neubauer.
El objetivo de este trabajo es comparar dos técnicas de medición de la concentración espermática de sementales CC21: cámara de Bürker y espectrofotometría.
MATERIALES Y MÉTODOS
Este trabajo fue realizado en el laboratorio del Centro de Procesamiento de Semen Porcino (CPSP) del Instituto de Investigaciones Porcinas (IIP). Para la realización del mismo se utilizaron 10 sementales CC21 durante un período de un año. Al inicio de la prueba los animales contaban 9 meses de edad y tuvieron una frecuencia de monta de 6 días que fue variando con la edad según lo establecido en el Manual de Buenas Prácticas para la Producción Porcina en Cuba (IIP 2016). Se utilizó un total de 255 eyaculados, en los que se determinó la concentración espermática mediante dos técnicas: cámara de Bürker y espectrofotómetro para comparar la exactitud de cada una.
Para la extracción de semen se empleó el método de la mano enguantada. Se obtuvo la fracción rica del eyaculado;
el semen fue colectado en jarras de cerámica que fueron previamente atemperadas a 37C˚, y se filtró la porción gelatinosa del semen con una gasa triple estéril. Después de la recolección se trasladó el material obtenido hasta el laboratorio para su análisis. La extracción de las muestras se realizó siempre en el horario comprendido de 7:00 am - 8:30 am.
48 Después se procedió a realizar un examen macroscópico y microscópico del semen. Se midió la concentración mediante dos métodos. Las tecnologías empleadas son las descritas por Magapor (1998) y Kubus (2011).
Para la determinación de la concentración de las muestras por cámara de Bürker, se diluyó el semen al 1:100 en un matraz aforado, con una solución salina formolada al 3%. De esta preparación se tomó una muestra con la pipeta de Pasteur, la cual se depositó en el retículo de la cámara. La cuantificación se realizó empleando el microscopio con aumento de 400x (Lorenzo 2008 y Kubus 2011). Para determinar el número de espermatozoides (spz) por milímetro cúbico (mm3), se contaron 40 cuadros. Al mismo tiempo se registraron las anomalías cola de látigo (CL), gotas proximales (GP) y distales (GD), y posteriormente se aplicó la fórmula para conteo útil que se expresa de la forma siguiente:
Total de spz/eyaculado = A x V x 107
Dónde: A= No de spz en 40 cuadros – (CL + GP) CL= Colas en Látigos
GP= Gotas Proximales V= Volumen del eyaculado
La determinación de la concentración de las muestras por espectrofotómetro se realizó con la misma preparación antes descrita. Se diluyó el semen al 1:100 en un matraz aforado, con una solución salina formolada al 3%. De esta preparación se tomó una muestra con la pipeta de Pasteur, la cual se depositó en la cubeta del espectrofotómetro y se procedió a la medición por el mismo.
Los datos obtenidos en este experimento fueron procesados por un PROC GLM del SAS (1997), con un modelo de clasificación simple que tuvo en cuenta la técnica para determinar la concentración como única fuente de variación.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los eyaculados estudiados cumplían con las características de color y olor propias de la especie porcina mencionadas por Magapor (1998), Kubus (2011) e IIP (2016), entre otros autores.
En la tabla 1 se muestran los valores medios de las concentraciones espermáticas analizadas por las dos técnicas en estudio. Se observaron diferencias significativas (P<0.01) entre las técnicas empleadas, lo que indica que hubo influencia en el valor de la concentración espermática.
Tabla 1. Concentración espermática utilizando las dos técnicas evaluadas
Técnicas Media E.E + Sig
Concentración en cámara de Bürker, (spz x107) 119.14 + 2.20 **
Concentración por espectrofotómetro, (spz x107) 368.18 + 1.10
**P<0.01
Aunque fueron usadas las mismas muestras se puede observar que donde se midió la concentración con el espectrofotómetro, los valores obtenidos fueron mayores; esto se debió a que este método sólo mide densidad óptica y no permite diferenciar entre espermatozoides vivos, aglutinados, muertos, decamaciones, acrosomas, entre otras. O sea, esta medición de la concentración no solo cuenta espermatozoides vivos, lo que según Lorenzo (2008) hace este método poco preciso. Estos autores también plantean que el conteo de espermatozoides en un hemocitómetro o cámara de conteo de células como la de Neubauer, Bürker entre otras, es más preciso.
Sin embargo, Rodríguez et al (2008), quienes estandarizaron la prueba de espectrofotometría en la medición de la concentración de semen, obtuvieron que existe una alta correlación entre el espectrofotómetro y la cámara de Neubauer, lo que permitió generar una tabla de equivalencias que facilita la lectura de los eyaculados.
49 La calibración debe realizarse de manera continua para reducir errores y garantizar más precisión en los resultados.
Que el valor de la concentración sea preciso es de vital importancia, ya en el caso de los centros donde se usa la inseminación artificial se pueden preparar dosis con una concentración inferior a la deseada, afectándose la fertilidad de la granja o por el contrario aumentar la concentración de las dosis por encima de los valores necesarios, disminuyendo de este modo el potencial productivo del semental (Llamas y García 2017). Estos autores realizaron la comparación de dos técnicas para medir la concentración espermática (espectrofotómetro y cámara de Bürker) y refieren que independientemente del método empleado para el cálculo de la concentración pueden producirse errores durante la medición, ya sean en el método de preparación de las muestras seminales o por fallos de los aparatos de medida y que la precisión que ofrece el método no va a depender más que de la superficie de recuento que realicemos sobre ellos.
En ambas técnicas se observaron valores de concentración superior a la encontrada por Acosta (2004) para cerdos de la misma raza, lo cual pudiera estar dado por la influencia de factores como el clima, la edad, entre otros, que pueden intervenir en la diferencia entre sus resultados y los nuestros.
Los resultados mostraron que la determinación de la concentración por cámara de Bürker fue más exacta que al usar el espectrofotómetro, aunque los valores obtenidos por ambos métodos estuvieron dentro de los parámetros establecidos.
REFERENCIAS
Acosta, M.J. 2004. Evaluación de dos técnicas de contrastación en el semen porcino. Tesis presentada en opción al grado científico de Master en Producción Porcina. Instituto de Investigaciones Porcinas. La Habana, pp 90 Acosta, M.J. 2018. Metodología para la evaluación de la calidad seminal porcina en Cuba. Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigaciones Porcinas. La Habana, pp 128
Delhomme, G. 2014. Biotecnologías de la Reproducción Porcina. Catálogo Suino IMV Technologies. Versión electrónica disponible en: https://www.imv-technologies.com
García, J.A. 1995. Evaluación práctica del semen porcino. Acontecer Porcino, 11(32):34-42
Hafs, H.D., Bratton, R.W., Henderson C.R. and Foote RH. 1958. Estimation of some variance components of bovine semen criteria and their use in the design of experiments. Journal of Dairy Science, 41:96-104
IIP. 2016. Manual de Buenas Prácticas para la Producción Porcina en Cuba. ISSBN 9789597208297, pp 117 Kubus. 2011. Inseminación Artificial Porcina. Madrid. Las Rozas, pp 136
Llamas, P.J. y García F.A. 2017. Puntos de control en la elaboración de dosis seminales: concentración espermática (2/2). Versión electrónica disponible en: https://www.3tres3.com/articulos/puntos-de-control-en-la- elaboracion-de-dosis-seminales-concentracion_37966/
Lorenzo, F.E. 2008. Efecto de la concentración espermática por dosis en dos protocolos de inseminación artificial en hembras porcinas. Tesis presentada en opción al título de Médico Veterinario. Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, pp 77
Magapor, S.A. 1998. Manual de Reproducción e I A en el Cerdo. Barcelona, pp 100
Mahmoud, A.M., Depoorter, B., Piens, N. and Comhaire, FH. 1997. The performance of 10 different methods for the estimation of sperm concentration. Fertil Sterility, 68(2):340-345
50 Paulino, J.A. 2017. Nutrición del verraco. Nutrición y Tecnología República Dominicana, NTECRD.S.R.L.
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SAS. 1997. Statistical analysis system user´s guide: stat. Version.6.12: SAS Institute
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http://livestocktrail.illinois.edu/uploads/porknet/papers/Knox3.pdf
